專利名稱：一種改良植物性狀的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及一種改良植物性狀的方法。
背景技術(shù)：
光合作用是地球上最重要的化學(xué)反應(yīng)，植物通過光合作用將光轉(zhuǎn)化為可為人類直接利用的穩(wěn)定的化學(xué)能形式，并提供了人類生存所需的氧氣和食物。然而就植物對太陽光能的利用效率而言，從整個(gè)生長季來計(jì)算，田間作物所能夠利用的光能低于整個(gè)生長季作物接受的地球表面太陽光能量的1%。植物對光的利用主要取決于以下幾個(gè)方面:首先是植物對光的捕獲。對高等植物而言，葉片的光能捕獲效率一般可以達(dá)到80%以上；其中植物的葉綠素a和b主要吸收可見光中的紅光和藍(lán)光部分用于光合作用，光合輔助色素類胡蘿卜素，主要吸收可見光中的藍(lán)光和近紫外部分；而綠光和黃光等則被部分反射或透過而不能被充分利用。其次，日光中紫外線部分(260-400nm)過多對植物細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，例如，過多紫外線對植物細(xì)胞的膜系統(tǒng)和植物光合機(jī)構(gòu)的功能產(chǎn)生破壞。第三，光能利用效率取決于植物對捕獲光能的轉(zhuǎn)換效率，即光能轉(zhuǎn)化效率。光能轉(zhuǎn)化效率不僅取決于葉綠體類囊體膜上進(jìn)行的光反應(yīng)，還受葉綠體基質(zhì)中進(jìn)行的暗反應(yīng)及光呼吸的影響。因此，與這幾方面相關(guān)的因素都會影響植物葉片對光的利用效率，例如植物光系統(tǒng)的保護(hù)機(jī)制或光修復(fù)能力；高等植物葉片內(nèi)可利用的CO2濃度，它受到氣孔開關(guān)的控制，而氣孔開關(guān)又受氣孔保衛(wèi)細(xì)胞中的葉綠體捕獲可用于光合同化能量的能力驅(qū)動。在當(dāng)今全球人口增加、糧食危機(jī)、能源危機(jī)的背景下，發(fā)現(xiàn)提高植物的光利用效率的新途徑具有重要的意義。在一般條件下陽光與光合作用所需要的原料水和二氧化碳并不缺乏，可是由于種種內(nèi)外原因，植物利用太陽能的效率很低，據(jù)估計(jì)溫帶地區(qū)植物光合作用的轉(zhuǎn)化率按全年平均計(jì)算約為太陽全部輻射能的0.5-2.5%，整個(gè)生物圈的平均轉(zhuǎn)化率可達(dá)3-5%。在提供理想的環(huán)境與條件下，光合作用的最高效率可達(dá)8-15%。因此，如何提高光能利用率是未來進(jìn)一步提高能源生物產(chǎn)量的重大突破口。多年來，人們嘗試各種手段提高植物光合作用效率，主要的策略包括降低光呼吸損失，增加植物Rubisco羧化與氧化反應(yīng)比值，改造C3植物成為C4植物等等。這些策略都是集中于改良影響植物光合效率的某個(gè)方面。目前尚無一種途徑被完全證實(shí)可以有效提高植物光能利用效率。鑒于光合機(jī)構(gòu)運(yùn)轉(zhuǎn)模式在各種植物間非常保守，一旦一種提高光能利用效率的途徑得到充分驗(yàn)證，其巨大潛力可以在不同植物中得到應(yīng)用。因此，本領(lǐng)域迫切需要研究和開發(fā)提高植物光利用效率的新方法，以培育出光能利用效率高的植物，提高植物的產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種改良植物性狀的方法。在本發(fā)明的第一方面， 提供一種改良植物性狀的方法，包括以下步驟:1)將一種或多種編碼光能吸收和傳遞蛋白(LEAT蛋白)的多核苷酸轉(zhuǎn)化入植物；2)從轉(zhuǎn)化后的植物中選擇出相較對照植物而言性狀獲得改良的植物；上述光能吸收和傳遞蛋白是能夠利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌的還原的蛋白。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的編碼光能吸收和傳遞蛋白的多核苷酸選自下組:(a)編碼熒光蛋白或其經(jīng)一個(gè)或多個(gè)(如1-30個(gè)；較佳地1-20個(gè)；更佳地1-10個(gè)；更佳地1-5個(gè))氨基酸位點(diǎn)突變后熒光強(qiáng)弱或熒光發(fā)射光譜發(fā)生變化的，但依然能夠利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌的還原的突變體蛋白的多核苷酸；或(b)編碼非熒光生色蛋白(non-fluorescent chromoprotein)或其經(jīng)一個(gè)或多個(gè)(如1-30個(gè)；較佳地1-20個(gè)；更佳地1-10個(gè)；更佳地1-5個(gè))氨基酸位點(diǎn)突變后但依然能夠利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌的還原的突變體蛋白的多核苷酸。在另 一優(yōu)選例中，所述的編碼熒光蛋白或其經(jīng)一個(gè)或多個(gè)(如1-30個(gè)；較佳地1-20個(gè)；更佳地1-10個(gè)；更佳地1-5個(gè))氨基酸位點(diǎn)突變后熒光強(qiáng)弱或熒光發(fā)射光譜發(fā)生變化的，但依然能夠利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌的還原的突變體蛋白的多核苷酸選自下組:(a)編碼SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸；(b)編碼SEQ ID NO: 10所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸；(c)編碼SEQ ID NO:36所示氨基酸序列的蛋白(efasCFP)的多核苷酸；(d)編碼SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸；(e)編碼SEQ ID NO:28所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸；(f)編碼SEQ ID NO:40所示氨基酸序列的蛋白(scubGFP)的多核苷酸；(g)編碼SEQ ID N0:44所示氨基酸序列的蛋白(rmueGFP)的多核苷酸；(h)編碼SEQ ID NO:52所示氨基酸序列的蛋白(cpGFP)的多核苷酸；(i)編碼SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的蛋白(YFP)的多核苷酸；(j)編碼SEQ ID NO: 12所示氨基酸序列的蛋白(YFPmu2)的多核苷酸；(k)編碼SEQ ID NO: 14所示氨基酸序列的蛋白(YFPmu4)的多核苷酸；(I)編碼SEQ ID NO: 16所示氨基酸序列的蛋白(YFPmu7)的多核苷酸；(m)編碼SEQ ID NO: 18所示氨基酸序列的蛋白(YFPl232h)的多核苷酸；(η)編碼SEQ ID NO:20所示氨基酸序列的蛋白(YFPl232q)的多核苷酸；(ο)編碼SEQ ID NO:50所示氨基酸序列的蛋白(phiYFP)的多核苷酸；(P)編碼SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的蛋白(mCherry)的多核苷酸；(q)編碼SEQ ID NO:22所示氨基酸序列的蛋白(mCherrymu3)的多核苷酸；(r)編碼SEQ ID NO:24所示氨基酸序列的蛋白(mCherrymu4)的多核苷酸；(s)編碼SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的蛋白(mCherrymu5)的多核苷酸；(t)編碼SEQ ID NO:30所示氨基酸序列的蛋白(eqFP611)的多核苷酸；(u)編碼SEQ ID NO:34所示氨基酸序列的蛋白(eforCP/RFP)的多核苷酸；(V)編碼SEQ ID NO:42所示氨基酸序列的蛋白(rf1RFP)的多核苷酸；(w)編碼SEQ ID N0:46所示氨基酸序列的蛋白(ceriantRFP)的多核苷酸；(x)編碼SEQ ID NO:32所示氨基酸序列的蛋白(hcriCP)的多核苷酸；(y)編碼SEQ ID N0:48所示氨基酸序列的蛋白(anm2CP)的多核苷酸；(z)編碼SEQ ID NO:62所示氨基酸序列的蛋白(YFP1^1)的多核苷酸；
(aa)編碼SEQ ID N0:64所示氨基酸序列的蛋白(GFP1.)的多核苷酸；(ab)編碼(a)至(aa)任一所示氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)(如1_30個(gè)；較佳地1-20個(gè)；更佳地1-10個(gè)；更佳地1-5個(gè))氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且能夠利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌的還原的蛋白的多核苷酸；(ac)編碼與(a)至(aa)任一氨基酸序列的蛋白的序列同源性高于70% (更佳地高于80% ;更佳地高于90% ;更佳地高于95% ;更佳地高于98% ;更佳地高于99%)，且能夠利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌的還原的蛋白的多核苷酸；或(ad)與上述(a)-(ac)任一所述多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。在另一優(yōu)選例中，所述的編碼熒光蛋白或其經(jīng)一個(gè)或多個(gè)(如1-30個(gè)；較佳地1-20個(gè)；更佳地1-10個(gè)；更佳地1-5個(gè))氨基酸位點(diǎn)突變后熒光強(qiáng)弱或熒光發(fā)射光譜發(fā)生變化的，但依然能夠利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌的還原的突變體蛋白的多核苷酸選自下組:(a)如SEQ ID NO:3所不核苷酸序列的多核苷酸；(b)如SEQ ID N0:9所不核苷酸序列的多核苷酸；(c)如SEQ ID NO:35所示核苷酸序列的多核苷酸；(d)如SEQ ID NO:5所不核苷酸序列的多核苷酸；(e)如SEQ ID NO:27所示核苷酸序列的多核苷酸；(f)如SEQ ID NO:39所示核苷酸序列的多核苷酸；(g)如SEQ ID NO:43所示核苷酸序列的多核苷酸；(h)如SEQ ID NO:51所不核苷酸序列的多核苷酸；(i)如SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的多核苷酸；(j)如SEQ ID NO: 11所示核苷酸序列的多核苷酸；(k)如SEQ ID NO: 13所示核苷酸序列的多核苷酸；(l)如SEQ ID NO: 15所示核苷酸序列的多核苷酸；(m)如SEQ ID NO: 17所示核苷酸序列的多核苷酸；(η)如SEQ ID NO: 19所示核苷酸序列的多核苷酸；(ο)如SEQ ID NO:49所不核苷酸序列的多核苷酸；(P)如SEQ ID NO:1所不核苷酸序列的多核苷酸；(q)如SEQ ID NO:21所示核苷酸序列的多核苷酸；(r)如SEQ ID NO:23所示核苷酸序列的多核苷酸；(s)如SEQ ID NO:25所示核苷酸序列的多核苷酸；(t)如SEQ ID NO:29所示核苷酸序列的多核苷酸；(u)如SEQ ID NO:33所示核苷酸序列的多核苷酸；(V)如SEQ ID NO:41所示核苷酸序列的多核苷酸；(w)如SEQ ID NO:45所不核苷酸序列的多核苷酸；(x)如SEQ ID NO:31所示核苷酸序列的多核苷酸；(y)如SEQ ID NO:47所示核苷酸序列的多核苷酸；(z)如SEQ ID NO:61所不核苷酸序列的多核苷酸；
(aa)如SEQ ID NO:63所示核苷酸序列的多核苷酸；或(ab)與(a)-(aa)任一所述的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。在另一優(yōu)選例中，所述的編碼非熒光生色蛋白或其經(jīng)一個(gè)或多個(gè)(如1-30個(gè)；較佳地1-20個(gè)；更佳地1-10個(gè)；更佳地1-5個(gè))氨基酸位點(diǎn)突變后依然能夠利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌還原的突變體蛋白的多核苷酸選擇下組:(a) SEQ ID NO:38所示氨基酸序列的蛋白(spisCP)；(b)將(a)所示氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)(如1-30個(gè)；較佳地1_20個(gè)；更佳地1-10個(gè)；更佳地1-5個(gè))氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且能夠利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌的還原的蛋白；(c)與(a)所示氨基酸序列的蛋白的序列同源性高于70%(更佳地高于80% ;更佳地高于90% ;更佳地高于95% ;更佳地高于98% ;更佳地高于99%)，且能夠利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌還原的蛋白；或(d)與(a)-(c)任一所述多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。在另一優(yōu)選例中，所述的編碼非熒光生色蛋白或其經(jīng)一個(gè)或多個(gè)(如1-30個(gè)；較佳地1-20個(gè)；更佳地1-10個(gè)；更佳地1-5個(gè))氨基酸位點(diǎn)突變后依然能夠利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌的還原的突變體蛋白的多核苷酸選自下組:(a)如SEQ ID NO:37所示核苷酸序列的多核苷酸；或(b)與(a)所述的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。在另一優(yōu)選例中，所述的編碼光能吸收和傳遞蛋白的多核苷酸還選自:編碼選自下列 GenBank 登錄號的蛋白的多核苷酸:AF168421、AY646070、AY646072、AY646071、AF168424、AF168420、AY182022、AY182023、DQ206381、DQ206392、DQ206382、AY181556、AY679113、EU498721、AY182017、AY646069、AY646066、AY151052、EU498722、AY647156、AY508123、AY508124、AY508125、AF435432、AY646067、AY485334、AY485335、AY646068、AF545827、AF545830、AY037776、AB180726、DQ206383、DQ206395、DQ206396、DQ206385、EU498723、AB193294、AY182020、AY182021、AB107915、DQ206389、P42212、AY268073、AY181553、AY181554、AY181555、DQ206393、AY155344、AY037766、AY679112、AF401282、EU498724、AY268076、AY268074、AY268075、AY268071、AY268072、DQ206391、AY015995、AY182014、AF372525、EU498725、DQ206390、AF168422、AY646073、AY296063、AF272711、AB128820、DQ206379、DQ206380、AF168419、AY059642、EF186664、AF420591、DQ206387、AY182019、AY765217、AB085641、AY181552、DQ206386、AY182013、AY646064、AY485333、AF168423、AY646077、AY646076、AY646075、EF587182、AF363775、AF383155、DQ206394、DQ206376、AF38315、AF363776、AY461714、AB209967、DQ206377、DQ206378 ;或上述蛋白經(jīng)一個(gè)或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變后熒光強(qiáng)弱或熒光發(fā)射光譜發(fā)生變化的，但依然能夠利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌的還原的突變體蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述將多核苷酸轉(zhuǎn)化入植物方法包括:將含有編碼光能吸收和傳遞蛋白的多核苷酸的表達(dá)盒轉(zhuǎn)入植物中，從而在植物中表達(dá)上述多核苷酸。
較佳地，所述的表達(dá)盒包括:至少一種(可以是一種或多種)編碼光能吸收和傳遞蛋白的多核苷酸；所述的編碼光能吸收和傳遞蛋白的多核苷酸與表達(dá)調(diào)控元件可操作性相連。
