專利名稱：日本血吸蟲hgprt基因的克隆、表達(dá)和dna疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物基因領(lǐng)域，具體涉及日本血吸蟲(中國(guó)大陸株)HGPRT基因的基因序列、日本血吸蟲(中國(guó)大陸株)HGPRT基因的基因克隆、以及在大腸桿菌中的表達(dá)，日本血吸蟲(中國(guó)大陸株)HGPRT基因DNA疫苗的構(gòu)建及小鼠免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)。
背景技術(shù)：
血吸蟲病是一種分布廣乏，危害嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲病?？寡x病疫苗研究是當(dāng)今血吸蟲病防治研究的熱點(diǎn)之一。
日本血吸蟲未成熟卵可溶性抗原(SIEA)具有明顯的抗蟲卵胚胎發(fā)育、抗雌蟲生殖產(chǎn)卵的作用，我們從SIEA中分離出SIEA26-28kDa天然分子抗原，并證明它是誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生抗血吸蟲病保護(hù)性免疫力的主要組分。1999-2000年，衛(wèi)生部專家組織進(jìn)行了全國(guó)血吸蟲疫苗免疫保護(hù)統(tǒng)一檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，該亞單位分子疫苗(1號(hào)疫苗)獲得了最佳的動(dòng)物保護(hù)效果。隨后，我們采用蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)，首次建立了SIEA-二維電泳圖譜，通過(guò)SIEA26-28kDa抗血清免疫識(shí)別、肽指紋圖譜、質(zhì)譜分析，獲得了3個(gè)同源性較高、免疫原性較強(qiáng)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)(SIEA-2D66，71，73)；分別與日本血吸蟲次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)，琥珀酸脫氫酶鐵硫蛋白(SDISP)，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)相匹配，其中以HGPRT的同源性最高。有資料證明，HGPRT與細(xì)胞的核苷酸代謝、血吸蟲的生長(zhǎng)發(fā)育、生理代謝密切相關(guān)；以上研究結(jié)果表明HGPRT可以作為抗日本血吸蟲病天然分子基因苗研究的靶標(biāo)本發(fā)明通過(guò)對(duì)日本血吸蟲成蟲cDNA文庫(kù)的篩選并結(jié)合先前的研究，我們已獲得編碼SIEA26-28kDa分子抗原相關(guān)的HGPRT基因片段，并對(duì)其進(jìn)行基因克隆、表達(dá)和保護(hù)性免疫效果的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了日本血吸蟲(中國(guó)大陸株)HGPRT基因的基因序列、日本血吸蟲HGPRT基因DNA疫苗的構(gòu)建及小鼠免疫保護(hù)性實(shí)驗(yàn)。
根據(jù)SjHGPRT的cDNA序列的閱讀框(ORF)設(shè)計(jì)引物，并從日本血吸蟲成蟲cDNA文庫(kù)中調(diào)出該基因片段的完整閱讀框，以文庫(kù)噬菌體DNA為模板，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段，回收目的片段后以瓊脂糖凝膠電泳鑒定分子量大小。然后對(duì)回收的目的片段以KpnI、ApaI作雙酶切，凝膠電泳回收雙酶切產(chǎn)物，用質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒pcDNA3，同樣以KpnI、ApaI作雙酶切，將酶切的目的基因與酶切質(zhì)粒進(jìn)行連接反應(yīng)，制備感受態(tài)細(xì)胞并將連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化完成后對(duì)陽(yáng)性克隆KpnI和ApaI作雙酶切鑒定。