專利名稱：一種突變的hpv16 e7基因的克隆、表達與蛋白純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因克隆表達技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種突變的HPV16 E7基因的克隆、 表達與蛋白純化方法。
背景技術(shù)：
宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，發(fā)病率位于女性腫瘤的第二位，僅排在乳腺癌之后，每年全球大約有50萬例新發(fā)宮頸癌病例，約20萬人死于宮頸癌，在一些發(fā)展中國家甚至已居于女性癌癥死亡率首位。分子流行病學的研究已經(jīng)證實人乳頭瘤病毒 (humanpapi 1 lomavirus,HPV)感染與宮頸癌有著十分密切的關(guān)系。HPV高危型(HPV16，18， 31，45型等)的感染是導致宮頸癌發(fā)生和發(fā)展的重要原因，宮頸癌中HPV DNA的檢出率高達 99%，其中HPV16約為60%。因此，HPV疫苗用于預防和治療宮頸癌已成為近年來的研究熱點。盡管HPV預防性疫苗已經(jīng)問世，但是面對眾多已感染HPV且出現(xiàn)病變的患者，預防性疫苗作用不大。HPV16兩個早期基因E6、E7的表達產(chǎn)物E6、E7蛋白在腫瘤發(fā)生、細胞周期調(diào)控及凋亡調(diào)節(jié)中起重要作用，是宮頸癌發(fā)生的主要原因，在癌細胞中持續(xù)表達，也被稱為E6、E7 癌蛋白。因此E6和E7蛋白可以作為HPV16相關(guān)腫瘤治療性疫苗的理想靶抗原，相繼也出現(xiàn)了以E6、E7為免疫抗原不同形式的疫苗。由于蛋白質(zhì)疫苗既不受HLA限制性，又避免了病毒載體或DNA疫苗潛在的安全隱患，是目前公認最安全、有效的疫苗。有報道，E6、E7蛋白的突變體可以避免或降低其轉(zhuǎn)化活性。E7蛋白的第2位His、M位Cys以及兩個模序 Cys-X-X-Cys (分別為58_61和91_94)結(jié)構(gòu)是其轉(zhuǎn)化活性的關(guān)鍵部位，將M位Cys轉(zhuǎn)變?yōu)?Gly可以完全消除E7蛋白的轉(zhuǎn)化活性，而將2位His轉(zhuǎn)變?yōu)镚ly、61或94為Cys轉(zhuǎn)變?yōu)镚ly 也可以大大降低蛋白的轉(zhuǎn)化活性，因此克隆表達E6、E7蛋白的突變體將能夠進一步提高疫苗的安全性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的問題是為進一步改進了宮頸癌治療性疫苗的安全性而克隆、表達并分離純化突變的HPV16 E7蛋白質(zhì)的方法。本發(fā)明是關(guān)于一種突變的HPV16 E7基因(mutant E7，mE7)的克隆、表達與蛋白純化方法。主要由以下內(nèi)容組成1.重組克隆載體TA-mE7的構(gòu)建(l)HPV16mE7 的引物設計以pET28a(+)_E7為模板，通過拼接PCR擴增mE7，引入E7基因第70位堿基突變(T — G)，去除終止密碼子之前的15bp，設計出4條引物mE7pl、mE7p2、mE7pl-G-3，、 mE7p2-G-5，。上游弓丨物mE7pl含有內(nèi)切酶位點Nde I，下游弓丨物mE7p2含有內(nèi)切酶位點Hind III，引入突變位點的弓I物分另Ij為mE7p 1-G-3，，mE7p2-G_5，。
3
mE7pl :5，-CGCATATGGCTAGCATGACTGGTGGA-3， mE7p1-G-3， 5，-TAATTGCTCATAACCGTAGAGATCAGTTG-3，mE7p2-G-5， 5， -CAACTGATCTCTACGGTTATGAGCAATT-3，mE7p2 :5， -CGAAGCTTTTAGATGGGGCACACAATTC-3‘(2)拼接PCR擴增HPV16mE7基因片段以pET28a(+)_E7為模板，通過拼接PCR擴增mE7基因片段，先擴增Nde I與E7基因第84堿基中間的片段(13^p，稱為Nde I_E784)和E7基因第56-297位堿基序列(稱為 E756_297)。PCR反應體系(Pyrobest 酶)41. 