在另一優(yōu)選例中，所述方法包括:(1)提供攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，所述的表達(dá)載體含有上述表達(dá)盒；(2)將植物組織或器官與步驟(I)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使上述表達(dá)盒轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞或組織或器官。在另一優(yōu)選例中，所述的改良植物性狀選自下列一種或幾種:提高植物的生物量；提高植物的產(chǎn)量；促進(jìn)植物生長；促進(jìn)植物種子或穗增大；增加植物種子數(shù)、分蘗數(shù)或穗數(shù)；增加種子體積；增加種子重量；增加植物的總蛋白量；提高植物的光利用效率；增加植物PSI或PSII的光化學(xué)效率；增加植物光合電子傳遞效率；提高植物對CO2的同化能力；提高植物的凈光合效率；提高植物的光合器官的光保護(hù)能力；提高植物中光合輔助色素(包括類胡蘿卜素)的含量；提高植物的光合放氧速率；優(yōu)選的，所述改良植物性狀為改良了植物的產(chǎn)量相關(guān)性狀，選自下列一種或幾種:提高植物的生物量；提高植物的產(chǎn)量；促進(jìn)植物種子或穗增大；增加植物種子數(shù)、分蘗數(shù)或穗數(shù)；增加種子體積；增 加種子重量。在另一優(yōu)選例中，所述的植物是:裸子植物、雙子葉植物或單子葉植物。在另一優(yōu)選例中，所述的植物包括:楊柳科(Salicaceae)、?？?Moraceae)、桃金娘科(Myrtaceae)、石松科(Lycopodiaceae)、(Selaginellaceae)、銀杏科(Ginkgoaceae)、松科(Pinaceae)、蘇鐵科(Cycadaceae)、天南星科(Araceae)、毛莫科(Ranunculaceae)、懸鈴木科(Platanaceae)、偷科(Ulmaceae)、胡桃科(Juglandaceae)、禪科(Betulaceae)、稱猴桃科(Actinidiaceae)、錦奏科(Malvaceae)、梧桐科(Sterculiaceae)、鍛樹科(Tiliaceae)、徑柳科(Tamaricaceae)、蓄薇科(Rosaceae)、景天科(Crassulaceae)、蘇木科(Caesalpinaceae)、蝶形花科(Fabaceae)、石植科(Punicaceae)、拱桐科(Nyssaceae)、山萊英科(Cornaceae)、八角諷科(Alangiaceae)、衛(wèi)矛科(Celastraceae)、冬青科(Aquifoliaceae)、黃楊科(Buxaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、小盤木科(Pandaceae)、鼠李科(Rhamnaceae)、葡萄科(Vitaceae)、漆樹科(Anacardiaceae)，撤攬科(Burseraceae)、梧?？?Campanulaceae)、紅樹科(Rhizophoraceae)、植香科(Santalaceae)、木扉科(Oleaceae)、玄參科(Scrophulariaceae)、禾本科(Gramineae)、露覽樹科(Pandanaceae)、黑三棱科(Sparganiaceae)、水蕹科(Aponogetonaceae)、眼子菜科(Potamogetonaceae)、茨藻科(Najadaceae、冰沼草科(Scheuchzeriaceae)、澤灣科(Alismataceae)、花蔚科(Butomaceae)、水瞥科(Hydrocharitaceae)、霉草科(Triuridaceae)、莎草科(Cyperaceae)、掠桐科(模柳科)(Palmae (Arecaceae))、天南星科(Araceae)、浮萍科(Lemnaceae)、須葉藤科(Flagellariaceae)、帚燈草科(Restionaceae)、刺鱗草科(Centrolepidaceae)、黃眼草科(Xyridaceae)、谷精草科(Eriocaulaceae)、鳳梨科(Bromeliaceae)、鴨妬草科(Co_elinaceae)、雨久花科(Pontederiaceae)、田蔥科(Philydraceae)、燈心草科(Juncaceae)、百部科(Stemonaceae)、百合科(Liliaceae)、石蒜科(Amaryllidaceae)、蔚 If 薯科(箭根薯科)(Taccaceae)、墓葡科(Dioscoreaceae)、鸞尾科(Iridaceae)、色蕉科(Musaceae)、姜科(Zingiberaceae)、美人蓮科(annaceae)、竹芋科(Marantaceae)、水玉替科(Burmanniaceae)、黎科(Chenopodiaceae)或蘭科(Orchidaceae)0在一個(gè)優(yōu)選例中，所述地植物包括但不限于:小麥、水稻、大麥、玉米、高粱、燕麥、黑麥、甘蔗、油菜、白菜、棉花、大豆、苜蓿、煙草、番茄、辣椒、南瓜、西瓜、黃瓜、蘋果，桃、李、海棠、甜菜、向日葵、萵苣、萵筍、青蒿、菊芋、甜葉菊、楊樹、柳樹、桉樹、丁子香、橡膠樹、木薯、蓖麻、花生、豌豆、黃芪、煙草，番茄，辣椒等。在本發(fā)明的另一方面，提供光能吸收和傳遞蛋白或編碼光能吸收和傳遞蛋白的多核苷酸的用途，用于改良植物性狀。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的光能吸收和傳遞蛋白選自:熒光蛋白或非熒光生色蛋白。在本發(fā)明的另一方面，提供分離的光能吸收和傳遞蛋白，所述光能吸收和傳遞蛋白包括:SEQ ID NO:22所不氨基酸序列的蛋白(mCherrymu3)；SEQ ID NO: 24所不氨基酸序列的蛋白(mCherrymu4)；SEQ ID NO:26所不氨基酸序列的蛋白(mCherrymu5)SEQ ID NO: 12所示氨基酸序列的蛋白(YFPmu2)；SEQ ID NO: 14所示氨基酸序列的蛋白(YFPmu4)；SEQ ID NO: 16所示氨基酸序列的蛋白(YFPmu7)；SEQ ID NO: 18所示氨基酸序列的蛋白(YFPl232h)；SEQ ID NO:20所示氨基酸序列的蛋白(YFPl232q)；SEQ ID N0:62所示氨基酸序列的蛋白(YFP^231);或SEQ ID N0:64 所示氨基酸序列的蛋白(GFP1^31)q在本發(fā)明的另一方面，提供分離的多核苷酸，其編碼所述的任一光能吸收和傳遞蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的多核苷酸選自:SEQ ID NO:21所示核苷酸序列的多核苷酸(mCherrymu3)；SEQ ID NO:23所不核苷酸序列的多核苷酸(mCherrymu4)；SEQ ID NO:25所不核苷酸序列的多核苷酸(mCherrymu5)SEQ ID NO: 11所示核苷酸序列的多核苷酸(YFPmu2)；SEQ ID NO: 13所示核苷酸序列的多核苷酸(YFPmu4)；SEQ ID NO: 15所示核苷酸序列的多核苷酸(YFPmu7)；SEQ ID NO: 17所示核苷酸序列的多核苷酸(YFPl232h)；SEQ ID NO: 19所示核苷酸序列的多核苷酸(YFPl232q)；SEQ ID N0:61所示核苷酸序列的多核苷酸(YFP^31);或SEQ ID N0:63所示核苷酸序列的多核苷酸(GFP1^1)t5tj在本發(fā)明的另一方面，提供一種重組表達(dá)載體，其中含有所述的多核苷酸。在本發(fā)明的另一方面，提供一種基因工程化的細(xì)胞，其中含有所述的重組表達(dá)載體，或其基因組中整合有所述的多核苷酸。在另一優(yōu)選例中，所述的基因工程化的細(xì)胞為非繁殖材料以及非生殖細(xì)胞。在本發(fā)明的另一方面，提供一種改良的植物，其基因組中包括光能吸收和傳遞蛋白的表達(dá)盒。較佳地，所述的改良的植物是轉(zhuǎn)基因植物，其通過前述任一種方法制備獲得。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1、光照對YFP還原NAD+或NADP+的影響。圖中所示為開光前后NADH和NADPH在340nm處吸收值的變化。圖2、YFP，CFP，BFP和GFP光下催化2，3，5_三甲基-1，4-對苯醌(TMBQ)的還原活力的比較。50mM的磷酸緩沖液(pH6.5)，了1^0，40(^11，熒光蛋白濃度為251^。還原速率在1-2 μ mo I IrTiV1各自激發(fā)光下測定。圖3、TMBQ存在條件下YFP和GFP催化水裂解放氧的光強(qiáng)響應(yīng)曲線。TMBQ:2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌；反應(yīng)速率以每個(gè)蛋白分子每分鐘轉(zhuǎn)換的分子數(shù)表示。反應(yīng)體系為:50mM 的磷酸緩沖液(pH6.5)，YFP，10nM (終濃度，下同)；GFP，I μ M ;TMBQ，400 μ M，;光強(qiáng):0.6-1 μ mo I m 2S、圖4、TMBQ存在條件下mCherry和GFP光下催化水裂解放氧活力的光強(qiáng)響應(yīng)曲線。TMBQ:2，3，5-三甲基-1,4-對苯醌；反應(yīng)體系為:50mM的磷酸緩沖液(pH6.5)，mCherry,10nM;GFP，lyM;TMBQ，400yM;光強(qiáng):0.6-1 μ mo I nT2s'圖5、熒光蛋白GFP，YFP，CFP和BFP放氧活力的TMBQ濃度響應(yīng)曲線。50mM的磷酸緩沖液(PH6.5)，GFP，I μ M ;其他熒光蛋白，10nM，TMBQ，400 μ M ;光強(qiáng):0.6-1 μ mo I nT2s'圖6、不同醌存在條件下YFP(A)和mCherry (B)的光下催化水裂解放氧活力的比較。BQ: 1,4-對苯醌;MBQ:甲基-1,4-對苯酉昆；DMBQ1:2，5-二甲基-1，4-對苯醌；DMBQ2:2，6-二甲基-1,4-對苯醌；TMBQ:2, 3，5-三甲基-1，4-對苯醌；DQ:杜醌或四甲基_1，4-對苯醌；UQ:2, 3-甲氧基-5-甲基-1，4-對苯醌。反應(yīng)體系為:50mM磷酸緩沖液，pH6.5 ;YFP，IOnM ；mCherry, 5nM ;光強(qiáng):0. 6-1 μ mo I m 2s、圖7、YFP(A, B)和mCherry (E，F(xiàn))及其突變體的吸收光譜，(B)為A圖中YFPmu4和YFPmu7部分的放大；(F)為E圖中mCherrymu4和mCherrymu7部分的放大。YFP(C)和mCherry (G)及其突變體的熒光光譜；YFP (D)和mCherry (H)與其突變體的在光下裂解水放氧活力。(A，B，C，E，F(xiàn)，G):光吸收和熒光強(qiáng)度在相同蛋白濃度下進(jìn)行比較，以突變前的YFP或mCherry的吸收峰值的強(qiáng)度為1，熒光發(fā)射峰值的強(qiáng)度為100。圖8、GFP系列不同熒光蛋白序列比較。圖9、(A)YFP蛋白232位氨基酸點(diǎn)突變及231位后末端去除的突變蛋白光下放氧活力的比較。(B)GFP蛋白與其231位后末端去除的點(diǎn)突變光下放氧活力的比較。YFP的L232H和GFP蛋白濃度為I μ M，其他蛋白濃度為10nM，TMBQ濃度為400 μ M，在1_2μπιο1HT2s-1激發(fā)光下測定。圖10、110種刺胞動物(Cnidarian)和節(jié)足動物(Arthropoda)來源突光蛋白和非熒光生色蛋白進(jìn)化樹(摘自Alieva et al.，2008)。圖中黑點(diǎn)表示在本發(fā)明中所選用的熒光蛋白。這些熒光蛋白在進(jìn)化樹上分別屬于A，B, C，D等不同的分支。圖11、(A)本發(fā)明所用的所有LEAT蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹。(B)本發(fā)明所用的所有LEAT蛋白的序列同源性比較，其中I對應(yīng)eqFP611、2對應(yīng)hcriCP，依次類推。圖12、pUC57質(zhì)粒圖譜及多克隆位點(diǎn)。圖13、(A)植物轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒構(gòu)建載體pHB圖譜。mCherry片段經(jīng)PCR擴(kuò)增和酶切后連接到 pHB 載體的 HindII1-XbaI 位點(diǎn)。MCS (multiple cloning site),多克隆位點(diǎn)。(B)Southern blot鑒定mCherry轉(zhuǎn)基因油菜。(C)轉(zhuǎn)基因植株根細(xì)胞中熒光觀察。(D)RT-PCR和Western blot鑒定mCherry轉(zhuǎn)基因植株(L1-L6)。(E)免疫電鏡檢測mCherry蛋白的表達(dá)及亞細(xì)胞定位。mCherry蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)(Cy)及細(xì)胞核(N)中表達(dá)。N:細(xì)胞核，Cff:細(xì)胞壁，Chl:葉綠體，V:液泡，G:高爾基體。圖14、(A)野生型(WT)，空載體(pHB)和mCherry轉(zhuǎn)基因油菜(L1-L3)在人工氣候室白光(光強(qiáng):250μπιΟ1 H1-2S-1)下萌發(fā)并生長I周的幼苗分別轉(zhuǎn)移到白光、綠光(光強(qiáng):60 μ mo I nT2s4)和紅光+藍(lán)光(紅光光強(qiáng):60 μ mo I JiT2S'藍(lán)光光強(qiáng):10 μ mo I IrT2S-1)條件下繼續(xù)生長3周后拍照。⑶在白光、綠光和紅光+藍(lán)光下生長4周的野生型(WT)和mCherry轉(zhuǎn)基因油菜鮮重和干重比較。圖中數(shù)據(jù)為測定平均值土SD，對WT，n=10，對空載體轉(zhuǎn)基因?qū)φ誔HB和mCherry轉(zhuǎn)基因植株，數(shù)據(jù)分別來自3個(gè)獨(dú)立株系，每個(gè)株系10株苗的平均值。、彡0.01。(C)野生型(WT)和mCherry轉(zhuǎn)基因油菜在不同光質(zhì)下凈光合速率。野生型和轉(zhuǎn)基因油菜在人工氣候室(光照強(qiáng)度:250μπιΟ1 H1-2S-1)生長9周后，轉(zhuǎn)移到不同光質(zhì)下培養(yǎng)4天，并測定凈光合速率。(D)生長在田間自然條件下的野生型和轉(zhuǎn)基因油菜，不同光強(qiáng)下的凈光合速率。凈光合速率為原位測定，測定時(shí)間為10:00am-12:00pm之間。(E)mCherry轉(zhuǎn)基因油菜的植物可溶性蛋白量略有增加。圖15、(A)在田間自然條件下生長7周的野生型和mCherry轉(zhuǎn)基因油菜及單株鮮重、干重測定。圖中數(shù)據(jù)為測定平均值土SD，n=10。*p ( 0.05，**p彡0.01。(B)種子成熟收獲時(shí)期，整體植株大小，果莢大小、種子大小、單株產(chǎn)量以及種子千粒重比較。圖中數(shù)據(jù)為測定平均值土SD，n=10。*p ( 0.05，**p ( 0.01。圖16、不同光強(qiáng)下mCherry轉(zhuǎn)基因油菜提高了光能吸收。圖17、(A)野生型和mCherry轉(zhuǎn)基因油菜在不同光強(qiáng)白光和紅光+藍(lán)光條件下，電子傳遞速率；光系統(tǒng)II的光化學(xué)效率(ΦΡΜΙ)和光系統(tǒng)II激發(fā)壓(Ι-qL)測定比較。1-qL反應(yīng)了質(zhì)體醌庫的氧化還原狀態(tài)。(B)類囊體膜77K葉綠素a熒光。野生型植株葉片類囊體膜受藍(lán)光(波長:435nm)激 發(fā)，或在類囊體膜中加入32 μ g/ml ofGST (Greencsi)或32μ g/mlmCherry蛋白(Greenm)并在綠光(波長:540nm)下激發(fā)。插圖顯示的是mCherry或GST存在時(shí)，綠光激發(fā)后695nm (系統(tǒng)II熒光)和735nm (系統(tǒng)I熒光)處的發(fā)射峰比值。(C)不同濃度mCherry突光蛋白存在時(shí),類囊體膜77K葉綠素a突光。黑線(mCherry)表示GST_mCherry融合蛋白在663nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度。(B)圖數(shù)據(jù)為6次測定平均值土SD，n=6，(C)圖數(shù)據(jù)為4次測定平均值土SD，n=4。*p < 0.05，**p彡0.01。(D)野生型和mCherry轉(zhuǎn)基因油菜P700+還原動力學(xué)曲線。圖中插圖為P700+還原的初始速率。說明轉(zhuǎn)基因油菜的圍繞系統(tǒng)I的循環(huán)電子傳遞能力上升。圖18、mCherry蛋白表達(dá)提聞了葉綠素暈秒延遲發(fā)光慢相的發(fā)光強(qiáng)度。白光和綠光下WT和mCherry轉(zhuǎn)基因(TG)植株葉綠素毫秒延遲發(fā)光測定。白光(1200 μ mo I photonsHT2iT1PPFD)光源為鹵素?zé)襞?，綠光來源為白光通過濾色片(530-560nm)。圖19、(A)Wesren blot檢測野生型和mCherry轉(zhuǎn)基因植株葉片中光合作用相關(guān)蛋白ATP合酶β亞基(Atp B)，系統(tǒng)II反應(yīng)中心Dl蛋白，系統(tǒng)I反應(yīng)中心Psa D蛋白，捕光天線色素復(fù)合體II蛋白Lhcbl亞基，捕光天線色素復(fù)合體I Lhcal亞基和細(xì)胞色素f(cytf)表達(dá)狀況。表明轉(zhuǎn)基因油菜光系統(tǒng)1、光系統(tǒng)II以及捕光天線色素復(fù)合體的含量顯著上升。(B)野生型和mCherry轉(zhuǎn)基因油菜葉片中I, 5—二磷酸核酮糖羧化/加氧酶(Rubisco)初始活力和Rubisco總活力的比較。(C)狀態(tài)轉(zhuǎn)換葉片原位測定。狀態(tài)轉(zhuǎn)換測定時(shí)，葉片首先用狀態(tài)2的光(光照強(qiáng)度:100 μ mo I IrTiV1白光)照射15分鐘,將狀態(tài)I的光(6 μ mo I IrTiV1遠(yuǎn)紅光)打開15分鐘，再將遠(yuǎn)紅光關(guān)閉15分鐘。ta5表示狀態(tài)I (Stl)和狀態(tài)2 (St2)之間轉(zhuǎn)換所需的1/2時(shí)間。(D) 77K熒光檢測白光下生長的野生型和轉(zhuǎn)基因油菜狀態(tài)轉(zhuǎn)換能力。從白光下生長的野生型和轉(zhuǎn)基因油菜葉片中分離獲得類囊體膜，并檢測77K熒光。(E) 77K熒光檢測紅光+藍(lán)光下生長的野生型和轉(zhuǎn)基因油菜狀態(tài)轉(zhuǎn)換能力。熒光光譜用685nm處的熒光峰值進(jìn)行歸一化。(B-D)圖中數(shù)據(jù)為平均值土SD，n=6。*p ( 0.05，**p ( 0.01。表明捕光天線色素復(fù)合體在2個(gè)光系統(tǒng)之間的調(diào)控能力顯著增強(qiáng)。圖20、mCherry轉(zhuǎn)基因油菜葉綠素含量以及葉綠素a/b比值(A)以及葉片中類胡蘿卜素含量(B) ο V:vioIaxanthin,紫黃質(zhì)，L:lutein,葉黃素，Z:zeaxanthin,玉米黃素，A:Antheraxanthin,異黃質(zhì)，N:neoxanthin,新黃素。葉片來自人工氣候室(光強(qiáng):250μηιο1In-2S-1)生長9周的幼苗，或田間自然條件生長11周的幼苗。圖中數(shù)據(jù)為測定平均值土SD，n=6, *p ^ 0.05。圖21、(A)人工氣候室白光下(光強(qiáng):250μηιο1 mH生長的野生型和mCherry轉(zhuǎn)基因油菜胞間CO2濃度(Ci)測定。