專利名稱：日本血吸蟲(中國大陸株)mfs4基因的克隆、表達(dá)和dna疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物基因領(lǐng)域，具體涉及日本血吸蟲(中國大陸株)MFS4基因的基因序列、日本血吸蟲(中國大陸株)MFS4基因的克隆、以及在大腸桿菌中的表達(dá)、日本血吸蟲(中國大陸株)MFS4基因DNA疫苗的構(gòu)建及小鼠免疫保護(hù)試驗(yàn)。
東方田鼠(Microtus fortis)在分類學(xué)上隸屬于嚙齒目倉鼠科(Cricetidae)田鼠亞科(Microtinae)田鼠屬(Microtus)，分布于我國西北、東北及南方16個省區(qū)，是血吸蟲病流行區(qū)洞庭湖洲上廣泛分布的一個優(yōu)勢鼠種，在我國有四個亞種。東方田鼠是至今在我國血吸蟲病疫區(qū)發(fā)現(xiàn)的唯一一種感染日本血吸蟲尾蚴后不致病的哺乳類動物。近年來研究證實(shí)，日本血吸蟲流行區(qū)野生東方田鼠、非日本血吸蟲流行區(qū)野生東方田鼠和室內(nèi)繁殖的東方田鼠均具有抗日本血吸蟲病現(xiàn)象。
為探討東方田鼠抗日本血吸蟲感染機(jī)制，將新鮮東方田鼠血清通過尾靜脈注射被動轉(zhuǎn)移給昆明系小鼠后，與對照組比較，小鼠體內(nèi)血吸蟲蟲荷、糞便蟲卵數(shù)、毛蚴孵出率，均具顯著性意義變化。為進(jìn)一步研究東方田鼠血清中哪些成分和因子與東方田鼠抗日本血吸蟲感染相關(guān)，以ELISA方法檢測東方田鼠抗血吸蟲可溶性童蟲抗原不同亞型的抗體，結(jié)果提示東方田鼠血清中IgG3抗體可能在其抗日本血吸蟲感染中發(fā)揮重要作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，東方田鼠正常血清中存在有較高水平的抗日本血吸蟲成蟲可溶性抗原的IgG3亞類抗體，其OD值是抗BSA的31倍，而小鼠陰性血清為1.7倍。以上研究結(jié)果表明體液免疫在東方田鼠抗血吸蟲病中發(fā)揮了重要的作用，IgG3抗體可能是東方田鼠血清中抗血吸蟲病的重要成分。
本發(fā)明根據(jù)東方田鼠對日本血吸蟲感染具有天然抵抗力這一特性，利用未感染日本血吸蟲尾蚴的實(shí)驗(yàn)室繁殖的洞庭湖種群東方田鼠血清的IgG3抗體篩選日本血吸蟲(中國大陸株)成蟲cDNA文庫，結(jié)果得到了東方田鼠血清IgG3抗體相關(guān)的日本血吸蟲特異性抗原基因MFS4，并對其作為血吸蟲病候選疫苗分子作了研究。
本發(fā)明應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室繁殖洞庭湖種群的健康東方田鼠血清和羊抗小鼠IgG3免疫篩選日本血吸蟲(中國大陸株)成蟲cDNA文庫，經(jīng)過初篩和多輪復(fù)篩，獲得一陽性克隆，應(yīng)用RACE技術(shù)對這一克隆的cDNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。利用NCBI的Blast進(jìn)行基因序列的同源性分析，結(jié)果無顯著同源性基因(Score值＜50bits)，表明該基因?yàn)橐谎x新基因。該日本血吸蟲(中國大陸株)MFS4基因的核苷酸序列及相應(yīng)的氨基酸序列見序列1gtatcatatc gttaacgcgc tccagttttg tttttgccca ggtattata atg gcg gtt 58Met Ala Val1ggt ggt cag aaa aag gtc act aaa ggg ggg aag aaa gga ggc aaa aag106Gly Gly Gln Lys Lys Val Thr Lys Gly Gly Lys Lys Gly Gly Lys Lys5 10 15aaa acg gct gat cca ttc tct aaa aag gag tgg tat gat atc aag gct154Lys Thr Ala Asp Pro Phe Ser Lys Lys Glu Trp Tyr Asp Ile Lys Ala20 25 30 35cca gct atg ttt cct aaa agg aca tgt gca aga acg ctt gtc aca cga202Pro Ala Met Phe Pro Lys Arg Thr Cys Ala Arg Thr Leu Val Thr Arg40 45 50act cag ggt act cgc ata gcc agt gaa gca ctt aag ggt cgt gtt gtt250Thr Gln Gly Thr Arg Ile Ala Ser Glu Ala Leu Lys Gly Arg Val Val55 60 65aca ctt agt ctt ggg gat ctg agc gaa aag aac gaa gaa gtc ttc cgt298Thr Leu Ser Leu Gly Asp Leu Ser Glu Lys Asn Glu Glu Val Phe Arg70 75 80aaa ttc aag ctt caa atc gaa gat gtc cag ggg cgt cat tgt cta aca 346Lys Phe Lys Leu Gln Ile Glu Asp Val Gln Gly Arg His Cys Leu Thr85 90 95aat ttc cac gga tta gaa ctt act cga gac aaa cta tgt tca gtt gtt 394Ash Phe His Gly Leu Glu Leu Thr Arg Asp Lys Leu Cys Ser Val Val100 105 110 115gtt aag tgg cgg tca act ata gaa gcg cac gtc gac gtc aaa aca aca 442Val Lys Trp Arg Ser Thr Ile Glu Ala His Val Asp Val Lys Thr Thr120 125 130gat gga tac tta ctt cgt ttc ttt att atc acg ttc act cca agt gta 490Asp Gly Tyr Leu Leu Arg Phe Phe Ile Ile Thr Phe Thr Pro Ser Val135 140 145cca