專利名稱：一種預(yù)防和治療日本血吸蟲感染的相關(guān)基因和蛋白質(zhì)及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制藥、基因藥物和基因工程產(chǎn)品，進一步是指東方田鼠血清白蛋白的分離純化，及其基因工程產(chǎn)品的研制。東方田鼠血清白蛋白及白蛋白基因制品的開發(fā)，及其在預(yù)防和治療日本血吸蟲病中的用途。
背景技術(shù)：
據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計資料，全世界有70多個國家血吸蟲病流行，2億人感染了血吸蟲，1億2千萬人出現(xiàn)臨床感染癥狀，每年大約有2萬人死于血吸蟲病。我國的血吸蟲為日本血吸蟲。新中國成立以來，我國在血吸蟲病控制方面取得巨大成就，但目前全國尚有108個縣(市、區(qū))未能控制血吸蟲病流行。由于河道和湖區(qū)泥沙淤積，有釘螺面積逐年擴大，不但送走的瘟神有卷土重來之勢，近年來某些城市也發(fā)現(xiàn)有血吸蟲病流行，感染人群不斷增加。而對該病目前尚無特別有效的防治方法。中國是世界上日本血吸蟲病流行最為嚴重的國家之一。據(jù)最新資料顯示，目前全國現(xiàn)有血吸蟲病病人81萬人，病牛近6萬頭，釘螺面積約34.5億平方米，受感染者不計其數(shù)。而湖南省是全國血吸蟲病最嚴重的省份，釘螺面積占全國有螺面積的51％，血吸蟲病人21萬多人，占全國血吸蟲病人數(shù)的25.7％。雖然可以用吡喹酮等化學(xué)藥物對血吸蟲病患者進行有效治療，由于化學(xué)藥物有一定的副作用，加之患者治愈后機體并沒有獲得有效免疫，接觸含有尾蚴的疫水后，可以反復(fù)感染再次發(fā)病。目前對日本血吸蟲病尚無特別有效的預(yù)防方法。目前對日本血吸蟲病的預(yù)防主要集中在日本血吸蟲的中間宿主釘螺方面，消滅釘螺成為人類預(yù)防血吸蟲病的有效方法之一。幾十年人與釘螺斗爭，難分勝負，這是日本血吸蟲病發(fā)病率居高不下的主要原因。同時，科學(xué)家們積極研制血吸蟲疫苗，希望能預(yù)防血吸蟲病。由于血吸蟲是一種多細胞真核生物，免疫機制極其復(fù)雜，研制疫苗任重而道遠。因此，預(yù)防和控制血吸蟲病仍是一個長期而艱巨的任務(wù)。
日本血吸蟲病是一種嚴重危害人類健康的人獸共患性寄生蟲病，可以感染包括人類在內(nèi)的40多種哺乳動物。我國洞庭湖血吸蟲病疫區(qū)棲居的野生動物東方田鼠對日本血吸蟲具有天然抗性，日本血吸蟲在其體內(nèi)不能發(fā)育成熟和產(chǎn)卵，是目前所知的疫區(qū)唯一對日本血吸蟲感染具有這種特殊抗性的嚙齒類哺乳動物，而且這種特性能穩(wěn)定地進行遺傳。東方田鼠分布的范圍很廣，有證據(jù)表明，洞庭湖區(qū)與黃河以北(寧夏)的東方田鼠均對日本血吸蟲感染具有抗性。
我國科學(xué)家從60年代開始，對東方田鼠抗日本血吸蟲感染機制進行了一系列研究，解剖了數(shù)以萬計疫區(qū)的東方田鼠，無一只發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲成蟲或蟲卵。實驗室的研究證明，經(jīng)人工感染日本血吸蟲尾蚴于東方田鼠后，盡管蟲體在感染后11天內(nèi)能正常發(fā)育，但從第12天開始，蟲體生長發(fā)育停滯，第20～28天蟲體在體內(nèi)全部消亡?，F(xiàn)已證明，東方田鼠血清和淋巴細胞在體外對日本血吸蟲童蟲有殺傷作用，其體內(nèi)存在的抗日本血吸蟲天然抗體以及抗日本血吸蟲的其它蛋白質(zhì)。實驗室馴化飼養(yǎng)的東方田鼠與野生東方田鼠均具有相同的特性。
在東方田鼠體內(nèi)尋找抗日本血吸蟲的特異基因和蛋白質(zhì)，并且用于血吸蟲病的預(yù)防和治療，一直是我們長期以來努力探索的目標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的關(guān)鍵技術(shù)問題是，針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足和社會實際需求，提出預(yù)防血吸蟲感染和治療血吸蟲病的方案，并從東方田鼠體內(nèi)獲得抗日本血吸蟲的蛋白質(zhì)——血清白蛋白和相應(yīng)基因。該蛋白質(zhì)和相應(yīng)基因?qū)w外培養(yǎng)的日本血吸蟲童蟲有明顯的殺滅作用，對感染日本血吸蟲的小白鼠有明顯的預(yù)防和治療作用?？梢岳棉D(zhuǎn)基因技術(shù)，建立轉(zhuǎn)基因家畜，阻斷日本血吸蟲的轉(zhuǎn)播。不同來源的東方田鼠血清白蛋白及其基因的一級結(jié)構(gòu)有所不同，但有相同的作用。該技術(shù)的社會效益和經(jīng)濟效益十分巨大。
本發(fā)明中的東方田鼠血清白蛋白及其基因系利用藍色瓊脂糖凝膠FF親和層析法、聚丙烯酰氨凝膠電泳、透析、冷凍干燥，氨基酸測序，PCR體外基因擴增，DNA測序，以及生物信息學(xué)技術(shù)，從東方田鼠體內(nèi)分離得到。
一、本發(fā)明主要有以下用途1.使用東方田鼠血清白蛋白，在感染日本血吸蟲前后，通過靜脈注射、腹腔注射、肌肉注射等方式給藥，用于人、畜血吸蟲感染和血吸蟲病的預(yù)防和治療。
2.利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)，改變東方田鼠血清白蛋白的氨基酸序列，形成血清白蛋白突變體，使用東方田鼠血清白蛋白的突變體，在感染日本血吸蟲前后，通過靜脈注射、腹腔注射、肌肉注射等方式給藥，用于人、畜血吸蟲感染和血吸蟲病的預(yù)防和治療。
3.將東方田鼠血清白蛋白基因插入真核表達載體，在感染日本血吸蟲前后，通過靜脈注射、腹腔注射、肌肉注射等方式給藥，將血清白蛋白基因?qū)塍w內(nèi)，用于人、畜血吸蟲感染和血吸蟲病的預(yù)防和治療。