圖中數(shù)值為6個(gè)不同植株的平均值土SD。(B)人工氣候室白光下(光強(qiáng):250 μ mol H1-2S-1)生長的野生型和轉(zhuǎn)基因油菜氣孔導(dǎo)度(Gs)測定。圖中數(shù)值為6-8片葉片平均值土SD，*p ( 0.05。(C)田間條件下生長11周油菜葉片光下胞間CO2濃度和氣孔導(dǎo)度測定。圖中數(shù)值為6個(gè)不同株系的測定的平均值土SD，每個(gè)株系測定6片葉片，*p ( 0.05。(D)飽和光強(qiáng)下凈光合速率的胞間CO2濃度響應(yīng)曲線。虛線部分反映的是植物Rubisco羧化限制狀況，直線部分?jǐn)M合的是RuBP再生限制狀況。圖中數(shù)值為4次測定的平均值土 SD。圖22、野生型(WT)和mChenry轉(zhuǎn)基因油菜(A)紅藍(lán)光轉(zhuǎn)白光過程中光下光系統(tǒng)II光化學(xué)效率(ΦΡΜΙ)的變化；(B)紅藍(lán)光下、白光下以及紅藍(lán)光轉(zhuǎn)白光2小時(shí)后葉片中NAD+和NADH含量變化；(C)紅藍(lán)光下、白光下以及紅藍(lán)光轉(zhuǎn)白光2小時(shí)后葉片中NADP+和NADPH濃度變化；(D)紅藍(lán)光下、白光下以及紅藍(lán)光轉(zhuǎn)白光2小時(shí)后葉片中GSH和GSSG濃度變化；(E)紅藍(lán)光下、白光下以及紅藍(lán)光轉(zhuǎn)白光2小時(shí)后葉片中抗壞血酸(ASC)和脫氫抗壞血酸(DHA)相對濃度的變化。 圖中數(shù)據(jù)為平均值土SD，數(shù)據(jù)來自5次測定平均值，η=5。*ρ 彡 0.05，**ρ 彡 0.01。圖23、光下mCherry轉(zhuǎn)基因油菜黃化苗下胚軸光下和暗中呼吸速率比較以及在呼吸被抑制時(shí)的凈放氧速率。-HgCl2:無HgCl2時(shí)，開光前后呼吸速率的差值，+HgCl2:加入HgCl2呼吸被抑制后凈放氧速率。圖中數(shù)據(jù)為測定平均值土SD，n=4。圖24、mCherry轉(zhuǎn)基因水稻苗期生長明顯加快。(A)PCR鑒定mCherry轉(zhuǎn)基因水稻幼苗。下劃線數(shù)字表示PCR鑒定為轉(zhuǎn)基因陽性植株。表示PCR陰性對照，“ + ”是以pHB-mCherry質(zhì)粒為模板擴(kuò)增，為PCR陽性對照。Mr,分子量標(biāo)記。(B)mCherry轉(zhuǎn)基因水稻苗期生長狀態(tài)，明顯比野生型快。圖25、(A)PCR鑒定mCherry轉(zhuǎn)基因小麥。下劃線數(shù)字表示PCR鑒定為轉(zhuǎn)基因陽性植株。Mr,分子量標(biāo)記。(B)mCherry轉(zhuǎn)基因小麥與各自野生型小麥品種(嘉麥、小偃54和京411)比較，種子和穗子大小明顯比野生型增加。(OmCherry轉(zhuǎn)基因小麥與各自野生型小麥品種(嘉麥、小偃54和京411)單株產(chǎn)量比較。圖中數(shù)值為平均值土SD，n=3。'P〈0.05。圖26、(A)BFP轉(zhuǎn)基因油菜鑒定。從油菜葉片中提取基因組DNA，并通過PCR鑒定BFP插入片段。pHB-BFP為PCR正對照，以pHB_BFP質(zhì)粒為模板進(jìn)行擴(kuò)增。B1-B5為轉(zhuǎn)入BFP基因的陽性轉(zhuǎn)基因油菜。(B)RT-PCR檢測BFP轉(zhuǎn)基因油菜中BFP表達(dá)情況。從WT，B1_B5轉(zhuǎn)基因油菜葉片中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行RT-PCR檢測BFP基因的表達(dá)。UBI為RT-PCR內(nèi)參基因，衡量BFP基因在各測試植株中的表達(dá)量差異。(C)在田間自然條件下生長7周的野生型(WT)和BFP轉(zhuǎn)基因油菜及單株鮮重、干重測定。圖中數(shù)據(jù)為測定平均值土SD，n=10。*p ( 0.05，**p ( 0.01。(D)種子成熟收獲時(shí)期，整體植株大小，果莢大小、種子大小以及單株產(chǎn)量比較。圖中數(shù)據(jù)為測定平均值土SD，n=10。*p^0.05,**p^0.0l0圖27、野生型(WT)，空載體(pHB)和BFP轉(zhuǎn)基因油菜(B1-B5)在人工氣候室白光(光強(qiáng):250 μ mol HT2s-1, UV-B輻射強(qiáng)度0.013mff cm-2)下萌發(fā)并生長I周的幼苗分別轉(zhuǎn)移到白光下㈧或移到白光+UV條件下(UV-B輻射強(qiáng)度0.075mff cm_2)繼續(xù)生長3周⑶后拍照。結(jié)果表明BFP轉(zhuǎn)基因油菜對UV抗性的提高。圖28、不同光照強(qiáng)度時(shí)野生型(WT)和BFP轉(zhuǎn)基因油菜的凈光合速率。凈光合速率為原位測定，測定時(shí)間為IO: OOam-12: OOpm之間，測定光為日光。說明BFP轉(zhuǎn)基因油菜在高光強(qiáng)下優(yōu)勢更為明顯。圖29、(A)野生型和BFP轉(zhuǎn)基因油菜光合作用系統(tǒng)II的光化學(xué)效率(ΦΡΜΙ)比較。(B)野生型和BFP轉(zhuǎn)基因油菜光系統(tǒng)II激發(fā)壓(Ι-qL)測定比較。l_qL反應(yīng)了質(zhì)體醌庫的氧化還原狀態(tài)。(C)野生型和BFP轉(zhuǎn)基因油菜P700+還原動力學(xué)曲線，圖中插圖為P700+還原的初始速率，它反應(yīng)了葉片圍繞系統(tǒng)I的循環(huán)電子傳遞的能力。圖30、Western blot檢測野生型和BFP轉(zhuǎn)基因植株葉片中光合作用相關(guān)蛋白ATP合酶β亞基(Atp B)，系統(tǒng)II反應(yīng)中心Dl蛋白，系統(tǒng)I反應(yīng)中心Psa D蛋白，捕光天線色素復(fù)合體II蛋白Lhcbl亞基，捕光天線色素復(fù)合體I Lhcal亞基和細(xì)胞色素f (cytf)的表達(dá)情況。表明轉(zhuǎn)基因油菜·光系統(tǒng)1、光系統(tǒng)II以及捕光天線色素復(fù)合體的含量顯著上升。圖31、野生型和BFP轉(zhuǎn)基因油菜在人工氣候室(光源為金鹵燈加日光，光強(qiáng):400 μ mol HT2iT1,含UV)生長11周，對幼苗葉片進(jìn)行測定:㈧葉片中葉綠素a/b比值。BFP轉(zhuǎn)基因油菜葉綠素a/b比值比野生型顯著提高。(B)葉片中不同類胡蘿卜素含量。V:violaxanthin,紫黃質(zhì)，L:lutein,葉黃素，Z:Zeaxanthin,玉米黃素，A:Antheraxanthin,異黃質(zhì)，Nmeoxanthin，新黃素。類胡蘿卜素，是光合作用的輔助色素，它的增加使得植物在高光強(qiáng)下的光能耗散能力增加，增加了植物光保護(hù)能力。(C)BFP轉(zhuǎn)基因油菜及野生型油菜進(jìn)行氣孔導(dǎo)度測定的結(jié)果。(D)BFP轉(zhuǎn)基因油菜及野生型油菜非光化學(xué)猝滅(NPQ)比較，說明BFP轉(zhuǎn)基因油菜比野生型油菜光保護(hù)能力有顯著提高。圖中數(shù)據(jù)為測定平均值土SD，n=6, *p ^ 0.05。圖32、(A)PCR鑒定BFP轉(zhuǎn)基因小麥。下劃線數(shù)字表示PCR鑒定為轉(zhuǎn)基因陽性植株。(B)BFP轉(zhuǎn)基因小麥與各自野生型小麥品種(嘉麥、小偃54和京411)比較，種子和穗子均比各自野生型品種增大。(C)BFP轉(zhuǎn)基因小麥與各自野生型小麥品種(嘉麥、小偃54和京411)單株產(chǎn)量比較。圖中數(shù)值為平均值土SD，n=3。*，P〈0.05廣，P〈0.01。圖33、(A) PCR鑒定mGFP5轉(zhuǎn)基因小麥。下劃線數(shù)字表示PCR鑒定為轉(zhuǎn)基因陽性植株。Mr，分子量標(biāo)記。(B)mGFP5轉(zhuǎn)基因小麥與野生型小麥品種嘉麥比較，種子和穗子明顯增大，分蘗數(shù)增加。圖34、(八)？0 鑒定11^ 5轉(zhuǎn)基因水稻。下劃線數(shù)字表示PCR鑒定為轉(zhuǎn)基因陽性植株。Mr，分子量標(biāo)記。(B)mGFP5轉(zhuǎn)基因水稻與野生型水稻比較。左圖為單株產(chǎn)量，右圖為種子百粒重。WT為野生型中花ll，mGFP5-l和mGFP5_2分別為兩個(gè)不同的mGFP5轉(zhuǎn)基因株系。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，mGFP5在水稻中異位表達(dá)，顯著增加單株產(chǎn)量和種子百粒重。圖中數(shù)值為3個(gè)重復(fù)的平均值，標(biāo)準(zhǔn)誤差來自3個(gè)地塊，每個(gè)地塊3個(gè)植株數(shù)值。C，P<0.05 ；**, p<0.01)。圖35、(A) PCR鑒定mGFP5轉(zhuǎn)基因棉花。下劃線數(shù)字表示PCR鑒定為轉(zhuǎn)基因陽性植株。Mr，分子量標(biāo)記。(B)mGFP5轉(zhuǎn)基因棉花生長情況及單株生物量、棉桃數(shù)量和重量比較。mGFP5轉(zhuǎn)基因棉花顯著增加了生物量、棉桃大小、數(shù)量和重量。圖36、(A)PCR 鑒定低熒光熒光蛋白突變體 mCherrymu3 (mu3)，mCherrymu4 (mu4), mCherrymu5 (mu5)和 YFPmu7 (mu7)轉(zhuǎn)基因油菜。Mr,分子量標(biāo)記，“ + ” 為以pHB-mCherrymu4質(zhì)粒為模板擴(kuò)增，為PCR陽性對照。(B )低熒光熒光蛋白突變體mCherrymu3, mCherrymu4, mCherrymu5 和 YFPmu7 轉(zhuǎn)基因油菜與野生型(WT)和空載體(pHB)比較。在苗期低熒光突變體轉(zhuǎn)基因油菜比野生型生長旺盛。圖37、LEAT蛋白光下催化水裂解反應(yīng)的模式圖。LEAT蛋白受光激發(fā)后，催化水的裂解，重新回到基態(tài)，在此過程中將裂解產(chǎn)生的電子和質(zhì)子傳遞給相關(guān)醌分子，特別是質(zhì)體醌，在此過程中完成醌的還原和放氧。LEAT:基態(tài)LEAT蛋白，Q:醌，QH2:氫醌；LEAf:激發(fā)態(tài)的LEAT蛋白。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，開發(fā)了一種以提高植物的光能利用效率為目的的改良植物的新方法，所述方法通過在植物中表達(dá)外源的光能吸收和傳遞蛋白(LightEnergy Absorption and Transduction protein, LEAT 蛋白)，在光下催化水的裂解，同時(shí)將裂解長生的電子和質(zhì)子傳遞給與植物體內(nèi)本身擁有的諸多甲基醌衍生物，如質(zhì)體醌(plastoquinone)等，并釋放氧氣,這一過程在光下提供持續(xù)的電子來源，改變了植物體內(nèi)氧還還原狀態(tài)，引起植物體內(nèi)光合相關(guān)基因表達(dá)的改變，從而提聞植物光能利用效率。術(shù)語如本文所用，所述的“植物”是指含有光合作用器官且能夠進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作的植物。所述“植物”包括整株植物、植物的后代以及植物部分(包括種子、枝條、莖、葉、根(包括塊莖)、花以及組織和器官)，還包括植物細(xì)胞、懸浮培養(yǎng)物、愈傷組織、胚、分生組織區(qū)、配子體、孢子體、花粉和小孢子。所述的植物比如可以是(不限于):雙子葉植物、單子葉植物、或裸子植物。更具體地，所述的植物包括(但不限于):小麥、大麥、黑麥、水稻、玉米、高梁、甜菜、蘋果、梨、李、桃、杏、樓桃、草莓、木莓、黑莓、豆、扁豆、豌豆、大豆、油菜、芥、Il粟、青蒿、齊墩果、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、花生、葫蘆、煙草、油棕、黃瓜、西瓜、棉花、亞麻、大麻、黃麻、柑桔、檸檬、葡萄柚、菠菜、苘苣、蘆筍、洋白菜、大白菜、小白菜、胡蘿卜、洋蔥、土豆、西紅柿、青椒、鱷梨、桂皮、樟腦、煙葉、堅(jiān)果、咖啡、茄子、甘蔗、茶葉、胡椒、葡萄樹、蠔麻草、香蕉、楊樹、柳樹、松、杉、桉樹、續(xù)隨子、綠玉樹、西谷椰子、西蒙得木、天然橡膠樹和觀賞植物等。如本文所用 ，所述的“改良性狀”指改良的植物的特性，包括但不僅限于:提高植物的光吸收效率、提高的CO2利用率、增強(qiáng)的光轉(zhuǎn)化效率、增強(qiáng)的光合同化效率、增強(qiáng)的光保護(hù)機(jī)制，器官的數(shù)目或大小、植物構(gòu)造(分蘗數(shù)或穗數(shù))、種子數(shù)量、穗或種子大小、提高作物經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量、種子體積、種子重量、植物(植株)分枝數(shù)、植物結(jié)實(shí)數(shù)、植物生物量和/或植物產(chǎn)量等等特征。本發(fā)明的一個(gè)重要方面，改良性狀是提高作物產(chǎn)量，包括在無環(huán)境脅迫壓力條件下的高產(chǎn)和在環(huán)境壓力條件下的高產(chǎn)。環(huán)境脅迫壓力條件可以包括，如日照不足、高光強(qiáng)、高紫外輻射條件、高溫、高植物密度?！爱a(chǎn)量”能被很多植物特征所影響，包括植物對光吸收效率、光轉(zhuǎn)化效率、光合碳同化效率，生物量的累積、器官的數(shù)目或大小、植物構(gòu)造(分蘗數(shù)或穗數(shù))、種子數(shù)量、穗或種子大小等特征的影響。并且，僅僅以在植物組織或細(xì)胞中對某類結(jié)構(gòu)或某類蛋白進(jìn)行標(biāo)記或示蹤為主旨而獲得的經(jīng)改造的植物組織或細(xì)胞并不包括在“改良性狀的植物”這一范疇內(nèi)。如本文所用，“植物性狀的改良”、“改良的性狀” “改良的植物性狀”、“性狀改良”、
“植物性狀改良”等可以等同替代，是指與未改良前植物相比，經(jīng)本發(fā)明改良的植物光吸收效率提高、光轉(zhuǎn)化效率增強(qiáng)、光合碳同化效率增強(qiáng)、光保護(hù)機(jī)制增強(qiáng)，器官的數(shù)目或大小向有利的方向變化、植物構(gòu)造(分蘗數(shù)或穗數(shù))向有利的方向變化、種子數(shù)量增加、穗或種子向有利的方向變化、提高作物經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量、種子體積增加、種子重量增加、植物(植株)分枝數(shù)向有利的方向變化、植物結(jié)實(shí)數(shù)增加、植物生物量提高和/或植物產(chǎn)量提高等。

如本文所用，術(shù)語“產(chǎn)量”可以涉及植物的營養(yǎng)生物量(根和/或枝條、葉片生物量)，涉及繁殖器官和/或涉及繁殖體(如種子)。“產(chǎn)量相關(guān)性狀”包括但不限于種子數(shù)量、種子體積、種子重量、植物分枝數(shù)、植物結(jié)實(shí)數(shù)、植物生物量、植物產(chǎn)量等。如本文所用，術(shù)語“提高”、“改良”或“增強(qiáng)”是相互可以交換的并且在應(yīng)用含義上應(yīng)當(dāng)意指與本文中定義的對照植物相比較，至少2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%、優(yōu)選的至少15%或20%、更優(yōu)選25%、30%、35%或40%更多的產(chǎn)量和/或生長等其他農(nóng)藝性狀。如本文所用，術(shù)語“籽指”或“百粒重”可互換使用，均指每百粒種子的重量，該數(shù)據(jù)反映了種子的籽粒大小和飽滿程度。如本文所用，生物體內(nèi)廣泛存在各種類型的甲基醌的衍生物，有些甲基醌是代謝過程中的中間產(chǎn)物，有些則本身參與生物體內(nèi)各種基礎(chǔ)代謝和次生代謝的調(diào)控。其中植物體內(nèi)“質(zhì)體醌”(plast0qUin0ne，PQ)就是一種甲基苯醌的衍生物。醌環(huán)上聯(lián)2個(gè)甲基，有一側(cè)鏈聯(lián)著不同數(shù)目的異戊二烯單位。植物體中有幾種PQ，它們的區(qū)別是異戊二烯單位數(shù)目不同。PQ廣泛存在于葉綠體和胞質(zhì)中，如粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等。又如葉綠醌是一種甲基萘醌的衍生物，它廣泛存在于植物葉綠體和胞質(zhì)中的諸多膜結(jié)構(gòu)中。本文中所述的“光”，除了指波長范圍從400_760nm的可見光范圍內(nèi)的電磁波外，還包括波長范圍是300-400nm的紫外線和760nm-1000nm的近紅外線的電磁波。所述“光能”，指上述范圍，即300-1000nm，的電磁波的能量。如本文所用，所述的“光能吸收和傳遞蛋白(LEAT蛋白)”是一類由其自身組成蛋白質(zhì)序列的氨基酸殘基構(gòu)成的生色基團(tuán)吸收300-1000nm的電磁波，并將其吸收的電磁波的能量(如上述用法所述，以下簡稱為“光能”)轉(zhuǎn)化為化學(xué)能的蛋白。所述轉(zhuǎn)化為化學(xué)能的過程為，在吸收光能后，通過催化水的裂解將裂解產(chǎn)生的電子和質(zhì)子傳遞給相關(guān)的甲基醌及其衍生物，還原甲基醌及其衍生物的蛋白。所述甲基醌及其衍生物包括，TMBQ(2，3，5-三甲基-1, 4-對苯醌)、DMBQ2 (2，6- 二甲基-1, 4-對苯醌)、MBQ (甲基-1, 4-對苯醌)和DMBQl(2，5- 二甲基-1，4-對苯醌)，較佳的是TMBQ (2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌)。
