專(zhuān)利名稱(chēng)：應(yīng)用小麥胚芽無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)標(biāo)記蛋白質(zhì)的一般方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及應(yīng)用小麥胚芽無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)，用硒代甲硫氨酸標(biāo)記蛋白質(zhì)的方法、以及用重氫標(biāo)記蛋白質(zhì)的方法。
蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究中，采用了X線結(jié)晶分析法、核磁共振(NMR)光譜法、中子衍射法。為了實(shí)施這些方法，每種方法必須大量制備用重原子標(biāo)記、同位素標(biāo)記、重氫標(biāo)記、且保持其活性的蛋白質(zhì)。以前的X線結(jié)晶分析法中，至少需要2種結(jié)晶，即天然型的蛋白質(zhì)結(jié)晶、以及為了確定格子數(shù)，將重原子摻入該結(jié)晶中的重原子標(biāo)記結(jié)晶。在獲得后一種結(jié)晶的過(guò)程中，伴隨著很多困難，因此，盡管前一種結(jié)晶的結(jié)晶化獲得成功，但仍然不能闡明其結(jié)晶結(jié)構(gòu)的例子也很多。對(duì)此，提出的解決方案有將一部分正在使用的技術(shù)甲硫氨酸中的離子原子置換為重原子硒的硒代甲硫氨酸而加以利用。該方法是利用基因工程的方法，將目的基因?qū)肱囵B(yǎng)細(xì)胞或大腸桿菌中，然后在含硒代甲硫氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使該基因編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)，從而將硒代甲硫氨酸導(dǎo)入該蛋白質(zhì)中。
一方面，用NMR光譜法、中子衍射法分析蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)和分子內(nèi)水分子的局限性時(shí)，必須要將蛋白質(zhì)中的氫原子置換成重氫。該方法采用的手段是將目的基因?qū)氪竽c桿菌等微生物中，然后在含有重氫標(biāo)記的氨基酸的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，使基因產(chǎn)物表達(dá)，制備重氫標(biāo)記的蛋白質(zhì)。
業(yè)已證實(shí)，用含硒代甲硫氨酸的蛋白質(zhì)所得的1種結(jié)晶即可對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，因此該蛋白質(zhì)是有用的蛋白質(zhì)。但是，以前使用的用硒代甲硫氨酸標(biāo)記蛋白質(zhì)的方法存在很多缺點(diǎn)。這些缺點(diǎn)是(1)甲硫氨酸不僅是與細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成的各種代謝有關(guān)的必須氨基酸，而且硒本身對(duì)細(xì)胞的毒性強(qiáng)，所以不能將培養(yǎng)基中的甲硫氨酸全部替換為硒代甲硫氨酸，因此，要制備必需量的含硒代甲硫氨酸的蛋白質(zhì)，必須要大量培養(yǎng)；(2)由于硒代甲硫氨酸的價(jià)格昂貴，而且毒性強(qiáng)，使培養(yǎng)后含高濃度硒代甲硫氨酸培養(yǎng)基的廢棄成為重大的問(wèn)題。
另一方面，用重氫標(biāo)記蛋白質(zhì)是用NMR光譜法、中子衍射法分析蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)的必要條件，但迄今為止，上述利用微生物培養(yǎng)的方法是重氫標(biāo)記蛋白質(zhì)的唯一方法。該方法有下述很多必須解決的缺點(diǎn)(1)操作煩雜、(2)標(biāo)記效率低、(3)由于需要大量的重氫標(biāo)記氨基酸，故成本非常高，而且由于其毒性強(qiáng)，在培養(yǎng)基的廢棄方面留下重大的問(wèn)題。
此外，同樣的理由，也沒(méi)有開(kāi)發(fā)下述的實(shí)用手段即用基因工程的方法制備N(xiāo)MR光譜法中所用的、含有用碳13(13C)或氮15(15N)標(biāo)記的氨基酸的蛋白質(zhì)。
在這種現(xiàn)狀下，期望有一種制備標(biāo)記蛋白質(zhì)的方法，該方法能保持目的蛋白的原有活性、并能將該蛋白質(zhì)中所要求的氨基酸按所要求的那樣標(biāo)記、效率高、價(jià)格低且廢液少。
本發(fā)明的另一個(gè)方案是用上述制造方法所得的硒代甲硫氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還有一個(gè)方案是含重氫的氨基酸標(biāo)記蛋白質(zhì)的制造方法，其特征在于，從小麥胚芽提取物中完全除去混入該胚芽提取物的胚乳，將所得的無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成用的細(xì)胞提取物中的天然型氨基酸變?yōu)橹貧錁?biāo)記氨基酸后，使用含代替天然型氨基酸的重氫標(biāo)記氨基酸的蛋白質(zhì)合成反應(yīng)液的組成、在批式條件下、或透析條件下，進(jìn)行無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成。
本發(fā)明還有一個(gè)方案是用上述制造方法所得的含重氫的氨基酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)。
圖2是用透析式無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成法合成48小時(shí)并精制的GFP(A)和DHFR(B)的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。圖2的(A)和(B)中，泳道2和泳道3都是天然型蛋白質(zhì)的電泳結(jié)果、泳道4和泳道5都是含硒代甲硫氨酸蛋白質(zhì)的電泳結(jié)果。另外，第2泳道和第4泳道表示合成反應(yīng)后的反應(yīng)原液的電泳結(jié)果、第3泳道和第5泳道是反應(yīng)原液精制后的每種蛋白質(zhì)的電泳結(jié)果。第1泳道作為對(duì)照，表示蛋白質(zhì)翻譯模板不存在下進(jìn)行合成反應(yīng)的結(jié)果。圖中的箭頭表示生成的蛋白質(zhì)條帶、MM表示分子量標(biāo)志。
圖3是精制的含硒代甲硫氨酸GFP的螢光發(fā)光光譜圖。
圖4是表示通用性無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成用的模板分子合成質(zhì)粒(pEU1)結(jié)構(gòu)的模式圖。