采用Sanger雙脫氧末端終止法進(jìn)行重組質(zhì)粒插入片段的測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如下CGAACATCTTCACGACATGTCTGGTGTTATGAAAAGAACTGGTTGTATTGTGATAGAAGATGACTTCAAAGGTTTTCCTATTGAGCATTTTTGCACGTCTCCTAGGTATGAGGGTTGTTTGGACTACGTTCTCGTATCAAACGGTATGATCAAGGATAGACTTGAAAAAATGTCAATGGATATTGTTGACTCTTATGAAGCTTCTAATGCAACATCTATCACACTTATGTGTGTTCTGAAAGGTGGATTCAAATTTCTTGCTGATCTTGTCGATGGTCTTGAGCGTACTGTACGTGCTCGAGGTATCGTCCTCCCTATGTCAGTTGAATTCGTTCGCGTTAAAAGCTATGTTAATGATGTCAGCTATCATGAGCCTTTGTTAACTGGTTTGGGGGACCCTTCAGACTACAGAGATAAGGATATTCTTGTTGTAGAAGATATAATCGATACGGGCAGAACAATAACCAAATTGATAAATCACTTGGAAAGCTTGTCCACGAAAAGTGTCAAGGTAGCAAGCCTTCTCGTCAAACGTACAATGCCTCCCAGTCAGTATCATCCAGATTTTGTTGGCTTTGAAGTTCCGAATCGGTTTGTTGTTGGTTATGCTTTAGACTACAATGAACATTTCCGTGACCTACACCATATTTGTGTGATTAATGAAATTGGTCAACAAAAATTCTCTGTACCTTGTGTGCCGAAATCAGTTTAATGTTCAAAAGATCGGATACACATATAAACAAGGATTATTCATAGTGCACAATCTCTAAATGAACACAATGTAATGATTAACTTATTTTGGGAAGGAAAAACATTTACTTCATTCACACTGTTCATGCAACCATATGTTTCCGTGTTTATGTCTGTATCTTACAGTTTCTAACTACGTCGTGTATTTTTAATTTTTGTTTTCATGATATGCTCTGTATTATGAACTTCTAATTTTTCCACATTAATTATTTTGTTCACTTTTTTTGATATCGTTCTTTATTCTCTACTTGTCATATTTTCTGTTTAGAAGGTCATACATACACGTATTTACCTATTAAT
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將HGPRT基因亞克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3中，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pcDNA3/SjHGPRT，轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)菌后擴(kuò)大培養(yǎng)，制備純化的重組質(zhì)粒DNA作為DNA疫苗免疫5-6周齡的昆明系小鼠，每次每只小鼠后腿肌肉注射重組質(zhì)粒100μg。隔2周免疫1次，共3次。末次免疫后第3周以日本血吸蟲尾蚴進(jìn)行攻擊感染，攻擊后第45天處死小鼠，心臟灌注法收集成蟲，肝臟用10％NaOH消化后計(jì)算每克肝組織蟲荷數(shù)(EPG)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)pcDNA3/SjHGPRT免疫小鼠獲得了30.4％的減蟲率和44.8％的減卵率。
進(jìn)一步將HGPRT基因亞克隆至原核表達(dá)載體pGEX-4T-l中，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/SjHGPRT，轉(zhuǎn)化BL21表達(dá)菌后，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳分析顯示，重組質(zhì)粒獲得高效表達(dá)，融合蛋白分子量大約在46KD，Western Blot實(shí)驗(yàn)顯示重組抗原可被日本血吸蟲未成熟蟲卵可溶性抗原免疫兔血清識(shí)別，而載體表達(dá)蛋白不與抗體反應(yīng)，表明該融合蛋白具有良好的抗原性。


圖1重組質(zhì)粒pcDNA3/Sj HGPRT雙酶切和PCRM標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA；1，2PCR產(chǎn)物；3重組質(zhì)粒雙酶切；4空質(zhì)粒對(duì)照?qǐng)D2小鼠肌組織HE染色顯示切片部位正確圖3正常兔血清對(duì)照呈陰性反應(yīng)，未見有棕色顆粒物圖4免疫兔血清對(duì)照呈陽(yáng)性反應(yīng)，可見棕色顆粒物圖5重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/SjHGPRT雙酶切鑒定和PCR驗(yàn)證M標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA1PCR產(chǎn)物2重組質(zhì)粒雙酶切 3空質(zhì)粒雙酶切對(duì)照?qǐng)D6重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/SjHGPRT表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE結(jié)果M低蛋白分子量； 1未被誘導(dǎo)； 2加IPTG誘導(dǎo)3溶于8M尿素的表達(dá)產(chǎn)物； 4誘導(dǎo)后的上清液圖7pGEX-4T-1/SjHGPRT表達(dá)產(chǎn)物Western-b1ot結(jié)果M蛋白分子量1抗SIEA26-28kDa免疫兔血清識(shí)別2正常兔血清識(shí)別具體實(shí)施方式