LEAT所吸收的電磁波的波長下限是300nm，較佳的，320nm、340nm，350nm、360nm更佳的，370nm、380nm、390nm、400nm、410nm 或 420nm ;上限是 IOOOnm,較佳的，950nm、900nm,850nm、800nm,更佳的，750nm、700nm、680nm、660nm、650nm、640nm、630nm 或 620nm。所述LEAT蛋白優(yōu)選自:熒光蛋白或其經(jīng)一個(gè)或多個(gè)(如1-30個(gè)；較佳地1-20個(gè)；更佳地1_10個(gè)；更佳地1-5個(gè))氨基酸位點(diǎn)突變后熒光強(qiáng)弱或熒光發(fā)射光譜發(fā)生變化的，但依然能夠利用光能催化水裂解同時(shí)完成甲基醌衍生物(例如2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌或質(zhì)體醌)的還原或其類似物的突變體蛋白；或非熒光生色蛋白其經(jīng)一個(gè)或多個(gè)(如1-30個(gè)；較佳地1-20個(gè)；更佳地1_10個(gè)；更佳地1-5個(gè))氨基酸位點(diǎn)突變后依然能夠利用光能催化水裂解的同時(shí)催化甲基醌衍生物(例如2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌或質(zhì)體醌)的還原或其類似物的突變體蛋白。所述熒光蛋白是指天然存在的或合成的蛋白，無需外加輔助因子，可受一定波長光的激發(fā)并發(fā)射熒光。所述非熒光生色蛋白是指天然存在的或合成的蛋白，無需外加輔助因子，可吸收一定波長的光，并且具有吸收光能后不發(fā)射熒光的蛋白。帶有任何輔基或輔助因子或通過任何輔基或輔助因子吸收光能的生色蛋白，如:血紅蛋白、黃素蛋白、細(xì)胞色素蛋白等，均不在本發(fā)明所述的非熒光生色 蛋白范圍內(nèi)。上述熒光蛋白和非熒光生色蛋白都具有相似的三維圓柱形結(jié)構(gòu)，其多肽骨架大部分折疊成11條氫鍵鏈接的β-片層，中央為包含生色基團(tuán)的α螺旋，其均都可依靠其自身的氨基酸序列就能夠形成生色團(tuán)結(jié)構(gòu)來吸收及發(fā)射光能。本發(fā)明中所述的熒光蛋白優(yōu)選自:藍(lán)色熒光蛋白、青色熒光蛋白、綠色熒光蛋白、黃色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、遠(yuǎn)紅光熒光蛋白、近紅外熒光蛋白。所述的“藍(lán)色突光蛋白”(Blue Fluorescent Protein, BFP)是發(fā)射峰位于440-470nm的熒光蛋白；如SEQ ID N0:4所示的藍(lán)色熒光蛋白。所述的“青色突光蛋白”(Cyan Fluorescent Protein, CFP)是發(fā)射峰位于470-500nm的熒光蛋白；如SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO:36所示的青色熒光蛋白。所述的“綠色突光蛋白”(Green Fluorescent Protein, GFP)是發(fā)射峰位于500-525nm 的熒光蛋白；如 SEQ ID N0:6、SEQ ID NO:28,SEQ ID N0:40 或 SEQ ID N0:44 所示的綠色熒光蛋白。所述的“黃色突光蛋白”(Yellow Fluorescent Protein, YFP)是發(fā)射峰位于525-570nm的熒光蛋白；如SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:50所示的黃色熒光蛋白。所述的“紅色突光蛋白”(Red Fluorescent Protein, RFP)是發(fā)射峰位于570-630nm的熒光蛋白；如SEQ ID NO:2所示的紅色熒光蛋白；如SEQ ID NO:2, SEQ IDNO:30, SEQ ID NO:34, SEQ ID N0:42 或 SEQ ID N0:46 所示的紅色熒光蛋白。所述的“遠(yuǎn)紅光突光蛋白”(Far-red Fluorescent Protein)是發(fā)射峰位于630-760nm的熒光蛋白。所述的“近紅外突光蛋白”(Near Infra-red Fluorescent Protein)是發(fā)射峰位于760-900nm的熒光蛋白；如SEQ ID N0:32或SEQ ID N0:48所示的近紅外熒光蛋白。所述的“非突光生色蛋白”(non-fluorescent chromoprotein)如 SEQ ID NO: 38所示的非熒光生色蛋白。 如本文所用，“表達(dá)”是指多核苷酸(一個(gè)或多個(gè))或含有多核苷酸的表達(dá)盒至mRNA的轉(zhuǎn)錄，有或無后者至蛋白質(zhì)的隨后翻譯。該過程包括DNA的轉(zhuǎn)錄和所獲得的mRNA產(chǎn)物的加工。如本文所用，術(shù)語“引入”或“轉(zhuǎn)化”包括將外源多核苷酸轉(zhuǎn)移進(jìn)宿主細(xì)胞，不考慮轉(zhuǎn)移所用的方法。能夠隨后通過器官發(fā)生或者胚胎發(fā)生進(jìn)行克隆增殖的植物組織都可以使用本發(fā)明的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化，并從其再生整個(gè)植物。具體的組織選擇將因可用于和最適于待轉(zhuǎn)化的具體物種的克隆增殖系統(tǒng)而變。示例性的組織靶標(biāo)包括葉盤、花粉、胚、子葉、下胚軸、雌配子、愈傷組織、既有的分生組織(例如頂端分生組織、腋芽和根分生組織)，以及誘導(dǎo)的分生組織(例如子葉分生組織和下胚軸分生組織)。可以將多核苷酸瞬時(shí)地或穩(wěn)定地引入宿主細(xì)胞，并且可以，例如作為質(zhì)粒以非整合的狀態(tài)維持?？蛇x地，其可以整合進(jìn)入宿主基因組。得到的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞可以接著以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式再生為轉(zhuǎn)化的植物。外來基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入植物基因組中稱為轉(zhuǎn)化。植物物種的轉(zhuǎn)化目前是一種相當(dāng)常規(guī)的技術(shù)。有利地，可以使用若干轉(zhuǎn)化方法的任一種向適當(dāng)?shù)淖嫦燃?xì)胞引入目的基因?？梢岳霉_的轉(zhuǎn)化方法以及由植物組織或植物細(xì)胞再生植物的方法來進(jìn)行瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化方法包括應(yīng)用脂質(zhì)體、電穿孔、增加游離DNA攝取的化學(xué)物質(zhì)、直接向植物注射DNA、基因槍/粒子槍轟擊、用病毒或花粉轉(zhuǎn)化和微粒轟擊。方法可以選自用于原生質(zhì)體的I丐 / 聚乙二醇方法(Krens, F.A.等，(1882)Nature296, 72-74;Negrutiu 1.等，(1987)Plant Mol.Biol.8:363-378);原生質(zhì)體的電穿孔法(Shillito R.D.等，(1985)Rio/Technol3, 1099-1102);植物材料的顯微注射(Crossway A.等，(1986)Mol.GenGenet202:179-185) ;DNA 或 RNA 包被的粒子轟擊(Klein T.Μ.等，(1987) Nature327:70)；用(非整合型)病毒感染，等等。優(yōu)選通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，包括轉(zhuǎn)基因作物植物。有利的轉(zhuǎn)化法是植物原位轉(zhuǎn)化。為此，可以例如使農(nóng)桿菌作用于植物種子，或用農(nóng)桿菌接種植物分生組織。己經(jīng)證明，根據(jù)本發(fā)明尤為有利的是使轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌懸液作用于完整植株或至少花原基。隨后培養(yǎng)植物，直至獲得所處理植物的種子(Clough和Rent, Plant J.(1998) 16，735-743 )。關(guān)于“對照植物”，選擇合適的對照植物是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的例行部分，可以包括對應(yīng)的野生型植物或無目的基因的相應(yīng)植物。對照植物一般是相同的植物物種或甚至是與待評估植物相同的品種。對照植物也可以是因分離而丟失轉(zhuǎn)基因植物的個(gè)體。如本文所用的對照植物不僅指完整植物，也指植物部分，包括種子和種子部分。本文所用的術(shù)語“增加的表達(dá)” “過表達(dá)”或“異位表達(dá)”是指相對于原有的野生表達(dá)水平外額外的任何形式的表達(dá)。如本文所用，“表達(dá)盒”在這里是指重組DNA分子，它包含預(yù)期的核酸編碼序列，這個(gè)序列編碼光能吸收和傳遞蛋白；這個(gè)DNA分子還包含轉(zhuǎn)錄在體外或體內(nèi)可操作的連接編碼序列所必需的或預(yù)期的適合的調(diào)控元件?！罢{(diào)控元件”在這里指的是可控制核酸序列表達(dá)的核苷酸序列?？勺鳛榈浞兜恼{(diào)控元件包括啟動子，轉(zhuǎn)錄終止序列或上游調(diào)節(jié)區(qū)，這些調(diào)控元件有助于核酸的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾等。此外，調(diào)控元件還可以包括:增強(qiáng)子，內(nèi)核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)，復(fù)制起點(diǎn)，多腺苷酸化信號等。如本文所用，所述的“操作性相連”或“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠調(diào)節(jié)或控制同一線性DNA序列其它部分的活性。例如，如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它就是可操作地連于編碼序列。如本文所用，“外源的”或“異源的”基因或蛋白是指并非天然包含在原生物體基因組中的基因或蛋白。所述的“外源蛋白的編碼基因”也稱為“異源DNA”，指在所給定的宿主細(xì)胞中原本不存在的一種DNA分子，或一個(gè)DNA分子群；或指異于特定宿主細(xì)胞的DNA分子。如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……構(gòu)成”、“基本上由……構(gòu)成”、和“由……構(gòu)成”;“主要由……構(gòu)成”、“基本上由……構(gòu)成”和“由……構(gòu)成”屬于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。LEAT 蛋白本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，一系列光能吸收和傳遞蛋白(LEAT蛋白)，能夠在光下丨隹化水的裂解和質(zhì)體醌或其類似物(如對2，3，5三甲基苯醌)甲基醌衍生物(例如2，3，5三甲基苯醌或質(zhì)體醌)的還原，同時(shí)放出氧氣。因此LEAT蛋白在植物中過表達(dá)，其在光下催化裂解水反應(yīng)可持續(xù)地產(chǎn)生的電子用于還原各種甲基醌衍生物，還原型的甲基醌衍生物可參與體內(nèi)的各種氧化還原反應(yīng)，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)植物的生長，改良植物的性狀。多種光能吸收和傳遞蛋白(LEAT)蛋白可應(yīng)用于本發(fā)明，只要其是吸收光子的能量超過裂解水所需能量的蛋白，或能夠吸收300-1000nm波長的蛋白。本領(lǐng)域公知，在標(biāo)準(zhǔn)條件下，I分子水裂解成氧和2個(gè)電子和2個(gè)質(zhì)子需要1.23電子伏特光能，因此LEAT蛋白吸收光子的能量只要超過裂解水所需的能量，也就是1.23電子伏特就能驅(qū)動這一反應(yīng)，放出的電子和質(zhì)子通過這類醌化合物的介導(dǎo)，還原體內(nèi)的氧化物質(zhì)。因此，本發(fā)明涉及一系列具有光能吸收和傳遞功能的蛋白，包括吸收光波輻射的發(fā)射和不發(fā)射熒光的蛋白基因，如綠色、黃色、紅色熒光蛋白及其突變體，它們能夠用于提高植物的光能利用率，極顯著地提高生物量。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的LEAT蛋白包括:藍(lán)色熒光蛋白，青色熒光蛋白，綠色熒光蛋白，黃色熒光蛋白，紅色熒光蛋白或遠(yuǎn)紅光熒光蛋白或非熒光生色蛋白。熒光蛋白是一類在適當(dāng)條件下能發(fā)光的蛋白，其生色基團(tuán)是由組成其蛋白序列的氨基酸殘基構(gòu)成。在現(xiàn)有技術(shù)中其主要被用于標(biāo)記細(xì)胞結(jié)構(gòu)和監(jiān)測胞內(nèi)過程，它還用于細(xì)胞群體的體內(nèi)示蹤，如腫瘤細(xì)胞。最早出現(xiàn)的綠色熒光蛋白(GFP)是于1962年在一種學(xué)名Aequorea victoria的水母中發(fā)現(xiàn)，之后又在海洋珊瑚蟲中分離得到了 GFP。隨后的研究又在腔腸動物門中的珊瑚蟲綱(Actinozoa)中，如珊瑚和?？邪l(fā)現(xiàn)了一系列不同光譜特性的熒光蛋白。所有的熒光蛋白都具有相似的三維圓柱形結(jié)構(gòu)，其多肽骨架大部分折疊成11條氫鍵鏈接的β_片層，中央為包含生色基團(tuán)的α螺旋。迄今為止，熒光蛋白經(jīng)過基因工程手段的改造已發(fā)展出一系列的衍生物，它們的發(fā)射光譜基本已覆蓋了整個(gè)的可見光區(qū)(400-760nm)和近紅外線區(qū)(760_900nm)。因此，較佳地，熒光蛋白是三級結(jié)構(gòu)為11股β_折疊組成的β_桶狀結(jié)構(gòu)環(huán)繞著包含生色基團(tuán)的α-螺旋。所述熒光蛋白是指天然存在的或合成的蛋白，無需外加輔助因子，其本身氨基酸構(gòu)成的生色基團(tuán)即可受一定波長范圍的電磁波激發(fā)并發(fā)射出可見光。另一方面，所述熒光蛋白可以是從腔腸動物，如水母，珊瑚蟲或?？蟹蛛x的熒光蛋白及其衍生物；另一方面，所述熒光蛋白是來自Aequorea的綠色熒光蛋白(Swiss-Prot:Ρ42212)及其衍生物，如SEQID N0:4所不的BFP ;或所述突光蛋白也可來自Discosoma sp.的紅色突光蛋白(DsRed)(Swiss-Prot:Q9U6Y8)或其衍生物，如 mCherry。本發(fā)明中所述的非熒光生色蛋白與上述熒光蛋白具有類似的結(jié)構(gòu)，能夠吸收一定波長的光能，但其野生型蛋白發(fā)射熒光的能力極弱。
目前，GFP, RFP, BFP等被廣泛用于生物影像研究，報(bào)道蛋白在組織和細(xì)胞中的定位(Shaner NC, Patterson GH, Davidson MW.2007Advances in fluorescent proteintechnology.J Cell Sc1.15;120(Pt24):4247-4260 ；mCherry Shaner NC, CampbellRE, Steinbach PA, Giepmans BN, Palmer AE, Tsien RY.(2004)Improved monomericred, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp.redfluorescent protein.Nat Biotechnol.22 (12): 1567-72)。但是，目前還沒有技術(shù)人員將這些熒光蛋白或非熒光生色蛋白用于制備轉(zhuǎn)基因植物以提高植物的光合作用效率。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式,所述的LEAT蛋白是:藍(lán)色突光蛋白(Blue FluorescentProtein, BFP),青色突光蛋白(Cyan Fluorescent Protein, CFP),綠色突光蛋白(GreenFluorescent Protein, GFP),黃色突光蛋白，紅色突光蛋白(Red Fluorescent Protein,RFP)，或遠(yuǎn)紅色熒光蛋白或非熒光生色蛋白。上述熒光蛋白的變異體也可應(yīng)用于本發(fā)明中。上述熒光蛋白的變異體盡管熒光強(qiáng)度發(fā)生較大的改變，但仍然能夠在甲基醌或其衍生物存在的條件下利用光能催化水的裂解反應(yīng)，釋放氧氣，持續(xù)的產(chǎn)生還原能并儲存在醌中，因此它們也能夠應(yīng)用于本發(fā)明。作為本發(fā)明的另一優(yōu)選方式，所述的熒光蛋白選自但不限于:黃色熒光蛋白(Yellow Fluorescent Protein),紅色突光蛋白(Red Fluorescent Protein, RFP),或遠(yuǎn)紅光突光蛋白(Far-red Fluorescent Protein)。應(yīng)理解，本發(fā)明的方法通過利用突光蛋白來轉(zhuǎn)換吸收光的波長或光譜能量來實(shí)現(xiàn)技術(shù)效果，所以任何可被495-620nm的光激發(fā)且發(fā)射峰位于550-700nm間的熒光蛋白都具有與RFP類似的光學(xué)特性，可將植物利用率低的光轉(zhuǎn)化為光系統(tǒng)利用效率高的光，從而可應(yīng)用于本發(fā)明，例如:mHoneydew(激發(fā)峰為487/504nm,發(fā)射峰為537/562nm), mBanana(激發(fā)峰為540nm,發(fā)射峰為553nm),mOrange (激發(fā)峰為548nm,發(fā)射峰為562nm), dTomato (激發(fā)峰為554nm,發(fā)射峰為58Inm),tdTomato (激發(fā)峰為554nm,發(fā)射峰為581nm), mStrawberry (激發(fā)峰為574nm,發(fā)射峰為596nm), mCherry (激發(fā)峰為587nm,發(fā)射峰為610nm), mPlum(激發(fā)峰為590nm,發(fā)射峰為649nm), mRFPl (激發(fā)峰為584nm,發(fā)射峰為607nm), mTangerine (激發(fā)峰為568nm,發(fā)射峰為585nm)。所述的“綠色熒光蛋白”、“青色熒光蛋白”、“藍(lán)色熒光蛋白”還包括“增效的綠色熒光蛋白”、“增效的青色熒光蛋白”、“增效的藍(lán)色熒光蛋白”。所述的“青色熒光蛋白”例如可以具有GenBank登錄號AAQ96626所示的氨基酸序列或與其基本上相同；或?qū)⒃摪被嵝蛄薪?jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有該序列的蛋白相同功能的蛋白；或與GenBank登錄號AAQ96626所示氨基酸序列的蛋白的序列同源性高于70%，且具有改良植物性狀功能的蛋白。