cgg tct gaa agg ctc cac tct tat gct cag acc aca cgc ata aaa 538Pro Arg Ser Glu Arg Leu His Ser Tyr Ala Gln Thr Thr Arg Ile Lys150 155 160cgg att cgc gct cgc ctt gtt gag ata atc cag caa gag gtt tct act 586Arg Ile Arg Ala Arg Leu Val Glu Ile Ile Gln Gln Glu Val Ser Thr165 170 175tgc gat ctg aaa gag gtc gtt aat aag ctt att cca gat tcc att gca 634Cys Asp Leu Lys Glu Val Val Asn Lys Leu Ile Pro Asp Ser Ile Ala180 185 190 195caa gac gct cga aaa gcg gca tca tgg ata tat cca cta ggt gag aca 682Gln Asp Ala Arg Lys Ala Ala Ser Trp Ile Tyr Pro Leu Gly Glu Thr200 205 210ttt atc cgc aaa gtt aag gtt tta aaa aga cca aaa gct gat ctc gct 730Phe Ile Arg Lys Val Lys Val Leu Lys Arg Pro Lys Ala Asp Leu Ala215 220 225cgg ctc atg gaa ctt cat ggt gaa tca aag tca act gcc cct ggt gag 778Arg Leu Met Glu Leu His Gly Glu Ser Lys Ser Thr Ala Pro Gly Glu230 235 240act gta tcc cgt cca gat cac tat gaa cct ccg aaa gtt gat tca gtg 826Thr Val Ser Arg Pro Asp His Tyr Glu Pro Pro Lys Val Asp Ser Val245 250 255taattcaata aagaatttca tccggaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 871DNA序列分析表明該基因(MFS4)的開放閱讀框含780bp，編碼259個氨基酸。基因的起始密碼子符合Kozak序列特征，3’端非翻譯序列含有一個多聚核苷酸化信號AATAAA。MFS4基因編碼產(chǎn)物的第23-223氨基酸區(qū)段與核糖體蛋白3A家族有60％同源性，其理論等電點(diǎn)(pI)為9.1，推測蛋白質(zhì)分子量為29kD。利用PSORT在線預(yù)測蛋白質(zhì)信號肽軟件分析，在N端未發(fā)現(xiàn)信號肽的存在，以Tmpred軟件也未預(yù)測出蛋白質(zhì)跨膜區(qū)的存在。
將MFS4基因亞克隆至原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a/MFS4，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)表達(dá)菌后，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE電泳分析顯示，重組質(zhì)粒獲得高效表達(dá)，融合蛋白分子量大約在35kD左右。Western-blotting實(shí)驗(yàn)顯示重組抗原可被日本血吸蟲成蟲粗抗原免疫小鼠血清識別，而載體表達(dá)蛋白不與抗體發(fā)生反應(yīng)，表明該融合蛋白具有良好的抗原性，為進(jìn)一步開展動物免疫實(shí)驗(yàn)提供了基礎(chǔ)。
進(jìn)一步將MFS4基因亞克隆至真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3中，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pcDNA3/MFS4，轉(zhuǎn)化TG1細(xì)菌后，擴(kuò)大培養(yǎng)，制備純化的重組質(zhì)粒DNA作為DNA疫苗免疫6-7周齡的昆明系小鼠，每次每鼠腿部肌肉注射100ug DNA，共免疫三次，每次間隔二周，末次免疫2周后攻擊日本血吸蟲尾蚴，攻擊后6周剖殺小鼠，門靜脈灌洗收集成蟲，肝臟用8％KOH消化后計(jì)算每克肝組織所荷蟲卵數(shù)。結(jié)果含MFS4基因的pcDNA3/MFS4重組質(zhì)粒DNA免疫鼠的蟲荷數(shù)為17.13，質(zhì)粒pcDNA3 DNA免疫鼠平均每鼠蟲荷數(shù)為24.27，減蟲率為28.6％。重組質(zhì)粒免疫鼠平均每克肝組織含蟲卵數(shù)為7258.49個，質(zhì)粒DNA免疫鼠為9370.11個，減卵率為21.73％。
圖3Western-blotting檢測表達(dá)目的蛋白，用感染血吸蟲小鼠血清檢測，在pET28a(+)/MFS4表達(dá)產(chǎn)物的35kD處出現(xiàn)一陽性反應(yīng)條帶。
M標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量；1pET28a(+)表達(dá)產(chǎn)物；2pET28a(+)/MFS4表達(dá)產(chǎn)物圖4日本血吸蟲(中國大陸株)MFS4基因陽性克隆的PCR鑒定MDNA Maker 2,000；1陽性克隆的PCR產(chǎn)物圖5陽性克隆重組質(zhì)粒pBluescript IISK(+)的PCR鑒定MDNA Maker 2,000；1重組質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物圖6陽性克隆重組質(zhì)粒pBluescript IISK(+)的酶切分析MDNA Maker 2,000；1重組質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物
1.2日本血吸蟲中國大陸株安徽品系尾蚴中國農(nóng)科院上海家畜寄生蟲病研究所釘螺室提供。