一、日本血吸蟲(中國(guó)大陸株)真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3/HGPRT的構(gòu)建及其序列測(cè)定1.材料1.1質(zhì)粒與受體菌pcDNA3質(zhì)粒，大腸桿菌DH5α為本室貯存。
1.2工具酶與試劑限制性內(nèi)切酶KpnI、ApaI、T4DNA連接酶、膠回收試劑盒均為大連寶生物公司產(chǎn)品，Marker為Sigma公司產(chǎn)品，UNIQ-10質(zhì)粒小量抽提試劑盒(030828)、PCR試劑盒為上海生工生物工程公司產(chǎn)品，其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。
1.3引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)SjHGPRT(ORF)的基因序列設(shè)計(jì)引物一對(duì)，由大連寶生物公司合成。
H35’-ACGGTACCCGGTATGATCAAGGATAG-3’，其中AC為保護(hù)性堿基，GGTACC為KpnI酶切位點(diǎn)。
H45’-CAGGGCCCATTAAACTGATTTCGGCA-3’，其中CA為保護(hù)性堿基，GGGCCC為ApaI酶切位點(diǎn)。
2.方法2.1模板制備將適量SjcDNA文庫(kù)加入過(guò)夜培養(yǎng)的大腸桿菌Y1090中，37℃預(yù)吸附20min左右。在吸附液中加入氨芐青霉素、MgSO4、20％麥芽糖并混勻，然后加入到55℃保溫的頂瓊脂中，快速混勻后倒入9cm的LB平板中，42℃培養(yǎng)約4h，待出現(xiàn)密集的噬菌斑后，在LB培養(yǎng)基平板中加入SM液，4℃輕搖過(guò)夜。次日收集洗脫液，5000rpm室溫離心5min，取上清液，加入20％PEG/NaCl(20％的PEG，2mol/LNaCl)，混合后室溫放置30min，然后12，000rpm×15min離心，棄上清，加入100μl雙蒸水，溶解沉淀物，沸水浴5min，使噬菌體DNA變性。存-20℃?zhèn)溆谩?br> 1.2PCR擴(kuò)增得到目的基因以文庫(kù)噬菌體DNA為模板，以H3，H4為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段。PCR反應(yīng)體系(100μl總反應(yīng)量)10×buffer 10μl，25mM MgCl210μl，10mM dNTP 2μl，引物H3和H4各2μl，模板DNA 13μl，Taq酶(5U/μl)1μl，補(bǔ)雙蒸水至100μl。PCR反應(yīng)參數(shù)為96℃預(yù)變性3min，94℃變性1min，56℃退火1min，72℃延伸2min共35個(gè)循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸8min。1.0％瓊脂糖凝膠電泳鑒定分子量大小，并回收SjHGPRT基因的目的片段。
2.3目的基因和真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3的酶切、回收和連接回收的目的片段以KpnI、ApaI雙酶切，37℃酶切2-4h，凝膠電泳回收雙酶切產(chǎn)物。按質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書抽提質(zhì)粒pcDNA3，同樣以KpnI、ApaI雙酶切、回收。將酶切的目的基因與酶切質(zhì)粒按照摩爾比5∶1，反應(yīng)體系為20μl，通過(guò)T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，16℃連接16-18h。
2.4感受態(tài)細(xì)胞的制備和連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化用CaCl2法制備大腸桿菌DH5α的感受態(tài)細(xì)胞，將連接產(chǎn)物20μl轉(zhuǎn)化200μl感受態(tài)大腸桿菌DH5α，涂布于氨芐青霉素抗性LB平板上，37℃培養(yǎng)12-16h，挑取單菌落加入到LB液體培養(yǎng)基中增菌，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。