所述的“黃色熒光蛋白”例如可以具有GenBank登錄號ADR00308所示的氨基酸序列或與其基本上相同；或?qū)⒃摪被嵝蛄薪?jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有該序列的蛋白相同功能的蛋白；或與GenBank登錄號ADR00308所示氨基酸序列的蛋白的序列同源性高于70%，且具有改良植物性狀功能的蛋白。所述的“遠(yuǎn)紅光熒光蛋白”例如可以具有GenBank登錄號ACH06541所示的氨基酸序列或與其基本上相同；或?qū)⒃摪被嵝蛄薪?jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有該序列的蛋白相同功能的蛋白；或與GenBank登錄號ACH06541所示氨基酸序列的蛋白的序列同源性高于70%，且具有該序列的蛋白相同功能的蛋白。所述的“非熒光生色蛋白”例如可以具有GenBank登錄號DQ206394 (gfasCP)，AF363776 (hcriCP)，AY485336 (anm2CP)等。在本發(fā)明中，所用的LEAT蛋白可以是天然存在的，比如其可被分離或純化自低等生物，如腔腸動物門。此外，所述的LEAT蛋白也可以是人工制備的，比如可以根據(jù)常規(guī)的基因工程重組技術(shù)來生產(chǎn)的LEAT蛋白。優(yōu)選的，本發(fā)明可采用重組的LEAT蛋白。任何適合的LEAT蛋白均可用于本發(fā)明。所述的LEAT蛋白包括全長的LEAT蛋白或其生物活性片段。將野生型LEAT蛋白的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)(如1-30個(gè)；較佳地1-20個(gè)；更佳地1_10個(gè)；更佳地1-5個(gè))氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有該序列的蛋白相同功能的蛋白；或與野生型氨基酸序列的蛋白的序列同源性高于70%，且具有野生型蛋白相同功能的蛋白。LEAT蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述經(jīng)氨基酸替換的序列并不影響其光能吸收和傳遞特性。適當(dāng)替換氨基酸是本領(lǐng)域公知的技術(shù)，所述技術(shù)可以很容易地被實(shí)施并且確保不改變所得分子的生物活性。這些技術(shù)使本領(lǐng)域人員認(rèn)識到，一般來說，在一種多肽的非必要區(qū)域改變單個(gè)氨基酸基本上不會改變生物活性；見Watson 等 Molecular Biology of The Gene,第四版，1987, The Benjamin/Cummings Pub.C0.P224。任何一種LEAT蛋白的生物活性片段都可以應(yīng)用到本發(fā)明中。在這里，LEAT蛋白的生物活性片段的含義是指作為一種多肽，其仍然能保持全長的LEAT蛋白的全部或部分功能。通常情況下，所述的生物活性片段至少保持50%的全長LEAT蛋白的活性。在更優(yōu)選的條件下，所述活性片段能夠保持全長LEAT蛋白的60%、70%、80%、90%、95%、99%、或100%的活性。本發(fā)明也可采用經(jīng)修飾或改良的LEAT蛋白，比如，可采用為了促進(jìn)其半衰期、有效性、代謝、和/或蛋白的效力而 加以修飾或改良的LEAT蛋白。也就是說，任何不影響LEAT蛋白的光能吸收和傳遞的變化形式都可用于本發(fā)明中。本發(fā)明所述的LEAT蛋白還能夠用于改良植物多方面性能，包括:提高植物的光能利用效率；增加植物PSI或PSII的光化學(xué)效率；增加植物光合電子傳遞效率；提高植物對CO2的同化能力；提高植物的凈光合效率；提高植物的光合器官的光保護(hù)機(jī)制；促進(jìn)植物生長；提高植物的生物量；增加植物種子或穗數(shù)；增加植物的總蛋白量；促進(jìn)植物種子或穗增大和/或提高植物的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量。上述植物性狀變化對于植物品種的改良是非常有益的。改良植物性狀的方法植物對日光的利用并不是全光譜利用，而是根據(jù)葉綠素分子的不同，吸收特定波長的光能。比如高等植物中含有葉綠素a和b，主要吸收紅光和藍(lán)紫光，而其他部分光譜的光能如黃光利用效率偏低，而對綠光的利用效率最低。本發(fā)明利用不同LEAT蛋白可以吸收特定波長光子的特點(diǎn)，同時(shí)在光下催化水的裂解，裂解產(chǎn)生電子和質(zhì)子的特性，在植物細(xì)胞內(nèi)異位表達(dá)，與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的甲基醌或其衍生物，例如質(zhì)體醌，相互作用，將光能轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W(xué)能，持續(xù)產(chǎn)生還原力，從而使植物細(xì)胞氧化還原狀態(tài)發(fā)生變化；從而促使光系統(tǒng)I(PSI)和光系統(tǒng)II (PSII)發(fā)生系統(tǒng)性調(diào)整和提高其效率，包括PSI1、PSI和捕光天線復(fù)合體表達(dá)程度的提高導(dǎo)致的捕光能力的增強(qiáng)、光能在2個(gè)光系統(tǒng)之間分配的轉(zhuǎn)換能力、循環(huán)和線性電子傳遞效率提聞及Rubsico活力提聞，從而提聞?wù)w光合作用效率。另外，由于突光蛋白同時(shí)發(fā)射出可以被植物利用的另一波長光子的特性，將綠光和UV等轉(zhuǎn)化成紅光或藍(lán)光，從而有效拓展植物可利用的光譜范圍，提高植物光合作用效率，同時(shí)降低UV的傷害作用。本發(fā)明提供了一種改良植物性狀的方法，所述方法包括:在植物中表達(dá)外源的LEAT蛋白。外源的LEAT蛋白與植物體內(nèi)的醌類物質(zhì)一起，自發(fā)形成一個(gè)新的人工光反應(yīng)系統(tǒng)，通過光下催化水的裂解，將吸收的光能轉(zhuǎn)換為還原能儲存在醌分子中，并放出氧氣，而還原性的醌分子可以參與植物體內(nèi)一系列的氧化還原反應(yīng)，同時(shí)還利用一些LEAT蛋白吸收一些對植物有害的射線，如紫外或高強(qiáng)度的藍(lán)光等，保護(hù)強(qiáng)光下的光合機(jī)構(gòu)免受傷害。并進(jìn)而提高了植物的光合作用、促進(jìn)生長提高了生物量和產(chǎn)量。所述的LEAT蛋白可以是:藍(lán)色熒光蛋白，青色熒光蛋白，綠色熒光蛋白，黃色熒光蛋白，紅色熒光蛋白或遠(yuǎn)紅光熒光蛋白或他們的變異體。使得植物表達(dá)外源蛋白的方法是本領(lǐng)域周知的。通常，可通過轉(zhuǎn)入攜帶LEAT蛋白編碼基因的表達(dá)盒使植株表達(dá)熒光蛋白。因此，本發(fā) 明還提供了一種用于在植物體內(nèi)表達(dá)LEAT蛋白的表達(dá)盒。所述的表達(dá)盒包括操作性連接的調(diào)控元件以及LEAT蛋白的編碼序列，從而當(dāng)其轉(zhuǎn)入到細(xì)胞內(nèi)或整合到基因組中后，可重組表達(dá)LEAT蛋白。所述的表達(dá)盒中包括與LEAT蛋白編碼序列操作性連接的啟動子。所述的啟動子可以是任何可指導(dǎo)LEAT蛋白編碼序列在植物組織內(nèi)表達(dá)的啟動子，例如是組成型(例如CaMV35S啟動子)的或是組織特異性的或是誘導(dǎo)型的。在啟動子驅(qū)動下，LEAT蛋白的表達(dá)可提聞植物對光的利用效率。本發(fā)明中，LEAT蛋白的表達(dá)盒可插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動物細(xì)胞病毒或其他載體?？傊?，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性，或用于大腸桿菌的卡那霉素或氨芐青霉素抗性。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，獲得表達(dá)LEAT蛋白的植株的方法如下:(I)提供攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，所述的表達(dá)載體含有LEAT蛋白的表達(dá)盒；(2)將植物組織或器官與步驟(I)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使LEAT蛋白的表達(dá)盒轉(zhuǎn)入植物組織或器官；(3)選擇出轉(zhuǎn)入了 LEAT蛋白的表達(dá)盒的植物組織或器官；和(4)將步驟(3)中的植物組織或器官再生成植物。其中，可采用任何適當(dāng)?shù)某Ｒ?guī)手段，包括試劑、溫度、壓力條件等來實(shí)施此方法。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，通過以下幾個(gè)實(shí)驗(yàn)，證明LEAT蛋白在體外以及在植物體內(nèi)的功能:(I)在體外驗(yàn)證了 LEAT蛋白在光下催化TMBQ (—種質(zhì)體醌類似物)的還原，并放出氧氣的能力。它的活力高，其轉(zhuǎn)換數(shù)最高可以達(dá)到每秒1000醌分子。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)這種功能并不依賴于其是否具有熒光特性。說明這類分子可以在體內(nèi)的質(zhì)體醌分子存在時(shí)，在光下通過催化水的裂解，持續(xù)穩(wěn)定的提供電子。而且這種特征普遍存在于現(xiàn)有的大部分已經(jīng)報(bào)道的LEAT蛋白中。進(jìn)一步的基因突變證明，即使是現(xiàn)在活力很低的蛋白，如GFP的活力只有YFP的1/20，通過基因突變也可以獲得很高的活力，達(dá)到并超過了野生型YFP的活力，比如，GFP蛋白的C末端去除的突變體GFP1.。(2)將紅色突光蛋白(red fluorescent protein, RFP)中的一種 mCherry 在油菜中異位表達(dá)，并檢測油菜的光合作用效率，發(fā)現(xiàn)mCherry轉(zhuǎn)基因油菜與野生型相比，在強(qiáng)光(1200 μ mol條件下，凈光合效率提高16%，在較弱光(800或400 μ πιοΙπΓΥ1)條件下，凈光合效率分別提高28%和31%。mCherry蛋白主要激發(fā)波長位于500_610nm間，峰值為587nm,發(fā)射波長范圍是560_680nm,峰值為610nm。通過一系列體外實(shí)驗(yàn)證明，mCherry蛋白提高植物光合作用的原因包括，光合作用效率的提高主要是由于光系統(tǒng)I(PSI)和光系統(tǒng)II(PSII)的系統(tǒng)性調(diào)整和能力的提高，包括光合機(jī)構(gòu)狀態(tài)轉(zhuǎn)換能力提高，循環(huán)和線性電子傳遞效率提高。另外mCherry在細(xì)胞內(nèi)可以將綠光轉(zhuǎn)化成可以被植物葉綠素a和b高效利用的紅光^40-665nm)，并被葉綠素吸收從而提高光能利用率。因此mCherry轉(zhuǎn)基因植物在較弱的光下或綠光較多的條件下更具優(yōu)勢。(3)將藍(lán)色突光蛋白(blue fluorescent protein,BFP)在油菜中異位表達(dá),并檢測油菜的光合作用效率，發(fā)現(xiàn)BFP轉(zhuǎn)基因油菜與野生型相比，在光強(qiáng)1200和800 μ Hi0InT2iT1條件下，凈光合效率分別提高12.6%和17.6%，在光強(qiáng)400 μ moln^s—1條件下，凈光合效率和野生型沒有顯著差異。BFP蛋白能夠吸收300-400nm間的UVB和UVA，激發(fā)波長峰值為370nm,發(fā)射波長為380-500nm,峰值為 450nm,恰好為葉綠素a/b的最高吸收峰。推測其作用原理是除了與mCherry相同的機(jī)理外，BFP可以將日光中的能量最高，并對植物細(xì)胞具有危害的UV轉(zhuǎn)化為能量較低，同時(shí)可以被植物葉綠素a/b所吸收的藍(lán)光，從而降低UV的傷害作用，提高植物光合作用。BFP主要用于提高在強(qiáng)光或強(qiáng)紫外輻射下的植物光合作用效率。(4)將mCherry在油菜中異位表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因黃化苗下胚軸光下的呼吸速率低于暗中的呼吸數(shù)量，而野生型沒有差異，同時(shí)在呼吸被抑制的情況下，轉(zhuǎn)基因油菜黃花苗光下有氧的凈釋放，說明通過mCherry在油菜中的異位表達(dá)，與油菜中的甲基醌衍生物，如質(zhì)體醌等，建立了與體 外相似的光裂解水放氧體系，從而轉(zhuǎn)基因植株細(xì)胞氧化還原狀態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞內(nèi)還原物質(zhì)增加，細(xì)胞氧化還原狀態(tài)比野生型油菜更加還原。(5)將mCherry在油菜中異位表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株生長狀況比野生型好，幼苗期鮮重、干重分別增加66.7%和78%。單株產(chǎn)量增加30-100%。種子千粒重增加25%。(6)將BFP在油菜中異位表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株生長狀況比野生型好，幼苗期鮮重、干重都增加。單株產(chǎn)量和種子千粒重也增加。(7)將不發(fā)光或熒光強(qiáng)度降低的mCherry和YFP突變體在油菜中表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株生長狀況比野生型好。(8)將mCherry和BFP在小麥中異位表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株生長狀況比野生型好，而且種子大小增加，單株產(chǎn)量增加。(9)將mCherry和BFP在水稻中異位表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株生長狀況比野生型好，而且種子大小增加，單株產(chǎn)量增加。(10)將綠色突光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的一種 mGFP5 在水稻、小麥和棉花中異位表達(dá)，發(fā)現(xiàn)水稻、小麥和棉花在生長狀況上均比野生型良好，而且分蘗數(shù)增加，單株產(chǎn)量和百粒重增加，單株棉桃數(shù)量和重量增加。GFP蛋白的激發(fā)波長為395nm，發(fā)射波長為510nm。推測其作用原理是GFP將日光中的UV以及藍(lán)紫光轉(zhuǎn)化為能量較低的綠光，從而降低UV以及中午時(shí)分高光強(qiáng)對植物葉綠體的傷害作用，起到光保護(hù)作用，提高植物在強(qiáng)光下的光合作用效率，同時(shí)雖然GFP與其他LEAT蛋白相比，催化甲基醌及其衍生物還原的活力比較低，但在高光強(qiáng)下，也應(yīng)有一定的貢獻(xiàn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員均了解，植物的光合作用的機(jī)理是非常接近的，即:在可見光的照射下，利用光合色素(主要是葉綠素，如葉綠素a (Chlorophyl I a)、葉綠素b (Chlorophyllb))和光合輔助色素，經(jīng)過光反應(yīng)將光能轉(zhuǎn)化為不穩(wěn)定的化學(xué)能，進(jìn)而通過暗反應(yīng)，將二氧化碳和水轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的有機(jī)物，并釋放出氧氣。這個(gè)過程的關(guān)鍵參與者是內(nèi)部的葉綠體，其在陽光的作用下，把經(jīng)由氣孔進(jìn)入葉子內(nèi)部的二氧化碳和由根部吸收的水轉(zhuǎn)變成為淀粉，同時(shí)釋放氧氣。因此，應(yīng)理解，本發(fā)明的技術(shù)方案可以適用于多種植物而不僅限于油菜、小麥、水稻、棉花。本發(fā)明的技術(shù)方案的主要優(yōu)點(diǎn)在于:本發(fā)明的方法可以拓展植物、作物對光能的利用，提高光合效率及產(chǎn)量。本發(fā)明將LEAT蛋白轉(zhuǎn)到植物的胞質(zhì)中，通過改變胞質(zhì)的氧化還原狀態(tài)來調(diào)控光合機(jī)構(gòu)的表達(dá)，從而達(dá)到提高對太陽光能利用效率。方法簡易，成本低，效果好，成效顯著。本發(fā)明對于提高植物對太陽光的利用效率，降低有害輻射(紫外線UVB)以及高光強(qiáng)對植物的傷害，從而提高植物光合作用效率，最終提高作物生物量和經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量具有重要意義。因此本發(fā)明可以應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、生物能源產(chǎn)業(yè)、城市綠化、太空生保系統(tǒng)等方面。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。1.材料和方法凈光合速率測定使用便攜式光合氣體分析系統(tǒng)(L1-6400，L1-Cor Inc, Lincoln NE, USA)進(jìn)行氣體交換測定。主要測定凈光合速率(Pn)和氣孔導(dǎo)度(Gs)。測定時(shí)使用自然光源和人工光源，在400μπιΟ1 mo Γ1的CO2濃度下進(jìn)行測定，葉室氣溫控制在植物的生長溫度。每株系測定6片葉片。另外，植物葉片的CO2響應(yīng)曲線。將人工光源的PPFD固定在1500 μ mol πΓΥ1，測定50-1200ppm不同濃度CO2下的凈光合速率。毫秒延遲發(fā)光的測定參考Chen 等 2010 (Reversible association of ribulose-1, 5-bisphosphatecarboxylase/oxygenase activase with the thyIakoid membrane depends upon theATP level and pH in rice without heat stress.Journal of Experimental Botany61:2939-2950)的方法測定毫秒延遲發(fā)光。相同面積的葉片經(jīng)過相同時(shí)間的暗適應(yīng)后，進(jìn)行原位測定。光線通過兩個(gè)轉(zhuǎn)盤上小孔照射葉片，因此，測量的過程被分為連續(xù)的Ims光照-4.6ms黑暗的循環(huán)過程。葉綠素?zé)晒庠诠庹蘸?.8和3.8ms延遲發(fā)光被記錄下來。白光光源來自齒素?zé)簦?綠光光源為白光通過530nm濾光片獲得。
