專利名稱：日本血吸蟲Frizzled9基因、蛋白及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種日本血吸蟲Frizzled9基因、蛋白 及用途。
背景技術(shù)：
日本血吸蟲病是一種分布廣泛、危害嚴重的人畜共患寄生蟲病。至今仍有76個國 家、近2億人口受到該病的威脅。近20年來，我國對日本血吸蟲病的防治主要依賴于藥物 (吡喹酮)化療為主的綜合措施，但長期單一用藥不能解決重復感染問題，也容易引發(fā)血吸 蟲的耐藥性，因此新的治療藥物亟待開發(fā)。然而，要使新藥研究取得突破性進展，充分了解 血吸蟲的生長發(fā)育過程及其相關(guān)的調(diào)控機制是重要基礎(chǔ)。日本血吸蟲生活史復雜，在終末宿主體內(nèi)蟲體的生長發(fā)育過程都呈現(xiàn)顯著的生物 學和形態(tài)學變化，但是，以往研究者對血吸蟲的研究主要集中于表觀生物學及組織化學層 面，對于蟲體復雜的生長發(fā)育調(diào)控機理缺乏認識，因而在新藥開發(fā)方面沒有新的突破。生物 體的生長發(fā)育由細胞間的信號網(wǎng)路系統(tǒng)調(diào)控，日本血吸蟲也不例外。另外，全基因組測序分 析發(fā)現(xiàn)，日本血吸蟲存在Wnt、Notch等信號通路。因此對信號通路的研究有助于更好的理 解血吸蟲生長發(fā)育機制，也為新藥的開發(fā)提供新思路。其中，Wnt信號通路普遍存在于果蠅、小鼠、爪蟾等真核生物中，是調(diào)控胚胎發(fā)育以 及成年生物體內(nèi)環(huán)境平衡的重要信號途徑。許多研究報道發(fā)現(xiàn)該通路的異常調(diào)控會導致 胚胎發(fā)育發(fā)生表型突變，甚至腫瘤等疾病的產(chǎn)生。Wnt信號通路的激活，是由Wnt信號分子 (一種分泌性糖蛋白)，與細胞膜表面的Frizzled(Fz)家族受體結(jié)合觸發(fā)下游信號的傳遞， 且涉及許多不同的信號元件。關(guān)于Wnt信號通路如何調(diào)控日本血吸蟲生長發(fā)育的分子機制已經(jīng)展開初步研究， 目前已克隆到SjWnt4信號分子(陶麗紅，姚利曉，傅志強等。日本血吸蟲信號轉(zhuǎn)導蛋白 SjWnt4基因的克隆、表達及功能分析。生物工程學報2007年5月，23卷3期392-397)和 SjWntlOa信號分子(陶麗紅，姚麗曉，苑純秀等。日本血吸蟲信號轉(zhuǎn)導蛋白SjWntlOa基因的 克隆及其在童蟲和成蟲中mRNA表達量的變化。中國獸醫(yī)科學，2007，37 (02) :93_97)、SjFz5 和SjFz7受體分子及其他成員組分，還有待于對它們進行具體的生物學功能分析。Wnt信 號分子(配體)與Fz受體的相互作用是Wnt途徑的啟始步驟，闡明它們的相互作用機制， 對了解血吸蟲WNT途徑的發(fā)育生物學功能具有重要意義。此外，由于一種Wnt可能和Fz受 體家族不同成員作用，不同的Wnt也可能作用于同一種Fz受體，即受配體的結(jié)合主要取決 于Fz受體及其所在的組織環(huán)境，因此有必要對日本血吸蟲Fz家族成員的種類、表達特征、 組織分布等進行研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決由于對日本血吸蟲的生長發(fā)育調(diào)控機制缺乏認識而導致在新藥研 發(fā)方面難以取得突破的技術(shù)問題，提供一種日本血吸蟲FriZZled9基因(簡稱SjFz9基因)和蛋白，該S jFz9基因是日本血吸蟲Fz受體家族的新成員，參與調(diào)控血吸蟲的生長發(fā)育及 生殖系統(tǒng)發(fā)育，對開發(fā)控制血吸蟲生長發(fā)育及生殖生理的新藥具有較高的應(yīng)用價值。此外，還需要提供一種日本血吸蟲FriZZled9基因和蛋白質(zhì)的用途。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)在本發(fā)明的一個方面，提供了一種日本血吸蟲基因，所述基因具有編碼Frizzled 家族蛋白的核苷酸序列，該核苷酸序列包含下述DNA序列之一(1)編碼SEQ ID NO. 1氨基酸序列的DNA序列；(2)編碼SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列中缺失、添加、插入或取代一個或多個氨基 酸所得到的具有SEQ ID NO. 1相同活性的氨基酸序列的DNA序列。優(yōu)選的，所述基因具有SEQ ID NO. 2所示的DNA序列。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種日本血吸蟲蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)選自(1)具有SEQ ID NO. 1氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(2)具有SEQ ID NO. 1中部分氨基酸序列的活性片段或保守性變異蛋白質(zhì)；(3) SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列中缺失、添加、插入或取代一個或多個氨基酸所 得到的具有SEQ ID NO. 1相同活性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。優(yōu)選的，所述蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列。在本發(fā)明中，由于體內(nèi)或純化期間蛋白質(zhì)本身的修飾等或由于編碼蛋白基因的多 態(tài)性及變異，天然存在的蛋白質(zhì)會出現(xiàn)氨基酸的缺失、添加、插入、取代或其他變異。事實 上，存在著一些生理和生物活性上基本等同于無變異蛋白質(zhì)的蛋白。這些結(jié)構(gòu)不同于相應(yīng) 的蛋白質(zhì)但與該蛋白質(zhì)沒有明顯的功能差異的多肽或蛋白稱為功能等同變異體。功能等同變異體同樣適用于通過人工手段向一種蛋白質(zhì)的氨基酸序列中導入這 類變異而制成的多肽。盡管這樣能獲得更多不同形式的變異體，但所得的變異體作為功能 等同變異體的前提是其生理活性基本等同于原始無變異蛋白質(zhì)的活性。例如，人白介素2(IL_2)的氨基酸序列中用絲氨酸替換特定的半胱氨酸殘基所得 到的多肽仍保留著IL-2的活性[Science，224，1431 (1984)]。