專(zhuān)利名稱(chēng)：日本血吸蟲(chóng)sdisp基因及其克隆、表達(dá)和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物基因領(lǐng)域，具體涉及日本血吸蟲(chóng)中國(guó)大陸株SDISP基因的基因序列及其克隆表達(dá)方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
血吸蟲(chóng)病是一種分布廣乏，危害嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲(chóng)病?？寡x(chóng)病疫苗研究是當(dāng)今血吸蟲(chóng)病防治研究的熱點(diǎn)之一。
日本血吸蟲(chóng)未成熟卵可溶性抗原(SIEA)具有明顯的抗蟲(chóng)卵胚胎發(fā)育、抗雌蟲(chóng)生殖產(chǎn)卵的作用，我們從SIEA中分離出SIEA26-28kDa天然分子抗原，并證明它是誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生抗血吸蟲(chóng)病保護(hù)性免疫力的主要組分。1999-2000年，衛(wèi)生部專(zhuān)家組織進(jìn)行了全國(guó)血吸蟲(chóng)疫苗免疫保護(hù)統(tǒng)一檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，該亞單位分子疫苗(1號(hào)疫苗)獲得了最佳的動(dòng)物保護(hù)效果53.9％減雌雄合抱率和89.3％肝臟減卵率。隨后，我們采用蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)，首次建立了SIEA-二維電泳圖譜，通過(guò)SIEA26-28kDa抗血清免疫識(shí)別、肽指紋圖譜、質(zhì)譜分析，獲得了3個(gè)同源性較高、免疫原性較強(qiáng)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)(SIEA-2D66，71，73)；分別與日本血吸蟲(chóng)次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)，琥珀酸脫氫酶鐵硫蛋白(SDISP)，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)相匹配，其中SDISP的同源性較高。有資料證明，SDISP與細(xì)胞的核苷酸代謝、血吸蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育、生理代謝密切相關(guān)。以上研究結(jié)果表明SDISP可以作為抗日本血吸蟲(chóng)病天然分子基因苗研究的靶標(biāo)。
我們?cè)诮Y(jié)合先前研究的基礎(chǔ)上，對(duì)編碼SIEA26-28kDa分子抗原相關(guān)的SDISP基因片段進(jìn)行全長(zhǎng)克隆、表達(dá)和保護(hù)性免疫效果的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于
公開(kāi)日本血吸蟲(chóng)中國(guó)大陸株SjSDISP的基因序列。
本發(fā)明公開(kāi)的日本血吸蟲(chóng)中國(guó)大陸株SjSDISP的基因具有序列1所示的核苷酸和序列2的氨基酸。序列1的第106個(gè)至第939個(gè)核苷酸區(qū)域?yàn)樾蛄?的編碼區(qū)。
本發(fā)明根據(jù)基因庫(kù)中SjSDISP對(duì)應(yīng)的EST(BU804141)以及日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)cDNA文庫(kù)載體λgt11多克隆位點(diǎn)鄰近核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，以日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)cDNA文庫(kù)為模板，采用錨式PCR對(duì)SjSDISP基因不完整的3’端和5’端進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序，用電子軟件進(jìn)接全長(zhǎng)cDNA，DNA序列分析表明該基因的開(kāi)放閱讀框含837bp，編碼278個(gè)氨基酸，其密碼子符合Kozak序列特征。該基因全長(zhǎng)序列如下GGTCAGTAAATTTCATTTCATACCTCACAGATTTTCAGTTCGACATCACAGTATTTGTGCGTGTTTAATACCTCGAGAGACAAACCACCTTTATTGAAGTTCAGAATGCTGAAGTCTCTATCTACTTTGCAGTCAGCATCCTTCAAACTTGTTCGTTATGTTTCAACTGCATCAGAGTTAGCACCACGTATTAAAACGTTTTCAATCTACAGATGGAACCCAGACAAACCTGGCGAGAAACCTAGTATGCAGAATTATCAAGTTGACCTCAACGACTGTGGCCCTATGGTCTTGGATGCTCTAATTAAGATAAAAAATGAACAAGACTCCACTTTGACATTTCGACGTTCTTGTCGTGAGGGGATTTGCGGTTCTTGTGCAATGAATATAGGAGGCCGTAATCATCTTGCTTGCATATGGGAAATCGATCAAGATGTTAGCAAACCGACTAAAATATATCCATTACCGCACATGTATGTTATTAAGGATCTAATTCCTGATATGAACAATTTCTATGCTCAATACCGTTTTATTGAGCCTTATTTAAAGAAAAAGAATGTAACTGAAGAAGATATTGGGAAGAAGACTTATTATCAGTCAGTGGAAGACAGAGCAAAACTAGATGGGTTATACGAGTGCATTCTGTGTGCCTGCTGCTCTACTTCATGTCCATCTTATTGGTGGAATGGTGATAAATATTTAGGTCCTGCAGTCCTCCTCCAGGCTTATAGATGGCTAGTTGATTCTCGTGATGACTACACATACGAGCGTCTGTCTGAATTCCAGAACAAATGGTCACTTTATCGATGTCATACTATTATGAACTGCACAGAAACGTGTCCAAAAGGACTGAATCCTGGTTTGGCCATTGGAGAAATTAAGAAAATGTTAATCTATTTTAATCAGTACAAGGACAAAAAGCCGGAGACAAGAACTGTCTGAACTGTGTGACTGTTTCGTCCACATATTCGTCCGAATTTGGATAACTTTTTATTGATTGTTTATAGTGAATTCAGCCATATCTTCTACTTTTTGATTTAACTTATATAAATTCATAGTCAAAAAAAAAAA本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問(wèn)題在于提供上述日本血吸蟲(chóng)中國(guó)大陸株SjSDISP基因在大腸桿菌中的表達(dá)及重組蛋白純化的方法。
本發(fā)明公開(kāi)的表達(dá)方法為
(1)jSDISP基因PCR擴(kuò)增上游引物為5’GCGGATCCATGCTGAAGTCTCTATCTAC3’下游引物為5’ACGTCGACTCAGTCAGTTCTTGTCTCCG3’(2)重組表達(dá)質(zhì)粒SjSDISP/pGEX-4T-1的構(gòu)建(3)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)(4)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳、切膠電洗脫及超濾濃縮回收進(jìn)行回收表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳分析顯示重組蛋白在大腸桿菌BL21中獲得準(zhǔn)確、高效表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE鑒定，該融合表達(dá)產(chǎn)物分子量約為56kDa，Western blot分析表明該重組蛋白能被日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)抗原免疫血清特異識(shí)別，而載體表達(dá)蛋白不與抗體反應(yīng)，表明該融合蛋白具有良好的抗原性。切取融合蛋白區(qū)帶進(jìn)行電洗脫、超濾濃縮。
本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問(wèn)題在于公開(kāi)上述日本血吸蟲(chóng)中國(guó)大陸株SjSDISP基因在制備防治日本血吸蟲(chóng)病重組疫苗中的應(yīng)用。
用SDISP基因原核重組蛋白免疫5-6周齡的昆明系小鼠，每次每只小鼠后腿肌肉注射重組質(zhì)粒100μg。隔2周免疫1次，共3次。末次免疫后第3周以日本血吸蟲(chóng)尾蚴進(jìn)行攻擊感染，攻擊后第45天處死小鼠，心臟灌注法收集成蟲(chóng)，肝臟用10％NaOH消化后計(jì)算每克肝組織蟲(chóng)荷數(shù)(EPG)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)原核重組蛋白免疫小鼠獲得了22.8％的減蟲(chóng)率和38.4％的減卵率。
以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。


圖1錨式PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳1.SjSDISP5’端錨式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2.SjSDISP3’端錨式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物3.蛋白marker圖2原核重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/SDISP雙酶切鑒定和PCR驗(yàn)證1.DNA marker；2.重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/SDISP的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；3.重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/SDISP用BamH1和Sal1進(jìn)行雙酶切4.pGEX-4T-1質(zhì)粒用BamH1和Sal1進(jìn)行雙酶切5.pGEX-4T-1質(zhì)粒；6.DNA marker
圖3pGEX4T-1/SjSDISP原核表達(dá)及其純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析1.純化后的GST-SjSDISP融合蛋白；2.pGEX4T-1/SjSDISP經(jīng)IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)物；3.蛋白Marker圖4Western-blot分析SjSDISP表達(dá)產(chǎn)物的免疫活性1.蛋白Marker；2，3.pGEX-4T-1/SjSDISP在大腸桿菌BL21中的表達(dá)產(chǎn)物具體實(shí)施方式