轉(zhuǎn)基因植物PCR鑒定轉(zhuǎn)基因植物通過PCR鑒定。植物基因組DNA提取采用CTAB法。取200mg植物葉片組織，在液氮中充分研磨。加入6ml DNA提取緩沖液(0.1M Tris, pH8.0,0.5M NaCl, 0.05MEDTA, 0.0lM巰基乙醇)和0.8mllO%SDS,在65° C保溫30分鐘。加入2ml5MKAc，混勻后在冰上放置30分鐘。4000轉(zhuǎn)/分鐘，4° C離心10分鐘。上清加入6ml異丙醇，室溫沉淀20分鐘，4000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，棄上清。將沉淀溶解在400 μ I水中，加如400 μ I CTAB緩沖液(0.2Μ Tris, ρΗ7.5，0.2Μ NaCl, 0.05Μ EDTA, 2%CTAB)，在 65。C 保溫 15 分鐘。加入800 μ I氯仿，混勻后，13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，將上層水相轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入1.4ml無水乙醇沉淀15分鐘。13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，棄上清，并用75%乙醇洗沉淀2次。沉淀晾干后加100 μ I水溶解。用上述方法獲得的2 μ I基因組DNA為模板，對目標(biāo)基因mCherry，BF P，mGFP5，YFP或突變體進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增引物:mCherry，BFP，YFP 正向引物:5 ’ -ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3，；mCherry，BFP，YFP 反向引物:5’ -CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3’ ;mGFP5 正向引物:5’ -ATGAGTAAAGGAGAAGAAC-3’ ；反向引物:5’ -TTATTTGTATAGTTCATCCAT-3’，PCR 條件:95。C4 分鐘；95。C30 秒，56° C30秒，72° C30秒，進(jìn)行30循環(huán)；最后72° ClO分鐘。SouthernblotSouthernblot方法參照分子克隆實(shí) 驗(yàn)手冊。具體條件如下:200 μ g野生型和mCherry轉(zhuǎn)基因油菜基因組DNA，用HindIII酶切，將酶切產(chǎn)物電泳后轉(zhuǎn)到HybondN+膜上。地高辛標(biāo)記的 HindIII 酶切 λ-DNA (DNA Molecular weight marker II, Digoxigenin-1abeled, Roche, Mannheim, Germany)做為分子量標(biāo)記。Southern blot方法參照分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊，探針為地高辛標(biāo)記的全長mCherry片段。探針標(biāo)記試劑盒為PCR DIG Probe SynthesisKit (Roche Applied Science, Mannheim, Germany)。標(biāo)記方法按照產(chǎn)品說明書，正向引物為:5’ -ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’ ；反向引物為:5’ -CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3’。RT-PCRRNA 使用 Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)從葉片中提取。使用 3 μ g 總 RNA用于反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄酶為 ReverTra Ace reverse transcriptase (Toyobo, Osaka, Japan),反應(yīng)體積為20 μ I。2 μ I cDNA用于RT-PCR。使用UBI做為內(nèi)參基因。RT-PCR引物:mCherry 或 BFP 正向引物:5，-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3，；mCherry 或 BFP 反向引物:5 ’ -CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3，；UBI 正向引物:5’ -AGGCCAAGATCCAGGACAAAG-3’ ；UBI 反向引物:5 ’ -CGAGCCAAAGCCATCAAAGAC-3，；PCR 條件:mCherry 或 BFP 擴(kuò)增，95。C4 分鐘；95。C30 秒，56。C30 秒，72。C30秒，進(jìn)行28循環(huán)；最后72° ClO分鐘。UBI擴(kuò)增使用同樣PCR條件，循環(huán)次數(shù)為21次。Westernblot野生型(WT)或mCherry轉(zhuǎn)基因油菜葉片在液氮中充分研磨成粉末。在200mg植物材料中加入 400 μ I 提取緩沖液(IOOmM Tris, ρΗ7.6，50mM NaCl, 5mM EDTA, 0.2% 巰基乙酉享，1% 非可溶性 polyvinyl pyrrolidone 和 ImM phenyImethanesulfonyI fluoride),震蕩混勻后，3300Xg4° C離心20分鐘。將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，用Bradford方法測定蛋白含量。50yg可溶性蛋白用12.5%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并將蛋白轉(zhuǎn)印到 PVDF 膜(Milipore, Billerica, MA, USA)上。一抗為 mCherry 抗體(BioVision, SanFrancisco，CA，USA)，稀釋濃度為1:1000，二抗為辣根過氧化物酶偶聯(lián)的牛抗兔IgG (SantaCruze Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA),稀釋濃度為 1:10000。雜交信號用 ECLWestern blotting 底物(Pierce, Thermo Scientific, Rockford, IL, USA),通過 X 光壓片檢測。免疫電鏡使用高壓冷凍/冷凍替代技術(shù)(AndSme Ondzighi C等，Plant Cell.2008,20(8):2205-20)對轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜葉片進(jìn)行免疫標(biāo)記分析。樣品首先在LeciaHPMlOO進(jìn)速凍，然后轉(zhuǎn)移到液氮存儲。將樣品放入含有0.1%醋酸鈾和0.25%戊二醛的丙酮溶液中進(jìn)行冷凍替代7天，此過程均在-90° C的冷凍瓶(Nunc，丹麥)中進(jìn)行，接著緩慢升溫至室溫或-50° C，升溫過程為一天左右。用丙酮進(jìn)行3次漂洗后，將樣品嵌入在樹脂中。嵌入樹脂濃度為33%(24小時(shí))，66%(24小時(shí))，和100%的樹脂(3天)。嵌入材料的樹脂在-50° C的UV光下進(jìn)行2-3天的聚合反應(yīng)，最后嵌入平底膠囊，將樹脂包埋切片并置于金網(wǎng)上。免疫標(biāo)記時(shí)，先用1%BSA封閉30分鐘，隨后用PBS對切片進(jìn)行洗滌，然后用稀釋10倍的mCherry抗體(BioVision, San Francisco, CA, USA)室溫孵育2小時(shí)。再一次洗漆切片，并轉(zhuǎn)移到稀釋30倍的羊抗兔IgG-膠體金IOnm 二抗(博士德，武漢)室溫孵育2小時(shí)。切片進(jìn)行洗滌后，分別用醋酸鈾和檸檬酸鉛染色。最后使用日立H7650顯微鏡(HITACHI，Japan)進(jìn)行觀察。葉片吸收光譜測定使用積分球連接的光纖光譜儀(Ocean Optics,英國)測定油菜葉片在不同光強(qiáng)下葉片對不同波長光的反射和透射效率，通過公 式:吸收效率=100%(未加葉片時(shí))-透射效率-反射效率，計(jì)算得出葉片對不同波長光的吸收效率。植物葉片葉綠素?zé)晒饧癙700氧化還原的測定通過葉綠素?zé)晒鉁y定來檢測葉片的電子傳遞效率。利用PAM-2000熒光儀(Walz，Effeltrich，德國)測定葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化。葉片暗適應(yīng)30分鐘后，測定葉片的電子傳遞的光響應(yīng)曲線。Fo和Fm分別代表了檢測光和飽和脈沖白光開啟后,最小和最大PS II 發(fā)射突光。PS II 光化學(xué)效率 ΦPSII= (Fm，-Fs)/Fm，(Genty, B.，Briantais, J.M.，Baker, N.R.(1989)The relationship between the quantum yield ofphotosyntheticelectron transport and quenching of Chl fluorescence.Biochimica Et BiophysicaActa, 990，87-92)。葉綠素激發(fā)壓參數(shù) l_qL=l_ (Fm，-Fs) / (Fm，-Fo) X Fo，/Fs (Kramer, D.Μ.，Johnson, G., Kiirats, 0., Edwards, G.E.(2004)New fluorescence parameters for thedetermination of Q(A)redox state and excitation energy fluxes.PhotosynthesisResearch,79,209-218)。用帶有ED-P700DW-E光吸收單元的PAM葉綠素?zé)晒鈨x，檢測810-830納米的光吸收變化來反映P700的氧化還原狀態(tài)的變化，在照射遠(yuǎn)紅光40秒后測定P700暗中的還原初始速率(Klughammer, C 等(1998), In:Grab, G.(ed)Photosynthesis:mechanisms andeffects, Vol5.Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, the Netherlands,4357—4360 ；Mi, H.等(1992), Plant CellPhysiol.33:1099-1105)。
LEAT蛋白光下催化水裂解放氧體外測定方法將1.85ml50mM磷酸緩沖液(pH6.5)加入Clark型氧電極的反應(yīng)池中。然后避光先后加入終濃度為 0.02-1 μ g/ml的LEAT蛋白和400 μ M2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌(TMBQ)或其他醌。然后在其被激發(fā)波長的光下(光強(qiáng)約為1-2 μ mol HT2s-1)測定其放氧速率。熒光蛋白在光下催化TMBQ的還原能力測定方法將2ml50mM PBS(pH6.5)加入3ml四面透光的石英比色杯中。然后避光先后加入終濃度為0.02-1 μ g/ml LEAT蛋白(GFP蛋白含量約為20 μ g/ml)和400 μ M2，3，5-三甲基-1,4-對苯醌(TMBQ)。然后在各自適合波長的光(光強(qiáng)約為1-2 μ mol m_2s_1)下用UV-3000 (日本島津公司Shimadzu)分別測定其OD436吸收減少速率，TMBQ還原速率按照其在436nm處的消光系數(shù)(41.AiT1CnT1)進(jìn)行計(jì)算。植物葉片狀態(tài)轉(zhuǎn)換測定取白光下生長的四周葉片，葉片狀態(tài)轉(zhuǎn)換測定參照(L.Dietzel etal.,The PlantCell23, 2964 (Augustl, 2011)用 PAM-101/PDA100 熒光儀(Walz)測定。系統(tǒng) II(PSII)光(100 μ mol m 2S 1PFD)由 Schott KL-1500 燈(Walz)控制。系統(tǒng) I (PSI)光(6 μ mol m 2S 1PFD遠(yuǎn)紅光)由PAM-101 (Walz)。通過計(jì)算系統(tǒng)I光關(guān)閉后熒光強(qiáng)度減弱的程度計(jì)算狀態(tài)1-狀態(tài)2轉(zhuǎn)換的半時(shí)間。狀態(tài)2-狀態(tài)I的轉(zhuǎn)換半時(shí)間計(jì)算方法參照(L.Dietzeletal.,The PlantCell23,2964 (Augustl,2011)。77K熒光測定植物類囊體膜的狀態(tài)轉(zhuǎn)換將油菜葉片類囊體膜加到含IOmM ATP的STN緩沖液中(終濃度為5_10 μ g/ml)，在室溫下I份照光處理，I份暗處理，處理20-30分鐘后，用F4600熒光光度計(jì)(Hitachi，日本)在77K(液氮下)測定其葉綠素a熒光光譜，激發(fā)波長為435納米，4次測定的平均值。

葉綠素和色素濃度測定用80%丙酮提取油菜葉片葉綠素和類胡蘿卜素的提取，葉綠素含量測定參見Arnon DJ1949, Plant Physiol24:1-15，類胡蘿卜素含量測定參見 Niyogi KK 等(1997)，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.94，14162—14167。NAD+/NADH，NADP+/NADPH，GSSG/GSH 和 ASC/DHA 測定分別在白光或紅藍(lán)光下生長的4周葉片，以及紅藍(lán)光下生長的油菜葉片轉(zhuǎn)移到白光下處理2小時(shí)后的葉片。葉片代謝物的提取和NAD+/NADH，NADP+/NADPH，GSSG/GSH和ASC/DHA 測定方法參照 G Queval, G.Noctor，Anal.Biochem.363，58 (2007)。黃化苗下胚軸呼吸速率和呼吸抑制條件下的放氧速率測定取5-6根I周大小的黃化苗下胚軸(5_6cm長)，切除根部和子葉,稱重后,切成1_長的片段，放入Clark型氧電極反應(yīng)池，分別觀測其在暗和光下溶液中溶氧量隨時(shí)間變化速率，然后加入終濃度為15mM HgCl2后測定其呼吸被終止的溶氧量的變化速率。通過計(jì)算得到光下和暗中的呼吸速率差值，以及呼吸被HgCl2抑制后的放氧速率。Rubisco酶活力測定1，5_ 二憐酸核酮糖羧化酶 / 加氧酶(ribulose-l, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase, Rubisco)羧化活性的測定:用緩沖溶液(50mM Tris-HCl pH7.8, ImM EDTA,50mMNaCl和2mM β -Mercaptoethanol)從新鮮植物葉片中快速提取可溶性蛋白。將勻漿離心(4 ° C，12，000g, 6分鐘)所得上清液用于分析Rubisco活力。用14C同位素法測定 Rubisco 的羧化活性(Wang ZY, Snyder Gff, Esau BD, Portis AR, OgrenWL(1992)Species-dependent variation in the interaction of substrate-boundribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase(rubisco)and rubisco activase.Plant PhysiologylOO: 1858-1862)。所用LEAT蛋白序列及基因序列本發(fā)明用到的LEAT蛋白包括熒光蛋白及不發(fā)熒光的突變體，都具有相似的三維圓柱形結(jié)構(gòu)，其多肽骨架大部分折疊成11條氫鍵鏈接的β-片層，中央為包含生色基團(tuán)的α螺旋。吸收光譜覆蓋了大部分的可見光區(qū)和部分紫外線區(qū)(320-630nm)。mCherry 基因序列如 SEQ ID NO:1。
mCherry 蛋白序列如 SEQ ID NO: 2 (激發(fā)波長 480_620nm)。BFP 基因序列如 SEQ ID N0:3。BFP 蛋白序列如 SEQ ID N0:4(激發(fā)波長 320_410nm)。GFP 基因序列如 SEQ IDN0:5。GFP 蛋白序列如 SEQ ID N0:6(激發(fā)波長 400_510nm)。YFP 基因序列如 SEQ IDN0:7。YFP 蛋白序列如 SEQ ID N0:8(激發(fā)波長 450_530nm)。CFP 基因序列如 SEQ ID N0:9。CFP 蛋白序列如 SEQ ID NO: 10 (激發(fā)波長 350_490nm)。YFP點(diǎn)突變后的基因和蛋白序列如下:YFPmu2 (YFPhi49cy2ci4a)基因序列如 SEQ ID NO: 11。YFPmu2 (YFPhi49cy2ci4a)蛋白序列如 SEQ ID NO: 12。YFPmu4(yfph149CF166NI168MY2CI4A)基因序列如 SEQ ID NO: 13。YFPmu4(YFPm49c F166N I168MY204A)蛋白序列(SEQ ID NO: 14)。YFPmu7 (YFPsi48cm49c F166NK167MI168M S203AY204A)基因序列如 SEQ ID N0:15oYFPmu7 (YFpsi48cm49CF腳κ 2ο3Α.4Α)蛋白序列如 SEQ IQ N0:16oYFPl232h 基因序列如 SEQ ID NO: 17。YFPl232h 蛋白序列如 SEQ ID NO: 18。YFPl232q 基因序列如 SEQ ID NO: 19。YFPl232q 蛋白序列如 SEQ ID N0:20。mCherry點(diǎn)突變后的基因和蛋白序列如下mCherrymu3 (mCherrysl51c S152C K167M)基因序列如 SEQ ID NO: 210mCherrymu3 (mCherrysl51c S152CK167M)蛋白序列如 SEQ ID NO: 22。mCherrymu4(mCherrysl51c S152C K167M I202A)基因序列如 SEQ ID NO:23。mCherrymu4(mCherrysl51c S152C K167M I202A)蛋白序列如 SEQ ID NO:24。mCherrymu5 (mCherysl51c S152C I166N K167M I202A)基因序列如 SEQ ID NO: 25。mCherrymu5 (mCherrysl51c S152C I166N 臓麵)蛋白如 SEQ ID NO: 26。mGFP5 基因序列如 SEQ ID N0:27。mGFP5 蛋白序列如 SEQ ID N0:28。eqFP611(AY130757)基因序列如 SEQ ID N0:29。