圖5是用透析式無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成法合成的重氫標(biāo)記DHFR和經(jīng)48小時(shí)合成后精制的DHFR的電泳圖。圖中，箭頭表示生成的蛋白質(zhì)條帶、各數(shù)字表示反應(yīng)時(shí)間。此外，“天然氨基酸”和“天然”表示使用天然型氨基酸時(shí)的DHFR合成結(jié)果；“重氫標(biāo)記氨基酸”和“重氫標(biāo)記的”表示使用重氫標(biāo)記L型氨基酸時(shí)的DHFR合成結(jié)果。“放大的”是擴(kuò)大電泳圖；“純化的”是精制的DHFR的電泳圖。
本發(fā)明中，無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)所用的細(xì)胞提取物是小麥胚芽提取物，優(yōu)選基本上完全除去胚乳成分雜質(zhì)的小麥胚芽提取物。作為原料的該小麥胚芽提取物可按下述實(shí)施例1中所示的方法獲得，特別優(yōu)選將有白色小傷部分的胚芽以及茶色或黑色的胚芽完全除去、僅由黃色的胚芽組成的小麥胚芽為原料而制備的小麥胚芽提取物。
硒代甲硫氨酸標(biāo)記蛋白質(zhì)時(shí)，小麥胚芽提取物中的甲硫氨酸被置換成了硒代甲硫氨酸。具體的置換方法在下述的實(shí)施例中描述。例如，首先用抽提溶液由小麥胚芽制備提取物，該抽提溶液含有預(yù)先除去甲硫氨酸、并添加了硒代甲硫氨酸的20種氨基酸混合物(含19種氨基酸和硒代甲硫氨酸的溶液)?；蛘?，也可以按以前采用含有全部20種氨基酸的抽提溶液，由小麥胚芽制備提取物。然后將上述胚芽提取物進(jìn)行凝膠過(guò)濾、制備含代替甲硫氨酸的硒代甲硫氨酸的小麥胚芽提取物，凝膠過(guò)濾所用的溶液含有除甲硫氨酸以外的19種氨基酸中添加了硒代甲硫氨酸的20種氨基酸。
用重氫標(biāo)記蛋白質(zhì)時(shí)，小麥胚芽提取物中的天然型氨基酸置換成重氫標(biāo)記的氨基酸。具體的置換方法在下述的實(shí)施例中描述。例如，使用未預(yù)先除去要標(biāo)記的天然型氨基酸、而添加了相應(yīng)的重氫標(biāo)記氨基酸的抽提溶液，或使用含有20種重氫標(biāo)記氨基酸混合液的抽提溶液由小麥胚芽制備提取物。然后用凝膠過(guò)濾柱將所制備的小麥胚芽提取物進(jìn)行凝膠過(guò)濾，該柱經(jīng)過(guò)含目的重氫標(biāo)記的氨基酸溶液，或含20種重氫標(biāo)記氨基酸混合液的溶液平衡，凝膠過(guò)濾中，提取物的氨基酸中的目的氨基酸或全部20種氨基酸與重氫標(biāo)記氨基酸交換，制備成小麥胚芽提取物。
在所得的蛋白質(zhì)是硒代甲硫氨酸標(biāo)記蛋白質(zhì)時(shí)，本發(fā)明中使用的蛋白質(zhì)合成反應(yīng)液的組成，可以是現(xiàn)有已知的無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)(無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成反應(yīng)系統(tǒng))所使用的組成中，將甲硫氨酸置換成硒代甲硫氨酸的組成。例如，該反應(yīng)液由以下組分組成24％體積的小麥胚芽提取物(濃度為200A260nm單位/ml)中，加入1,000單位/ml的核糖核酸酸酶抑制劑(RNAsin)、30mM N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(Hepes)-KOH，pH7.6、95mM醋酸鉀，2.65mM醋酸鎂、2.85mM二硫蘇糖醇、0.5mg/ml肌酸激酶、1.2mM腺苷三磷酸(ATP)、0.25mM鳥(niǎo)苷三磷酸(GTP)、16mM磷酸肌酸、0.380mM亞精胺、含代替甲硫氨酸的硒代甲硫氨酸的20種L氨基酸(各0.3mM)、0.05％NP-40等。
另外，所得的蛋白質(zhì)是重氫標(biāo)記蛋白質(zhì)時(shí)，可以使用以下的組成即在上述同樣的現(xiàn)有已知無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系所用的組成中，將要標(biāo)記的天然氨基酸置換成相應(yīng)的重氫標(biāo)記氨基酸，或?qū)? 0種氨基酸全部置換成重氫標(biāo)記氨基酸。
在上述蛋白質(zhì)合成反應(yīng)液中，添加編碼目的蛋白質(zhì)的mRNA，進(jìn)行蛋白質(zhì)的合成?？墒褂糜梢阎椒ㄖ苽涞膍RNA，但是，本發(fā)明中，為了合成作為蛋白質(zhì)合成翻譯模板的mRNA，利用藤構(gòu)建的具有通用性的質(zhì)粒(pUE)(參照?qǐng)D4)。該質(zhì)粒是無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中用作模板的質(zhì)粒，其特征是(1)具有啟動(dòng)子功能的堿基序列；(2)在該序列下游區(qū)至少有以下構(gòu)成的轉(zhuǎn)錄模板的堿基序列苜蓿花葉病毒(AMV)前導(dǎo)序列、存在于煙草花葉病毒(TMV)RNA的5′末端非翻譯序列(5’UTR)的Ω序列、序列表的序列號(hào)1或序列號(hào)2或序列號(hào)3所述的堿基序列、或者與上述序列有70％相同性、而且與存在帽子類(lèi)似物(CAP)結(jié)構(gòu)的mRNA的翻譯起始活性相比，能使其mRNA約有70％以上的翻譯起始活性的堿基序列；(3)在該序列下游的多個(gè)限制性酶切位點(diǎn)；(4)ORF(開(kāi)放讀框)的終止密碼子下游區(qū)設(shè)置至少由500個(gè)以上堿基形成的3′末端非翻譯序列(3′UTR)。由上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄的mRNA中，其5′末端非翻譯序列有AMV前導(dǎo)序列、TMVΩ序列、或序列表的序列號(hào)1或序列號(hào)2、或序列號(hào)3所述的堿基序列，而且有長(zhǎng)的3′末端非翻譯序列，所以該mRNA穩(wěn)定、而且翻譯效率高。序列表的序列號(hào)1或序列號(hào)2、或序列號(hào)3所述的堿基序列是作為5′末端非翻譯序列使用、以AMV前導(dǎo)序列及TMVΩ序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)而得到的多核苷酸。
按該質(zhì)粒的環(huán)狀原樣使用時(shí)，由于在該質(zhì)粒中未插入特定的轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)，因此所合成的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA是各種分子大小的mRNA。在啟動(dòng)子區(qū)的上游，設(shè)置具有規(guī)定轉(zhuǎn)錄終止位置的終止子功能的序列，也可以得到一定分子大小的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。此外，也可以在轉(zhuǎn)錄反應(yīng)之前，用限制酶將該質(zhì)粒切斷，使其開(kāi)環(huán)而作為直鏈型的質(zhì)粒使用。
本發(fā)明中用作翻譯模板的mRNA可以用上述質(zhì)粒制備，也可以用其本身的已知方法制備。