2.5陽(yáng)性克隆的鑒定對(duì)真核表達(dá)重組質(zhì)粒進(jìn)行KpnI和ApaI雙酶切鑒定，酶切反應(yīng)條件同前，酶切產(chǎn)物經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
2.6質(zhì)粒插入片段測(cè)序鑒定以pcDNA3載體多克隆位點(diǎn)前的公共序列為測(cè)序引物，采用Sanger雙脫氧末端終止法，在ABI-377型全自動(dòng)測(cè)序分析儀上進(jìn)行重組質(zhì)粒插入片段的測(cè)序。
3結(jié)果3.1重組質(zhì)粒pcDNA3-SjHGPRT的構(gòu)建及其鑒定以H3、H4為引物從日本血吸蟲成蟲cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增出564bp的片段。將重組子經(jīng)KpnI和ApaI雙酶切后出現(xiàn)兩條帶，大小分別為0.57Kb，5.4Kb；而空白質(zhì)粒pcDNA3經(jīng)KpnI和ApaI雙酶切后，只有一條帶，大小與原質(zhì)粒一致，約為5.4Kb(見圖1)；測(cè)序結(jié)果如下二、日本血吸蟲pcDNA3/SjHGPRT重組質(zhì)粒免疫小鼠的保護(hù)性效果觀察1材料1.1主要試劑酵母粉、胰蛋白胨、RnaseA為BBI公司產(chǎn)品；苯酚、氯仿、異丙醇為上海生工產(chǎn)品；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和陽(yáng)性釘螺昆明系小鼠，雄性，5-6周齡，由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院動(dòng)物學(xué)部提供。陽(yáng)性釘螺由江蘇省血吸蟲病防治研究所提供。
1.3菌株和質(zhì)粒大腸桿菌DH5α、pcDNA3載體為本室保存，pcDNA3/SjHGPRT由本室構(gòu)建。
2方法2.1質(zhì)粒的大量制備采用SDS堿裂解法大量制備質(zhì)粒。然后溶于無(wú)菌的生理鹽水，經(jīng)751紫外分光光度計(jì)測(cè)質(zhì)粒DNA的濃度和純度(260/280≥1.80)，用無(wú)菌生理鹽水調(diào)整濃度至1mg/ml，置-20℃?zhèn)溆谩?br> 2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為A、B、C三組，A組為pcDNA3空質(zhì)粒對(duì)照組，B組為pcDNA3/SjHGPRT免疫組，C組為注射生理鹽水組，每組各10只昆明系小鼠。
2.3DNA免疫途徑和方法按常規(guī)免疫方法進(jìn)行，分別于免疫前一天進(jìn)行預(yù)處理，即每只小鼠后腿肌肉注射50μl鹽酸布比卡因(0.5mg/ml)，第二天在該部位按分組要求注射質(zhì)粒100g/100μl或生理鹽水100μl。每間隔2周免疫1次，共3次。
2.4免疫酶組織化學(xué)檢測(cè)HGPRT蛋白在小鼠肌肉中的表達(dá)末次免疫后2周，每組剖殺2只小鼠，取注射部位股四頭肌0.5cm3，10％福爾馬林固定過(guò)夜，然后進(jìn)行石蠟包埋、組織切片、HE染色和免疫酶組織化學(xué)鑒定。(免疫酶組化所用SIEA26-28kDa免疫血清由本室制備，工作濃度為1∶100；生物素化山羊抗兔IgG為武漢博士德生物公司產(chǎn)品。具體操作方法為先制備3μm厚的切片，60℃烤片30min，常規(guī)脫蠟、去水，用新鮮配制的3％雙氧水處理切片5-10min，以滅活內(nèi)源性酶，再用蒸餾水洗3次。然后，加0.01M枸櫞酸鹽緩沖液，微波處理2次，5min/次，PBS浸泡同前處理后，加5％BSA封閉液，置室溫20min，甩出多余液體，直接加SIEA26-28kDa免疫血清，置4℃冰箱反應(yīng)過(guò)夜。次日以PBS洗3次，5min/次，加酶標(biāo)二抗置37℃20min，PBS洗3次，5min/次，滴加試劑SABC，37℃20min，PBS洗滌后DAB顯色，蒸餾水終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染，37℃烘干，蓋片，顯微鏡下觀察結(jié)果。
2.5免疫小鼠攻擊感染實(shí)驗(yàn)及保護(hù)性效果評(píng)價(jià)末次免疫后第3周，按常規(guī)方法經(jīng)小鼠腹部人工感染40±1條日本血吸蟲尾蚴，感染后第45天處死小鼠，采用心臟灌注法收集血吸蟲成蟲，并計(jì)算減蟲率。同時(shí)，每鼠取1g肝研磨，加10％NaOH于37℃消化過(guò)夜，取50μl混懸液涂片鏡檢全部蟲卵數(shù)，計(jì)算每克肝蟲卵數(shù)(EPG)。運(yùn)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟計(jì)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)計(jì)算其保護(hù)效果，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理得出P＜0.05，表示有顯著性差異。減蟲率和減卵率的計(jì)算公式如下。