此外，在用基因工程方法生產(chǎn)蛋白質(zhì)時，常把所需蛋白質(zhì)表達為融合蛋白質(zhì)，例 如，把源于其他蛋白質(zhì)的N-末端肽鏈加到所需蛋白質(zhì)的N-末端以提高所需蛋白質(zhì)的表達， 或者把一個合適的肽鏈加到所需蛋白的N-或C-末端，表達該蛋白并使用一種對所加肽鏈 具有親和力的載體使所需蛋白的純化變得更加容易。就決定基因上特定氨基酸的密碼子(三聯(lián)體堿基組合)而言，每種氨基酸存在1 到6個密碼子。因此盡管依賴于氨基酸序列，但仍有許多編碼一種氨基酸的基因。在自然 界中，基因并不穩(wěn)定，常發(fā)生核酸變異?；虻淖儺惪赡懿挥绊懰幋a的氨基酸序列(沉默 變異)，這種情況下，會產(chǎn)生編碼相同氨基酸序列的不同基因。因此，即使分離出了編碼特定 氨基酸序列的基因，隨著含有該基因生物體的傳代，仍不可避免地會產(chǎn)生編碼相同氨基酸 序列的不同基因。用各種基因工程技術(shù)人工產(chǎn)生編碼相同氨基酸序列的各種基因并不困難。例如， 當編碼所需蛋白質(zhì)的天然基因的密碼子在用于以基因工程技術(shù)產(chǎn)生蛋白質(zhì)的宿主中可利 用性較低、表達的蛋白量不夠時，可以人工將密碼子轉(zhuǎn)變成在該宿主中可利用性高的另一 密碼子而不改變所編碼的氨基酸序列，即可增強所需蛋白質(zhì)的表達。因此，這類人工生產(chǎn)的不同多核苷酸也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要它能編碼出本發(fā)明公開的氨基酸序列即可。另外，由至少一種改變(如蛋白質(zhì)的氨基酸序列中有一個或多個氨基酸殘基的缺 失、添加、插入或取代)所得的多肽或蛋白一般具有功能上等同于所述蛋白質(zhì)的活性，編碼 這類多肽或蛋白的基因也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，不管它是從天然來源分離還是人工生產(chǎn) 的。一般的，編碼功能等同變異體的基因是同源的。因此，能與本發(fā)明的基因雜交且編 碼具有FriZZled9受體活性的蛋白質(zhì)的核酸分子也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種包含上述日本血吸蟲基因DNA序列的全部或 部分序列的重組載體。所述重組載體包括重組克隆載體或重組表達載體，重組表達載體包括重組原核表 達載體、重組真核表達載體。優(yōu)選的，所述重組載體包含編碼SEQ ID NO. 1中55-244位氨基酸序列的DNA序列。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種宿主細胞，包含上述重組載體，或已用上述基 因序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種上述日本血吸蟲基因的用途，用于制備預防 或治療血吸蟲病的藥物；或用于篩選預防或治療血吸蟲病的藥物。所述藥物通過阻斷血吸蟲生長發(fā)育或阻斷血吸蟲生殖系統(tǒng)發(fā)育來發(fā)揮作用。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種上述日本血吸蟲蛋白質(zhì)的用途，用于制備預 防或治療血吸蟲病的藥物；或用于篩選預防或治療血吸蟲病的藥物。所述藥物通過阻斷血吸蟲生長發(fā)育或阻斷血吸蟲生殖系統(tǒng)發(fā)育來發(fā)揮作用。本發(fā)明日本血吸蟲FriZZled9基因，是日本血吸蟲Fz受體家族的新成員。實時熒 光定量PCR分析結(jié)果表明SjFz9基因可能介導了童蟲階段的發(fā)育及產(chǎn)卵初期、高峰期雌雄 蟲的發(fā)育調(diào)控；免疫組化實驗結(jié)果顯示SjFz9基因可能與日本血吸蟲的運動相關(guān)，并且還 參與調(diào)控血吸蟲成蟲生殖系統(tǒng)的發(fā)育，為開發(fā)阻斷蟲體發(fā)育的新藥提供了新思路。


下面結(jié)合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進一步詳細的說明。圖1是本發(fā)明實施例1簡并PCR反應(yīng)產(chǎn)物的電泳檢測圖；圖2是本發(fā)明實施例1的SjFz9基因的3’和5’ RACE產(chǎn)物電泳鑒定圖；圖3是本發(fā)明實施例1利用生物信息學工具在線預測SjFz9蛋白的結(jié)構(gòu)圖；圖4是本發(fā)明實施例1不同物種的Frizzled 9分子親緣關(guān)系和進化分析圖；圖5是本發(fā)明實施例2的SjFz9基因在日本血吸蟲不同發(fā)育階段的mRNA表達水 平差異分析圖；圖6是本發(fā)明實施例3重組原核表達質(zhì)粒PET28a-SjFz9的酶切鑒定圖；圖7是本發(fā)明實施例3重組蛋白經(jīng)純化后的SDS-PAGE電泳圖；圖8是本發(fā)明實施例3的pET28a-SjFz9重組表達蛋白的Western-blot鑒定圖；圖9是本發(fā)明實施例3的SjFz9多抗的Western-blot檢測圖；圖10是本發(fā)明實施例3免疫組化分析SjFz9蛋白在日本血吸蟲童蟲、成蟲體壁肌 肉層細胞的定位圖11是本發(fā)明實施例3免疫組化分析SjFz9蛋白在日本血吸蟲成蟲生殖細胞的 定位圖。
具體實施例方式下列實施例中，未注明具體條件的實驗方法，通常按常規(guī)條件，如《分子克隆實驗 指南》(J.薩姆布魯克，D. W.拉塞爾著，黃培堂，汪嘉璽，朱厚礎(chǔ)，等譯.第3版，北京科學 出版社，2002)中所述的方法進行。本發(fā)明利用簡并引物PCR方法從日本血吸蟲13d童蟲cDNA中獲得Frizzled家族 新成員一-Fz9同源的EST，然后通過RACE技術(shù)獲得全長cDNA，再利用生物信息學軟件分析 該基因及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，該基因具有Fz家族受體的基本結(jié)構(gòu)特征含有一 個信號肽，一段保守的半胱氨酸富集區(qū)(CRD，也是Wnt信號分子的區(qū)域)，和一段七次跨膜 疏水區(qū)。利用熒光實時定量PCR方法分析了 SjFz9基因在日本血吸蟲發(fā)育的不同時期的 mRNA表達圖式。成功制備了能夠特異性識別天然蟲體中SjFz9蛋白的多克隆抗體，并以該 制備的多抗作為一抗，利用免疫組化方法對SjFz9蛋白進行組織定位研究分析，實驗結(jié)果 顯示SjFz9可能與日本血吸蟲的運動相關(guān)，并且還參與調(diào)控血吸蟲成蟲生殖系統(tǒng)的發(fā)育。 