4.利用基因工程技術(shù)，改變東方田鼠血清白蛋白基因的核苷酸序列，形成血清白蛋白基因突變體。將東方田鼠血清白蛋白基因的突變體插入真核表達載體，在感染日本血吸蟲前后，通過靜脈注射、腹腔注射、肌肉注射等方式給藥，將血清白蛋白基因突變體導(dǎo)入體內(nèi)，用于人、畜血吸蟲感染和血吸蟲病的預(yù)防和治療。
5.將東方田鼠血清白蛋白基因的突變體插入病毒(逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒等)載體，在感染日本血吸蟲前后，通過靜脈注射、腹腔注射、肌肉注射等方式給藥，將白蛋白基因突變體導(dǎo)入體內(nèi)，用于人、畜血吸蟲感染和血吸蟲病的預(yù)防和治療。
6.利用利用親和層析法、聚丙烯酰氨凝膠電泳、透析、冷凍干燥等方法，從東方田鼠血清中分離、純化血清白蛋白，用于人、畜血吸蟲感染和血吸蟲病的預(yù)防和治療。
7.上述東方田鼠血清白蛋白基因及其突變體的DNA序列插入真核表達載體，利用真核表達系統(tǒng)，在真核細胞(包括哺乳動物細胞、昆蟲細胞、酵母細胞等)中表達和生產(chǎn)血清白蛋白，用于人、畜血吸蟲感染和血吸蟲病的預(yù)防和治療。
8.東方田鼠血清白蛋白基因及其突變體的DNA序列插入原核表達載體，利用原核表達系統(tǒng)，在原核細胞(包括大腸桿菌和其它細菌)中表達和生產(chǎn)血清白蛋白，用于人、畜血吸蟲感染和血吸蟲病的預(yù)防和治療。
9.上述東方田鼠指名亞種白蛋白基因及其突變體的DNA序列插入各種真核表達載體，包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、腺病毒載體等病毒載體，通過基因?qū)爰夹g(shù)，建立轉(zhuǎn)基因動物(包括水牛和其它家畜)，使這些動物對血吸蟲產(chǎn)生永久抗性，用于阻斷血吸蟲病的傳播和蔓延。
二、以下對本發(fā)明做出進一步說明。
日本血吸蟲病是一種嚴重危害人類健康的人獸共患性寄生蟲病，可以感染包括人類在內(nèi)的40多種哺乳動物。我國洞庭湖血吸蟲病疫區(qū)棲居的野生動物東方田鼠對日本血吸蟲具有天然抗性，日本血吸蟲在其體內(nèi)不能發(fā)育成熟和產(chǎn)卵。人工感染血吸蟲尾蚴于東方田鼠后，盡管蟲體在感染后11天內(nèi)能正常發(fā)育，但從第12天開始，蟲體生長發(fā)育停滯，第20～28天蟲體在體內(nèi)全部消亡?，F(xiàn)已證明，東方田鼠血清和淋巴細胞在體外對血吸蟲童蟲有殺傷作用，其體內(nèi)存在的抗日本血吸蟲天然抗體以及抗日本血吸蟲的其它蛋白質(zhì)在抗日本血吸蟲的過程中發(fā)揮了重要作用。實驗室馴化飼養(yǎng)的東方田鼠與野生東方田鼠均具有相同的特性。東方田鼠是目前所知的疫區(qū)唯一對日本血吸蟲感染具有這種特殊抗性的嚙齒類哺乳動物，而且這種特性能穩(wěn)定地進行遺傳。
根據(jù)東方田鼠這一重要的遺傳性狀，本發(fā)明研制者經(jīng)過幾年的努力，利用親和層析法、聚丙烯酰氨凝膠電泳、透析、冷凍干燥，用Edman降解法以及生物信息學(xué)技術(shù)對相關(guān)蛋白質(zhì)進行分離純化和氨基端序列測定，同時利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)，對該基因進行體外擴增。將擴增的基因片段進行DNA序列測定和生物信息學(xué)分析。在東方田鼠指名亞種和長江亞種血清中分離到一個對日本血吸蟲有特異抗性的蛋白質(zhì)——血清白蛋白以及在東方田鼠指名亞種和長江亞種的肝細胞中獲得這種蛋白質(zhì)的基因序列。該專利成果為本發(fā)明的申請者首創(chuàng)，目前國內(nèi)外尚未見到東方田鼠血清白蛋白及其基因用于血吸蟲預(yù)防和治療的報道和相關(guān)研究。
三、本發(fā)明的實驗包括1.東方田鼠血清白蛋白的分離純化。將成年東方田鼠用乙醚麻醉，眼框取血。血液收集于玻璃試管中，冰箱4℃過夜，使血液凝固。血液凝固后，3000轉(zhuǎn)/每分鐘，離心5分鐘，收集血清。
東方田鼠血清以緩沖液I(0.05M KH2PO4，pH7.0)按1∶1稀釋，經(jīng)10000轉(zhuǎn)/每分鐘離心，去除不溶性物質(zhì)后，上樣于藍色瓊脂糖凝膠FF親和層析柱頂部。層析柱用緩沖液I洗脫，以去除未結(jié)合蛋白質(zhì)。隨后用緩沖液II(0.05M KH2PO4，1.5M KCl，pH7.0)對血清白蛋白進行洗脫，收集洗脫液。透析袋(透析分子量8000-14000 kDa)用緩沖液I透析平衡24小時(其間換液至少3次)。將含有血清白蛋白的洗脫液裝于透析袋內(nèi)，4℃對水充分透析去鹽3天(其間換液至少6次)，真空冷凍干燥。用12％ SDS聚丙烯酰氨凝膠電泳，對純化的血清白蛋白進行純度鑒定。(見圖1)。
2.用Edman降解法對東方田鼠血清白蛋白進行氨基端序列測定，并結(jié)合生物信息學(xué)分析技術(shù)，得到血清白蛋白的氨基酸序列。(見圖2、圖3)。
3.根據(jù)小白鼠白蛋白基因的序列，設(shè)計如下引物ALBUMIN1 5’-ACCGGAATTCTAGCCTCTGGCAAAATGA-3’ALBUMIN2 5’-CCGGAATTCAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’在乙醚麻醉下，處死動物，取東方田鼠肝臟，提取總RNA，使用引物ALBUMIN1和ALBUMIN2，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，對血清白蛋白基因進行體外擴增。將擴增的基因片段進行DNA序列測定和生物信息學(xué)分析。得到東方田鼠白蛋白基因的序列(見圖4、圖5)。
根據(jù)東方田鼠指名亞種和長江亞種血清白蛋白基因序列，推導(dǎo)其編碼產(chǎn)物為608個氨基酸殘基的白蛋白前體，白蛋白前體的氨基酸序列為(見圖6、圖7)。