減蟲率(％)＝(1-實(shí)驗(yàn)組檢獲成蟲均數(shù)/對(duì)照組檢獲成蟲均數(shù))×100減卵率(％)＝(1-實(shí)驗(yàn)組檢獲肝蟲卵均數(shù)/對(duì)照組檢獲肝蟲卵均數(shù))×100三、日本血吸蟲pGEX-4T-1/SjHGPRT重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其表達(dá)1材料原核表達(dá)載體pGEX-4T-1以及大腸桿菌BL21來(lái)自中山大學(xué)寄生蟲學(xué)教研室。限制性內(nèi)切酶BamHI.、NotI，T4DNA連接酶，膠回收試劑盒均為大連寶生物公司產(chǎn)品，質(zhì)粒回收試劑盒為上海生工產(chǎn)品，其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
上游引物5’-ACGGATCCCTCGTATCAAACGGTATG-3’AC為保護(hù)性堿基，GGATCC為BamHI的酶切位點(diǎn)；下游引物5’-ACGCGGCCGCCTTATGAACATTAAACTG-3’
AC為保護(hù)性堿基，GCGGCCGC為NotI的酶切位點(diǎn)。
引物由大連寶生物公司合成2實(shí)驗(yàn)方法2.1pGEX-4T-1/SjHGPRT原核表達(dá)載體的構(gòu)建 回收的目的片段分別以BamHI和NotI雙酶切，抽提的pGEX-4T-1，同樣以BamHI和NotI雙酶切、回收，將酶切的目的基因與酶切質(zhì)粒連接，操作同前。
用CaCl2法[14]制備大腸桿菌BL21的感受態(tài)細(xì)胞，將連接產(chǎn)物20μl全部轉(zhuǎn)化至200μl感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)12-16h，挑取單菌落加入到LB液體培養(yǎng)基中增菌，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。
2.2陽(yáng)性克隆的鑒定 原核表達(dá)重組質(zhì)粒進(jìn)行BamHI和NotI雙酶切鑒定。酶切產(chǎn)物經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
2.3重組質(zhì)粒插入片段測(cè)定鑒定以pGEX-4T-1載體多克隆插入位點(diǎn)前公共序列作為測(cè)序引物(引物由測(cè)序公司提供)，采用Sanger雙脫氧末端終止法，在ABI-377型全自動(dòng)分析儀上對(duì)重組質(zhì)粒插入片段進(jìn)行測(cè)序。
2.4SjHGPRT在原核表達(dá)體系中的表達(dá)及SDS-PAGE分析 實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[28]略作修改。挑取單個(gè)陽(yáng)性菌落加入到5ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃振搖8-12h；然后，將此菌液按1∶100的比例接種到新鮮的LB液體培基中，37℃振搖至OD600≈0.6；加入終濃度為1.0mM的IPTG，28℃誘導(dǎo)4h(誘導(dǎo)前后各留1ml細(xì)菌作誘導(dǎo)檢測(cè))。4℃離心收集細(xì)菌沉淀，懸浮于緩沖液A(50mM Tris-Hcl，pH8.0)中。經(jīng)反復(fù)凍融、超聲粉碎使細(xì)菌裂解，4℃12000rpm離心15min，分別留取上清和沉淀，將沉淀溶于含8M尿素的緩沖液A中，4℃離心取上清。收集溶于緩沖液A和8M尿素中的表達(dá)產(chǎn)物及誘導(dǎo)前后的產(chǎn)物，進(jìn)行SDS-PAGE分析。按配方[29]制作4.5％濃縮膠，10％分離膠，采用LKB電泳裝置電泳，電泳條件為濃縮膠15mA，分離膠25mA，樣品距下緣約0.5cm時(shí)結(jié)束電泳，取凝膠進(jìn)行考馬斯亮蘭染色。