1.3質(zhì)粒、菌種pBluescript IISK(+)克隆載體、大腸桿菌Y1090、TGI由中國農(nóng)科院上海家畜寄生蟲病研究所保存。pGEM-T Easy克隆載體購自Promega公司。
1.4文庫日本血吸蟲成蟲cDNA文庫采用定向克隆法將目的cDNA片段插入到λZipLox載體中，雌、雄文庫庫容量分別為3.74×106、3.28×106，重組率都在96％以上，插入片段多在0.5-2kb之間。
1.5主要試劑及工具酶HRP-羊抗小鼠IgG3為美國Caltag公司產(chǎn)品；5′RACE試劑盒、Super Script II RnaseH-反轉(zhuǎn)錄酶購自Gibco BRL公司；T4 DNA連接酶，購自Promega公司；限制性內(nèi)切酶EcoRI、HindIII、DNA Marker DL15000、DNA Marker DL2000、dNTP Mixture為TaKaRa公司產(chǎn)品。Tag Plus I DNA聚合酶，購自上海生工生物工程有限公司。T3、T7及Sp6啟動子引物購自上海華美生物公司。1.65′RACE的引物AAP(Abridged Anchor Primer)5’-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3’AUAP(Abridged Universal Amplification Primer)5’-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3’MFS4-GSP15’-GGTTCATAGTGTTCTGA-3’ (750--767)MFS4-GSP25’-GGAGCCTTTCAGACCGTGGTACA-3’(444--467)MFS4-GSP35’-CGACGTGCGCTTCTATAGTT-3’ (366--386)MFS4-GSP45’-GGCTATGCGAGTACCCTGAGTT-3’ (159--181)引物GSP1、GSP2、GSP3、GSP4是MFS4基因片段5’RACE特異的反向引物，括號內(nèi)的數(shù)字表示該引物在此基因片段中的位置。引物由上海基康生物技術(shù)有限公司合成。2.方法2.1東方田鼠陰性血清制備摘眼球采血，室溫靜置1小時后，于4℃以4000g離心10min，取上清，然后收集血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 2.2血清中大腸桿菌抗體預(yù)吸收制備大腸桿裂解液貯存于-20℃?zhèn)溆?。將血清?∶10稀釋到含3％牛血清白蛋白的TNT中，每0.1ml血清加入0.5ml大腸桿菌裂解液，混合后于4℃搖床振蕩過夜后離心去沉淀，反復(fù)吸收3次。被吸收過的血清，直接用于免疫篩選或加入0.05％疊氮鈉，保存于4℃?zhèn)溆谩?br> 2.3免疫篩選日本血吸蟲成蟲cDNA表達(dá)文庫制備大腸桿菌Y1090感受態(tài)細(xì)胞。將約3×103個噬菌體吸附于200ul Y1090感受態(tài)細(xì)胞后加人頂層瓊脂，混勻后鋪LB平板，42℃培養(yǎng)4小時。將NC膜浸潤10mMIPTG，自然風(fēng)干后覆蓋于平板上，37℃下培養(yǎng)。做好標(biāo)記，用TNT緩沖液洗去殘存的瓊脂和菌體。換液時均用TNT緩沖液洗滌。該NC膜用3％牛血清白蛋白封閉液室溫下封閉30分鐘。將它和吸收過的東方田鼠血清室溫下作用1小時后，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG3反應(yīng)液中(稀釋度1∶1000)室溫作用1.5小時。再用DAB顯色液顯色10分鐘。觀察并從平板的相應(yīng)位置挑出陽性克隆，放入1mlSM中，于4℃放置若干小時，洗脫的噬菌體顆粒，以同樣方法進(jìn)行復(fù)篩。
2.4陽性克隆的擴(kuò)增將陽性克隆噬菌體吸附于E.Coli Y1090感受態(tài)細(xì)胞，于LB平板上37℃培養(yǎng)過夜，用3ml SM收集噬菌體DNA。4000g，4℃離心10分鐘。上清加入RNA酶A 1μl于37℃溫育15分鐘，加入等體積的含2％聚乙二醇和2mol/L NaCl的噬菌體稀釋液，冰浴1小時。以10000g，4℃離心10分鐘，回收噬菌體DNA，加入0.5mlTE(pH8.0)溶解沉淀，再加入5ul 10％SDS于68℃溫育5分鐘，加入10ul 5mol/L NaCl，用酚∶氯仿和氯仿各抽提一次。取水相，加入等體積異丙醇，混勻后于-70℃放置15分鐘。于4℃以12000g離心15分鐘。用70％乙醇洗滌沉淀，并將乙醇去凈，將DNA溶于50ul TE(pH8.0)中。
2.5陽性克隆的PCR擴(kuò)增鑒定以陽性克隆噬菌體為模板進(jìn)行PCR，按以下體系進(jìn)行Template 1μl
10×PCR buffer 5μldNTP混合物 6μlSP6引物0.5μlT7引物 0.5μlTag PlusI DNAase(4u/μl) 0.5μlddH2O 36.5μl依次加入以上各反應(yīng)物，混勻后輕微離心，再覆蓋2滴礦物油，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR條件94℃預(yù)變性5min；然后94℃ 1min，55℃ 55s，72℃ 1min，共30個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取2μl PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物于1％的瓊脂糖凝膠上電泳分析。