表明該SjFz9基因編碼蛋白可能對控制血吸蟲生長發(fā)育及生殖生理的新藥開發(fā)具有較高 的應(yīng)用價值。實施例lSjFz9新基因的克隆1.血吸蟲蟲體材料的收集及總RNA的提取 日本血吸蟲(安徽株)尾蚴感染雄性新西蘭雜交兔(3kg/只)，腹部貼片，2，000 10，000條每只。在標準衛(wèi)生條件下飼養(yǎng)，以肝門靜脈灌注法收集感染兔體內(nèi)不同期別的 蟲體，包括 7d、13d、18d、23d、26d、29d、32d、35d、42d 和 50d 蟲體，并將 26d，32d，35d，42d 和 50d蟲體進行雌雄分開。將感染42d的兔肝組織剪碎、勻漿后，通過多重篩網(wǎng)過濾純化方法 收集兔肝組織中的蟲卵。Trizol (invitrogen)抽提蟲卵及各期別蟲體總RNA(具體操作參 照Trizol說明書進行)，DNase I (Takara)除去殘留DNA。1 %非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA完整性，分光光度計(Eppendorf A G, Hambury)檢測濃度，DEPC水溶解的RNA于_80°C 冰箱保存。2.日本血吸蟲Fz9EST新基因的獲得參考文獻(Daudet N, Ripoll C, Moles JP, et al. Expression of members of Wnt andFrizzled gene families in the postnatal rat cochlea. Mol Brain Res, 2002,105 98-107 ；Wang Y, Macke JP, Abel la BS, et al. A large fami Iy of putative transmembrane receptorshomologous to the product of the Drosophila tissue polarity gene frizzled. J BiolChem. 1996，271 4468-4476)，根據(jù)已獲得的兩個日 本血吸蟲 Frizzled 受體SjFz5 (Genbank 登錄號EU370926)、SjFz7 (Genbank 登錄號 EU370927)，與其他物種的Fz家族成員比對結(jié)果，選取YPERP、WffVIL及VGIT氨基酸保守位 點，根據(jù)氨基酸的簡并性設(shè)計簡并引物(見表1)，引物由英俊生物技術(shù)公司合成。表1釣取日本血吸蟲Fz家族新基因的PCR反應(yīng)簡并引物
NNNGAATTCTAYCCNGARMGNCCNAT (SEQ ID NO. 3) NNNAAGCTTNARNAYNACCCACCA (SEQ ID NO. 4) NNNGAATTCTAYCCNGARMGNCCNAT (SEQ ID NO. 5) NNNAAGCTTNGTDTANCCNTC (SEQ ID NO. 6)表1中，F(xiàn) 上游引物，R 下游引物；根據(jù)核苷酸標準命名法確定簡并引物序列(N =A/C/G/T ；R = A/G ；M = A/C ；Y = C/T ；D = A/G/T)。以保存的血吸蟲13天童蟲cDNA為模板進行touch-up PCR。PCR反應(yīng)條件 94 °C 5min ； (94 °C lmin，50 °C 1. 5min，72 °C 2min) X5cycles ； (94 °C lmin，53 °C 1. 5min, 72°C 2min) X35cycles ；72°C再延伸lOmin。Touch-up PCR開始以低于理論Tm值的溫度退 火，確保引物能與模板結(jié)合；然后逐漸升高退火溫度，隨著循環(huán)的增加特異性擴增產(chǎn)物得到 積累，最終得到較特異的PCR產(chǎn)物。1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，目的片段切膠 回收后與pGEM-T Easy載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，PCR鑒定為陽性的克隆 由上海桑尼生物科技有限公司測序。結(jié)果以簡并引物進行touch-up PCR(上升PCR)可見多個條帶(見圖1)。在圖1 中，1 以Fzpl/2為引物對進行PCR反應(yīng)的產(chǎn)物；2 以Fzpl/3引物對進行PCR反應(yīng)的產(chǎn)物。 由設(shè)計引物的保守氨基酸序列間長度推測產(chǎn)物長度在200 400bp之間，選擇圖1中箭頭 所指約250bp大小的條帶進行克隆。挑選150個陽性克隆測序，測序結(jié)果經(jīng)blastx在線 分析，發(fā)現(xiàn)其中一個克隆的序列與其它物種Fz家族成員相似，且不同于已獲得的SjFz5和 SjFz7基因，是血吸蟲Fz家族的新成員。3.日本血吸蟲SjFz9新基因全長克隆及生物信息學分析利用RACE (rapid amplication of cDNA ends, cDNA 末端快速擴增技術(shù))方法獲 得SjFz9基因全長序列。以獲得的SjFz9EST序列為模板設(shè)計3’和5’RACE引物(見表2)。 利用 SMARTTMRACE cDNA Amplification kit (clontech)將 13d 童蟲 RNA 反轉(zhuǎn)錄成 3，race ready CDNA*5，raCe ready cDNA(參照試劑盒說明書完成)。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢 測PCR產(chǎn)物，擴增片段切膠回收后與pMD18T載體(TaKaRa)連接，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細胞， 陽性克隆測序結(jié)果用gene tool軟件進行電子拼接。利用常規(guī)生物信息學軟件對SjFz9基 因及其編碼蛋白結(jié)構(gòu)進行預測分析。表 結(jié)果以該克隆序列為模板，利用引物3，GSP1/NGSP1和5，GSP1/NGSP1 (表2)進行3， 和5，RACE PCR (RACE PCR產(chǎn)物電泳鑒定圖見圖2)。圖2中，1 :3，RACE產(chǎn)物；2 :5，RACE產(chǎn)物。其中箭頭所指片段為切膠回收作克隆用。