2.5Western Blot分析 為了避免血清中抗大腸桿菌蛋白抗體所引起的假陽(yáng)性，必須去除這些非特異性抗體，將一抗做如下初步純化挑取一個(gè)以pGEX-4T-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的BL21單菌落，接種到含有氨芐青霉素的5ml液體LB中，37℃振搖過(guò)夜，將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液按1∶100接種到含氨芐青霉素的500ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃振搖增菌。收集菌液于4000rpm冷凍離心10min，棄上清后加入6ml PBS懸浮沉淀物。將懸浮液置超聲粉碎儀中粉碎(功率400，超聲4S，間隔3S，循環(huán)50次)，制成BL21裂解液。按1ml血清加3ml裂解液混勻，再用4倍PBS稀釋，4℃吸附過(guò)夜。然后12000rpm離心15min，收集上清，-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> 將表達(dá)的融合蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后以100mA電轉(zhuǎn)移2h，將融合蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上，麗春紅染色檢查轉(zhuǎn)印效果。加入5％脫脂奶粉-PBS-Tween20 4℃封閉過(guò)夜；0.05％PBST洗膜5min×3，PBS洗3-5min，加入吸附后的SIEA26-28kDa免疫兔血清，稀釋度為1∶40)室溫孵育2h，0.05％PBST洗膜5min×3，加入二抗HRP-SPA(1∶30)室溫孵育2h，0.05％PBST洗膜5min×3，晾干后，DAB底物顯色15-30min，水洗終止反應(yīng)，掃描記錄。
4結(jié)果4.1重組質(zhì)粒pcDNA3-SjHGPRT的構(gòu)建及其鑒定 以H3、H4為引物從日本血吸蟲成蟲cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增出500bp以上的片段，與預(yù)計(jì)SjHGPRT的ORF大小567bp相近。將重組子經(jīng)KpnI和ApaI雙酶切后出現(xiàn)兩條帶，大小分別為0.57Kb，5.4Kb；而空白質(zhì)粒pcDNA3經(jīng)KpnI和ApaI雙酶切后，只有一條帶，大小與原質(zhì)粒一致，約為5.4Kb(圖1)；測(cè)序結(jié)果顯示，該重組子含有HGPRT ORF目的基因片段。(見核苷酸序列表)4.2免疫組織化學(xué)結(jié)果對(duì)小鼠肌組織切片進(jìn)行HE染色(圖2)，可見切片部位細(xì)胞分布正常且均勻，肌細(xì)胞核被染成藍(lán)色，胞漿被染成紅色；用正常兔血清做對(duì)照，在肌細(xì)胞肌漿內(nèi)外凡未見棕色反應(yīng)產(chǎn)物者，為陰性反應(yīng)(圖3)；采用SIEA26-28kDa免疫兔血清做為一抗，可見在肌細(xì)胞胞漿中有大小不一、被染成深棕色顆粒狀物質(zhì)，為陽(yáng)性反應(yīng)(圖4)。
4.3pcDNA3/SjHGPRT誘導(dǎo)小鼠抗血吸蟲感染的保護(hù)作用攻擊感染后45d剖殺小鼠沖蟲，計(jì)數(shù)蟲荷及每克肝臟蟲卵數(shù)(LEPG)，由表1、表2可見，pcDNA3/SjHGPRT免疫小鼠獲得了30.4％的減蟲率和44.8％的減卵率，與空白質(zhì)粒pcDNA3及NS對(duì)照組比較，均有顯著性差異(P＜0.05)。
表1.pcDNA3/SjHGPRT免疫小鼠的減蟲率

表2 pcDNA3/SjHGPRT免疫小鼠的減卵率

4.4原核表達(dá)載體pGEX-4T-1/SjHGPRT的構(gòu)建及鑒定 以Y1和K2為引物從日本血吸蟲成蟲cDNA文庫(kù)中，擴(kuò)增得到約570bp的單一目的片段，與SjHGPRT的ORF大小一致；將重組子經(jīng)BamHI和NotI雙酶切后出現(xiàn)兩條帶，大小分別約為0.57Kb約為4.9Kb；而空白質(zhì)粒pGEX-4T-1經(jīng)BamHI和NotI雙酶切后，只有一條帶，大小與原質(zhì)粒一致，約為4.9Kb(圖5)；測(cè)序結(jié)果顯示，該重組子含有HGPRT ORF基因片段。
4.5pGEX-4T-1/SjHGPRT重組質(zhì)粒融合蛋白的表達(dá) pGEX-4T-1原核表達(dá)載體含有SjGST的編碼基因，重組原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1/SjHGPRT轉(zhuǎn)化菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，可見在46kDa附近有外源基因的融合蛋白表達(dá)。這與理論預(yù)測(cè)的外源基因SjHGPRT表達(dá)的蛋白(20.2kDa)及GST蛋白(26kDa)分子量之和一致(圖6)。