2.6PCR產(chǎn)物與pBluescript IISK(+)克隆載體的連接和轉(zhuǎn)化克隆載體與目的DNA的連接將質(zhì)粒載體pBluescript IISK(+)、PCR產(chǎn)物分別用EcoRI、HindIII酶切后，電泳，用Silver Beads DNA膠回收試劑盒回收線性質(zhì)粒和目的片段。按以下體系進(jìn)行連接pIISK(+)載體 2μl目的基因片段 3μl10×Ligation Buffer1μlT4 DNA連接酶 1μl水 3ul總體積 10μl混勻后，16℃連接過夜。取5μl連接反應(yīng)物，加入到200μl新鮮制備的TGI感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，置冰上20min。于42℃水浴熱激細(xì)胞45~50sec(其間不要搖動離心管)。熱激后，立即轉(zhuǎn)移至冰上放置2min。向離心管中加入800μl SOC培養(yǎng)基，混勻后將管轉(zhuǎn)移至37℃搖床上溫育1.5h(~150r/min)。取轉(zhuǎn)化好的菌液200μl涂布于加有Ampicillin、X-gal和IPTG的LB平板上，37℃溫箱中培養(yǎng)16～24h，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。2.7陽性克隆的鑒定及測序挑取經(jīng)初步蘭白斑篩選認(rèn)為陽性的菌落，堿裂解法小量制備質(zhì)粒DNA，-20℃保存?zhèn)溆?。PCR鑒定取5μl質(zhì)粒溶液作為PCR模板以T3及T7為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，同時以藍(lán)斑質(zhì)粒作對照。取5μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1％的瓊脂糖凝膠上電泳。同時用EcoRI、Hind III對制備的質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，酶切產(chǎn)物于1％的瓊脂糖凝膠上電泳分析。經(jīng)鑒定為重組的質(zhì)粒用Sangers雙脫氧核糖核酸末端終止法測序。2.8日本血吸蟲中國大陸株MFS4全長基因的克隆日本血吸蟲蟲體總RNA制備用日本血吸蟲中國大陸株安徽品系尾蚴，按2500條/只的量攻擊感染新西蘭大白兔，6周后無菌收集蟲體，用高壓滅菌的PBS洗兩次，放入小凍存管中，液氮中速凍貯存?zhèn)溆?。按Trizol試劑盒使用說明提取血吸蟲蟲體總RNA。
5′RACE擴(kuò)增基因5′端按5′RACE試劑盒說明書介紹的方法進(jìn)行。cDNA第一鏈制備與純化cDNA第一鏈由目的基因片段特異的引物GSP1引導(dǎo)合成。每25μl反應(yīng)體系中，含有5μgRNA，2.5mM MgCl2，20mM KCl，20mM Tris-Cl(PH8.4)，10mM DTT，100mM cDNA primer(GSP1)，400μMdNTP，200 U SupperscriptII RT。合成反應(yīng)在42℃進(jìn)行50分鐘，然后在70℃加熱15分鐘終止反應(yīng)。用酶消化法去除模板RNA后。加入120μl平衡至室溫的Binding buffer(6M NaI)，混勻后加到cDNA純化柱上，13000g離心20秒；用0.4ml預(yù)冷的Washing buffer洗柱4次，每次13000g離心20秒；然后用0.4ml預(yù)冷的70％乙醇洗柱4次，每次13000g離心20秒；最后一次70％乙醇洗柱后，13000g離心1分鐘；最后加50μl預(yù)熱到65℃的去離子水，13000g離心20秒收集純化的cDNA第一鏈。dC-tailed cDNA的制備依次加入各反應(yīng)物，DEPC-treated water 6.5μl5×tailing buffer5.0μl2mM dCTP 2.5μl純化的cDNA第一鏈 10.0μl94℃作用2-3分鐘后冰上冷卻1分鐘，短暫離心收集反應(yīng)物，加入1μlTdT(terminal deoxynucleotidyl transferase)，溫和混勻，37℃作用10分鐘后，65℃ 10分鐘滅活TdT，-20℃保存。PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系(50ul)為10×PCR buffer 5.0μl25mM MgCl23.0μl10mM dNTPmix10μlnested GSP2(10μM) 2.0μlAbridged Anchor Primer(10μM) 2.0μldC-tailed cDNA 5.0μlTag PlusI DNAase(4u/μl)0.5μlddH2O 31.5μl條件為94℃預(yù)變性5min；然后94℃1min，48℃55sec，72℃1min，共30個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10min。PCR結(jié)束后取10μl電泳檢查。巢式PCR取巢式引物GSP3和引物AUAP，以第一輪的PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行擴(kuò)增。從50μl反應(yīng)體系中取出5μl，稀釋100倍后作為第二輪PCR產(chǎn)物的模板。PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5min；然后94℃1min，50℃55s，72℃1min，共30個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10min。取巢式引物GSP4和引物AUAP，以第二輪的PCR產(chǎn)物為模板，進(jìn)行擴(kuò)增。從50μl反應(yīng)體系中取出5μl，稀釋100倍后作為第三輪PCR產(chǎn)物的模板。PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5min；然后94℃1min，55℃55s，72℃1min，共30個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10min。PCR結(jié)束后取10μl與第一輪和第二輪的PCR產(chǎn)物一起電泳檢測。