作為穩(wěn)定且翻譯效率高的mRNA，優(yōu)選使用其5′末端的一側(cè)配置上述AMV前導(dǎo)序列、TMVΩ序列、或者下述病毒所具有的5′末端非翻譯序列(5’UTR)的mRNA煙草蝕紋病毒(ETV)[Niepel，M.和Gallie，D.R.(1999)J.Virol.，73，9080-9088][Kawarasaki，Y.，等，(2000)Biotechnol.Prog.，16，517-521]、煙草脈斑病毒、馬鈴薯病毒、梅痘病毒?；蛳率霾《镜?′末端的內(nèi)部核糖體進(jìn)入部位(IRES)序列也可用作上述5′末端非翻譯序列腦心肌炎病毒、泰勒爾鼠腦心肌炎病毒、口蹄疫病毒、典型豬霍亂病毒、牛腹瀉病毒、C型肝炎病毒。
此外，為了構(gòu)建穩(wěn)定、且翻譯效率高的mRNA，其3′末端一側(cè)配置的非翻譯序列可使用例如，蕃茄叢矮病病毒[Wu，B和white，K.D.，(1999)J.Virol.，73，8982-8988]的3′末端非翻譯序列。
還有，已知衛(wèi)星煙草壞死病毒[Timmer，R.，等.，(1993)J.Biol.Chem.268，9504-9510]，以及大麥黃矮病病毒[Guo，L.，等，(2001)Molecular Cell 7，1103-1109]中，通過(guò)5′末端非翻譯序列和3′末端非翻譯序列的相互作用而有效地進(jìn)行翻譯，在目的mRNA的構(gòu)建中，也可使用這些5′末端非翻譯序列和3′末端非翻譯序列。
此外，也可以由隨機(jī)序列的RNA庫(kù)，按照已報(bào)道的文獻(xiàn)[Owens，G.C.，等，(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.98，1471-1476][Venkatesan，A.和Dasgupta，A.，(2001)Mol.Cell.Biol.21，2826-2837]中所述的方法，篩選出具有高翻譯效率功能的序列，該序列也可用于mRNA的構(gòu)建?；蛘撸部蓪⑦@些文獻(xiàn)中所述的堿基序列用作mRNA的5′末端非翻譯序列或3′末端非翻譯序列。
構(gòu)建mRNA時(shí)所用的模板DNA不限于環(huán)狀的質(zhì)粒DNA，也可使用由PCR擴(kuò)增所得的直鏈狀雙鏈DNA。在這種埸合，也可以采用T7RNA聚合酶的啟動(dòng)子作為轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的啟動(dòng)子，隨后是ETV的5′末端非翻譯區(qū)、目的蛋白質(zhì)的基因、以及最后是T7RNA聚合酶的終止子序列，由此配置成的基因用T7RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄，制備mRNA，接著使其在無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中反應(yīng)。
本發(fā)明中的蛋白質(zhì)合成采用由上述方法制備的小麥胚芽提取物和蛋白質(zhì)合成反應(yīng)液，按照無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成法進(jìn)行。有關(guān)無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成，可以按照以前的批式法進(jìn)行。也可以由利用透析法、超濾膜的一體型無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)進(jìn)行，該透析法可以用插入目的基因的上述質(zhì)粒，在同一容器內(nèi)連續(xù)進(jìn)行mRNA合成(轉(zhuǎn)錄)和蛋白質(zhì)合成(翻譯)。以下，對(duì)一體型無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)和批式無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成法進(jìn)行說(shuō)明。
批式無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成法是指，將mRNA合成反應(yīng)所得的mRNA加入無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成反應(yīng)中，通過(guò)從反應(yīng)開(kāi)始至該反應(yīng)結(jié)束的一次性反應(yīng)來(lái)合成蛋白質(zhì)。mRNA可用其已知的合成方法獲得，也可利用上述質(zhì)粒來(lái)合成。蛋白質(zhì)的合成可按照 藤已報(bào)道的有關(guān)利用小麥胚芽提取物的無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成[Endo，Y.等，(1992)J.Biotech.，25，221-230][Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，550-564(2000)]中所述的方法進(jìn)行。
一方面，一體型透析式無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中，將目的基因插入上述質(zhì)粒中，按其環(huán)狀型原樣、或制備成直鏈加入RNA合成反應(yīng)液中，在23～37℃下，預(yù)備反應(yīng)約5分鐘，優(yōu)選在30℃下，反應(yīng)10分鐘。根據(jù)需要，該預(yù)備反應(yīng)步驟也可以省略，但是，該預(yù)備反應(yīng)步驟中，由于RNA聚合酶在模板DNA啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合而進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)錄起始反應(yīng)，使隨后的保溫階段中的mRNA合成量增加，其結(jié)果使翻譯階段中的蛋白質(zhì)合成量增加，因此，進(jìn)行預(yù)備反應(yīng)更為合適。RNA合成反應(yīng)液由以下組分組成模板DNA、4種底物核糖核苷5′-三磷酸、根據(jù)需要還有CPA分子、RNA聚合酶、亞精胺、鎂離子及適當(dāng)?shù)木彌_液等。具體的例子是，例如，可以使用由以下組分組成的RNA合成反應(yīng)液80mMHepes-KOH pH7.6、16mM醋酸鎂、2mM亞精胺、10mM二硫蘇糖醇(DTT)、2.5mM的各種核苷5′-三磷酸[NTP；ATP、GTP、尿苷-5′-三磷酸(UTP)、胞苷5′-三磷酸(CTP)]、核糖核酸酶抑制劑(1,000單位/ml)、質(zhì)粒DNA(50μg/ml)、以及SP6 RNA聚合酶(3,000單位/ml)。應(yīng)說(shuō)明，在合成5′末端含有CAP結(jié)構(gòu)的RNA的場(chǎng)合，該溶液中也可追加5mM的7mGpppG。
然后，將含上述質(zhì)粒的RNA合成反應(yīng)液與上述蛋白質(zhì)合成反應(yīng)液(制備硒代甲硫氨酸標(biāo)記蛋白質(zhì)時(shí)，是添加代替甲硫氨酸的硒代甲硫氨酸的反應(yīng)液，或者制備重氫標(biāo)記蛋白質(zhì)時(shí)，是含有代替天然型氨基酸的重氫標(biāo)記氨基酸的反應(yīng)液)混合。將此混合液移至透析膜管內(nèi)之后，將其浸入裝滿(mǎn)了預(yù)先準(zhǔn)備好的蛋白質(zhì)合成用透析外液(上述添加了代替甲硫氨酸的硒代甲硫氨酸的溶液，或者制備重氫標(biāo)記蛋白質(zhì)時(shí)，是含有代替天然氨基酸的重氫標(biāo)記氨基酸的溶液)的容器中。在30℃、靜置的條件下反應(yīng)約3小時(shí)，首先，主要是合成mRNA。