東方田鼠指名亞種和長江亞種血清白蛋白基因在翻譯后的蛋白質(zhì)加工過程中信號肽序列被剪切掉，形成成熟的白蛋白。白蛋白信號肽序列如下MKWVTFLLLLFVSGSAFSRGLFRR4.體外殺日本血吸蟲童蟲試驗。將純化的東方田鼠血清白蛋白與日本血吸蟲童蟲一起培養(yǎng)，在光學(xué)顯微鏡下連續(xù)計數(shù)96小時，觀察活血吸蟲童蟲數(shù)量。以東方田鼠血清作為陽性對照，牛血清白蛋白作為陰性對照。結(jié)果可見，東方田鼠血清白蛋白對體外培養(yǎng)的日本血吸蟲童蟲有明顯的殺傷作用，而且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系(圖8、圖9)。
5.對感染血吸蟲的小白鼠的治療作用。將小白鼠先感染日本血吸蟲尾蚴，再經(jīng)腹腔、靜脈或肌肉注射，使東方田鼠血清白蛋白進入小白鼠體內(nèi)，以牛血清白蛋白作為陰性對照。41天后，處死小白鼠，計數(shù)小白鼠體內(nèi)血吸蟲成蟲數(shù)、每克肝組織的蟲卵數(shù)，計算減蟲率和減卵率。與對照組相比，效果非常明顯。(表1)。
表1東方田鼠血清白蛋白小白鼠體內(nèi)抗日本血吸蟲的實驗結(jié)果

注結(jié)果以均值±SD表示6.真核表達載體用限制性核酸內(nèi)切酶消化，將東方田鼠血清白蛋白基因插入真核表達載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提取重組真核表達載體。用重組真核表達載體轉(zhuǎn)染真核細胞(包括哺乳動物細胞、昆蟲細胞、酵母細胞等)，利用真核表達系統(tǒng)，在真核細胞中表達和生產(chǎn)東方田鼠血清白蛋白，并且分泌到細胞培養(yǎng)液中，收集含有血清白蛋白的細胞培養(yǎng)液。純化后用于血吸蟲的預(yù)防和治療。
將這種細胞培養(yǎng)液與緩沖液I(0.05M KH2PO4，pH7.0)按1∶1稀釋，經(jīng)10000轉(zhuǎn)/每分鐘離心去除不溶性物質(zhì)后，上樣于藍色瓊脂糖凝膠FF親和層析柱頂部。層析柱用緩沖液I洗脫，以去除未結(jié)合蛋白質(zhì)。隨后用緩沖液II(0.05MKH2PO4，1.5M KCl，pH7.0)對血清白蛋白進行洗脫，收集洗脫液。透析袋(透析分子量8000-14000kDa)用緩沖液I透析平衡24小時(其間換液至少3次)。將含有白蛋白的洗脫液置于透析袋內(nèi)，4℃對水充分透析去鹽3天(其間換液至少6次)，真空冷凍干燥。用12％ SDS聚丙烯酰氨凝膠電泳，對純化的血清白蛋白進行純度鑒定。將純化的白蛋白與日本血吸蟲童蟲一起培養(yǎng)，在光學(xué)顯微鏡下連續(xù)計數(shù)96小時，以東方田鼠血清作為陽性對照，觀察活日本血吸蟲童蟲數(shù)量。
7.原核表達載體用限制性核酸內(nèi)切酶消化，將東方田鼠血清白蛋白基因插入原核表達載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，利用原核表達系統(tǒng)，在大腸桿菌中表達東方田鼠血清白蛋白，從大腸桿菌中分離、純化東方田鼠血清白蛋白，用于血吸蟲的預(yù)防和血吸蟲病的治療。將純化的白蛋白與日本血吸蟲童蟲一起培養(yǎng)，在光學(xué)顯微鏡下連續(xù)計數(shù)96小時，以東方田鼠血清作為陽性對照，觀察活日本血吸蟲童蟲數(shù)量。
8.將東方田鼠血清白蛋白基因插入真核表達載體，經(jīng)腹腔、靜脈或肌肉注射，使白蛋白基因進入小白鼠體內(nèi)，再感染日本血吸蟲尾蚴，41天后，處死小白鼠，計算小白鼠體內(nèi)血吸蟲成蟲數(shù)、每克肝組織的卵數(shù)，計算減蟲率和減卵率。與對照組相比，效果明顯?？梢姈|方田鼠白蛋白基因?qū)π“资蟾腥狙x的的保護作用。
9.將東方田鼠白蛋白基因插入逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒等病毒載體，經(jīng)腹腔、靜脈或肌肉注射，使白蛋白基因進入小白鼠體內(nèi)，再感染日本血吸蟲尾蚴，41天后，處死小白鼠，數(shù)小白鼠體內(nèi)血吸蟲成蟲數(shù)、每克肝組織的卵數(shù)，計算減蟲率和減卵率。與對照組相比，效果非常明顯，可見東方田鼠白蛋白基因?qū)π“资蟾腥狙x的的保護作用。
10.利用基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)，改變東方田鼠血清白蛋白基因的一級結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生血清白蛋白突變體，插入真核表達載體和原核表達載體，通過真核表達系統(tǒng)核原核表達系統(tǒng)，生產(chǎn)東方田鼠血清白蛋白突變體，用于人、畜血吸蟲感染和血吸蟲病的預(yù)防和治療。
11.將東方田鼠血清白蛋白或者白蛋白突變體基因序列插入各種真核表達載體，包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、腺病毒載體等病毒載體，通過基因?qū)爰夹g(shù)，建立轉(zhuǎn)基因動物(包括水牛和其它家畜)，使這些動物對血吸蟲產(chǎn)生永久抗性，用于阻斷血吸蟲病的傳播和蔓延。


圖1中A是藍色葡聚糖凝膠洗脫圖，B是聚丙烯酰氨凝膠電泳圖。
圖2是東方田鼠指名亞種白蛋白的氨基酸序列。
圖3是東方田鼠長江亞種白蛋白的氨基酸序列。
圖4是東方田鼠指名亞種白蛋白基因的核苷酸序列。
圖5是東方田鼠長江亞種白蛋白基因的核苷酸序列。
圖6是根據(jù)東方田鼠指名亞種白蛋白基因的核苷酸序列推導(dǎo)的白蛋白前體的氨基酸序列。
圖7是根據(jù)東方田鼠長江亞種白蛋白基因的核苷酸序列推導(dǎo)的白蛋白前體的氨基酸序列。
圖8是東方田鼠白蛋白對日本血吸蟲童蟲的抑制作用。