eqFP611 蛋白序列如 SEQ ID N0:30。hcriCP(AF363776)基因序列如 SEQ ID N0:31。hcriCP 蛋白序列如 SEQ ID N0:32。eforCP(EU498726)基因序列如 SEQ ID N0:33。eforCP 蛋白序列如 SEQ ID N0:34。efasCFP(DQ206397)基因序列如 SEQ ID N0:35。efasCFP 蛋白序列如 SEQ ID N0:36。spisCP(DQ206398)基因序列如 SEQ ID N0:37。spisCP 蛋白序列如 SEQ ID N0:38。scubGFP(AY037767)基因序列如 SEQ ID N0:39。scubGFP 蛋白序列如 SEQ ID N0:40。rf1RFP(AY037773)基因序列如 SEQ ID N0:41。rfloRFP 蛋白序列如 SEQ ID N0:42。rmueGFP(AY015996)基因序列如 SEQ ID N0:43。rmueGFP 蛋白序列如 SEQ ID N0:44。ceriantRFP(AY296063)基因序列如 SEQ ID N0:45。ceriantRFP 蛋白序列如 SEQ ID N0:46。anm2CP(AY485336)基因序列如 SEQ ID N0:47。anm2CP 蛋白序列如 SEQ ID N0:48。phiYFP(AY485333)基因序列如 SEQ ID N0:49。phiYFP 蛋白序列如 SEQ ID N0:50。cpGFP(AB185173)基因序列如 SEQ ID N0:51。cpGFP 蛋白序列如 SEQ ID N0:52。YFP1J31 基因序列如 SEQ ID N0:61。YFP1J31 蛋白序列如 SEQ ID N0:62。GFP突變后的基因和蛋白序列如下:GFP1J31 基因序列如 SEQ ID N0:63。GFP1J31 蛋白序列如 SEQ ID N0:64。植物轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒構(gòu)建mCherry > mCherrymu3> mCherymu4> mCherrymu5> BFP、YFPmu7、mGFP5 基因通過 PCR 克隆，分別連接到 pHB 載體(參見 Jian Mao 等，PNAS_August23, 2005_vol.102_n0.34_12270_12275 ；http://www.pnas.0rg/content/102/34/12270/suppl/DCl#F7)的Hindlll/Xbal位點(diǎn)中，分別獲得攜帶相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)基因載體，用于植物轉(zhuǎn)基因。pHB圖譜如圖 13A。pHB-mCherry 構(gòu)建以 pmCherry vector (Clontech, Mountain View, CA, USA)為模板，PCR 擴(kuò)增 if 向引物為 5’ -CCCAAGCTTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’ (SEQ ID NO: 53)和反向引物為:5’ -CCGTCTA GACTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’ (SEQ ID N0:54)。正向和反向引物序列下劃線部分分別為HindIII和XbaI酶切位點(diǎn)。PCR條件為95° C4分鐘；95° C30秒，56° C30秒，72° C30秒，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72。ClO分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)Hindlll/Xbal酶切后，連接到PHB經(jīng)HindIII/Xbal酶切后的載體中。pHB-BFP 構(gòu)建以 pRSET-BFP (Invitiogen, Cat#v354_20)為模板，PCR 擴(kuò)增正向引物 5’ -CCCAAGCTTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3> (SEQ ID NO:55)和反向引物為:5’ -CCGTCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3J (SEQ ID N0:56)。正向和反向引物序列下劃線部分分別為HindIII和XbaI酶切位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增條件同mCherry。PCR產(chǎn)物經(jīng)Hindlll/Xbal酶切后，連接到PHB經(jīng)HindIII/Xbal酶切后的載體中。mCherrymu3, mCherrymu4, mCherrymu5 和 YFPmu7 通過合成獲得(金斯瑞生物科技，南京，中國)，合成后mCherrymu3,mCherrymu4,mCherrymu5基因片段連接到pUC57載體BamHI/SacI 酶切位點(diǎn)；YFPmu7 基因片段連接到 pUC57KpnI/SacI 位點(diǎn)。pHB_mCherrymu3，pHB_mCherrymu4 和 pHB_mCherrymu5 構(gòu)建分別以 pUC57_mCherrymu3, pUC57_mCherrymu4 和pUC57-mCherrymu5為模板；pHB_YFPmu7構(gòu)建以pUC57_YFPmu7為模板，PCR擴(kuò)增引物和條件同mCherry。PCR產(chǎn)物經(jīng)HindIII/Xbal酶切后，連接到pHB經(jīng)HindIII/Xbal酶切后的載體中。pUC57圖譜如圖12。pHB-mGFP5構(gòu)建以pCambia_1302 (Cambia公司)為模板擴(kuò)增，mGFP5正向引物:5，-CCCAAGCTTATGAGTAAAGGAGAAGAAC-3，(SEQ ID NO:57) ；mGFP5反向引物:5’-CCGTCTAGATTATTTGTATAGTTCATCCAT-3’ (SEQ ID N0:58)，正向和反向引物序列下劃線部分分別為HindIII和XbaI酶切位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增條件同mCherry。PCR產(chǎn)物經(jīng)HindIII/Xbal酶切后，連接到pHB經(jīng)HindIII/Xbal酶切后的載體中。植物轉(zhuǎn)基因油菜、小麥、水稻、棉花四種植物轉(zhuǎn)基因均采用農(nóng)桿菌侵染法。水稻轉(zhuǎn)基因方法參考劉巧泉，張景六，王宗陽，洪孟民，顧銘洪(1998):根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立；植物生理學(xué)報(bào)，24，259-271。油菜轉(zhuǎn)基因參考Zhang HX, Hodson JN, Williams JP, and BlumwaldE.(2001)Engineering salt-tolerant Brassica plants:Characterization of yield and seedoil quality in transgenic plants with increased vacuolar sodium accumulation.Proceeding of National Academy of Science USA98,12832-12836。小麥轉(zhuǎn)基因方法參考Supartana P, Shimizu T, Nogawa M, Shioiri H, Nakaima Τ,Haramoto N, Nozue Μ, and Kojima Μ.Development of simple and efficient inPlantatransformation method for wheat(Triticum aestivum L.)Using agrobacteriumtumefaciens.Journal of Bioscience and Bioengineeringl02,162—170。棉花轉(zhuǎn)基因參考岳建雄，張慧軍，張煉輝(2002):以對潮霉素抗性為篩選標(biāo)記的棉花遺傳轉(zhuǎn)化。棉花科學(xué)，14(4)，195-199。綜上，獲得轉(zhuǎn)基因油菜、轉(zhuǎn)基因小麥、轉(zhuǎn)基因水稻和轉(zhuǎn)基因棉花。LEAT蛋白的原核 表達(dá)及其純化PCR擴(kuò)增mCherry全長基因，PCR產(chǎn)物用BamHI和SalI酶切后接入pGEX_4T_l (GEhealthcare, Uppsala, Sweden)載體中，使得 GST 融合在 mCherry 基因的 N端，然后質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 E.coli BL21 (DE3) (Promega,Madison,WI) PCR 擴(kuò)增正向引物為:5’_CCC迎ATCCATGGTGAGCMGGGCGAGGAG-3 ’ (SEQ ID NO: 59)，反向引物為:5 ’ -CCGGTCGACCTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’(SEQ ID N0:60)。正向和反向引物序列下劃線部分分別為BamHI和Sail酶切位點(diǎn)。pRSET-BFP 經(jīng) EcoRI/XhoI 酶切將 BFP 全長基因片段連接到 pGEX-4T_lEcoRI/XhoI位點(diǎn)中，使得GST融合在BFP基因的N端，然后質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21 (DE3)。mCherry 點(diǎn)突變體基因(mCherrymu3, mCherrymu4 和 mCherrymu5)通過合成獲得(金斯瑞生物科技，南京，中國)，合成序列時(shí)分別兩端帶有BamHI和SacI,合成后mCherrymu3, mCherrymu4 和 mCherrymu5 片段連接到 pUC57 載體 BamHI/SacI 酶切位點(diǎn)。pUC57-mCherrymu3, pUC57-mCherrymu4 和 pUC57_mCherrymu5 用 BamHI 和 SacI 酶切后，片段接入pET30a (Novagen)載體，使得6XHis標(biāo)簽融合在mCherry各突變基因的N端。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)菌株中，誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白。分別以pEYFP，pECFP(Clonetech)和 pl301-GFP (Li N, Zhang D-S, Liu H-S etal.The rice tapetum degeneration retardation gene is required for tapetumdegradation and anther development.The Plant Cell2006; 18:2999-3014.)為模板，利用 iProof High-Fidelity DNA 聚合酶(Bio-rad)，通過 PCR 擴(kuò)增 YFP，CFP，GFP 基因以及 C末端去除的YFP突變體基因(YFPl)和GFP突變體基因(GFPp231),將PCR產(chǎn)物用KpnI和SacI酶切后連接到pET51b載體(Novagen)中，YFPmu2、YFPmu4等的點(diǎn)突變通過引物擴(kuò)增引入。以上的基因的N末端融合有str印II，將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21-CodonPluS菌株(Promega，Madison，WI)中，以 20。C,0.1ml IPTG 誘導(dǎo)過夜。12個(gè)LEAT蛋白基因通過合成獲得(金斯瑞生物科技，南京，中國)，合成序列時(shí)分別兩端帶有BamHI和SacI或EcoRI和SacI酶切位點(diǎn)，用BamHI和SacI或EcoRI和SacI酶切后接入pET30a (Novagen)，N·末端與6XHis標(biāo)簽融合。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21 (DE3)菌株中，誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白。上述融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)參照生產(chǎn)廠商的產(chǎn)品說明書。純化的蛋白經(jīng)脫鹽后，-80° C保存在含10%甘油的50mM的PBS緩沖液中。I1.實(shí)施例實(shí)施例1、LEAT蛋白利用光能催化水的裂解ULEAT蛋白在作用光下催化水對質(zhì)體醌的類似物2，3，5_三甲基_1，4_對苯醌的還原。已有報(bào)道表明，GFP等蛋白能夠作為電子供體還原一些氧化態(tài)的小分子化合物如NAD +、鐵氰化鉀以及一些蛋白如細(xì)胞色素C、以FAD為輔基的蛋白(BogdanovAM等，2009，Nature Chemical Biology.5:459-461)。本發(fā)明人利用純化的大腸桿菌表達(dá)重組蛋白。預(yù)照光的YFP和mCherry雖然可以作為電子供體，但I(xiàn)個(gè)LEAT蛋白分子只能提供I個(gè)電子，在光下不能持續(xù)的提供提供電子(圖1)。通過監(jiān)測醌分子的在436nm吸收減少來分析LEAT蛋白催化的醌分子的光下還原。LEAT蛋白可以作為一類與葉綠體內(nèi)反應(yīng)中心葉綠素a相似的反應(yīng)中心色素，在作用光的激發(fā)下，能夠催化水對甲基醌或其衍生物的還原，例如質(zhì)體醌的類似物2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌(圖2)。與TMBQ的光下還原相似，LEAT蛋白光下催化的水裂解放氧反應(yīng)是光強(qiáng)依賴的。雖然GFP光下也有裂解水放氧活性，但其活性比較低(圖3和圖4)，其余的LEAT蛋白都具有很強(qiáng)的催化TMBQ還原(圖2)和放氧的活力(圖5)，且是TMBQ濃度依賴的(圖5)。
YFP/mCherry在其他某些甲基醌存在時(shí)，也能在光下催化水裂解反應(yīng)，其中在TMBQ存在的情況下，YFP和mCherry蛋白分子的光下裂解水放氧活力最高，其中TMBQ>DMBQ2>MBQ>DMBQ1，而用杜醌(DuroQuinone，DQ，四甲基醌)和泛醌類似物(2，3-二甲氧基-5-甲基對苯醌，UQ)替代TMBQ時(shí)，YFP和mCherry蛋白則沒有光下裂解水放氧的活力(圖6)。植物體內(nèi)有有各種醌類物質(zhì)，其中甲基醌衍生物是最重要的一類醌之一，比如:TMBQ的類似物質(zhì)體醌含量很高，在細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中都有廣泛分布。2.LEAT蛋白光下催化TMBQ還原和水裂解放氧活力不依賴于其熒光的強(qiáng)弱自然界中存在許多不發(fā)光但能吸收光的生色蛋白。為了進(jìn)一步探討LEAT蛋白的熒光特性與其光下催化水裂解放氧能力關(guān)系，將YFP和mCherry生色團(tuán)周圍相關(guān)殘基進(jìn)行突變，各得到了 3個(gè)熒光大幅度減弱的點(diǎn)突變:YFPmu2 (YFPhi49c Y204A)，YFPmu4 (YFPhi49c
F166NI168M Υ204Α^ γρρ^γ (-yppSHSC H149C F166N K167MI168M S203A Y204A^ ^^errymuS (mCherryS151CS152C K16 )