隨后的步驟是將反應(yīng)溫度降低至26℃，在靜置的條件下，邊透析邊繼續(xù)進(jìn)行反應(yīng)。在該過(guò)程中，透析膜內(nèi)的低分子，特別是與mRNA合成的最適濃度一致而按高濃度設(shè)定的ATP、GTP、鎂離子的濃度隨著透析的進(jìn)行而降低，接近于由蛋白質(zhì)合成反應(yīng)液(上述添加了代替甲硫氨酸的硒代甲硫氨酸的溶液，或者制備重氫標(biāo)記蛋白質(zhì)時(shí)，是含有代替天然氨基酸的重氫標(biāo)記氨基酸的溶液)制成的透析外液的濃度，透析膜內(nèi)的溶液成分幾乎已達(dá)到蛋白質(zhì)合成反應(yīng)的最適濃度。
隨著透析的進(jìn)行，促進(jìn)了蛋白質(zhì)合成反應(yīng)，該反應(yīng)速度達(dá)到最大而使蛋白質(zhì)合成。該無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)反應(yīng)繼續(xù)60小時(shí)以上、合成二氫葉酸還原酶(DHFR)時(shí)，每1ml反應(yīng)容量可得到約4mg的蛋白質(zhì)。
利用透析膜的該系統(tǒng)中，環(huán)狀型、直鏈型中的任何一種質(zhì)粒都可使用。但是，從合成的收率和成本考慮，優(yōu)選使用環(huán)狀型的質(zhì)粒。此外，在促進(jìn)翻譯起始活性的CAP存在、或不存在的任一種條件下，該系統(tǒng)都可能實(shí)施。但是，mRNA合成中使用的CAP本身，對(duì)其與蛋白質(zhì)合成中必要的因子的強(qiáng)結(jié)合有抑制作用，降低了蛋白質(zhì)合成的效率，因此，在CAP不存在的條件下進(jìn)行合成是實(shí)用的。
還有，利用超濾膜，與上述同樣，采用mRNA合成后、繼續(xù)在同一容器內(nèi)進(jìn)行無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的轉(zhuǎn)錄和翻譯一體化的無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)，也可以進(jìn)行蛋白質(zhì)的硒代甲硫氨酸標(biāo)記和含重氫的氨基酸標(biāo)記。
首先，用上述質(zhì)粒作為模板，用配備好超濾膜的旋轉(zhuǎn)柱通過(guò)透析法合成mRNA。合成反應(yīng)是用上述RNA合成反應(yīng)液在30～37℃下進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間根據(jù)所需的RNA合成量而定，但通常大約3～5小時(shí)為好。此外，對(duì)這里所用的旋轉(zhuǎn)柱上配備的超濾膜的分子量界限大小無(wú)特別的限定，只要其孔徑能使合成的RNA與RNA合成所需的底物、合成的副產(chǎn)物等低分子物質(zhì)分離即可，優(yōu)選分子量界限為5,000～100,000的超濾膜。這些膜的孔徑為10～50。
反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)容器旋轉(zhuǎn)柱離心、洗凈，將純化的mRNA收集在膜上。隨后，將含有小麥胚芽提取物的上述無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成液加入同一旋轉(zhuǎn)柱內(nèi)，然后浸入裝滿(mǎn)上述無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成液制成的透析外液(含有含代替甲硫氨酸的硒代甲硫氨酸的20種L型氨基酸、或含代替天然型氨基酸的重氫標(biāo)記氨基酸的20種L型氨基酸)的容器中，在23℃下開(kāi)始無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成反應(yīng)，并在靜置的條件下進(jìn)行反應(yīng)。
由該系統(tǒng)所得的蛋白質(zhì)合成收率與用透析膜的上述系統(tǒng)的收率大致相同。此外，將旋轉(zhuǎn)柱的過(guò)濾器上的mRNA以過(guò)濾器原樣投入上述利用透析膜的系統(tǒng)中的透析管內(nèi)，也可以合成蛋白質(zhì)。還有，本發(fā)明中，對(duì)于含有CPA結(jié)構(gòu)的mRNA，也能完全同樣地在其合成以及精制之后有效地進(jìn)行蛋白質(zhì)合成反應(yīng)。
利用超濾膜的系統(tǒng)中，可采用環(huán)狀型、直鏈型中的任何一種質(zhì)粒，而且在CAP存在、不存在的任何一種條件下，該系統(tǒng)都能夠?qū)嵤?。采?′端有CAP結(jié)構(gòu)的mRNA時(shí)，蛋白質(zhì)合成的收量高，但由直鏈型質(zhì)粒合成的5′端有CAP結(jié)構(gòu)的mRNA與由環(huán)狀型質(zhì)粒在CAP不存在下合成的mRNA相比，兩者的合成量無(wú)太大的差別，從成本考慮，優(yōu)選在CAP不存在下、采用環(huán)狀型質(zhì)粒的合成條件。
上述2種一體型無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)都是首先進(jìn)行mRNA合成，然后在同一反應(yīng)容器內(nèi)繼續(xù)進(jìn)行蛋白質(zhì)合成的連續(xù)式系統(tǒng)，是轉(zhuǎn)錄、翻譯非共軛的系統(tǒng)。在這些系統(tǒng)中，至少對(duì)于選自下述的1種或2種以上的因素而言，也可以引進(jìn)在反應(yīng)開(kāi)始后，在必要時(shí)追加、或連續(xù)追加的添加手段，這些因素是蛋白質(zhì)合成的翻譯模板mRNA、能量再生系統(tǒng)的酶、底物(含有代替甲硫氨酸的硒代甲硫氨酸的20種L型氨基酸、或含有代替天然型氨基酸的重氫標(biāo)記氨基酸的20種L型氨基酸)、以及能源。這些因素可以按極少的量連續(xù)地添加、也可以隔一定的時(shí)間添加。另外，在這些系統(tǒng)中，為了維持其合成反應(yīng)的效率，也可以引入在該合成反應(yīng)開(kāi)始后，在反應(yīng)過(guò)程中對(duì)上述無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成反應(yīng)中必要的物質(zhì)進(jìn)行交換的處理。例如，也可以引進(jìn)將無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成反應(yīng)液(含有代替甲硫氨酸的硒代甲硫氨酸的20種L型氨基酸、或含有代替天然氨基酸的重氫標(biāo)記氨基酸的20種L型氨基酸)制成的透析外液的所需量，連續(xù)或不連續(xù)地交換的手段。
還有，為了追加添加、或交換上述無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成反應(yīng)中的必要物質(zhì)，這些系統(tǒng)也可以具備保存必要物質(zhì)的手段。此外還有，這些系統(tǒng)也可以具備除去該合成反應(yīng)中無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成反應(yīng)副產(chǎn)物的排出手段。也可以選擇1種或2種以上用于必要物質(zhì)、副產(chǎn)物的追加、保存、交換、和/或排出的手段，組合起來(lái)引入。