利用gene tool軟件將兩端延伸后的序列與 模板序列進行拼接，拼接后的序列(2572bp)在NCBI網(wǎng)站的ORF Finder及blastp在線分 析，預測的ORF編碼的Fz蛋白結(jié)構(gòu)不完整。在首次拼接序列基礎(chǔ)上再設(shè)計3’ GSP2/NGSP2 和5，GSP2/NGSP2(表2)，進行第二次RACE延伸。同樣方法拼接得到的序列為3670bp，再 次預測出的ORF編碼蛋白具有Fz家族蛋白的完整結(jié)構(gòu)，至此獲得了血吸蟲Frizzled家族 新成員的全長cDNA序列。氨基酸序列相似性分析顯示，該新獲得Fz家族成員與其他物種 的Fz9相似性最高，其中與斑馬魚、小鼠和人的同源性分別為33%、32%和31%，因此將該 新獲得的基因命名為日本血吸蟲FriZZled9基因，簡稱SjFz9基因。SjFz9 基因的 cDNA 全長 3670bp(SEQ ID NO. 2)，146 2917bp 為編碼區(qū)序列，編碼 923個氨基酸。理論相對分子量為103. 97Ku，理論等電點8. 65。SjFz9基因的核苷酸和氨基酸序列如下，起始、終止密碼子均用方框標出；曲線標 出的序列為信號肽；連續(xù)10個半胱氨酸為保守的CRD結(jié)構(gòu)，推測為Wnt結(jié)合位點；下劃直線 處為七個跨膜區(qū)段。1ggtcmatmcmtttmcanatgmagatatattttcmgtgtatatttatgmtgtacttacttgta
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2471CATATTTGTGGGGATGTTGTOGCTGGTGATACTGTTGGAGMACTMTMTGTGTCCCMGraOVWfflA0132]776HICGDVVAGDTVGETNNVSQVDQKA0133]2546Q\ACTMTGMTA0GACTTGTTGTMTTCMGAG0GGaTGTGGAMMACM0Q\GTAT0Q\GGAAACmTG0134]801QLMNTTCCNSRAACGKNNQYPGNTM0135]2621MTTTOGATMTACMTGMCMTATTMOCAGCrGGTGGCrGATKIMAGTATCATCMCMCMQVOCM0136]826NFDNTMNNINQLVADSTQYHQQQHQ0137]2696MTGMATOGQVOGMACMOGTMGAAATTTMTGCmOGGATCMTTMQVTGTCMOGGMQmTCA0138]851NEIARNNVRNLMLSGSFNMSSGTAS0139]2771TGTACMGTGCKIACTATTATCMGGTTTAGGMCMTAAATATGTCMTATTAAATTCMTTGMTOCMT0140]876CTSAPLLSHGLGTINMSLLNSFESN0141]2846TATmOOOGTTQMMOGACMACMTTAMACTAGAOCMUrMTAOGGGMGAOCAGACrGT @ TTT0142]901YCTRSSQRQTFKTRPSNTGRPDC*0143]2921GTTTGCrKrrTGGTAAATMTGTAMmTTCTTGMTAQVCrTAaiATGATTACMATTTATTTGTMQVGC0144]2996TGATATTTACTCrAQ\TTGQ\TMGCQ\TTGaCMACMAAOCrTGAGOGMGATCMATATGMMATMTCA0145]3071TMATCTTGTTCMUrCMTTTMTTTTGTATCMTTGATOGTTCATATTACMTCrGTMTCMTTimAATG0146]3146ATAGTTCTTTOGTIOGCrTGTTTCMTCAOGATTTATCMTTTGMCMGTGATTAOGCCrATaMAGMT0147]3221GCTCMTIOGTATATAAATTATTTTGTGACrTGTATTOOGGTTATCmTMCrTGAMATMTTTCMTTATT0148]3296CnTATTTTTTMCTACMATCMGMGCrATTGCrTGTOGCrTCAOCrATTATGaTTMTTTGATATTmTA0149]3371OGATTMTKMTTQVGACTTTGGTCMAOGTTTTCrnMACrTCAQVCrTTCAGMMAGMMACMAOCAT0150]3446ACTAGMQVGTGGTAOGGGTTAGTMTGAGGMTAAATGMCMTAAATMCKMTTTGATCACMAGCrCMT0151]3521MTTCIMTTTCrTGAGTCAOCrTGTATATGAGTMCrGTAGACrTGTATTTOCrTCAGTTTTCMTTGTTMTT0152]3596TATTCAOCTTTGCCMTMTTTMAGACACTMTTATAGCCTTGMAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAM0153]利用生物信息學軟件分析SjFz9蛋白結(jié)構(gòu)，表明該蛋白具有Frizzled家族蛋白結(jié)
構(gòu)特征(見圖3和SEQ ID NO. 1) :N-端1 31個氨基酸殘基為信號肽；126 244個氨 基酸殘基段為半胱氨酸富集區(qū)(cystein rich domain, CRD)，含有10個保守的半胱氨酸； 364 748氨基酸區(qū)段為七個跨膜的a螺旋疏水區(qū)；C_端尾部位于胞內(nèi)，含有磷酸化位點。選擇來自人(human,NP_003499. 1)、類人猿(Pan troglodytes, XP_527779. 2)、小 鼠(Musculus，NP_034376. 1)、斑馬魚(Danio，NP_571586. 1)、爪蟾(Xenopus，AAD44332. 1)、 斑馬(Taeniopygia，XP_002187952. 1)等幾個物種的Fz9蛋白以及曼氏血吸蟲Frizzled受 體(CAZ36662)進行氨基酸序列的多重比對。結(jié)果顯示，SjFz9蛋白與曼氏血吸蟲Frizzled 受體相似性最高，達79%，其次與爪蟾Fz9的相似性為33%。另外，參與比對序列中除類人 猿在CRD區(qū)缺少多個半胱氨酸，可能該序列在5’端不完整，其余物種的序列在CRD區(qū)內(nèi)均含 有10個保守的半胱氨酸，且跨膜區(qū)序列相當保守。從圖4所示的Fz9的進化樹上看，SjFz9 與曼氏血吸蟲Frizzled受體的親緣關(guān)系最接近，其次，與爪蟾Fz9在進化關(guān)系上比較接近。實施例2熒光定量PCR方法分析SjFz9基因的mRNA表達圖式1.實驗方法根據(jù)real time PCR引物設(shè)計原則，設(shè)計SjFz9基因引物F(上游 弓丨物)，5，TATCACTTCAGGAATGTGGGTATGG 3，(SEQ ID NO. 15) ；R(下游弓丨物)， 5，TTAGTTTCTCCAACAGTATCACCAG 3，(SEQ ID NO. 16)。選擇 18s rRNA 作內(nèi)參，引物為F， 5，TTAGTTGGTGGAGCGATTTGTCTGG 3’ (SEQ ID NO. 17) ；R，5，CTGTTATTGCTCAATTTCGTGCGAC