圖8中A是日本血吸蟲童蟲經(jīng)10mg/ml東方田鼠血清白蛋白處理；B是日本血吸蟲童蟲經(jīng)5mg/ml東方田鼠血清白蛋白處理；C是日本血吸蟲童蟲經(jīng)40％東方田鼠全血清處理；D是日本血吸蟲童蟲經(jīng)10mg/ml牛血清白蛋白處理。圖8A、B、C顯示的日本血吸蟲童蟲均為死童蟲；圖8D顯示的日本血吸蟲童蟲為活童蟲。
圖9是東方田鼠血清白蛋白濃度與日本血吸蟲童蟲死亡率的關(guān)系。
具體實施例方式
1.東方田鼠血清白蛋白的分離純化。
將成年東方田鼠用乙醚麻醉，眼框取血。血液收集于玻璃試管中，冰箱4℃過夜，使血液凝固。血液凝固后，3000轉(zhuǎn)/每分鐘，離心5分鐘，收集血清。
東方田鼠血清以緩沖液I(0.05M KH2PO4，pH7.0)按1∶1稀釋，經(jīng)10000轉(zhuǎn)/每分鐘離心，去除不溶性物質(zhì)后，上樣于藍色瓊脂糖凝膠FF親和層析柱頂部。層析柱用緩沖液I洗脫，以去除未結(jié)合蛋白質(zhì)。隨后用緩沖液II(0.05M KH2PO4，1.5M KCl，pH7.0)對血清白蛋白進行洗脫，收集洗脫液。透析袋(透析分子量8000-14000 kDa)用緩沖液I透析平衡24小時(其間換液至少3次)。將含血清白蛋白的洗脫液置于透析袋內(nèi)，4℃對水充分透析去鹽3天(其間換液至少6次)，真空冷凍干燥。用12％SDS聚丙烯酰氨凝膠電泳，對純化的血清白蛋白進行純度鑒定。
2.東方田鼠血清白蛋白氨基端測序。
用Edman降解法對東方田鼠血清白蛋白進行氨基端序列測定，得到氨基端序列DAHKSEIAHR，結(jié)合生物信息學(xué)分析技術(shù)，確認得到的蛋白質(zhì)為血清白蛋白。
3.東方田鼠血清白蛋白基因克隆與分析。
根據(jù)小白鼠血清白蛋白基因的序列，設(shè)計如下引物ALBUMIN1 5’-ACCGGAATTCTAGCCTCTGGCAAAATGA-3’ALBUMIN2 5’-CCGGAATTCAAGCTTTTTTTTTTTTTTT-3’在乙醚麻醉下，處死東方田鼠，取東方田鼠肝臟，提取總RNA，使用引物ALBUMIN1和ALBUMIN2，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)，對該基因進行體外擴增。將擴增的白蛋白基因片段進行DNA序列測定和生物信息學(xué)分析。得到東方田鼠血清白蛋白基因的序列。根據(jù)東方田鼠血清白蛋白基因序列，推導(dǎo)其編碼產(chǎn)物為608個氨基酸殘基的多肽鏈。東方田鼠血清白蛋白基因在翻譯后的蛋白質(zhì)加工過程中，信號肽序列被剪切掉，形成成熟的血清白蛋白。
4.體外殺日本血吸蟲童蟲試驗。
將純化的東方田鼠血清白蛋白與日本血吸蟲童蟲一起培養(yǎng)，在光學(xué)顯微鏡下每24小時計數(shù)一次，連續(xù)計數(shù)96小時。以東方田鼠血清作為陽性對照，牛血清白蛋白作為陰性對照。分別計算活血吸蟲童蟲數(shù)與死血吸蟲童蟲數(shù)。
5.對感染血吸蟲的小白鼠的治療作用。
將小白鼠先感染日本血吸蟲尾蚴，再經(jīng)腹腔、靜脈或肌肉注射，使東方田鼠血清白蛋白進入小白鼠體內(nèi)，以牛血清白蛋白作為陰性對照。41天后，處死小白鼠，計算小白鼠體內(nèi)血吸蟲成蟲數(shù)、每克肝組織的蟲卵數(shù)，計算減蟲率和減卵率。
6.東方田鼠血清白蛋白真核表達產(chǎn)物的制備及應(yīng)用。
真核表達載體用限制性核酸內(nèi)切酶消化，將東方田鼠血清白蛋白基因插入真核表達載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，從大腸桿菌中提取重組真核表達載體。用重組真核表達載體轉(zhuǎn)染真核細胞(包括哺乳動物細胞、昆蟲細胞、酵母細胞等)，利用真核表達系統(tǒng)，在真核細胞中表達和生產(chǎn)東方田鼠血清白蛋白，并且分泌到細胞培養(yǎng)液中，收集含有白蛋白的細胞培養(yǎng)液。
含有東方田鼠血清白蛋白的細胞培養(yǎng)液用緩沖液I(0.05M KH2PO4，pH7.0)按1∶1稀釋，經(jīng)10000轉(zhuǎn)/每分鐘，離心去除不溶性物質(zhì)后，上樣于藍色瓊脂糖凝膠FF親和層析柱頂部。層析柱用緩沖液I洗脫，以去除未結(jié)合蛋白質(zhì)。隨后用緩沖液II(0.05M KH2PO4，1.5M KCl，pH7.0)對血清白蛋白進行洗脫，收集洗脫液。透析袋(透析分子量8000-14000 kDa)用緩沖液I透析平衡24小時(其間換液至少3次)。將洗脫液置于透析袋內(nèi)，4℃對水充分透析去鹽3天(其間換液至少6次)，真空冷凍干燥。用12％ SDS聚丙烯酰氨凝膠電泳，對純化的血清白蛋白進行純度鑒定。將純化的血清白蛋白與兔血清脫尾的血吸蟲童蟲一起培養(yǎng)，在光學(xué)顯微鏡下連續(xù)計數(shù)96小時，以東方田鼠血清作為陽性對照，觀察活日本血吸蟲童蟲數(shù)量。
7.含東方田鼠血清白蛋白基因重組真核表達載體的直接注射。
真核表達載體用限制性核酸內(nèi)切酶消化，將東方田鼠血清白蛋白基因插入真核表達載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提取重組真核表達載體。經(jīng)腹腔、靜脈或肌肉注射，使血清白蛋白基因進入小白鼠體內(nèi)，再感染日本血吸蟲尾蚴，41天后，處死小白鼠，數(shù)小白鼠體內(nèi)血吸蟲成蟲數(shù)、每克肝組織的蟲卵數(shù)，計算減蟲率和減卵率。
8.用病毒載體將東方田鼠血清白蛋白基因?qū)雱游矬w內(nèi)。
逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒等病毒載體用限制性核酸內(nèi)切酶消化，將東方田鼠血清白蛋白基因插入逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒等病毒載體，經(jīng)腹腔、靜脈或肌肉注射，使血清白蛋白基因進入小白鼠體內(nèi)，用于人、畜血吸蟲感染和血吸蟲病的預(yù)防和治療。在感染日本血吸蟲尾蚴前后，給予病毒介導(dǎo)的血清白蛋白基因，41天后，處死小白鼠，數(shù)小白鼠體內(nèi)血吸蟲成蟲數(shù)、每克肝組織的蟲卵數(shù)，計算減蟲率和減卵率。