此外，這些系統(tǒng)的反應(yīng)容器內(nèi)的反應(yīng)液所接觸的表面中，如果至少在與透析手段或分子篩手段有關(guān)的表面上，例如透析膜或超濾膜上，預(yù)先施予蛋白質(zhì)涂層，可進(jìn)一步提高蛋白質(zhì)合成的效率。亦即，通過(guò)用蛋白質(zhì)的涂層處理，可以使mRNA的轉(zhuǎn)錄效率、以及在其后發(fā)生的蛋白質(zhì)翻譯效率提高。用作涂層的蛋白質(zhì)例如有白蛋白，但不一定限于白蛋白。另外，用于涂層的蛋白質(zhì)不必特別固定在與透析手段或分子篩手段有關(guān)的表面，用含蛋白質(zhì)的溶液洗數(shù)次也有效果。該方法簡(jiǎn)便且令人滿(mǎn)意，但不限于這種方法。例如，用白蛋白在透析膜上制備涂層的場(chǎng)合，用水和白蛋白的混合溶液作為內(nèi)液、用水作為外液透析數(shù)小時(shí)即可。當(dāng)然，內(nèi)液和外液的組成也可以互換。對(duì)含有用作涂層的蛋白質(zhì)溶液的濃度無(wú)特別的限定，但溶解飽和濃度已足夠，低于此濃度也可以。
還有，本發(fā)明中，用小麥胚芽提取物進(jìn)行上述的一體型或批式無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的場(chǎng)合，優(yōu)選在不攪拌反應(yīng)液的靜置條件下進(jìn)行蛋白質(zhì)合成反應(yīng)。
由采用小麥胚芽提取物的無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成法，進(jìn)行綠色螢光蛋白質(zhì)(GFP)和二氫葉酸還原酶(DHFR)的硒代甲硫氨酸標(biāo)記。
小麥胚芽提取物的制備和用該小麥胚芽提取物的無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成法按照已報(bào)導(dǎo)的文獻(xiàn)(Endo，Y.等，(1992)J.Biotech.，25，221～230)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)，97，559～564)進(jìn)行。
首先，用改進(jìn)的Johnston等的方法(Johnston，F(xiàn).B.等(1957)Nature，179，160～161)獲得小麥胚芽。先將北海道產(chǎn)的氣候枯(チホク)小麥種子(未消毒)按每1分鐘100g的比例加入碾磨機(jī)(RotorSpeed Mill pulverisette 14型Fritsch公司生產(chǎn))中，在8,000rpm下溫和地破碎。將此破碎物在6,000rpm下再次破碎，通過(guò)篩分獲得粗胚芽級(jí)分(篩孔大小0.71mm～1.00mm)后，用聚乙烯板等帶靜電的帶電體吸附，除去混入該胚芽級(jí)分內(nèi)的種皮等雜質(zhì)。
再用篩和帶靜電的帶電體，將胚芽粒子分為小粒(0.71mm～0.85mm)、中粒(0.85mm～1mm)、輕粒(0.85mm～1mm，且重量輕)3個(gè)級(jí)分，最后用肉眼進(jìn)行分辨，采集黃色的胚芽。小粒級(jí)分表現(xiàn)出最高的蛋白質(zhì)合成活性。根據(jù)推測(cè)，輕粒是在種子破碎時(shí)，胚芽上產(chǎn)生的小傷胚芽在浮選操作中破壞的粒子。然后，用上述所得的黃色胚芽制成試樣，為了完全除去該試樣中的小麥胚乳成分，將所得的小麥胚芽放入收集器內(nèi)，用冷蒸餾水(DDW)冷卻并洗凈，然后懸浮于0.5％的非離子表面活性劑NP-40溶液中，用超聲波洗凈器反復(fù)洗凈，直至洗凈液變白濁。在蒸餾水存在下，再經(jīng)過(guò)1次超聲波洗凈后，通過(guò)吸濾收集小麥胚芽，用冷蒸餾水(DDW)洗凈數(shù)次，將小麥胚芽純化。如此純化的小麥胚芽是基本上除去小麥胚芽?jī)?nèi)夾雜的內(nèi)因性蛋白質(zhì)合成抑制因子、小麥糖、硫堇、以及核糖核酸酶等的物質(zhì)，亦即基本上不夾雜胚乳成分的物質(zhì)。
小麥胚芽提取物的制備按常規(guī)方法(Erickson，A.H.等，(1996)Methods in Enzymol.，96，38-50)進(jìn)行。以下的操作在4℃下進(jìn)行。將上述純化的小麥胚芽用液氮冷凍后在研缽中研碎，每1mg所得的粉體中，加入1ml部分改變的帕他松(バタ-ソン)等的方法中的抽提液(含有80mM Hepes-KOH，pH7.8、200mM醋酸鉀、2mM醋酸鎂、4mM氯化鈣、8mM二硫蘇糖醇、除甲硫氨酸以外的19種L型氨基酸各0.6mM、蛋白分解酶抑制劑FUT、E-64和PMSF各1μM)，小心攪拌，使其不產(chǎn)生泡沫。然后在30,000g下離心15分鐘，回收上清作為胚芽提取物，在預(yù)先用溶液(40mM Hepes-KOH，pH7.8、100mM醋酸鉀、5mM醋酸鎂、4mM二硫蘇糖醇、除甲硫氨酸以外的19種L型氨基酸中補(bǔ)充了硒代甲硫氨酸的20種氨基酸)平衡好的Sephadex G-25柱(Coarse)上進(jìn)行凝膠過(guò)濾?；蛘撸靡郧八玫暮?0種氨基酸的溶液代替上述的抽提液，與上述同樣地制備胚芽提取物。在這種場(chǎng)合下，凝膠過(guò)濾柱預(yù)先用含有除甲硫氨酸外的19種氨基酸的凝膠過(guò)濾溶液平衡，再進(jìn)行凝膠過(guò)濾操作，然后在所得過(guò)不含甲硫氨酸的小麥胚芽提取物中補(bǔ)足硒代甲硫氨酸、制備小麥胚芽提取物。試樣的濃度調(diào)整至170～250A260nm(A260/A280＝1.5)。
所用的蛋白質(zhì)合成反應(yīng)液由以下組分組成24％容積的小麥胚芽提出液(濃度為200 A260nm單位/ml)、1,000單位/ml核糖核酸酶抑制劑(RNAsin)、30mMHepes-K0H，pH7.6、95mM醋酸鉀、2.65mM醋酸鎂、2.85mM二硫蘇糖醇、0.5mg/ml肌酸激酶、1.2mM ATP、0.25mM GTP、16mM磷酸肌酸、0.380mM亞精胺、含有代替甲硫氨酸的硒代甲硫氨酸的20種L型氨基酸(各0.3mM)、0.05％NP-40。
gfpmRNA或dhfrmRNA合成用的質(zhì)粒按以下方法構(gòu)建而成以質(zhì)粒pPSP65為基礎(chǔ)，插入SP6或T7啟動(dòng)子等的RNA聚合酶結(jié)合的堿基序列，在其下游插入具有mRNA的翻譯起始重要功能的AMVΩ序列的轉(zhuǎn)錄模板堿基序列，在此序列下游再引入gfp基因或dhfr基因，在3′末端插入編碼gfp或dhfr基因來(lái)源的3’UTR和聚(A)100的序列(圖4)。用限制酶HindIII，在導(dǎo)入該質(zhì)粒聚(A)下游的限制酶位點(diǎn)(HindIII位點(diǎn))將其切斷開(kāi)環(huán)，作為直鏈型質(zhì)粒DNA使用。
為了由上述直鏈型質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄mRNA，反應(yīng)容器的底部采用由透析膜制成的微型旋轉(zhuǎn)柱(Amicon公司生產(chǎn)，YM-10)。將含有上述直鏈型質(zhì)粒DNA的RNA合成反應(yīng)液{80mM Hepes-KOH，pH7.6、16mM醋酸鎂、2mM亞精胺、10mM二硫蘇糖醇(DTT)、核苷5′-3三磷酸[NTP；ATP、GTP、尿苷-5′-3三磷酸(UTP)、胞苷5′-3三磷酸(CTP)]各2.5mM、核糖核酸酶抑制劑(1,000單位/ml)、質(zhì)粒DNA(50μg/ml)、SP6RNA聚合酶(3,000單位/ml)}在37℃下保溫2小時(shí)，合成mRNA。還要說(shuō)明，YM-10用牛血清白蛋白做涂層處理后使用。