5′RACE PCR產(chǎn)物的克隆和鑒定PCR產(chǎn)物與pGEM-T Easy克隆載體按前法進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化，篩選、鑒定陽性克隆，并進(jìn)行測序分析。3.結(jié)果3.1陽性克隆的篩選及PCR擴(kuò)增鑒定初篩共鋪板26個，從大約8萬個噬菌班中篩選出5個陽性克隆，經(jīng)過多輪復(fù)篩確定2個陽性克隆。對其中一個陽性克隆以T7及SP6為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別約為830bp(圖4)。3.2陽性克隆重組質(zhì)粒pBluescript IISK(+)的PCR、酶切鑒定經(jīng)過EcoRI，HindIII雙酶切的PCR產(chǎn)物與同樣酶切消化的pBluescript IISK(+)質(zhì)粒連接后，以T3及T7為引物進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果PCR擴(kuò)增出的片段與預(yù)期分子量大小一致，約為830bp(圖5)。用EcoRI和Hind III對其進(jìn)行酶切分析，結(jié)果獲得的片段與預(yù)期的一致如(圖6)。3.4核苷酸序列測定經(jīng)過PCR和酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒，以Sangers雙脫氧核糖核酸末端終止法測序，利用NCBI的Blast進(jìn)行基因序列的同源性搜索，結(jié)果無顯著同源性(Score值＜50bits)，為血吸蟲新基因序列，命名為MFS4基因，見序列1。3.5 5’RACE擴(kuò)增產(chǎn)物重組質(zhì)粒pGEM-T的PCR、酶切鑒定利用5’RACE技術(shù)對外源片段進(jìn)行全長cDNA的克隆，將第三輪PCR產(chǎn)物同pGEM-T載體連接。PCR鑒定結(jié)果，擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為300bp。利用在T載體插入位點(diǎn)兩側(cè)的NotI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)進(jìn)行酶切分析，得到插入片段大小約為300bp。3.6測序結(jié)果與分析測序后，進(jìn)行序列拼接。結(jié)果分析表明MFS4的開放閱讀框?yàn)?80bp，編碼259個氨基酸，見序列2。Met Ala Val Gly Gly Gln Lys Lys Val Thr Lys Gly Gly Lys Lys Gly1 5 10 15Gly Lys Lys Lys Thr Ala Asp Pro Phe Ser Lys Lys Glu Trp Tyr Asp20 25 30Ile Lys Ala Pro Ala Met Phe Pro Lys Arg Thr Cys Ala Arg Thr Leu35 40 45Val Thr Arg Thr Gln Gly Thr Arg Ile Ala Ser Glu Ala Leu Lys Gly50 55 60Arg Val Val Thr Leu Ser Leu Gly Asp Leu Ser Glu Lys Asn Glu Glu65 70 75 80Val Phe Arg Lys Phe Lys Leu Gln Ile Glu Asp Val Gln Gly Arg His85 90 95Cys Leu Thr Asn Phe His Gly Leu Glu Leu Thr Arg Asp Lys Leu Cys100 105 110Ser Val Val Val Lys Trp Arg Ser Thr Ile Glu Ala His Val Asp Val115 120 125Lys Thr Thr Asp Gly Tyr Leu Leu Arg Phe Phe Ile Ile Thr Phe Thr130 135 140Pro Ser Val Pro Arg Ser Glu Arg Leu His Ser Tyr Ala Gln Thr Thr145 150 155 160Arg Ile Lys Arg Ile Arg Ala Arg Leu Val Glu Ile Ile Gln Gln Glu165 170 175Val Ser Thr Cys Asp Leu Lys Glu Val Val Asn Lys Leu Ile Pro Asp180 185 190Ser Ile Ala Gln Asp Ala Arg Lys Ala Ala Ser Trp Ile Tyr Pro Leu195 200 205Gly Glu Thr Phe Ile Arg Lys Val Lys Val Leu Lys Arg Pro Lys Ala210 215 220Asp Leu Ala Arg Leu Met Glu Leu His Gly Glu Ser Lys Ser Thr Ala225 230 235 240Pro Gly Glu Thr Val Ser Arg Pro Asp His Tyr Glu Pro Pro Lys Val245 250 255Asp Ser Val全長基因的起始密碼子都符合Kozak序列特征(Kozak，1991)，3’端非翻譯序列都包含一個多聚核苷酸化信號(AATAAA)。MFS4基因編碼產(chǎn)物的23-223氨基酸區(qū)段與核糖體蛋白3A家族有60％同源性，其理論等電點(diǎn)(pI)為9.1，理論分子量29KD，利用PSORT在線預(yù)測蛋白質(zhì)信號肽軟件分析，在N端未發(fā)現(xiàn)信號肽的存在，以Tmpred軟件也未預(yù)測出蛋白質(zhì)跨膜區(qū)的存在。二日本血吸蟲(中國大陸株)MFS4基因DNA疫苗的構(gòu)建及小鼠免疫保護(hù)試驗(yàn)1實(shí)驗(yàn)材料pcDNA3真核表達(dá)載體，由中國農(nóng)科院上海家畜寄生蟲病研究所、農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室保存。實(shí)驗(yàn)動物為昆明系小鼠，雄性、6周齡，購自中科院上海分院實(shí)驗(yàn)動物中心。根據(jù)MFS4全長cDNA序列設(shè)計(jì)引物上游引物5′-ATGGATCCAACGCGCTCCAGTTTTGT-3′下游引物5′-ATGCGGCCGCCCGGATGAAATTCTATATT-3′引物由上?；瞪锕竞铣伞?實(shí)驗(yàn)方法2.1 MFS4基因的RT-PCR擴(kuò)增按前述方法收集日本血吸蟲中國大陸株成蟲，提取蟲體總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。