9.東方田鼠血清白蛋白原核表達產(chǎn)物的制備及應(yīng)用。
原核表達載體用限制性核酸內(nèi)切酶消化，將東方田鼠血清白蛋白基因插入原核表達載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。經(jīng)過誘導(dǎo)后，在大腸桿菌中表達東方田鼠血清白蛋白。分離純化大腸桿菌中的東方田鼠血清白蛋白。在感染日本血吸蟲尾蚴前后，通過靜脈注射、腹腔注射、肌肉注射等方式給藥，用于人、畜血吸蟲感染和血吸蟲病的預(yù)防和治療。
10.使用蛋白質(zhì)工程技術(shù)，改變東方田鼠血清白蛋白基因的核苷酸序列，導(dǎo)致其氨基酸序列結(jié)構(gòu)改變，產(chǎn)生東方田鼠血清白蛋白突變體。使用東方田鼠血清白蛋白突變體，在感染日本血吸蟲尾蚴前后，通過靜脈注射、腹腔注射、肌肉注射等方式給藥，用于人、畜血吸蟲感染和血吸蟲病的預(yù)防和治療。
11.將東方田鼠血清白蛋白突變體基因插入真核表達載體，在感染日本血吸蟲尾蚴前后，通過靜脈注射、腹腔注射、肌肉注射等方式給藥，將血清白蛋白基因突變體導(dǎo)入體內(nèi)，用于人、畜血吸蟲感染和血吸蟲病的預(yù)防和治療。
12.將東方田鼠血清白蛋白突變體基因插入病毒(逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒等)載體，在感染日本血吸蟲前后，通過靜脈注射、腹腔注射、肌肉注射等方式給藥，將血清白蛋白基因?qū)塍w內(nèi)，用于人、畜血吸蟲感染和血吸蟲病的預(yù)防和治療。
13.將東方田鼠血清白蛋白突變體基因序列插入真核表達載體，利用真核表達系統(tǒng)，在真核細胞(包括哺乳動物細胞、昆蟲細胞、酵母細胞)中表達和生產(chǎn)東方田鼠指名亞種血清白蛋白突變體，用于人、畜血吸蟲感染和血吸蟲病的預(yù)防和治療。
14.將東方田鼠血清白蛋白突變體基因序列插入原核表達載體，利用原核表達系統(tǒng)，在原核細胞(包括大腸桿菌和其它細菌)中表達和生產(chǎn)東方田鼠指名亞種血清白蛋白突變體，用于人、畜血吸蟲感染和血吸蟲病的預(yù)防和治療。
15.將東方田鼠血清白蛋白基因和東方田鼠血清白蛋白基因突變體序列插入各種真核表達載體，包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、腺病毒載體等病毒載體，通過基因?qū)爰夹g(shù)，建立轉(zhuǎn)基因動物(包括水牛和其它家畜)，使這些動物對血吸蟲產(chǎn)生永久抗性，用于阻斷血吸蟲病的傳播和蔓延。
權(quán)利要求
1.東方田鼠血清白蛋白系利用親和層析法、聚丙烯酰氨凝膠電泳、透析、冷凍干燥，從東方田鼠長江亞種和寧夏指名亞種血清中分離得到。東方田鼠白蛋白對在體外培養(yǎng)的日本血吸蟲童蟲有明顯的殺滅作用，對在體內(nèi)接種血吸蟲尾蚴的小白鼠有明顯的預(yù)防和治療作用。將成年東方田鼠用乙醚麻醉，眼框取血。血液收集于試管中，冰箱4℃過夜，使血液凝固。血液凝固后，3000轉(zhuǎn)/每分鐘，離心5分鐘，收集血清。東方田鼠血清用緩沖液I(0.05M KH2PO4，pH7.0)按1∶1稀釋，經(jīng)10000rpm離心去除不溶性物質(zhì)后，上樣于藍色瓊脂糖凝膠FF親和層析柱頂部。層析柱用緩沖液I洗脫，以去除未結(jié)合蛋白質(zhì)。隨后用緩沖液II(0.05M KH2PO4，1.5MKCl，pH7.0)對血清白蛋白進行洗脫，收集洗脫液。透析袋(透析分子量8000～14000kDa)用緩沖液I透析平衡24小時(其間換液至少3次)。將含有血清白蛋白的洗脫液置于透析袋內(nèi)，4℃對水充分透析去鹽3天(其間換液至少6次)，真空冷凍干燥。用12％SDS聚丙烯酰氨凝膠電泳，對純化的白蛋白進行純度鑒定。
2.用Edman降解法對東方田鼠指名亞種(來自寧夏)和長江亞種血清白蛋白進行氨基端序列測定，并結(jié)合生物信息學(xué)分析技術(shù)，得到白蛋白的氨基酸序列。東方田鼠指名亞種血清白蛋白氨基酸序列為DAHKSEIAHRYNDLGEKYFKGLVLITFAQHLQKCPYEEHIKLVNEVTDFAKACAADESAENCDKSLHTLFGDKLCAIPNLGDNYAEMAECCAKQEPERNQCFLKHKDDKPSLPPFVRPEAEVMCTSFQENPASFMGHYLHAVARRHPYFYAPELLYYAEKQSAIMTECCAEADKAACLGPKLDALKEKALLSSVKQRLKCSSLEKFGERAFKAWAVARMSQKFPKADFAEITKLATDLTKVTQECCHGDLLECVDDRLELAKYMCDNQATISSKLHTCCDKPVLQKAHCLAEVDHDEMPADLTPLADDFVEDKDVCKNYAEAKDVFLGTFLYEYARRHPDYSVALLLRLAKKYEATLEKCCAEADPHACYGKVFDEFQPLVEEPKNLVKANCELFEKLGEYGFQNALLVRYTQKAPQVSTPTLVEVSRNLGKVGTKCCALPEADRLPCVEDYLSAILNHLCVLHEKTPVSEQVTKCCTGSVVERRPCFSALPVDEHYVPKEFKAESFTFHADICTLPDKEKQIKKQTALAELVKHKPKATGDQLKTVMGEFSAFLEKCCKADDKEACFSEEGPKLVATSQAALA東方田鼠長江亞種血清白蛋白氨基酸序列為DAHKSEIAHRYNDLGEKYFKGLVLITFAQHLQKCPYEEHIKLVNEVTDFAKACAADESAENCDKSLHTLFGDKLCAIPNLGDNYAEMAECCAKQEPERNQCFLKHKDDKPNLPPFVRPEAEVMCTSFQENPASFMGHYLHAVARRHPYFYAPELLYYAEKQSAIMTECCAEADKAACLGPKLDALKEKALLSSVKQRLKCSSLEKFGERAFKAWAVARMSQKFPKADFAEITKLATDLTKVTQECCHGDLLECADDRLELAKYMCDNQATISSKLHTCCDKPVLQKAHCLAEVDHDEMPADLTPLADDFVEDKDVCKNYAEAKDVFLGTFLYEYARRHPDYSVALLLRLAKKYEATLEKCCAEADPHACYGKVFDEFQPLVEEPKNLVKANCELFEKLGEYGFQNALLVRYTQKAPQVSTPTLVEVSRNLGKVGTKCCALPEADRLPCVEDYLSAILNHLCVLHEKTPVSEQVTKCCTGSVVERRPCFSALPVDEHYVPKEFKAESFTFHADICTLPDKEKQIKKQTALAELVKHKPKATGDQLKTVMGEFSAFLEKCCKADDKEACFSEEGPKLVATSQAALA
3.根據(jù)小白鼠白蛋白基因的序列，設(shè)計如下引物ALBUMIN1 5′-ACCGGAATTCTAGCCTCTGGCAAAATGA-3′ALBUMIN2 5′-CCGGAATTCAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′在乙醚麻醉下，處死動物，取東方田鼠肝臟，提取總RNA，使用引物ALBUMIN1和ALBUMIN2，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)，對東方田鼠白蛋白基因進行體外擴增。將擴增的基因片段進行DNA序列測定和生物信息學(xué)分析，得到東方田鼠白蛋白基因的序列。東方田鼠指名亞種血清白蛋白基因的核苷酸序列為TAGCCTCTGGCAAAATGAAGTGGGTAACTTTCCTCCTCCTTCTCTTTGTCTCCGGCTCTGCTTTTTCCAGGGGCTTGTTTCGCCGAGATGCACACAAGAGTGAGATCGCTCATCGGTACAATGATTTGGGAGAAAAATATTTCAAAGGCCTAGTCTTGATCACCTTCGCCCAGCATCTCCAGAAATGCCCGTATGAAGAACACATAAAATTAGTGAATGAGGTAACCGACTTTGCAAAGGCATGTGCTGCTGACGAGTCTGCTGAAAACTGTGACAAGTCACTTCACACTCTTTTTGGAGATAAGCTTTGTGCCATCCCAAATCTTGGTGATAACTATGCTGAGATGGCTGAGTGCTGCGCCAAACAAGAACCTGAGAGAAACCAATGTTTCCTGAAACACAAGGATGACAAGCCCAGCCTGCCCCCCTTTGTGAGGCCAGAGGCTGAGGTCATGTGCACCTCCTTCCAGGAAAATCCTGCTTCATTTATGGGACACTATCTGCACGCAGTTGCCAGAAGACATCCTTATTTCTATGCCCCTGAGCTCCTTTACTATGCTGAGAAGCAAAGTGCCATCATGACCGAGTGCTGTGCCGAAGCTGACAAAGCCGCCTGCCTGGGACCAAAGCTTGATGCTCTGAAGGAGAAAGCGCTGCTTTCCTCTGTCAAGCAGAGACTGAAGTGCTCCAGCCTGGAGAAATTTGGAGAGAGAGCTTTCAAAGCATGGGCAGTAGCTCGTATGAGCCAGAAATTCCCCAAAGCTGACTTCGCAGAAATTACCAAACTGGCAACAGACCTCACCAAAGTCACCCAGGAGTGCTGCCATGGCGACCTGCTTGAGTGCGTAGACGACAGGTTGGAACTCGCCAAGTACATGTGTGATAACCAAGCAACCATCTCTAGCAAACTGCACACTTGCTGTGACAAACCCGTGCTGCAGAAAGCCCATTGCCTTGCTGAGGTGGACCATGATGAGATGCCTGCTGATCTGACCCCACTGGCTGATGATTTTGTTGAGGATAAGGACGTGTGCAAGAACTATGCGGAAGCCAAAGACGTCTTCCTGGGCACGTTTTTGTATGAATATGCAAGAAGGCACCCTGACTACTCTGTGGCCTTGCTGCTGAGGCTCGCTAAGAAATACGAAGCCACCTTGGAAAAGTGCTGTGCTGAAGCTGACCCTCATGCCTGCTACGGCAAAGTGTTTGATGAATTCCAGCCTCTTGTAGAAGAGCCTAAGAACTTAGTCAAAGCTAACTGTGAACTTTTTGAGAAGCTTGGAGAGTATGGATTCCAAAATGCGCTCCTAGTGCGTTACACCCAGAAAGCACCTCAGGTGTCAACTCCAACTCTCGTCGAAGTCTCAAGAAACCTAGGAAAAGTGGGCACCAAGTGCTGTGCGCTCCCTGAAGCAGACAGACTGCCATGCGTGGAAGACTATCTCTCTGCCATCCTCAACCATTTGTGTGTGCTGCACGAGAAGACCCCAGTGAGTGAGCAGGTCACCAAGTGCTGTACTGGCTCCGTGGTGGAAAGGCGACCTTGCTTCTCTGCTCTGCCAGTTGATGAACATTATGTCCCCAAAGAATTTAAAGCCGAATCCTTCACCTTCCATGCCGACATCTGCACACTTCCAGACAAGGAGAAGCAGATAAAGAAACAAACCGCCCTTGCTGAGCTCGTGAAACACAAACCCAAGGCCACAGGTGACCAGTTGAAGACCGTGATGGGCGAGTTCTCAGCTTTCTTGGAAAAGTGCTGCAAGGCTGACGACAAGGAGGCCTGCTTCTCTGAAGAGGGTCCAAAACTTGTTGCTACGAGCCAAGCTGCCTTAGCCTAAATACATCACAAGCATCTCAGTTTACCCTGAGAAAAAGAGAGACCTGAAGACTCATCTTTTGTGTTGGTGTAAAATCAACACCCTAAGGAACAAAAATTTCTTTAAACATTTAACTTCTTTTCTCTGTATTGCAATTAATAAAAAATGAAAAGAATCTAAAAAAAAAAAAAAAAAA東方田鼠長江亞種血清白蛋白基因的核苷酸序列為TAGCCTCTGGCAAAATGAAGTGGGTAACTTTCCTCCTCCTTCTCTTTGTCTCCGGCTCTGCTTTTTCCAGGGGCTTGTTTCGCCGAGATGCACACAAGAGTGAGATCGCTCATCGGTACAATGATTTGGGAGAAAAATATTTCAAAGGCCTAGTCTTGATCACCTTCGCCCAGCATCTCCAGAAATGCCCGTATGAAGAACACATAAAATTAGTGAATGAGGTAACCGACTTTGCAAAGGCATGTGCTGCTGACGAGTCTGCTGAAAACTGTGACAAGTCACTTCACACTCTTTTTGGAGATAAGCTTTGTGCCATCCCAAATCTTGGTGATAACTATGCTGAGATGGCTGAGTGCTGCGCCAAACAAGAACCTGAGAGAAACCAATGTTTCCTGAAACACAAGGATGACAAGCCCAATCTGCCCCCCTTTGTGAGGCCAGAGGCTGAGGTCATGTGCACCTCCTTCCAGGAAAATCCTGCTTCATTTATGGGACACTATCTGCACGCAGTTGCCAGAAGACATCCTTATTTCTATGCCCCTGAGCTCCTTTACTATGCTGAGAAGCAAAGTGCCATCATGACCGAGTGCTGTGCCGAAGCTGACAAAGCCGCCTGCCTGGGACCAAAGCTTGATGCTCTGAAGGAGAAAGCGCTGCTTTCCTCTGTCAAGCAGAGACTGAAGTGCTCCAGCCTGGAGAAATTTGGAGAGAGAGCTTTCAAAGCATGGGCAGTAGCTCGTATGAGCCAGAAATTCCCCAAAGCTGACTTCGCAGAAATTACCAAACTGGCAACAGACCTCACCAAAGTCACCCAGGAGTGCTGCCATGGCGACCTGCTTGAGTGCGCAGACGACAGGTTGGAACTCGCCAAGTACATGTGTGATAACCAAGCAACCATCTCTAGCAAACTGCACACTTGCTGTGACAAACCCGTGCTGCAGAAAGCCCATTGCCTTGCTGAGGTGGACCATGATGAGATGCCTGCTGATCTGACCCCACTGGCTGATGATTTTGTTGAGGATAAGGACGTGTGCAAGAACTATGCGGAAGCCAAAGACGTCTTCCTGGGCACGTTTTTGTATGAATATGCAAGAAGGCACCCTGACTACTCTGTGGCCTTGCTGCTGAGGCTCGCTAAGAAATACGAAGCCACCCTGGAAAAGTGCTGTGCTGAAGCTGACCCTCATGCCTGCTACGGCAAAGTGTTTGATGAATTCCAGCCTCTTGTAGAAGAGCCTAAGAACTTAGTCAAAGCTAACTGTGAACTTTTTGAGAAGCTTGGAGAGTATGGATTCCAAAATGCGCTCCTAGTGCGTTACACCCAGAAAGCACCTCAGGTGTCAACTCCAACTCTCGTCGAAGTCTCAAGAAACCTAGGAAAAGTGGGCACCAAGTGCTGTGCGCTCCCTGAAGCAGACAGACTGCCATGCGTGGAAGACTATCTCTCTGCCATCCTCAACCATTTGTGTGTGCTGCACGAGAAGACCCCAGTGAGTGAGCAGGTCACCAAGTGCTGTACTGGCTCCGTGGTGGAAAGGCGACCTTGCTTCTCTGCTCTGCCAGTTGATGAACATTATGTCCCCAAAGAATTTAAAGCCGAATCCTTCACCTTCCATGCCGACATCTGCACACTTCCAGACAAGGAGAAGCAGATAAAGAAACAAACCGCCCTTGCTGAGCTCGTGAAACACAAACCCAAGGCCACAGGTGACCAGTTGAAGACCGTGATGGGCGAGTTCTCAGCTTTCTTGGAAAAGTGCTGCAAGGCTGACGACAAGGAGGCCTGCTTCTCTGAAGAGGGTCCAAAACTTGTTGCTACAAGCCAAGCTGCCTTAGCCTAAATACATCACAAGCATCTCAGTTTACCCTGAGAAGAAGAGAGACCTGAAGACTCATCTTTTGTGTTGGTGTAAAATCAACACCCTAAGGAACAAAAATTTCTTTAAACATTTAACTTCTTTTCTCTGTATTGCAATTAATAAAAAATGAAAAGAATCTAAAAAAAAAAAAAAAAA根據(jù)東方田鼠血清白蛋白基因序列，推導(dǎo)其編碼產(chǎn)物為608個氨基酸的白蛋白前體。