反應(yīng)結(jié)束后，將此反應(yīng)器(微型旋轉(zhuǎn)柱)離心處理。通過(guò)理心處理，使溶液中的核苷三磷酸、CAP等底物、副產(chǎn)物吡咯啉酸、離子、以及緩沖液等低分子通過(guò)濾孔除去、合成的mRNA等高分子留在過(guò)濾器上。溶液中加入水，反復(fù)上述的操作數(shù)次，完全除去合成的mRNA級(jí)分中的吡咯啉酸等低分子蛋白質(zhì)合成抑制物，將合成的mRNA收集在過(guò)濾器上。還有，該純化操作中，模板DNA不能除去而殘留在過(guò)濾器上，但未呈現(xiàn)出對(duì)翻譯反應(yīng)的抑制作用。
mRNA可從收集該mRNA的過(guò)濾器以水溶液的形式回收，或照原樣收集在過(guò)濾器上用于無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系中。
將由此所得的mRNA加入上述無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成反應(yīng)液中，進(jìn)行批式或一體型無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的蛋白質(zhì)合成。mRNA作為水溶液回收而使用時(shí)，將mRNA加入上述蛋白質(zhì)合成反應(yīng)液中，并使其濃度為0.2μM。蛋白質(zhì)合成反應(yīng)、亦即翻譯反應(yīng)在26℃、靜置的反應(yīng)條件下進(jìn)行。
關(guān)于批式無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成法的GFP和DHFR的合成量，通過(guò)放射性同位素在三氯乙酸不溶級(jí)分中的摻入量來(lái)測(cè)定，再進(jìn)一步用放射自顯影分析合成的蛋白質(zhì)。
用透析法大量合成的蛋白質(zhì)用SDS-聚丙烯酰胺電泳法和考馬斯亮藍(lán)(CCB)染色法分析[Endo，Y.等，(1992)J.Biotenol，25，221-230][Proc.Natl.Acad.Sci.USA.97，559～564(2000)]。
GPT的精制以及通過(guò)螢光分光光度計(jì)的發(fā)光光譜分析的活性測(cè)定按Deschamps等的方法[Deschamps，J.R.等，(1995)ProteinExpression and Purification，6，555-558]進(jìn)行。發(fā)光光譜的測(cè)定采用島津RF-5000型螢光光度計(jì)。DHER的活性用Stanley等的方法[Methods.Enzymol.18，195-199(1971)]測(cè)定。
其結(jié)果如下所示。


圖1表示將甲硫氨酸置換為硒代甲硫氨酸的蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中，用批式法合成GFP和DHFR時(shí)每種蛋白的合成量(A)、以及每種合成產(chǎn)物的放射自顯影分析結(jié)果[(B)和(C)]。圖1的(B)和(C)分別表示有關(guān)GFP和DHFR的結(jié)果；圖中的Met(甲硫氨酸)是指天然型的蛋白質(zhì)、Se-met(硒代甲硫氨酸)是指硒代甲硫氨酸蛋白質(zhì)。正如由放射自顯影所知，含硒代甲硫氨酸的GFP和含硒代甲硫氨酸的DHFR的電泳遷移率與其各自含甲硫氨酸的天然型蛋白質(zhì)的相同。此外，由蛋白質(zhì)隨時(shí)間而變濃的結(jié)果可知，其合成量隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)而增加。如由圖1的(A)所示可知，在甲硫氨酸置換為硒代甲硫氨酸的合成反應(yīng)系統(tǒng)方面，雖然可看到含硒代甲硫氨酸GTP合成(●—●)的合成量比對(duì)照的天然型GFP合成(○—○)約低20-25％，但是含硒代甲硫氨酸GFP的合成效率高。關(guān)于含硒代甲硫氨酸DHFR合成(■—■)和天然型DHFR合成(□—□)也得到同樣的結(jié)果。
一方面，在不含甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸的反應(yīng)系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)中，合成反應(yīng)在1小時(shí)后完全停止(○--○)。在該時(shí)間內(nèi)合成的GFP，相當(dāng)于硒代甲硫氨酸存在下，4小時(shí)批式反應(yīng)所合成的含硒代甲硫氨酸GFP量的約12％。這種現(xiàn)象表明，用凝膠過(guò)濾操作未能除去而殘存于胚芽提取物中的甲硫氨酸，在反應(yīng)開(kāi)始后的1小時(shí)內(nèi)被用于蛋白質(zhì)合成中的結(jié)果。這種現(xiàn)象還表明，在硒代甲硫氨酸存在下批式合成的GFP中，有12％的量是含甲硫氨酸的GFP、88％是含硒代甲硫氨酸的GFP。如下面所述，透析式無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的大量合成方面，由于含硒代甲硫氨酸GFP的合成是連續(xù)的，隨著其含量的增加，天然型GFP混入量的比例降低，實(shí)際上成為可忽略的微量。在用DHFR基因作為模板的含硒代甲硫氨酸DHFR合成方面，也可證實(shí)同樣的看法[圖1的(A)](□--□)。
然后，用一體型透析式無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成法進(jìn)行含硒代甲硫氨酸GFP和含硒代甲硫氨酸DHFR的大量合成、并由此反應(yīng)液將蛋白質(zhì)精制。圖2是用上述方法經(jīng)48小時(shí)反應(yīng)合成并精制的GFP(A)和DHFR(B)的各自的天然型(泳道2和3)蛋白質(zhì)、以及含硒代甲硫氨酸蛋白質(zhì)(泳道4和5)的SDS-丙烯酰胺凝膠電泳圖。圖中的箭頭指示每種蛋白質(zhì)的條帶。由圖2可知，天然型蛋白質(zhì)和含硒代甲硫氨酸的蛋白質(zhì)都依賴(lài)于添加的模板而有效地合成。泳道1是作為對(duì)照、在模板不存在下反應(yīng)所得反應(yīng)液的電泳帶型。由于GFP、DHFR用一體型透析式無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成法的合成效率都很高，所以反應(yīng)液中這些產(chǎn)物含量也高，可以按照常規(guī)方法簡(jiǎn)便地精制(泳道3和4)。圖2(B)所示的DHFR例子中，用氨甲喋呤為配體的親和層析法精制時(shí)，通過(guò)1次層析操作，可以制備出純度接近100％的天然DHFR和含有硒代甲硫氨酸DHFR的試樣(泳道3和4)。
泳道3和4所示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，含硒代甲硫氨酸的DHFR對(duì)配體氨甲喋呤與天然型的DHFR有同樣強(qiáng)的親和性。可以認(rèn)為，該同祥的親和性意味著合成的含硒代甲硫氨酸的DHFR與天然型DHFR有相同的酶活性。