實(shí)施例1日本血吸蟲(chóng)中國(guó)大陸株SDISP全長(zhǎng)基因的克隆1.試驗(yàn)材料1.1質(zhì)粒與受體菌質(zhì)粒pGEX-4T-1和大腸桿菌BL21、Y1090為本室保存，日本血吸蟲(chóng)中國(guó)大陸株成蟲(chóng)cDNA文庫(kù)由南京醫(yī)科大學(xué)陳淑貞教授提供。
1.2工具酶與試劑ExTaqDNA聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶BamH1和Sal1、質(zhì)粒提取試劑盒及DNA marker均為大連TaKaRa公司產(chǎn)品；Protein marker為Fermentas公司產(chǎn)品；T4DNA連接酶為上海生工生物工程公司產(chǎn)品；1.3引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)文庫(kù)載體多克隆插入位點(diǎn)上下游鄰近區(qū)核苷酸序列設(shè)計(jì)上下游引物P1、P2；根據(jù)序列號(hào)為BU804141的EST5’端和3’端核苷酸序列設(shè)計(jì)特異引物分別為S1、S2；以上引物由大連TaKaRa公司合成。
P15’GGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCG3’P25’TTGACACCAGGCCAACTGGTAATG3’S15’AGGGCCACAGTCGTTGAGGTCAAC3’S25’CGTCCACATATTCGTCCGAATTTG3’S35’GCGGATCCATGCTGAAGTCTCTATCTAC3’S45’ACGTCGACTCAGTCAGTTCTTGTCTCCG3’2.試驗(yàn)方法2.1模板準(zhǔn)備將適量日本血吸蟲(chóng)中國(guó)大陸株成蟲(chóng)cDNA文庫(kù)包裝液與適量過(guò)夜培養(yǎng)的大腸桿菌Y1090中，放置37℃預(yù)吸附20min，然后加入含有MgSO4、氨芐青霉素、麥芽糖的55℃平衡的頂層瓊脂中，快速混均后倒入直徑為8cm的LB瓊脂培養(yǎng)皿中，42℃培養(yǎng)4h后每皿加3mlSM液放4℃輕搖過(guò)夜。收集上清，5000rpm室溫離心5min，取上清加入20％PEG，混均室溫放置30min后12000g室溫離心15min，棄上清，沉淀中加入100μl雙蒸水，沸水浴5min，使噬菌體DNA變性，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 2.2錨式PCR擴(kuò)增基因不完整的5’端和3’末端(1)SjSDISP5’端錨式PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系(100μl)。PCR條件為96℃預(yù)變性3min，94℃變性40S，56℃退火20S，72℃延伸40S，共35個(gè)循環(huán)；10×ExTaq buffer10μl10mMdNTP2μl引物P1 2μl引物S1 2μl文庫(kù)模板6μlExTaq酶 1μl25mMgCl 10μl雙蒸水 67μl(2)SjSDISP3’末端錨式PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系(100μl)。PCR條件為96℃預(yù)變性3min，94℃變性1min，61℃退火1min，72℃延伸2min，共35個(gè)循環(huán)。
10×ExTaq buffer10μl10mMdNTP2μl引物S2 2μl引物P2 2μl文庫(kù)模板6μlExTaq酶 1μl25mMgCl 10μl雙蒸水 67μl
PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定分子量大小，根據(jù)同源基因估計(jì)，對(duì)符合目的條帶大小的片段進(jìn)行回收，對(duì)回收產(chǎn)物1∶100稀釋后用作模板再進(jìn)行PCR擴(kuò)增、回收后進(jìn)行DNA測(cè)序。
2.3全長(zhǎng)編碼基因的克隆與鑒定根據(jù)全長(zhǎng)序列編碼閱讀框起始密碼子和終止密碼子附近的核苷酸序列再設(shè)一對(duì)引物S3和S4為引物，以cDNA文庫(kù)為模板進(jìn)行全長(zhǎng)編碼基因的PCR擴(kuò)增，用BamH1和Sal1同時(shí)雙酶切目的片段及原核表達(dá)質(zhì)粒，用凝膠回收試劑盒對(duì)雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行回收后，將已雙酶切的目的片段與質(zhì)粒在T4 DNA連接酶作用下16℃連接16h，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸BL21，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含氨芐青霉素的LB瓊脂平皿，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取菌落接種至含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜，抽提質(zhì)粒，雙酶切鑒定和測(cè)序。