MFS4基因的RT-PCR擴(kuò)增按以下體系進(jìn)行MFS4基因反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1μl10×PCR Buffer5μldNTP混合物6μl上、下游引物 各0.5μlTag PlusI DNAase(4u/μl) 0.5μlddH2O36.5μl條件為94℃預(yù)變性5min，94℃ 30s；50℃ 55s；72℃ 1min，共30個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72℃自動延伸10min。PCR結(jié)束后，取5μl反應(yīng)產(chǎn)物于1％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢查。2.2小量制備真核表達(dá)載體pcDNA3質(zhì)粒將pcDNA3質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGI感受態(tài)細(xì)胞，鋪含Ampicillin的LB平板，37℃培養(yǎng)16h，挑單菌落于3ml LB(含Ampicillin)培養(yǎng)基中，37C搖床培養(yǎng)過夜，用堿裂解法小量制備質(zhì)粒DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?.3重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3/MFS4的構(gòu)建將PCR產(chǎn)物、pcDNA3載體分別用BamHI，NotI酶切后，電泳，用SilverBeads DNA膠回收試劑盒回收小片段目的基因和線性質(zhì)粒DNA。取2μl質(zhì)粒載體DNA、3μl目的基因、1μl 10×Rapid Ligation Buffer、1μl T4 DNA連接酶，3ul ddH2O，總體積為10μl，混勻后，4℃連接過夜。取5μl連接產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGI感受態(tài)細(xì)胞，將菌液涂布于含Ampicillin的LB固體培養(yǎng)基上，37℃溫箱培養(yǎng)過夜。挑選陽性克隆進(jìn)行PCR、酶切鑒定。將經(jīng)PCR、酶切鑒定為陽性的克隆測序，確認(rèn)MFS4基因正確插入pcDNA3真核表達(dá)載體。2.4重組真核表達(dá)質(zhì)粒的純化將陽性的重組質(zhì)?？寺U(kuò)大培養(yǎng)，以堿裂解法大量抽提質(zhì)粒DNA，并用PEG8000進(jìn)一步純化質(zhì)粒DNA。最后用400μl TE(pH8.0)溶解沉淀，貯存于-20℃以備用。2.5動物免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)將小鼠隨機(jī)分為兩組，實(shí)驗(yàn)組15只接種純化的重組真核表達(dá)質(zhì)粒DNA，對照組15只接種純化的pcDNA3質(zhì)粒DNA。小鼠用腿部肌肉注射法免疫，劑量為100ugDNA/鼠，共免疫三次，每次間隔兩周。末次免疫后兩周，用腹部蓋玻片法接種尾蚴，劑量為40±2條/鼠。攻擊6周后，解剖小鼠，肝門靜脈沖洗法收集成蟲，計(jì)數(shù)。用以下公式計(jì)算減蟲率 解剖后每鼠取肝臟2g，剪碎后用8％KOH(20ml)消化，60℃水浴4-6h。取400μl消化液在顯微鏡下計(jì)數(shù)，按以下公式計(jì)算減卵率。(EPG為平均每克肝組織中所荷蟲卵數(shù)) 3.結(jié)果MFS4基因的RT-PCR擴(kuò)增以反轉(zhuǎn)錄的cDNA第一鏈為模板，用兩條特異性引物擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物，經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為850bp左右，與預(yù)期分子量大小一致。
重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3/MFS4的鑒定(見

圖1)以T7、SP6為引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量與預(yù)期分子量大小一致。進(jìn)一步用BamH I、Not I進(jìn)行酶切鑒定，得到約850bp左右的片段。測序分析表明，MFS4正確插入pcDNA3真核表達(dá)載體。
動物免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果表1 pcDNA3-MFS4重組質(zhì)粒免疫小鼠后抗血吸蟲感染結(jié)果Tablel.Worm and egg counting reduction rate induced by pcDNA3-MFS4 in mice組別 平均蟲荷數(shù)(x±s)減蟲率 平均卵荷數(shù)減卵率GroupWorm burden(x±s) Worm reduction PEPG(x±s) Egg reductionPrate(％) rate(％)實(shí)驗(yàn)組 17.13±4.46 28.64％ ＜0.057258.49±787.65 21.73％ ＜0.05Experiment對照組 24.27±5.40 9370.11±2020.43Control實(shí)驗(yàn)組和對照組的小鼠攻擊感染后均存活。從表1可看出，用pcDNA3/MFS4重組質(zhì)粒免疫的小鼠，平均每鼠的蟲荷數(shù)為17.13，質(zhì)粒pcDNA3免疫的小鼠蟲荷數(shù)為24.27，實(shí)驗(yàn)組明顯低于對照組，減蟲率為28.64％；實(shí)驗(yàn)組小鼠平均每克肝組織含蟲卵數(shù)為7258.49，對照組為9370.11，減卵率為21.73％。三日本血吸蟲(中國大陸株)MFS4基因在大腸桿菌中的表達(dá)1實(shí)驗(yàn)材料pET28a(+)原核表達(dá)載體由中國農(nóng)科院上海家畜寄生蟲病研究所，農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存提供。