更重要的是，用一體型透析式無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成法，按上述那樣所得的合成蛋白質(zhì)中，硒代甲硫氨酸的含量非常高。換言之，所得的含硒代甲硫氨酸的非天然型蛋白質(zhì)是高純度的蛋白質(zhì)。根據(jù)圖1所示的硒代甲硫氨酸存在下，反應(yīng)4小時(shí)后所合成的GFP和DHFR中的硒代甲硫氨酸的含量、以及甲硫氨酸與硒代甲硫氨酸不存在下的合成動(dòng)力學(xué)結(jié)果，可以計(jì)算出硒代甲硫氨酸的含量。在批式反應(yīng)4小時(shí)后所合成的GFP和DHFR蛋白質(zhì)量分別是每1ml反應(yīng)液0.4mg和0.45mg；由于這些蛋白質(zhì)的甲硫氨酸殘基中，至少約80％是硒代甲硫氨酸(含甲硫氨酸蛋白質(zhì)的比例最大約為20％)，所以，可計(jì)算出，含甲硫氨酸GFP的量為0.08mg、含甲硫氨酸DHFR的量為0.09mg。一方面，用一體型透析式無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)時(shí)，48小時(shí)反應(yīng)后的GFP和DHFR合成量分別為2.8mg和3.1mg。亦即，用一體型透析式無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)大量制備的含硒代甲硫氨酸蛋白質(zhì)的純度，若按上述方法計(jì)算，GFP和DHFR均為97.1％。
由此，與以前使用的方法相比，按照本發(fā)明的硒代甲硫氨酸導(dǎo)入蛋白質(zhì)的導(dǎo)入率要高得多。以前利用的硒代甲硫氨酸導(dǎo)入蛋白質(zhì)的導(dǎo)入法是將大腸桿菌進(jìn)行大量培養(yǎng)，但已報(bào)道的該導(dǎo)入率最大只有53％[Huber，R.E.等，(1967)Biochim.Biophys.Acta，141，587-599]。
因此，本發(fā)明的非天然型氨基酸導(dǎo)入法與以前的方法比較，是非常優(yōu)良的。
接著，對(duì)精制的這些含硒代甲硫氨酸蛋白質(zhì)的酶學(xué)性質(zhì)從生物化學(xué)上進(jìn)行研究。在410nm-600nm的范圍，測(cè)定圖2所示的一定濃度的精制GFP標(biāo)品在395nm激發(fā)時(shí)的熒光發(fā)光光譜，其結(jié)果示于圖3。由圖3可知，天然型的含甲硫氨酸GFP[圖3的(A)]和含硒代甲硫氨酸GFP[圖3的(B)]的熒光發(fā)光光譜未見(jiàn)有差別。亦即，可以說(shuō)，甲硫氨酸殘基置換為硒代甲硫氨酸的GFP其活性的變化在通常的測(cè)定感度之下。
此外，DHFR的酶學(xué)性質(zhì)的研究結(jié)果歸納在表1中。由表1可知，表示天然型的含甲硫氨酸DHFR(Met-DHFR)和含硒代甲硫氨酸DHFR(SeMet-DHFR)的酶化學(xué)性質(zhì)的參數(shù)，即對(duì)還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NADPH的米氏常數(shù)Km和最大速度Vmax，兩種酶間都未見(jiàn)有差別。亦即，甲硫氨酸殘基置換為硒代甲硫氨酸的DHFR保持了與天然型DHFR相同的酶活性。
表1

然后，進(jìn)行質(zhì)量分析，其目的是確認(rèn)蛋白質(zhì)合成時(shí)，硒代甲硫氨酸進(jìn)入mRNA上的甲硫氨酸密碼子指示部位，亦即在蛋白質(zhì)分子中本來(lái)是甲硫氨酸殘基的部位，導(dǎo)入了硒代甲硫氨酸。由天然蛋白質(zhì)(對(duì)照)和含硒代甲硫氨酸蛋白質(zhì)的質(zhì)量差，可確定含硒代甲硫氨酸的GFP含有5.9個(gè)原子硒、另外，含硒代甲硫氨酸的DHFR含有4.8原子硒。這些測(cè)定值，與GFP和DHFR的甲硫氨酸殘基數(shù)分別為6個(gè)和5個(gè)的事實(shí)非常一致。進(jìn)一步由質(zhì)量分析的分布可知，在這些含硒代甲硫氨酸的蛋白質(zhì)中所含的非標(biāo)記蛋白質(zhì)雜質(zhì)的比例約為2％～4％，該值與由圖1和2的實(shí)驗(yàn)值所得的計(jì)算值非常一致。
以上事實(shí)表明，本發(fā)明的含硒代甲硫氨酸蛋白質(zhì)，可以高效率地合成、且維持其原有的蛋白質(zhì)活性。該事實(shí)表明，上述小麥胚芽無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成反應(yīng)中，與甲硫氨酸t(yī)RNA的合成、40S核糖體亞粒子和翻譯起始氨?；鵷RNA(甲硫氨酸t(yī)RNA)復(fù)合體形成、肽鏈伸長(zhǎng)反應(yīng)、以及翻譯終止反應(yīng)有關(guān)的因子群中，無(wú)論哪種因子，對(duì)硒代甲硫氨酸的識(shí)別都與對(duì)甲硫氨酸一樣，保持其使該氨基酸類(lèi)似化合物進(jìn)入蛋白質(zhì)中的性質(zhì)。
小麥胚芽采用由實(shí)施例1所述的方法制備的基本上不夾雜胚乳成分的原料。同時(shí)，小麥胚芽提取物的制備按照與實(shí)施例1完全相同的方法進(jìn)行。但是，抽提用溶液和凝膠過(guò)濾所使用的溶液中，含有重氫標(biāo)記的20種L型氨基酸，以代替含硒代甲硫氨酸的20種氨基酸。所制備的提取物的濃度調(diào)整至170-250A260nm(A260/A280＝1.5)。
蛋白質(zhì)合成反應(yīng)液的組成與實(shí)施例1所述的相同，但含有重氫標(biāo)記的20種L型氨基酸，以代替含硒代甲硫氨酸的20種氨基酸。
二氫葉酸還原酶(DHFR)的合成所用的質(zhì)粒、mRNA的合成方法、蛋白質(zhì)合成方法、以及合成的蛋白質(zhì)的分析，同樣按實(shí)施例1所述的方法進(jìn)行。
其結(jié)果如以下所示。
圖5表示一體型透析式無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中，20種L型天然型氨基酸全部置換為重氫標(biāo)記氨基酸的DHFR的合成量。在反應(yīng)開(kāi)始后的第0、12、24、48小時(shí)，分別取1μl反應(yīng)液，通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、并進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)(CBB)染色、檢測(cè)反應(yīng)液中的蛋白質(zhì)。圖中，箭頭表示生成的DHFR條帶。用光密度計(jì)測(cè)定該條帶的染色強(qiáng)度時(shí)，DHFR的合成隨時(shí)間而大致直線地進(jìn)行，進(jìn)一步搞清了重氫標(biāo)記的DHFR合成量與天然型DHFR合成量之間未見(jiàn)有差別。