東方田鼠指名亞種血清白蛋白前體氨基酸序列為MKWVTFLLLLFVSGSAFSRGLFRRDAHKSEIAHRYNDLGEKYFKGLVLITFAQHLQKCPYEEHIKLVNEVTDFAKACAADESAENCDKSLHTLFGDKLCAIPNLGDNYAEMAECCAKQEPERNQCFLKHKDDKPSLPPFVRPEAEVMCTSFQENPASFMGHYLHAVARRHPYFYAPELLYYAEKQSAIMTECCAEADKAACLGPKLDALKEKALLSSVKQRLKCSSLEKFGERAFKAWAVARMSQKFPKADFAEITKLATDLTKVTQECCHGDLLECVDDRLELAKYMCDNQATISSKLHTCCDKPVLQKAHCLAEVDHDEMPADLTPLADDFVEDKDVCKNYAEAKDVFLGTFLYEYARRHPDYSVALLLRLAKKYEATLEKCCAEADPHACYGKVFDEFQPLVEEPKNLVKANCELFEKLGEYGFQNALLVRYTQKAPQVSTPTLVEVSRNLGKVGTKCCALPEADRLPCVEDYLSAILNHLCVLHEKTPVSEQVTKCCTGSVVERRPCFSALPVDEHYVPKEFKAESFTFHADICTLPDKEKQIKKQTALAELVKHKPKATGDQLKTVMGEFSAFLEKCCKADDKEACFSEEGPKLVATSQAALA東方田鼠長江亞種血清白蛋白前體氨基酸序列為MKWVTFLLLLFVSGSAFSRGLFRRDAHKSEIAHRYNDLGEKYFKGLVLITFAQHLQKCPYEEHIKLVNEVTDFAKACAADESAENCDKSLHTLFGDKLCAIPNLGDNYAEMAECCAKQEPERNQCFLKHKDDKPNLPPFVRPEAEVMCTSFQENPASFMGHYLHAVARRHPYFYAPELLYYAEKQSAIMTECCAEADKAACLGPKLDALKEKALLSSVKQRLKCSSLEKFGERAFKAWAVARMSQKFPKADFAEITKLATDLTKVTQECCHGDLLECADDRLELAKYMCDNQATISSKLHTCCDKPVLQKAHCLAEVDHDEMPADLTPLADDFVEDKDVCKNYAEAKDVFLGTFLYEYARRHPDYSVALLLRLAKKYEATLEKCCAEADPHACYGKVFDEFQPLVEEPKNLVKANCELFEKLGEYGFQNALLVRYTQKAPQVSTPTLVEVSRNLGKVGTKCCALPEADRLPCVEDYLSAILNHLCVLHEKTPVSEQVTKCCTGSVVERRPCFSALPVDEHYVPKEFKAESFTFHADICTLPDKEKQIKKQTALAELVKHKPKATGDQLKTVMGEFSAFLEKCCKADDKEACFSEEGPKLVATSQAALA東方田鼠血清白蛋白基因在翻譯后的蛋白質(zhì)加工過程中信號肽序列被剪切掉。白蛋白信號肽序列如下MKWVTFLLLLFVSGSAFSRGLFRR
4.使用基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)，改變東方田鼠血清白蛋白和白蛋白基因的一級結(jié)構(gòu)，或者通過化學(xué)修飾而改變該白蛋白中氨基酸的化學(xué)性質(zhì)，而獲得白蛋白和白蛋白基因的突變體。
5.通過經(jīng)靜脈、腹腔或肌肉注射，利用東方田鼠血清白蛋白及其突變體對人、畜血吸蟲感染和血吸蟲病進行預(yù)防和治療。
6.上述東方田鼠血清白蛋白基因及其突變體的DNA序列插入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、腺病毒載體等病毒載體，并包裝成有感染能力的病毒顆粒，純化后，經(jīng)靜脈、腹腔或肌肉注射，用于人、畜血吸蟲感染和血吸蟲病的預(yù)防和治療。
7.上述東方田鼠血清白蛋白基因及其突變體的DNA序列插入其它真核表達載體，經(jīng)靜脈、腹腔或肌肉直接注射，用于人、畜血吸蟲感染和血吸蟲病的預(yù)防和治療。
8.上述東方田鼠血清白蛋白基因及其突變體的DNA序列插入真核表達載體，利用真核表達系統(tǒng)，在真核細胞(包括哺乳動物細胞、昆蟲細胞、酵母細胞等)中表達和生產(chǎn)抗性蛋白質(zhì)，用于人、畜血吸蟲感染和血吸蟲病的預(yù)防和治療。
9.上述東方田鼠血清白蛋白基因及其突變體的DNA序列插入原核表達載體，利用原核表達系統(tǒng)，在原核細胞(包括大腸桿菌和其它細菌)中表達和生產(chǎn)抗性蛋白質(zhì)，用于人、畜血吸蟲感染和血吸蟲病的預(yù)防和治療。
10.上述東方田鼠血清白蛋白基因及其突變體的DNA序列插入各種真核表達載體，包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、腺病毒載體等病毒載體，通過基因?qū)爰夹g(shù)，建立轉(zhuǎn)基因動物(包括水牛和其它家畜)，使這些動物對血吸蟲產(chǎn)生永久抗性，用于阻斷血吸蟲病的傳播和蔓延。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種殺滅日本血吸蟲童蟲及預(yù)防、治療日本血吸蟲感染的蛋白質(zhì)序列和相應(yīng)基因序列及其用途。該蛋白質(zhì)系利用親和層析法、聚丙烯酰氨凝膠電泳、透析、冷凍干燥和蛋白質(zhì)氨基端測序，從東方田鼠血清中分離得到血清白蛋白。利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，獲得東方田鼠血清白蛋白基因序列。將該基因以及修飾后的突變體插入真核表達載體，導(dǎo)入動物體內(nèi)，可用于日本血吸蟲感染的基因預(yù)防和治療?？衫没蚬こ碳夹g(shù)，生產(chǎn)東方田鼠血清白蛋白及其突變體，用于血吸蟲病的預(yù)防和治療。通過建立轉(zhuǎn)基因動物，使疫區(qū)動物對日本血吸蟲產(chǎn)生永久性抗性，阻斷日本血吸蟲的傳播和血吸蟲病的蔓延。
文檔編號C12N15/12GK1800215SQ20051003232
公開日2006年7月12日 申請日期2005年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月1日
發(fā)明者胡維新, 鄔國軍, 秦志強 申請人:中南大學(xué)