2實(shí)驗(yàn)方法重組質(zhì)粒pET28a/MFS4的構(gòu)建將前述重組質(zhì)粒pcDNA3/MFS4及pET28a(+)質(zhì)粒分別用BamHI、NotI酶切后，用Silver Beads DNA膠回收試劑盒回收目的DNA片段。取2μlpET28a(+)載體、3μl目的基因片段、1μl 10×Rapid Ligation Buffer、1μl T4 DNA連接酶、3ul水，總體積為10μl，混勻后，4℃連接過夜。取5μl連接反應(yīng)液，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，用含Kanamycin的LB平板篩選。37℃溫箱培養(yǎng)過夜。重組質(zhì)粒pET28a/MFS4的鑒定挑克隆后按前述方法用PCR及酶切鑒定，并將鑒定為陽性的克隆測序分析，以確定外源基因片段是否正確插入pET28a載體中。誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)將含有目的基因重組質(zhì)粒的細(xì)菌，劃線接種于含Kanamycin的LB平板上。挑選生長良好的克隆，接種至3ml LB培養(yǎng)基(含50ug/ul Kanamycin)中，37℃搖床培養(yǎng)過夜。按1/100的比例轉(zhuǎn)移到另一LB(含50ug/ulKanamycin)培養(yǎng)基中，37℃快速振蕩培養(yǎng)至細(xì)菌生長對數(shù)期OD600＝0.6～1.0時，加入IPTG至1mmol/L，37℃快速振蕩培養(yǎng)，并在加入IPTG后0h、2h、4h、6h、8h、10h后分別取出1ml細(xì)菌培養(yǎng)物，12000rpm離心1min，棄去上清液，沉淀中加入100ul 1×SDS-PAGE上樣緩沖液，充分混勻懸浮細(xì)菌，100℃煮樣品5min，離心取上清液，保存于-20℃或直接進(jìn)行SDS-PAGE電泳。將準(zhǔn)備好的樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析和Western blotting檢測。3結(jié)果重組質(zhì)粒pET28a/MFS4的鑒定將BamH I、Not I構(gòu)建的pET28a/MFS4質(zhì)粒用PCR鑒定，其擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量約850bp，合乎預(yù)期的分子量。進(jìn)一步用限制性內(nèi)切酶BamHI、Not I進(jìn)行酶切，結(jié)果得到約850bp左右的片段。誘導(dǎo)MFS4基因的特異性表達(dá)從SDS-PAGE電泳結(jié)果看，表達(dá)的融合蛋白分子量在預(yù)計(jì)的35KD左右，并且發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)10h后蛋白表達(dá)基本達(dá)到最高水平(見圖2)。
Western-blotting檢測表明，將重組質(zhì)粒和空載體分別誘導(dǎo)表達(dá)的產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE，再轉(zhuǎn)移到NC膜上，用小鼠抗日本血吸蟲成蟲粗抗原血清免疫雜交，結(jié)果重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白與抗體呈陽性反應(yīng)，而空載體的表達(dá)產(chǎn)物不與抗體反應(yīng)，證明該融合蛋白具有良好的抗原性(見圖3)。
權(quán)利要求
1.一種編碼日本血吸蟲(中國大陸株)MFS4基因的核苷酸序列，其特征在于它具有如下的核苷酸序列及相應(yīng)的氨基酸序列g(shù)tatcatatc gttaacgcgc tccagttttg tttttgccca ggtattata atg gcg gtt 58Met Ala Val1ggt ggt cag aaa aag gtc act aaa ggg ggg aag aaa gga ggc aaa aag106Gly Gly Gln Lys Lys Val Thr Lys Gly Gly Lys Lys Gly Gly Lys Lys5 10 15aaa acg gct gat cca ttc tct aaa aag gag tgg tat gat atc aag gct154Lys Thr Ala Asp Pro Phe Ser Lys Lys Glu Trp Tyr Asp Ile Lys Ala20 25 30 35cca gct atg ttt cct aaa agg aca tgt gca aga acg ctt gtc aca cga202Pro Ala Met Phe Pro Lys Arg Thr Cys Ala Arg Thr Leu Val Thr Arg40 45 50act cag ggt act cgc ata gcc agt gaa gca ctt aag ggt cgt gtt gtt250Thr Gln Gly Thr Arg Ile Ala Ser Glu Ala Leu Lys Gly Arg Val Val55 60 65aca ctt agt ctt ggg gat ctg agc gaa aag aac gaa gaa gtc ttc cgt298Thr Leu Ser Leu Gly Asp Leu Ser Glu Lys Asn Glu Glu Val Phe Arg70 75 80aaa ttc aag ctt caa atc gaa gat gtc cag ggg cgt cat tgt cta aca346Lys Phe Lys Leu Gln Ile Glu Asp Val Gln Gly Arg His Cys Leu Thr85 90 95aat ttc cac gga tta gaa ctt act cga gac aaa cta tgt tca gtt gtt394Asn Phe His Gly Leu Glu Leu Thr Arg Asp Lys Leu Cys Ser Val Val100 105 110 115gtt aag tgg cgg tca act ata gaa gcg cac gtc gac gtc aaa aca aca442Val Lys Trp Arg Ser Thr Ile Glu Ala His