3結(jié)果3.1SjSDISP 5’端和3’末端錨式PCR擴(kuò)增以成蟲(chóng)cDNA文庫(kù)為模板，分別以P1/S1和S2/P2為引物進(jìn)行錨式PCR，擴(kuò)增SjSDISP5’端和3’末端，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，5’錨式PCR獲得一條約350bp的條帶(圖1)，回收該條帶送大連TaKaRa公司進(jìn)行測(cè)序，得一個(gè)335bp的序列，有效長(zhǎng)度為284bp。該序列3’末端與原琥珀酸脫氫酶鐵硫蛋白EST(BU804141)5’端有24bp堿基重疊，表明是所要的目的片斷；EST(BU804141)3’端錨式PCR獲得一條約150bp的條帶(圖1)，回收該條帶送大連TaKaRa公司進(jìn)行測(cè)序，得一個(gè)143bp的序列，有效長(zhǎng)度為114bp。該序列5’末端與原琥珀酸脫氫酶鐵硫蛋白EST(BU804141)3’端有27bp堿基重疊，表明是所要的目的片斷。三者連接后得到一個(gè)1071bp的總序列。該序列的開(kāi)放閱讀框?yàn)?37bp，編碼278個(gè)氨基酸，起始密碼子符合Kozak序列特征，起始密碼子前有105bp；終止密碼子后有129bp，終止密碼子后還有一強(qiáng)終止子TGA。
3.2全長(zhǎng)編碼基因的克隆、重組子構(gòu)建與鑒定根據(jù)全長(zhǎng)ORF設(shè)計(jì)一對(duì)內(nèi)含BamaH1和Sal1酶切位點(diǎn)的引物S3和S4，以成蟲(chóng)cDNA文庫(kù)為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，可見(jiàn)一條約850bp大小的DNA條帶，與預(yù)期大小一致(圖2)。插入SjSDISP全長(zhǎng)編碼基因的質(zhì)粒表達(dá)載體pGEX-4T-1/SjSDISP，經(jīng)BamaH1、Sal1雙酶切和PCR鑒定，證明原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。原核表達(dá)載體pGEX-4T-1/SjSDISP質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果與全長(zhǎng)ORF完全一致。SjSDISP基因全長(zhǎng)序列已登錄GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為AY841892。
實(shí)施例2日本血吸蟲(chóng)(中國(guó)大陸株)SDISP基因在大腸桿菌中的表達(dá)和純化1.試驗(yàn)材料氨芐青霉素、IPTG、DTT等為Sigma公司產(chǎn)品；硝酸纖維素膜(NC膜)為上海四青生化材料廠產(chǎn)品；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG為晶美公司產(chǎn)品。
2.試驗(yàn)方法2.1目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)將經(jīng)雙酶切和測(cè)序鑒定正確的重組菌接種至含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，按常規(guī)方法誘導(dǎo)表達(dá)，37℃搖床培養(yǎng)至A600為0.6，加IPTG至終濃度為1mM，28℃搖床輕搖4-5h，按常規(guī)方法提取菌體蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析。
2.2基因表達(dá)產(chǎn)物的分離與純化先將經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組菌體蛋白用大膠進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，用預(yù)冷的0.25M KCl染色10-20min，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子帶準(zhǔn)確切取融合蛋白區(qū)帶，將膠塊切成小塊，裝入含0.5倍電泳緩沖液的透析袋中，200mA恒流電滲2h，收集透析袋中液體，500rpm離心10min，取上清于0.01M pH7.2透析過(guò)夜，超濾濃縮，測(cè)定蛋白濃度后-20℃貯存?zhèn)溆谩?br> 2.3 Western-blot檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物抗原性為了避免血清中抗大腸桿菌蛋白抗體所引起的假陽(yáng)性，必須去除這些非特異性抗體，將一抗做如下初步純化挑取一個(gè)以pGEX-4T-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的BL21單菌落，接種到含有氨芐青霉素的5ml液體LB中，37℃振搖過(guò)夜，將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液按1∶100接種到含氨芐青霉素的500ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃振搖增菌。收集菌液于4000rpm冷凍離心10min，棄上清后加入6ml PBS懸浮沉淀物。將懸浮液置超聲粉碎儀中粉碎(功率400，超聲4S，間隔3S，循環(huán)50次)，制成BL21裂解液。按1ml血清加3ml裂解液混勻，再用4倍PBS稀釋?zhuān)?C吸附過(guò)夜。然后12000rpm離心15min，收集上清，-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> 將高表達(dá)融合蛋白進(jìn)行SDS-PAGE(12％)電泳，然后以100mA電轉(zhuǎn)移2h，將融合蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上，麗春紅染色檢查轉(zhuǎn)印效果。加入5％脫脂奶粉-PBS-Tween204℃封閉過(guò)夜；0.05％PBST洗膜5min×3，PBS洗3-5min，加入吸附后的SIEA26-28kDa免疫兔血清(1∶40)室溫孵育2h，0.05％PBST洗膜5min×3，加入二抗HRP-SPA(1∶30)室溫孵育2h，0.05％PBST洗膜5min×3，晾干后，DAB底物顯色15-30min，水洗終止反應(yīng)，掃描記錄。