由此可以認(rèn)為，采用小麥胚芽無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的本發(fā)明的方法是有效的重氫標(biāo)記蛋白質(zhì)合成方法。合成反應(yīng)進(jìn)行48小時(shí)后，用氨甲喋呤柱精制的重氫標(biāo)記的DHFR收量為3.5mg。此外，從擴(kuò)大的電泳圖(實(shí)線部分)、以及精制品的電泳圖可確認(rèn)，電泳中的重氫標(biāo)記DHFR的遷移率也比天然DHFR稍有降低?？梢哉J(rèn)為，這種所看到重氫標(biāo)記DHFR在SDS-聚丙烯酰胺凝膠上的遷移率降低現(xiàn)象起因于質(zhì)量數(shù)的增加、直接地表明合成了含重氫的DHFR。
其次，與實(shí)施例1同樣，從生物化學(xué)方面研究精制的重氫標(biāo)記的DHFR的酶學(xué)性質(zhì)。由表2可知，表示天然型的DHFR和重氫標(biāo)記DHFR的酶化學(xué)性質(zhì)的參數(shù)，即對(duì)還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NADPH的米氏常數(shù)Km和最大速度Vmax，兩種酶間都未見(jiàn)有差別。亦即，明確了由重氫標(biāo)記氨基酸制成的DHFR保持了與天然型DHFR大致相同的酶活性。
表2

由以上的結(jié)果可以確定，本發(fā)明的含有20種L型重氫標(biāo)記氨基酸的蛋白質(zhì)，可以高效率地合成、且維持其原有的蛋白質(zhì)活性。
工業(yè)上的利用可能性根據(jù)本發(fā)明的標(biāo)記蛋白質(zhì)的方法，可以高效率地制備出高純度的標(biāo)記蛋白質(zhì)。因此，利用無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的本發(fā)明的標(biāo)記蛋白質(zhì)的制備方法，可以用于制備X線分析中所用的結(jié)晶樣品。此外，這里所述的標(biāo)記方法同樣可以用于制備含重氫的蛋白質(zhì)、該方法還可作為將任意一種氨基酸用其對(duì)應(yīng)的同位素標(biāo)記氨基酸等標(biāo)記的一般手段。
更重要的方面是，不僅是重氫、而且在13C、15N等的同位素標(biāo)記蛋白質(zhì)的制備方面也有效、并可期待廣泛用于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析中。
如上述那樣本發(fā)明的標(biāo)記蛋白質(zhì)的制造方法可于以下方面蛋白質(zhì)的X線結(jié)晶分析、核磁共振分析、以及中子衍射法等的高次結(jié)構(gòu)分析用試樣的制備、或利用同位素效果的蛋白質(zhì)的催化機(jī)制的解釋等。
序列表說(shuō)明序列號(hào)1設(shè)計(jì)用作5′非翻譯區(qū)的多核苷酸序列號(hào)2設(shè)計(jì)用作5′非翻譯區(qū)的多核苷酸序列號(hào)3設(shè)計(jì)用作5′非翻譯區(qū)的多核苷酸序列表<110> 遠(yuǎn)藤?gòu)浿靥?dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所和和研藥株式會(huì)社<120> 應(yīng)用小麥胚芽無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)標(biāo)記蛋白質(zhì)的一般方法<130> GP01-1018<140><141><150> JP P2000-220127<151> 2000-07-21<150> JP P2000-306119<151> 2000-10-05<160> 3<170> PatentIn Ver.2.1<210> 1<211> 34<212> RNA<213> 人工合成序列<220><223> 人工合成序列的說(shuō)明設(shè)計(jì)用作5′端非翻譯區(qū)的多核苷酸<400> 1gaacaauuac cauacauuuu acauuacaac uaca 34<210> 2<211> 29<212> RNA<213> 人工合成序列<220><223> 人工合成序列的說(shuō)明設(shè)計(jì)用作5′非翻譯區(qū)的多核苷酸<400> 2gaacaacaac aacaacaaac aacaacaaa 29<210> 3<211> 15<212> RNA<213> 人工合成序列<220><223> 人工合成序列的說(shuō)明設(shè)計(jì)用作5′非翻譯區(qū)的多核苷酸<400> 3ggacaacaac aacaa 1權(quán)利要求
1.硒代甲硫氨酸標(biāo)記蛋白質(zhì)的制造方法，其特征在于，從小麥胚芽提取物中完全除去混入該胚芽提取物的胚乳，將所得的無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成用的細(xì)胞提取物中的甲硫氨酸變?yōu)槲琢虬彼岷?，使用含有代替甲硫氨酸的硒代甲硫氨酸的蛋白質(zhì)合成反應(yīng)液組成、在批式條件下、或透析條件下，進(jìn)行無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成。
2.用權(quán)利要求1所述的制造方法所得的硒代甲硫氨酸標(biāo)記蛋白質(zhì)。
3.含有重氫氨基酸標(biāo)記蛋白質(zhì)的制造方法，其特征在于，從小麥胚芽提取物中完全除去混入該胚芽提取物的胚乳，將所得的無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成用的細(xì)胞提取物中的天然型氨基酸變?yōu)橹貧錁?biāo)記氨基酸后，使用含有代替天然型氨基酸的重氫標(biāo)記氨基酸的蛋白質(zhì)合成反應(yīng)液組成、在批式條件下、或透析條件下，進(jìn)行無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成。
4.用權(quán)利要求3所述的制造方法所得的含重氫氨基酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)。
全文摘要
提供硒代甲硫氨酸標(biāo)記蛋白質(zhì)的制造方法以及用該方法制造的蛋白質(zhì)，其特征在于利用小麥胚芽無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)，從小麥胚芽提取物中完全除去混入該胚芽提取物的胚乳，將所得的無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成用的細(xì)胞提取物中的甲硫氨酸變?yōu)槲琢虬彼岷?，使用含有代替甲硫氨酸的硒代甲硫氨酸的蛋白質(zhì)合成反應(yīng)液組成、在批式條件下、或透析條件下，進(jìn)行無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成。進(jìn)一步用同樣的手法，提供重氫標(biāo)記的蛋白質(zhì)的制造方法和該方法制造的蛋白質(zhì)。
文檔編號(hào)C12N15/10GK1471585SQ01813171
公開(kāi)日2004年1月28日 申請(qǐng)日期2001年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月21日
發(fā)明者遠(yuǎn)藤?gòu)浿靥? P·庫(kù)馬, 西川茂道, 道 申請(qǐng)人:獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所, 和研藥株式會(huì)社, 遠(yuǎn)藤?gòu)浿靥?br>