4.6SjHGPRT-GST融合蛋白的Western blot分析 結(jié)果顯示(圖7)在46kDa附近有一明顯的識(shí)別條帶，與46.2kDa的分子量大小相一致，這說(shuō)明46.2kDa的融合蛋白(SjHGPRT-GST)能被SIEA26-28kDa免疫兔血清識(shí)別，而不能被正常的兔血清識(shí)別。
權(quán)利要求
1.一種編碼日本血吸蟲(中國(guó)大陸株)HGPRT基因的核苷酸序列，其特征在于它具有如下核苷酸序列cgaacatcttcacgac16atg tct ggt gtt atg aaa aga act ggt tgt att gtg ata gaa gat61Met Ser Gly Val Met Lys Arg Thr Gly Cys Ile Val Ile Glu Asp5 10 15gac ttc aaa ggt ttt cct att gag cat ttt tgc acg tct cct agg 106Asp Phe Lys Gly Phe Pro Ile Glu His Phe Cys Thr Ser Pro Arg20 25 30tat gag ggt tgt ttg gac tac gtt ctc gta tca aac ggt atg atc 151Tyr Glu Gly Cys Leu Asp Tyr Val Leu Val Ser Asn Gly Met Ile35 40 45aag gat aga ctt gaa aaa atg tca atg gat att gtt gac tct tat 196Lys Asp Arg Leu Glu Lys Met Ser Met Asp Ile Val Asp Ser Tyr50 55 60gaa gct tct aat gca aca tct atc aca ctt atg tgt gtt ctg aaa 241Glu Ala Ser Asn Ala Thr Ser Ile Thr Leu Met Cys Val Leu Lys65 70 75ggt gga ttc aaa ttt ctt gct gat ctt gtc gat ggt ctt gag cgt 286Gly Gly Phe Lys Phe Leu Ala Asp Leu Val Asp Gly Leu Glu Arg80 85 90act gta cgt gct cga ggt atc gtc ctc cct atg tca gtt gaa ttc 331Thr Val Arg Ala Arg Gly Ile Val Leu Phe Met Ser Val Glu Phe95 100 105gtt cgc gtt aaa agc tat gtt aat gat gtc agc tat cat gag cct 376Val Arg Val Lys Ser Tyr Val Asn Asp Val Ser Tyr His Glu Phe110 115 120ttg tta act ggt ttg ggg gac cct tca gac tac aga gat aag gat 421Lys Leu Thr Gly Leu Gly Asp Phe Ser Asp Tyr Arg Asp Lys Asp125 130 135att ctt gtt gta gaa gat ata atc gat acg ggc aga aca ata acc 466Ile Leu Val Val Glu Asp Ile Ile Asp Thr Gly Arg Thr Ile Thr140 145 150aaa ttg ata aat cac ttg gaa agc ttg tcc acg aaa agt gtc aag 511Lys Leu Ile Asn His Leu Glu Ser Leu Ser Thr Lys Ser Val Lys155 160 165gta gca agc ctt ctc gtc aaa cgt aca atg cct ccc agt cag tat 556Val Ala Ser Leu Lys Val Lys Arg Thr Met Ppo Pro Ser Glu Tyr170 175 180cat cca gat ttt gtt ggc ttt gaa gtt ccg aat cgg ttt gtt gtt601His Pro Asp Phe Val Gly Phe Glu Val Pro Asn Arg Phe Val Val185 190 195ggt tat gct tta gac tac aat gaa cat ttc cgt gac cta cac cat646Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Asn Glu His Phe Arg Asp Leu His His200 205 210att tgt gtg att aat gaa att ggt caa caa aaa ttc tct gta cct691Ile Cys Val Ile Asn Glu Ile Gly Gln Gln Lys