3.結(jié)果3.1SjSDISP在大腸桿菌中表達(dá)和表達(dá)產(chǎn)物的純化用終濃度為1mM IPTG誘導(dǎo)SjSDISP在大腸桿菌中獲得表達(dá)，并用SDS-PAGE對(duì)不同表達(dá)時(shí)相進(jìn)行結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)該融合蛋白表達(dá)產(chǎn)物分子量大小約為56kDa，與推測(cè)的大小相符(圖3)，4-5h表達(dá)達(dá)高峰。表達(dá)蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳、0.25M KCl染色、切膠、電滲和超濾等處理，最后得到單一蛋白條帶(圖3)3.2表達(dá)產(chǎn)物的抗原性測(cè)定將高表達(dá)融合蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，經(jīng)電轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜上，用經(jīng)pGEX-4T-1載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21裂解液吸附過(guò)的日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)兔免疫血清作一抗體進(jìn)行Western-blot，結(jié)果在56kDa處有一明顯的識(shí)別條帶(圖4)實(shí)施例3日本血吸蟲(chóng)SDISP基因原核重組蛋白免疫小鼠的保護(hù)性效果觀察1試驗(yàn)材料昆明系小鼠，雄性，5-6周齡，由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院動(dòng)物學(xué)部提供。陽(yáng)性釘螺由江蘇省血吸蟲(chóng)病防治研究所提供。
2方法2.1SDISP基因原核重組蛋白的大量制備將重組菌體蛋白(經(jīng)IPTG誘導(dǎo))進(jìn)行多次SDS-PAGE凝膠電泳，用預(yù)冷的0.25M KCl染色10-20min，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量和表達(dá)產(chǎn)物的考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果，準(zhǔn)確切取融合蛋白區(qū)帶，將膠塊切成小塊，置入電洗脫回收裝置中進(jìn)行電洗脫，200mA恒流電滲2h，收集洗脫液，5000rpm離心10min，取上清于0.01M pH7.2透析過(guò)夜，超濾濃縮，測(cè)定蛋白濃度后-20℃貯存?zhèn)溆谩?br> 2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為A、B、C三組，A組為注射SDISP基因原核重組蛋白組，B組為佐劑免疫組，C組為注射PBS組，各組分別為10、10、9只昆明系小鼠。
2.3免疫途徑和方法按常規(guī)免疫方法進(jìn)行，分別于免疫前一天進(jìn)行預(yù)處理，即每只小鼠后腿肌肉注射50μl鹽酸布比卡因(0.5mg/ml)，第二天在該部位按分組要求注射原核重組蛋白100μg/100μl或生理鹽水100μl。每間隔2周免疫1次，共3次。
2.4免疫小鼠攻擊感染實(shí)驗(yàn)及保護(hù)性效果評(píng)價(jià)末次免疫后第3周，按常規(guī)方法經(jīng)小鼠腹部人工感染40±1條日本血吸蟲(chóng)尾蚴，感染后第45天處死小鼠，采用心臟灌注法收集血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)，并計(jì)算減蟲(chóng)率。同時(shí)，每鼠取1g肝研磨，加10％NaOH于37℃消化過(guò)夜，取50μl混懸液涂片鏡檢全部蟲(chóng)卵數(shù)，計(jì)算每克肝蟲(chóng)卵數(shù)(EPG)。運(yùn)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟計(jì)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)計(jì)算其保護(hù)效果，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理得出P＜0.05，表示有顯著性差異。減蟲(chóng)率和減卵率的計(jì)算公式如下。
減蟲(chóng)率(％)＝(1-實(shí)驗(yàn)組檢獲成蟲(chóng)均數(shù)/對(duì)照組檢獲成蟲(chóng)均數(shù))×100減卵率(％)＝(1-實(shí)驗(yàn)組檢獲肝蟲(chóng)卵均數(shù)/對(duì)照組檢獲肝蟲(chóng)卵均數(shù))×100
3.結(jié)果表1.SDISP基因原核重組蛋白免疫小鼠的減蟲(chóng)率

rSjSDISP是以GST融合蛋白的形式表達(dá)表2.SDISP基因原核重組蛋白免疫小鼠的減卵率

權(quán)利要求