25 μ L無菌水，5 μ L IOXbuffer (含MgCl2)，1 μ L IOmM dNTPs,1 μ L mE7pl/mE7pl-G_3，，1 μ L mE7p2-G_5，/mE7p2，0· 5 μ L pET28a(+)-E7， 0.25 μ L Pyrobest酶，混勻后立即進行擴增。反應條件為94°C預變性!Min ；然后進行以下 35 個循環(huán):94°C 45s, 56°C lmin，72°C 45s ；最后在 72°C延伸 3min。上述PCR產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠90V恒壓電泳20min，切膠后用膠回收試劑盒回收目的片段，再拼接PCR擴增Nde I-mE7序列。PCR反應體系(Pyrobest酶):39. 75 μ L無菌水，5口1^10父1311打61~(含]\%(12)，1口1^ IOmM dNTPs, 1 μ L mE7pl, 1 μ L mE7p2,1 μ L Nde I-E784，1 μ L E756_297，0.25 μ L Pyrobest酶，混勻后立即進行擴增。反應條件為94°C預變性 3min ；然后進行以下；35 個循環(huán)94°C 45s, 56°C lmin，72°C 45s ；最后在 72°C延伸!3min。瓊脂糖凝膠電泳、膠回收DNA片段，為便于用Taq酶延伸加A，膠回收的洗脫緩沖液使用含MgCl2的Taq酶緩沖液。用25 μ L膠回收洗脫緩沖液洗脫PCR擴增的DNA片段。取 13. 7μ L的膠回收洗脫液，加入1. 2μ L IOmM dNTP和0. IyL Taq酶，72°C延伸6min，PCR產(chǎn)物延伸A。(3) TA克隆連接取IyL PMD18-T載體，加入2yL延伸過A的mE7片段，再加入5yL的連接緩沖液，2 μ L無菌水補足至1(^1^體系，于161連接2hr。(4) TA克隆轉(zhuǎn)化將上述TA連接產(chǎn)物10 μ L轉(zhuǎn)移到DH5 α感受態(tài)細胞中；冰上靜置30min ；42°C熱激 90s ；冰上再靜置 5min ；加入 800 μ L LB, 37°C搖床 120rpm 搖 Ihr ；4000rpm 離心 3min ；在超凈臺中移去大部分上清，輕懸沉淀，涂布于含50 μ g/mL氨芐青霉素(Amp)的LB平板中； LB平板倒置于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。(5) TA克隆的鑒定隨機挑取4個TA陽性克隆，接入4mL LB (Amp+)中；37°C搖床220rpm搖過夜；抽提質(zhì)粒TA-mE7，保存于_80°C，并進行雙酶切和PCR鑒定。選取雙酶切和PCR都為陽性的TA 克隆質(zhì)粒測序。2.重組表達質(zhì)粒pET_28a (+) ~mE7的構(gòu)建(1)酶切與回收mE7基因序列中有EcoR I酶切位點(E7上游引物中引入)，用EcoR I/Hind III 雙酶切TA-mE7及pET48a(+)質(zhì)粒，用1 %瓊脂糖凝膠電泳，膠回收目標片段。(2) T4DNA連接酶連接及轉(zhuǎn)化連接體系為1 μ L IOX連接酶緩沖液，1 μ L雙酶切pET48a (+)質(zhì)粒，7 μ L mE7片段，1 μ L T4DNA連接酶，16°C連接過夜。
將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5 α感受態(tài)，轉(zhuǎn)化后涂布于含50 μ g/mL卡那霉素(Kan)的LB 平板上，37°C倒置培養(yǎng)過夜。(3)陽性克隆鑒定隨機挑取4個陽性克隆，接入4mL的LB (Kan+)中；37°C搖床220rpm搖過夜；抽提質(zhì)粒進行雙酶切(EcoR I/Hind III)和PCR鑒定。3. mE7蛋白的誘導表達與鑒定(1)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌將上述鑒定為陽性的重組質(zhì)粒pET_28a (+) _mE7轉(zhuǎn)入感受態(tài)Rosetta，涂布于LB平板(Kan+)上，37°C倒置培養(yǎng)過夜。(2) IPTG誘導蛋白表達挑單克隆于LB(Kan+)中，37°C搖床，220rpm培養(yǎng)過夜，以1 50接過夜菌于20mL LB(Kan+)中，繼續(xù)培養(yǎng)3hr左右，OD6tltlnm達到0. 