103，(SEQ ID NO. 18)。按照 PrimeScript RT reagent Kit(Takara)說明書，將蟲卵及各期別 蟲體總 RNA 反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，SYBR Green I (SYBR Premix Ex Taq，Takara)作染料，在 Rotor gene-3000A(corbett)儀器上進行Real time PCR0 Δ Δ GT法計算出各期別蟲體中的目的 基因相對于內(nèi)參基因的初始模板量。2.結(jié)果以18s rRNA為內(nèi)參，通過qPCR方法對SjFz9在血吸蟲不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄水平差 異情況進行分析，重復3次實驗，分析結(jié)果如圖5。7、13、18d的蟲體較小，無法進行雌雄分 開，因此圖5A顯示的是在雌雄蟲混合樣品中對SjFz9mRNA表達水平的檢測結(jié)果，可以看出 在血吸蟲童蟲(7、13、18d)階段，SjFz9轉(zhuǎn)錄水平較高。23d及其后的成蟲蟲體樣品雌雄分 開，圖5B分析結(jié)果顯示，23d雌雄蟲中mRNA均有較高表達。但23d后的成蟲體內(nèi)mRNA表達 水平變化較大SjFz9mRNA在26、32、35、50d雌蟲蟲體中的表達水平較低，而在29d、42d又 分別呈現(xiàn)很高的轉(zhuǎn)錄水平；SjFz9mRNA在26、29、32、35d雄蟲蟲體的表達量較低，而在42d、 50d蟲體又呈現(xiàn)很高表達水平(在42d蟲體的表達量幾乎是35d的6倍，P < 0. 05)。實施例3S jFz9蛋白的組織定位分析1. SjFzQ蛋白在原核系統(tǒng)的表達、純化與鑒定選取SjFz9蛋白CRD結(jié)構(gòu)功能域作為免疫組化定位的目標抗原，設(shè)計引物如下F， 5’ GTGGATCCACAGTCATGTTAACTCAATGTCTCT 3，(SEQ ID NO. 19) :R,5，GTCTCGAGTTCACACTTTGA TTGTACATAACGA 3，(SEQ ID NO. 20)，上下游引物中分別引入BamHI和Xho I限制性內(nèi)切酶 位點(引物序列中劃線處標出)。以13d童蟲cDNA為模板進行PCR擴增。將純化的目的片 段(567bp)克隆至pMD18T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細胞。提取陽性克隆的質(zhì)粒， 經(jīng)BamH I和Xho I雙酶切，切膠回收，連接到經(jīng)同樣雙酶切的pET28a載體中，構(gòu)建成重組 原核表達質(zhì)粒pET28a-SjFz9，將該PET28a_SjFz9重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入DH5 α感受態(tài)細胞后，陽 性克隆進行測序和雙酶切鑒定。圖6所示為重組原核表達質(zhì)粒PET28a-SjFz9的酶切鑒定 圖，在圖6中，“1”代表重組表達質(zhì)粒PET28a-SjFz9的BamH I和Xho I雙酶切產(chǎn)物。經(jīng)鑒 定正確的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達用工程菌BL21 (DE3)感受態(tài)細胞。分別挑取重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達菌的克隆及空載體轉(zhuǎn)化克隆于試管LB培養(yǎng)基，37°C 過夜培養(yǎng)。次日，以1 100轉(zhuǎn)接新鮮LB培養(yǎng)基，待菌液OD6tltlS 0.8 1.0時加入IPTG進 行誘導表達，IPTG的終濃度為0. 8mmol/L。8h后收集菌體誘導物，用1 XPBS溶解，冰浴超 聲后，離心分離上清，用8M尿素溶解沉淀蛋白，分別取樣進行12% SDS-PAGE凝膠電泳。參 照M親和柱使用說明書進行蛋白純化。純化的蛋白再利用SDS-PAGE凝膠電泳進行檢測， 結(jié)果如圖7所示。與His標簽融合的重組蛋白理論分子量為30. 7kD，圖7中所示純化的重 組蛋白大小與理論預測一致。用Western-blot方法鑒定原核表達的重組蛋白(參照分子克隆操作指南進行)。 用含0. 05%吐溫-20的TBS稀釋一抗、二抗，以1 100比例稀釋血吸蟲蟲卵抗原免疫兔血 清作一抗(本實驗室制備)，以1 2000比例稀釋HRP標記的羊抗兔IgG作二抗。(沉淀 型)TMB (天根生物)為底物進行顯色。Western-Blot結(jié)果如圖8所示，表明PET28a-SjFz9 原核表達的蛋白能被血吸蟲蟲卵蛋白免疫血清識別，具有良好的抗原性。2. SjFzQ多抗的制備及其特異性鑒定取500ul純化的重組蛋白(lmg/ml)與等體積完全弗氏佐劑混合乳化進行首免，背部脊柱兩側(cè)兩點皮下注射免疫6只雄性Balb/c小鼠，免疫劑量為50 u g/只；以后每隔兩周 進行加強免疫，將純化蛋白與不完全弗氏佐劑混合，免疫劑量為75 y g/只。在第4次加強 免疫后一周進行摘眼球采血，分離血清。-70°C冰箱凍存?zhèn)溆?。PBS與佐劑混合物免疫小鼠 作對照。通過Western-blot方法鑒定用重組蛋白制備的抗血清。用蛋白抽提試劑盒 (Pierce，美國)抽提血吸蟲18天蟲體蛋白，在蛋白抽提過程中加入蛋白酶抑制劑PMSF和 EDTA。抽提的蟲體蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維(NC)膜上(轉(zhuǎn)印方法同 上)。以1 500比例稀釋制備的多抗作一抗；以1 2000的比例稀釋IRDyeTM800標記的 羊抗小鼠IgGOtockland)作二抗，避光條件下孵育，通過Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)分 析結(jié)果。