1.一種編碼日本血吸蟲(chóng)中國(guó)大陸株SDISP基因的核苷酸序列，其特征在于它具有如下核苷酸序列g(shù)gtcagtaaa tttcatttca tacctcacag attttcagtt cgacatcaca gtatttgtgc 60gtgtttaata cctcgagaga caaaccacct ttattgaagt tcagaatgct gaagtctcta120tctactttgc agtcagcatc cttcaaactt gttcgttatg tttcaactgc atcagagtta180gcaccacgta ttaaaacgtt ttcaatctac agatggaacc cagacaaacc tggcgagaaa240cctagtatgc agaattatca agttgacctc aacgactgtg gccctatggt cttggatgct300ctaattaaga taaaaaatga acaagactcc actttgacat ttcgacgttc ttgtcgtgag360gggatttgcg gttcttgtgc aatgaatata ggaggccgta atcatcttgc ttgcatatgg420gaaatcgatc aagatgttag caaaccgact aaaatatatc cattaccgca catgtatgtt480attaaggatc taattcctga tatgaacaat ttctatgctc aataccgttt tattgagcct540tatttaaaga aaaagaatgt aactgaagaa gatattggga agaagactta ttatcagtca600gtggaagaca gagcaaaact agatgggtta tacgagtgca ttctgtgtgc ctgctgctct660acttcatgtc catcttattg gtggaatggt gataaatatt taggtcctgc agtcctcctc720caggcttata gatggctagt tgattctcgt gatgactaca catacgagcg tctgtctgaa780ttccagaaca aatggtcact ttatcgatgt catactatta tgaactgcac agaaacgtgt840ccaaaaggac tgaatcctgg tttggccatt ggagaaatta agaaaatgtt aatctatttt900aatcagtaca aggacaaaaa gccggagaca agaactgtct gaactgtgtg actgtttcgt960ccacatattc gtccgaattt ggataacttt ttattgattg tttatagtga attcagccat 1020atcttctact ttttgattta acttatataa attcatagtc aaaaaaaaaa a1071。
2.一種如權(quán)利要求1所述的日本血吸蟲(chóng)中國(guó)大陸株HGPRT基因全長(zhǎng)序列的克隆方法，其特征在于以日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)cDNA文庫(kù)為模板，采用錨式PCR對(duì)SjSDISP基因不完整的3’端和5’端進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序，用電子軟件進(jìn)接得到全長(zhǎng)序列。
3.一種如權(quán)利要求1所述的日本血吸蟲(chóng)中國(guó)大陸株SDISP基因的核苷酸編碼序列在原核生物中的表達(dá)方法，其特征在于所使用的宿主菌為大腸桿菌BL21，原核表達(dá)質(zhì)粒為pGEX-4T-1。
4.一種防治日本血吸蟲(chóng)病的重組疫苗，其特征在于它是由重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/SjSDISP轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，再經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳、切膠、電洗脫及超濾濃縮回收得到的重組蛋白產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明具體涉及日本血吸蟲(chóng)中國(guó)大陸株SDISP基因的基因序列及其克隆表達(dá)方法和應(yīng)用。根據(jù)基因庫(kù)中該基因?qū)?yīng)的EST及日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)cDNA文庫(kù)載體λgt11多克隆位點(diǎn)鄰近核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，以成蟲(chóng)cDNA文庫(kù)為模板，采用錨式PCR對(duì)SjSDISP基因不完整的3’端和5’端進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序，用電子軟件拼接全長(zhǎng)序列。該基因的開(kāi)放閱讀框含834bp，編碼278個(gè)氨基酸。將該基因亞克隆入原核表達(dá)載體pGEX－4T－1中，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pGEX－4T－1/SjSDISP，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，以純化的重組蛋白免疫昆明系小鼠，獲得22.8％的減蟲(chóng)率和38.4％的減卵率。
文檔編號(hào)C12N15/10GK1962868SQ20051003234
公開(kāi)日2007年5月16日 申請(qǐng)日期2005年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月8日
發(fā)明者汪世平, 余俊龍, 周松華, 何卓, 呂志躍, 徐紹銳 申請(qǐng)人:余俊龍, 汪世平