6-0. 8時加入IPTG至ImM誘導蛋白表達，分別于 0hr、lhr、2hr、3hr、4hr、5hr、6hr 后收集 ImL 菌液。(3) SDS-PAGE 鑒定取ImL菌液12000rpm離心Imin收集菌體，加入IOOyL的IX上樣緩沖液，煮沸5min，冷卻后12000rpm離心lmin，取10 μ L樣品進行12% SDS-PAGE,電泳條件為18mA, 1. 5hr0取下凝膠在考馬斯亮藍染液中搖動染色lhr，移入洗脫液中搖動洗脫過夜。觀察誘導前后蛋白條帶的變化，結(jié)果顯示誘導4hr后蛋白表達到達高峰。4. mE7蛋白的純化和鑒定(l)mE7蛋白的誘導表達將過夜培養(yǎng)已轉(zhuǎn)入pET-28a(+)_mE7的Rosseta菌液以1 50接于IL LB (Kan+) 中，37°C搖床，220rpm培養(yǎng)2hr左右，OD600nm達到0. 6-0. 8時，加入IPTG至ImM,繼續(xù)誘導培養(yǎng)4hr，4°C，7000rpm離心6min，收集菌體，-80°C保存。(2)細菌蛋白表達形式的分析-80°C凍存菌體按每克濕菌5-10mL的比例加入細菌裂解液(0. 5M NaCl, 20mM Tris, IOmM巰基乙醇，ImM PMSF，pH7. 9)，超聲破菌，4°C，8000rpm離心20min，包涵體沉淀在底部，分別取上清、包涵體做SDS-PAGE，結(jié)果顯示mE7蛋白主要存在于包涵體中。(3)mE7蛋白的純化超聲破菌后，4 °C，8000rpm離心20min，棄上清，沉淀用50mL溶液(0. 5MNaCl， 20mMTris,0. 5% Triton, pH7. 9)超聲洗滌一次；4°C，8000rpm 離心 20min，棄上清。沉淀即包涵體加入30mL溶液(0. 5M NaCl, 20mM Tris，6M鹽酸胍，ρΗ7· 9)，置37°C溶解2hr以上。 4°C，16000rpm 離心 20min，取上清上樣至預先用 0. 5M NaCl, 20mM iTrisjM 鹽酸胍，pH7. 9 的溶液平衡好的鎳柱，分別用溶液①、②、③(①0.5M NaCl, 20mM Tris，5mM巰基乙醇，5mM 咪唑，6M 鹽酸胍，pH7. 9 ；② 0. 5M NaCl, 20mM Tris，5mM 巰基乙醇，5mM 咪唑，8M 尿素，pH7. 9 ； ③0.5M NaCl, 20mM Tris，5mM巰基乙醇，20mM咪唑，8M尿素，pH7. 9)洗滌10個柱床體積， 再用洗脫緩沖液(0. 5M NaCl, 20mM Tris，5mM巰基乙醇，200mM咪唑，8M尿素，pH7. 9)洗脫， 收集蛋白液，置4°C對IXPBS充分透析，4°C，16000rpm離心20min，取上清液。收獲的蛋白用SDS-PAGE進行純度分析，結(jié)果顯示純化的蛋白分子量約為20kDa。(4)mE7蛋白的鑒定
Western blot鑒定SDS_PAGE電泳結(jié)束后取下凝膠，電轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上 (4 °C,100V, Ihr)，取膜，于室溫用5%脫脂奶粉封閉》ir，加入鼠抗人HPV16 E7抗體，室溫孵育》ir，用PBST洗膜3次，每次lOmin，加入羊抗鼠抗體室溫孵育1. 5hr,再用PBST洗膜3 次，每次lOmin，加入底物液顯色，在暗室內(nèi)顯影、定影。結(jié)果顯示約20kDa處出現(xiàn)了 mE7的目標條帶O
具體實施例方式以下通過具體的實施例對本發(fā)明作進一步闡述。實施例1 :mE7的核苷酸序列本發(fā)明克隆了 E7的突變體，將第70位堿基由T變成G，并去除終止密碼子前的15 個堿基，先后構(gòu)建了重組克隆質(zhì)粒TA-mE7和重組表達質(zhì)粒PETj8a(+)-mE7，mE7的核苷酸序列見說明書的下一部分。 實施例2 :mE7蛋白的氨基酸序列本發(fā)明分離純化了 mE7蛋白，與HPV16 E7蛋白相比較，第M位氨基酸殘基由Cys 轉(zhuǎn)變?yōu)镚ly，并且去除了 C-末端5個氨基酸殘基，包括94位的Cys，破壞了 Cys-X-X-Cys的模序結(jié)構(gòu)。mE7蛋白的氨基酸序列見說明書的下一部分。實施例3 :mE7蛋白預防免疫抗腫瘤作用1. 