結(jié)果顯示該抗血清識別的單一蛋白條帶約104kD (見圖9)，與理論預測的S jFz9蛋 白大小一致，說明制備的多抗血清能夠特異性地識別天然蟲體中的SjFz9蛋白，而檢測PBS 免疫血清的對照結(jié)果為陰性，表明該多抗可用于SjFz9蛋白的免疫組化定位分析。在圖9 中，a為陽性血清檢測，b為PBS免疫血清檢測對照。3. SjFz9蛋白的蟲體定位分析選擇性收集13d、18d童蟲及23d、32d、42d雌、雄蟲新鮮蟲體，制備石蠟切片。通過 小鼠S-P免疫組化檢測試劑盒對SjFz9進行組織定位分析。具體步驟如下經(jīng)二甲苯脫蠟，2X15min。由高到低的梯度濃度酒精進行水化100 % — 95 % —90% — 85% — 75%— 50%，每個梯度放置5min，然后放入蒸餾水中20 30min，還可在 水中放置過夜。3%過氧化氫中放置20min，去除內(nèi)源性過氧化物酶。PBS洗滌3次，3min/ 次。滴加經(jīng)37°C預熱的(0. 25% )胰酶于切片上約3min進行抗原修復。PBS洗滌3次，3min/ 次。以正常山羊血清(工作濃度)封閉滴于切片上，濕盒內(nèi)37°C孵育lh。甩掉封閉血清，滴 加正常的小鼠血清及SjFz9的小鼠多抗血清的稀釋液(1 200)各50 80y L，37°C孵育 lh。PBS洗滌4次，5min/次。滴加生物素化山羊抗鼠IgG。50 80 y L，37°C孵育30min。 PBS洗滌同上。加HRP標記的鏈霉卵白素工作液50 80 ii L，37°C孵育20 30min，PBS洗 滌4次，加DAB(DAKO)顯色液，同時光鏡下觀察顯色情況。一旦著色即用蒸餾水洗滌。蘇木 素復染2min，自來水沖洗lOmin。脫水，透明，封片，鏡檢。結(jié)果如圖10所示，圖10為免疫組化分析SjFz9蛋白在日本血吸蟲童蟲、成蟲體壁肌肉 層細胞的定位圖，其中，A，B, C，D，E分別為13d、18d、23d、32d、42d蟲體定位結(jié)果，F(xiàn)為陰性 對照，箭頭所指為陽性染色；at代表吸盤，ap代表前部，sm代表體壁肌細胞，p代表實質(zhì)細 胞，gc代表抱雌溝。圖10所示的童蟲蟲體定位顯示，SjFz9蛋白在蟲體的分布比較廣，主 要在蟲體的前部、口腹吸盤、體壁肌細胞層(見圖10A，B)，在實質(zhì)細胞中也有少量表達，以 正常陰性血清檢測的對照沒有任何染色(圖10F)。而在成蟲中的定位顯示，SjFz9蛋白在 23d、32d和42d蟲體的吸盤、體壁肌肉層細胞上仍然有大量分布(圖10C，D，E)。另外，更有 意思的是，SjFz9蛋白在雌蟲的卵細胞、卵黃腺細胞和雄蟲的精子細胞內(nèi)或細胞膜上都有大 量表達(見圖11A，B，C)，相應(yīng)期別的蟲體對照組沒有表達信號(圖11D，E，F(xiàn))。圖11是免 疫組化分析SjFz9蛋白在日本血吸蟲成蟲生殖細胞的定位圖，是以SjFz9蛋白的多抗血清孵育蟲體切片，以正常小鼠血清做陰性對照，以DAB為顯色劑作的免疫組化實驗結(jié)果圖。圖 11中，A，D為雄蟲的睪丸定位；B，E為雌蟲的卵巢定位；C，F(xiàn)為雌蟲的卵黃腺定位；A-C顯示 陽性結(jié)果，D-F為陰性對照；箭頭所指為SjFz9蛋白的陽性染色；0代表卵巢；t代表睪丸；ν 代表卵黃腺細胞；ic代表腸腔。以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能 因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說， 在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范 圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準。序列表<110>中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所<120>日本血吸蟲Frizzled9基因、蛋白及用途<160>20<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>923<212>PRT<213>Schistosoma japonicum<220><221>SIGNAL<222>(1). . (31)<223> 信號肽<220><221>D0MAIN<222>(126). . (244)<223>半胱氨酸富集區(qū)<220><221>TRANSMEM<222> (264)·· (748)<223> 跨膜區(qū)<400>1Met Lys lie Val Arg Met Ser Leu Phe Lys Lys Phe Asn Leu Val Asn151015Phe lie Asn lie lie Thr Val Met Leu Thr Gln Cys Leu Ser Asp Thr
SerGluGlnAlaHisAsnAsnlieThrCysAlaArgArgCysAsnAla
340345350
HisLeuPheTyrLysProValGluLysArgPheAlaAsnlieTrpMet
355360365
LeuValTrpSerlielieCysLeuGlySerCysAlaLeuThrlielie
370375380
ThrPheThrLeuAsnArgThrArgPheAlaTyrProGluArgProlie
385390395400
IleTyrlieSerValCysCysPheValTyrSerAlaGlyPhelieLeu
405410415
HisSerLeulieGlyArgAspLeuValAlaCysArgAsnLysValGlu
420425430
ThrlieSerProSerLeuLeuThrAsnGlyValSerGlnValGlyThr
435440445
LysLysLeuPheThrGlyLeuThrGlnLeuLysValAsnAlaSerPhe
450455460
LeulieThrSerGlyTyrGluGlyThrTrpCysThrlieliePhelie
465470475480
lieLeuPheTyrPheSerGlnAlaSerTyrLeuTrpTrpValMetLeu
485490495
AlaThrSerTrpPheLeuSerAlaSerCysLysTrpGlyCysGluGly
500505510
lieGluAlaValSerSerliePheHisMetLeuAlaTrpAlaLeuPro
515520525