Phe Ser Val Pro215 220 225tgt gtg ccg aaa tca gtt709Cys Val Pro Lys Ser Val231taatgttcaa aagatcggat acacatataa taatgttcaa aagatcggat 759acacatataa acaaggatta ttcatagtgc acaatctcta aatgaacaca 809atgtaatgat taacttattt tgggaaggaa aaacatttac ttcattcaca 859ctgttcatgc aaccatatgt ttccgtgttt atgtctgtat cttacagttt 909ctaactacgt cgtgtatttt taatttttgt tttcatgata tgctctgtat 959tatgaacttc taatttttcc acattaatta ttttgttcac tttttttgat1009atcgttcttt attctctact tgtcatattt tctgtttaga aggtcataca1059tacacgtatt tacctattaa tcgacattgt ttttctgatt catacgtctt1109taagctattt tctttttaaa agtctggttg tcgccacgtt gttcatattg1159atgttgtgat ggttggtact atatagtcat tttgtttgct ccttgttatt1209cactgaagta gtaaagtatt cttgtgatta ttattaaatg taaacttggt1259aaaataagat taaatggaat tggatatgaa aaaaaaaaaa a 1300。
2.一種如權(quán)利要求1所述的日本血吸蟲(中國(guó)大陸株)HGPRT基因的核苷酸序列的克隆方法，其特征在于以日本血吸蟲成蟲cDNA文庫(kù)為模板，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增得到HGPRT基因完整的核苷酸序列。
3.一種如權(quán)利要求1所述的日本血吸蟲(中國(guó)大陸株)HGPRT基因的核苷酸編碼序列在真核生物中的表達(dá)方法，其特征在于所使用的宿主菌為大腸桿菌DH5a，真核表達(dá)質(zhì)粒為pcDNA3。
4.一種如權(quán)利要求1所述的日本血吸蟲(中國(guó)大陸株)HGPRT基因的核苷酸編碼序列在原核生物中的表達(dá)方法，其特征在于所使用的宿主菌為大腸桿菌BL21，原核表達(dá)質(zhì)粒為pGEX-4T-1。
5.一種防治日本血吸蟲病的DNA疫苗，其特征在于它是由日本血吸蟲(中國(guó)大陸株)HGPRT基因和真核表達(dá)質(zhì)粒組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種防治日本血吸蟲病的DNA疫苗，其特征在于其中的真核表達(dá)質(zhì)粒為pcDNA3。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物基因領(lǐng)域，具體涉及日本血吸蟲(中國(guó)大陸株)HGPRT基因的基因序列、原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX－4T－1/SjHGPRT的構(gòu)建及鑒定、真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3/HGPRT的構(gòu)建及重組質(zhì)粒免疫小鼠的保護(hù)性效果觀察。其發(fā)明基于我們對(duì)HGPRT基因可以作為抗日本血吸蟲病天然分子基因疫苗研究靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)，根據(jù)SjHGPRT的cDNA序列的閱讀框(ORF)設(shè)計(jì)引物，并從日本血吸蟲成蟲cDNA文庫(kù)中調(diào)出該基因片段的完整閱讀框，然后亞克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3中，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pcDNA3/SjHGPRT，制備DNA疫苗免疫昆明系小鼠，獲得30.4％的減蟲率、44.8％的減卵率。
文檔編號(hào)C12N15/10GK1749394SQ200510031438
公開日2006年3月22日 申請(qǐng)日期2005年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月12日
發(fā)明者汪世平, 何卓, 余俊龍, 劉立鵬, 李少波, 毛金武, 李宏實(shí), 周松華, 彭先楚, 徐紹銳, 呂志躍, 李文凱 申請(qǐng)人:汪世平, 湖南景達(dá)基因有限公司