5nmol蛋白(mE7蛋白及E7蛋白，PBS組為對照)皮下免疫C57BL/6小鼠，兩周后腹腔加強免疫1次，一周后皮下接種IXlO5TC-I細胞(經(jīng)胰酶消化，PBS洗滌2次)。之后每天觀察腫瘤生長狀況，12d后用游標卡尺測量腫瘤長徑和垂直徑(每3d測量1次)，持續(xù)觀測直至對照組小鼠開始死亡為止，繼續(xù)觀察直到荷瘤小鼠全部死亡，記錄其荷瘤情況及存活時間，結(jié)果全部PBS組小鼠長出了腫瘤，而mE7和E7蛋白免疫組則100 %保護了小鼠不生成腫瘤。植瘤40d時未長瘤小鼠皮下再接種2X IO5TC-I細胞，以未免疫小鼠作為對照組，之后每天觀察腫瘤生長狀況，直到對照組小鼠全部死亡，記錄其荷瘤情況及存活時間， 結(jié)果顯示對照組小鼠6d后全部長瘤，而mE7和E7蛋白免疫組50d后仍無瘤體生長。
權(quán)利要求
1.一種突變的HPV16 E7基因的克隆、表達與蛋白純化方法，其特征是“通過拼接PCR 的方法克隆突變的HPV16 E7序列，構(gòu)建重組的原核表達載體PETj8a(+)-mE7，原核表達并純化突變的HPV16 E7蛋白”。
2 根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變的HPV16E7基因的克隆、表達與蛋白純化方法，其特征是突變的HPV16 E7基因的克隆方法為以pET28a(+)-E7為模板，通過拼接PCR擴增mE7基因片段，先擴增Nde I與E7基因第84堿基中間的片段(135bp，稱為Nde I_E784)和E7基因第56-297位堿基序列(稱為E756_297)，用膠回收試劑盒回收目的片段Nde I_E784和E756_297， 再拼接PCR擴增Nde I-mE7序列，然后構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒TA_mE7。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變的HPV16E7基因的克隆、表達與蛋白純化方法，其特征是突變的HPV16 E7基因的重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建方法為mE7基因序列中有EcoR I酶切位點(E7上游引物中引入)，用EcoR I/Hind III雙酶切TA_mE7，將mE7基因定向插入表達載體pET-28a (+)，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-28a (+) _mE7。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變的HPV16E7基因的克隆、表達與蛋白純化方法，其特征是突變的HPV16 E7蛋白的表達與純化方法為將轉(zhuǎn)入PETj8a(+)-mE7的Rosetta菌在 37°C培養(yǎng)，ImM IPTG誘導表達4hr，超聲裂菌后，用鎳柱純化mE7蛋白，與HPV16 E7蛋白相比較，突變的E7蛋白多肽鏈中第M位氨基酸由原來的Cys轉(zhuǎn)變?yōu)镚ly，而且去除了 C-末端 5個氨基酸殘基，包括第94位的Cys，破壞了 Cys-X-X-Cys的模序結(jié)構(gòu)，避免或降低了 E7蛋白的轉(zhuǎn)化活性，作為宮頸癌治療的疫苗更為安全可靠。
全文摘要
本發(fā)明用原核細胞表達系統(tǒng)表達了突變的HPV16 E7蛋白。首先克隆了突變的E7(mutantE7，mE7)基因，將第70位堿基由T變成G，并去除終止密碼子前的15個堿基，分別構(gòu)建了mE7的克隆載體TA-mE7和表達載體pET-28a(+)-mE7，并原核表達、分離純化了mE7蛋白，與HPV16 E7蛋白相比較，第24位氨基酸殘基由Cys轉(zhuǎn)變?yōu)镚ly，并且去除了C-末端5個氨基酸殘基，包括94位的Cys，破壞了Cys-X-X-Cys的模序結(jié)構(gòu)，從而大大降低了E7蛋白的轉(zhuǎn)化活性。mE7蛋白免疫100％保護了小鼠不生成TC-1腫瘤。
文檔編號C07K14/025GK102373226SQ20101026292
公開日2012年3月14日 申請日期2010年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月26日
發(fā)明者劉建寧, 李艷利 申請人:南京大學