AlaLeuLysThrlielielieLeulieMetHisArglieAspAlaAsp
530535540
GluLeuThrGlyLeuCysAsnValGlyTyrGlnAsnSerThrSerLeu
545550555560
LeuThrLeulieLeuLeuProGlnlielieTyrLeuLeuLeuGlylie
565570575
MetPheLeuLeuValGlyPheHisSerLeulieSerLeuArgSerAsn
580585590
LeuLysGlnHisAlaLysSerLeuLeuProAlaThrLysThrThrThr
595600605
AlaProAlaAsnCysTyrAsnSerGlnCysLysArgAsnAlaSerAla
610615620
ThrValAlalieProThrMetThrLeuGlnThrMetThrThrSerSer
625630635640
ProVallieAlaLeuAsnAsnGlyAsnlieArgArgLeuAspLysLeu
<213>Schistosoma japonicum
<220>
<221>CDS
<222>(146)..(2917)
<400>2
ggtcaaataa caatttaaca ttatgaaaga tatattttca agtgtatatt tatgaatgta60
cttacttgta aaatgaagtc atcttaacag aactgagctg tttagttgct ttgttgtgtt120
aatttacata aattgtcact cagag atg aaa att gta aga atg agt tta ttt172
MetLyslie Val Arg Met Ser Leu Phe
15
clclclclclcltttaatttg gtcaat ttc ata aat att ata aca gtc atg tta220
LysLys Phe Asn Leu Val Asn PhelieAsnlielieThrValMetLeu
10152025
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303540
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455055
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606570
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758085
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9095100105
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110115120
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AspAspValAsnHisCyslieProlieHisGluProlieCysHisGly
125130135
Cttcaatatactcatacttggttacctaatteagtgggtctaacgaca604
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140145150
17
tgtagacttg tatttccttc agttttcatt tgttaattta ttcacctttg ccaataattt 3617aaagacacta attatagcct tgaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa3670<210>3<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1). . (26)<223> 引物<220><221>misc_feature<222>(1). . (26)<223>N = A/C/G/T ；R = A/G ；M = A/C ；Y = C/T<400>3nnngaattct ayccngarmg nccnat 26<210>4<211>24<212>DNA<213〉人工序列<220><221>misc_feature<222> (1)·· (24)<223> 引物<220><221>misc_feature<222>(1). . (24)<223>N = A/C/G/T ；R = A/G ；Y = C/T<400>4nnnaagcttn arnaynaccc acca 24<210>5
22<211>26 <212>DNA <213>人工序列
<220>
<221>misc_feature <222>(1). . (26) <223>引物
<220>
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<223>N = A/C/G/T ；R = A/G ；M = A/C ；Y = C/T <400>5
nnngaattct ayccngarmg nccnat 26
<210>6 <211>21 <212>DNA <213>人工序列
<220>
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<220>
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<223>N = A/C/G/T ；D = A/G/T
<400>6
nnnaagcttn gtdtanccnt c 21
<210>7 <211>25 <212>DNA <213>人工序列
CN 10<221>misc_feature<222>(1). . (25)<223> 引物<400>10caccatgtac cttcatatcc tgaag 25<210>11<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1). . (25)<223> 引物<400>11taacggaata cggtacaagt tggtc 25<210>12<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1). (25)<223> 引物<400>12tatcacttca ggaatgtggg tatgg 25<210>13<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature
<222>(1). . (25)<223> 引物<400>13taagttcgat tggccatgga aagct 25<210>14<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1). . (25)<223> 引物<400>14accaacattg atgagggaac gatag 25<210>15<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc—feature<222>(1). . (25)<223> 引物<400>15tatcacttca ggaatgtggg tatgg 25<210>16<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc—feature<222>(1). . (25)
<223> 引物<400>16ttagtttctc caacagtatc accag 25<210>17<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1). . (25)<223> 引物<400>17ttagttggtg gagcgatttg tctgg 25<210>18<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1). . (25)<223> 引物<400>18ctgttattgc tcaatttcgt gcgac 25<210>19<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1). . (33)<223> 引物
27
<220><221>misc_signal<222>(3). . (8)<223>BamH I 酶切位點<400>19gtggatccac agtcatgtta actcaatgtc tct 33<210>20<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1). . (33)<223> 引物<220><221>misc_signal<222>(3). . (8)<223>Xho I 酶切位點<400>20gtctcgagtt cacactttga ttgtacataa cga 3權(quán)利要求
一種日本血吸蟲基因，其特征在于，所述基因具有編碼Frizzled家族蛋白的核苷酸序列，該核苷酸序列包含下述DNA序列之一(1)編碼SEQ ID NO.1氨基酸序列的DNA序列；(2)編碼SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中缺失、添加、插入或取代一個或多個氨基酸所得到的具有SEQ ID NO.1相同活性的氨基酸序列的DNA序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的日本血吸蟲基因，其特征在于，所述基因具有SEQID NO. 2所 示的DNA序列。
3.—種日本血吸蟲蛋白質(zhì)，其特征在于，所述蛋白質(zhì)選自(1)具有SEQID NO. 1氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(2)具有SEQID NO. 1中部分氨基酸序列的活性片段或保守性變異蛋白質(zhì)； (3)SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列中缺失、添加、插入或取代一個或多個氨基酸所得到 的具有SEQ ID NO. 1相同活性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的日本血吸蟲蛋白質(zhì)，其特征在于，所述蛋白質(zhì)具有SEQID NO. 1所示氨基酸序列。
5.一種重組載體，其特征在于，包含權(quán)利要求1所述日本血吸蟲基因DNA序列的全部或 部分序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組載體，其特征在于，包含編碼SEQID NO. 1中55-244位 氨基酸序列的DNA序列。
7.一種宿主細胞，其特征在于，包含權(quán)利要求5或6所述的重組載體，或已用權(quán)利要求 1所述基因序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。
8.一種能與權(quán)利要求3所述日本血吸蟲蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的抗體。
9.權(quán)利要求1所述日本血吸蟲基因的用途，其特征在于，用于制備預防或治療血吸蟲 病的藥物；或用于篩選預防或治療血吸蟲病的藥物。
10.權(quán)利要求3所述日本血吸蟲蛋白質(zhì)的用途，其特征在于，用于制備預防或治療血吸 蟲病的藥物；或用于篩選預防或治療血吸蟲病的藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種日本血吸蟲基因，所述基因具有編碼Frizzled(Fz)家族蛋白的核苷酸序列，該核苷酸序列包含編碼SEQ ID NO.1氨基酸序列的DNA序列，或編碼SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中缺失、添加、插入或取代一個或多個氨基酸所得到的具有SEQ ID NO.1相同活性的氨基酸序列的DNA序列。本發(fā)明還公開了上述基因編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的日本血吸蟲基因和蛋白，是日本血吸蟲Fz受體家族的新成員，參與調(diào)控血吸蟲的生長發(fā)育及生殖系統(tǒng)發(fā)育，對開發(fā)阻斷血吸蟲生長發(fā)育及生殖系統(tǒng)發(fā)育的新藥具有很高的應(yīng)用價值。
文檔編號C12Q1/68GK101892239SQ20101022464
公開日2010年11月24日 申請日期2010年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月15日
發(fā)明者馮新港, 李紅飛, 楊健美, 王孝波, 苑純秀 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所