Val Asp Val Lys Thr Thr120 125 130gat gga tac tta ctt cgt ttc ttt att atc acg ttc act cca agt gta 490Asp Gly Tyr Leu Leu Arg Phe Phe Ile Ile Thr Phe Thr Pro Ser Val135 140 145cca cgg tct gaa agg ctc cac tct tat gct cag acc aca cgc ata aaa 538Pro Arg Ser Glu Arg Leu His Ser Tyr Ala Gln Thr Thr Arg Ile Lys150 155 160cgg att cgc gct cgc ctt gtt gag ata atc cag caa gag gtt tct act 586Arg Ile Arg Ala Arg Leu Val Glu Ile Ile Gln Gln Glu Val Ser Thr165 170 175tgc gat ctg aaa gag gtc gtt aat aag ctt att cca gat tcc att gca 634Cys Asp Leu Lys Glu Val Val Asn Lys Leu Ile Pro Asp Ser Ile Ala180 185 190 195caa gac gct cga aaa gcg gca tca tgg ata tat cca cta ggt gag aca 682Gln Asp Ala Arg Lys Ala Ala Ser Trp Ile Tyr Pro Leu Gly Glu Thr200 205 210ttt atc cgc aaa gtt aag gtt tta aaa aga cca aaa gct gat ctc gct 730Phe Ile Arg Lys Val Lys Val Leu Lys Arg Pro Lys Ala Asp Leu Ala215 220 225cgg ctc atg gaa ctt cat ggt gaa tca aag tca act gcc cct ggt gag 778Arg Leu Met Glu Leu His Gly Glu Ser Lys Ser Thr Ala Pro Gly Glu230 235 240act gta tcc cgt cca gat cac tat gaa cct ccg aaa gtt gat tca gtg 826Thr Val Ser Arg Pro Asp His Tyr Glu Pro Pro Lys Val Asp Ser Val245 250 255taattcaata aagaatttca tccggaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa871
2.一種如權(quán)利要求1所述的日本血吸蟲(中國大陸株)MFS4基因的核苷酸序列的克隆方法，其特征在于用東方田鼠健康血清結(jié)合抗小鼠IgG3抗體免疫篩選日本血吸蟲c-DNA文庫，獲得日本血吸蟲MFS4基因完整ORF的核苷酸序列。
3.一種如權(quán)利要求1所述的日本血吸蟲(中國大陸株)MFS4基因的核苷酸序列的編碼序列在大腸桿菌中的表達(dá)方法，其特征在于所使用的宿主菌為大腸桿菌BL21(DE3)，原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)。
4.一種如權(quán)利要求1所述的日本血吸蟲(中國大陸株)MFS4基因的核苷酸序列的編碼序列在真核生物中的表達(dá)方法，其特征在于所使用的宿主菌為大腸桿菌TG1，真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3。
5.一種防治日本血吸蟲病的DNA疫苗，其特征在于它是由日本血吸蟲(中國大陸株)MFS4基因和真核表達(dá)質(zhì)粒組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種防治日本血吸蟲病的DNA疫苗，其特征在于其中的真核表達(dá)質(zhì)粒是pcDNA3。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物基因領(lǐng)域，具體涉及日本血吸蟲(中國大陸株)MFS4基因的基因序列、免疫篩選、在大腸桿菌中的表達(dá)、DNA疫苗的構(gòu)建及小鼠免疫保護(hù)試驗(yàn)。本發(fā)明基于我們對東方田鼠抗日本血吸蟲病機(jī)理研究的發(fā)現(xiàn)，用健康東方田鼠血清IgG3抗體免疫篩選日本血吸蟲成蟲cDNA文庫，獲得一個陽性克隆，用RACE技術(shù)擴(kuò)增出含ORF的基因。同源性序列分析表明其為一個新基因(MFS4)，開放閱讀框含780bp，編碼259個氨基酸。將MFS4基因亞克隆至原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a/MFS4，在BL21(DE3)表達(dá)菌中獲得高效表達(dá)，融合蛋白分子量約35kD，具有良好的抗原性；將該基因亞克隆至真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3中，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pcDNA3/MFS4，制備DNA疫苗免疫昆明系小鼠，獲得28.6％的減蟲率、21.73％的減卵率。
文檔編號C12N15/70GK1477202SQ0311573
公開日2004年2月25日 申請日期2003年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月11日
發(fā)明者林矯矯, 傅志強(qiáng), 張亮, 苑純秀, 劉金明, 馮新港, 蔡幼民 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海家畜寄生蟲病研究所, 上海動物生物技術(shù)研究中心, 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室, 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海家畜寄生蟲病研究