,mCherrymu4(mCherrysl51csl52C K167M I202A), mCherrymu5 (mCherrysl51csl52cn66N K )。本發(fā)明人比較了這些突變體與野生型的光吸收能力、熒光強(qiáng)度、在光下催化TMBQ還原和水裂解放氧能力。吸收和熒光光譜掃描實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這6個(gè)突變體只能發(fā)很弱的熒光或基本不發(fā)熒光。其中YFPmu2和mCherrymu3的吸收光的能力分別減少到原來的30%和40%(圖7A，E)，但其熒光強(qiáng)度分別只有原來的 I和4%(圖7D，H)。其他的4個(gè)突變體不僅熒光強(qiáng)度減弱得更多，其吸收光的能力也由很大幅度減少。其中YFPmu4和YFPmu7的熒光強(qiáng)度分別只有野生型的0.04%和0.07%(圖7A,B,E, F),而mCherrymu4和mCherrymu5的突光強(qiáng)度分別只有野生型的3%和5%(圖7C，G)。進(jìn)一步的光下裂解水放氧活力測定表明，不管LEAT蛋白是否發(fā)熒光都能在光下催化醌介導(dǎo)的裂解水放氧。放氧活力不僅沒有隨著熒光強(qiáng)度降低，反而有大幅度的提高。其中YFPmu2和YFPmu7分別是野生型的6倍和30倍，mCherrymu3是野生型的6倍(圖7D, H)。這些結(jié)果表明，醌介導(dǎo)的LEAT 蛋白催化水裂解放氧活性與其是否能發(fā)射熒光無關(guān)，而與蛋白吸收光能并傳遞和轉(zhuǎn)換光能的能力有關(guān)。由于其沒有熒光來耗散吸收的光能，它們催化TMBQ還原和水裂解放氧的活力反而更高。3、YFP 突變體 YFPL232H，YFPl232q, YFP1.和 GFP1.放氧活力 通過對GFP和YFP，CFP, BFP氨基酸序列進(jìn)行序列比較后發(fā)現(xiàn)(圖8)，232位的氨基酸可能對放氧活力有影響。YFP⑵2H突變體光下裂解水放氧活性降低到野生型YFP的1%以下，如圖9A。但是去除C末端后YFP (圖9A)和GFP (圖9B)蛋白在TMBQ存在的情況下催化水裂解放氧活力很高。說明GFP活力較低的主要原因在于232位的組氨酸，還表明現(xiàn)在活力較低的LEAT蛋白經(jīng)過簡單的遺傳改造，如去除C末端，就可以大幅度提高它的活力，用于提高植物的光合效率。實(shí)施例2、不同來源的LEAT蛋白光下催化水裂解放氧能力的比較從110種刺胞動物(Cnidarian)和節(jié)足動物(Arthropoda)來源的突光蛋白和非熒光生色蛋白(表I)中選擇了 9個(gè)熒光蛋白和3個(gè)非熒光生色蛋白(圖10)。這12個(gè)蛋白在進(jìn)化樹上分別屬于A、B、C、D等不同的分枝(圖10)。這12個(gè)熒光蛋白和非熒光生色蛋白加上GFP系列和dsRED系列熒光蛋白在進(jìn)化上覆蓋了目前已報(bào)道的大部分的熒光蛋白和非突光生色蛋白(Alieva et al., 2008, Diversity and evolution of coarl fluorescentproteins.PLoS 0ne3 (7): e2680.do1: 10.1371/journal, pone.0002680)，它們分子進(jìn)化途徑以及氨基酸的同源性與GFP系列和dsRED系列的LEAT蛋白有很大的差別(圖1lA和11B)。利用大腸桿菌表達(dá)這些蛋白，發(fā)現(xiàn)雖然它們的熒光強(qiáng)度、吸收光譜、熒光光譜有比較大的差異，但都有不同程度的光下催化水裂解放氧的活力(表2)。這就有可能將其或其突變體經(jīng)過合適的遺傳改造，利用其催化水裂解的功能，使得水在光下作為穩(wěn)定持續(xù)的電子供體，改善植物的性狀。表1、110種剌胞動物(Cnidarian)和節(jié)足動物(Arthropoda)來源焚光蛋白和非熒光生色蛋白名稱及基因序列號(Alieva et al.，2008)
權(quán)利要求
1.一種改良植物性狀的方法，包括以下步驟: 1)將一種或多種編碼光能吸收和傳遞蛋白的多核苷酸轉(zhuǎn)化入植物； 2)從轉(zhuǎn)化后的植物中選擇出相較對照植物而言性狀獲得改良的植物； 上述光能吸收和傳遞蛋白是能夠利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌的還原的蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的編碼光能吸收和傳遞蛋白的多核苷酸選自下組: (a)編碼熒光蛋白或其經(jīng)一個(gè)或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變后熒光強(qiáng)弱或熒光發(fā)射光譜發(fā)生變化的，但依然能夠利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌的還原的突變體蛋白的多核苷酸；或 (b)編碼非熒光生色蛋白或其經(jīng)一個(gè)或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變后但依然能夠利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌的還原的突變體蛋白的多核苷酸。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的編碼熒光蛋白或其經(jīng)一個(gè)或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變后熒光強(qiáng)弱或熒光發(fā)射光譜發(fā)生變化的，但依然能夠利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌的還原的突變體蛋白的多核苷酸選自下組: (a)編碼SEQID N0:4所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (b)編碼SEQID NO: 10所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (c)編碼SEQ ID NO:36所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (d)編碼SEQID NO:6所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (e)編碼SEQID NO:28所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (f)編碼SEQID N0:40所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (g)編碼SEQID N0:44所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (h)編碼SEQID NO:52所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (i)編碼SEQID NO:8所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (j)編碼SEQ ID NO: 12所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (k)編碼SEQ ID NO: 14所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (I)編碼SEQ ID NO: 16所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (m)編碼SEQ ID NO: 18所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (η)編碼SEQ ID NO:20所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (ο)編碼SEQ ID NO:50所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (P)編碼SEQ ID ΝΟ:2所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (q)編碼SEQ ID NO:22所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (r)編碼SEQ ID NO:24所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (s)編碼SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (t)編碼SEQ ID NO:30所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (u)編碼SEQ ID NO:34所示氨基酸序列的蛋白多核苷酸； (v)編碼SEQ ID NO:42所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (w)編碼SEQ ID N0:46所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (x)編碼SEQ ID NO:32所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸；(y)編碼SEQ ID N0:48所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (z)編碼SEQ ID N0:62所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (aa)編碼SEQID N0:64所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (ab)編碼(a)至(aa)任一所示氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且能夠利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌的還原的蛋白的多核苷酸； (ac)編碼與(a)至(aa)任一氨基酸序列的蛋白的序列同源性高于70%，且能夠利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌的還原的蛋白的多核苷酸； 或 (ad)與上述(a)-(ac)任一所述多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的編碼熒光蛋白或其經(jīng)一個(gè)或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變后熒光強(qiáng)弱或熒光發(fā)射光譜發(fā)生變化的，但依然能夠利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌的還原的突變體蛋白的多核苷酸選自下組: (a)如SEQID NO:3所示核苷酸序列的多核苷酸； (b)如SEQID NO:9所示核苷酸序列的多核苷酸； (c)如SEQID NO:35所示核苷酸序列的多核苷酸； (d)如SEQID NO:5所示核苷酸序列的多核苷酸；(e)如SEQID NO:27所示核苷酸序列的多核苷酸； (f)如SEQID NO:39所示核苷酸序列的多核苷酸； (g)如SEQID NO:43所示核苷酸序列的多核苷酸； (h)如SEQID NO:51所示核苷酸序列的多核苷酸； (i)如SEQID NO:7所示核苷酸序列的多核苷酸； (j)如SEQ ID NO: 11所示核苷酸序列的多核苷酸； (k)如SEQ ID NO: 13所示核苷酸序列的多核苷酸； (I)如SEQ ID NO: 15所示核苷酸序列的多核苷酸； (m)如SEQ ID NO: 17所示核苷酸序列的多核苷酸； (η)如SEQ ID NO: 19所示核苷酸序列的多核苷酸； (ο)如SEQ ID Ν0:49所示核苷酸序列的多核苷酸； (P)如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的多核苷酸； (q)如SEQ ID NO:21所示核苷酸序列的多核苷酸； (r)如SEQ ID NO:23所示核苷酸序列的多核苷酸； (s)如SEQ ID NO:25所示核苷酸序列的多核苷酸； (t)如SEQ ID NO:29所示核苷酸序列的多核苷酸； (u)如SEQ ID NO:33所示核苷酸序列的多核苷酸； (V)如SEQ ID N0:41所示核苷酸序列的多核苷酸； (w)如SEQ ID NO:45所示核苷酸序列的多核苷酸； (x)如SEQ ID NO:31所示核苷酸序列的多核苷酸； (y)如SEQ ID NO:47所示核苷酸序列的多核苷酸； (z)如SEQ ID NO:61所示核苷酸序列的多核苷酸；(aa)如SEQID N0:63所示核苷酸序列的多核苷酸；或 (ab)與(a)-(aa)任一所述的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的編碼非熒光生色蛋白或其經(jīng)一個(gè)或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變后依然能夠利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌還原的突變體蛋白的多核苷酸選擇下組: (a)SEQ ID NO: 38所不氣基酸序列的蛋白； (b)將(a)所示氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且能夠利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌的還原的蛋白； (c)與(a)所示氨基酸序列的蛋白的序列同源性高于70%，且能夠利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌還原的蛋白；或 (d)與(a)-(c)任一所述多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的編碼非熒光生色蛋白或其經(jīng)一個(gè)或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變后依然能夠利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌的還原的突變體蛋白的多核苷酸選自下組: (a)如SEQID NO:37所示核苷酸序列的多核苷酸；或 (b)與(a)所述的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。
7.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的編碼光能吸收和傳遞蛋白的多核苷酸還選自:編碼選自下 列GenBank登錄號的蛋白的多核苷酸:AF168421、AY646070、AY646072、AY646071、AF168424、AF168420、AY182022、 AY182023、DQ206381、DQ206392、DQ206382、AY181556、AY679113、EU498721、AY182017、AY646069、AY646066、AY151052、EU498722、AY647156、AY508123、AY508124、AY508125、AF435432、AY646067、AY485334、AY485335、AY646068、AF545827、AF545830、AY037776、AB180726、DQ206383、DQ206395、DQ206396、DQ206385、EU498723、AB193294、AY182020、AY182021、AB107915、DQ206389、P42212、AY268073、AY181553、AY181554、AY181555、DQ206393、AY155344、AY037766、AY679112、AF401282、EU498724、AY268076、AY268074、AY268075、AY268071、AY268072、DQ206391、AY015995、AY182014、AF372525、EU498725、DQ206390、AF168422、AY646073、AY296063、AF272711、AB128820、DQ206379、DQ206380、AF168419、AY059642、EF186664、AF420591、DQ206387、AY182019、AY765217、AB085641、AY181552、DQ206386、AY182013、AY646064、AY485333、AF168423、AY646077、AY646076、AY646075、EF587182、AF363775、AF383155、DQ206394、DQ206376、AF38315、AF363776、AY461714、AB209967、DQ206377、DQ206378 ;或上述蛋白經(jīng)一個(gè)或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變后熒光強(qiáng)弱或熒光發(fā)射光譜發(fā)生變化的，但依然能夠利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌的還原的突變體蛋白。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述將多核苷酸轉(zhuǎn)化入植物方法包括:將含有編碼光能吸收和傳遞蛋白的多核苷酸的表達(dá)盒轉(zhuǎn)入植物中，從而在植物中表達(dá)上述多核苷酸。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的改良植物性狀選自下列一種或幾種: 提高植物的生物量； 提聞植物的廣量；促進(jìn)植物生長； 促進(jìn)植物種子或穗增大； 增加植物種子數(shù)、分蘗數(shù)或穗數(shù)； 增加種子體積； 增加種子重量； 增加植物的總蛋白量； 提高植物的光利用效率； 增加植物PSI或PSII的光化學(xué)效率； 增加植物光合電子傳遞效率； 提高植物對CO2的同化能力； 提高植物的凈光合效率； 提高植物的光合器官的光保護(hù)能力； 提高植物中光合輔助色素的含量； 提高植物的光合放氧速率。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植物是:裸子植物、雙子葉植物或單子葉植物。
11.光能吸收和傳遞蛋白或編碼光能吸收和傳遞蛋白的多核苷酸的用途，用于改良植物性狀。
12.分離的光能吸收和傳遞蛋白，其特征在于，所述光能吸收和傳遞蛋白包括: SEQ ID NO:22所示氨基酸序列的蛋白； SEQ ID N0:24所示氨基酸序列的蛋白； SEQ ID N0:26所示氨基酸序列的蛋白； SEQ ID NO: 12所示氨基酸序列的蛋白； SEQ ID NO: 14所示氨基酸序列的蛋白； SEQ ID NO: 16所示氨基酸序列的蛋白； SEQ ID NO: 18所示氨基酸序列的蛋白； SEQ ID N0:20所示氨基酸序列的蛋白； SEQ ID N0:62所示氨基酸序列的蛋白；或 SEQ ID NO:64所示氨基酸序列的蛋白。
13.分離的多核苷酸，其編碼權(quán)利要求12所述的任一光能吸收和傳遞蛋白。
14.一種重組表達(dá)載體，其特征在于，其中含有權(quán)利要求13所述的多核苷酸。
15.一種基因工程化的細(xì)胞，其特征在于，其中含有權(quán)利要求14所述的重組表達(dá)載體，或其基因組中整合有權(quán)利要求13所述的多核苷酸。
16.由權(quán)利要求1-10任一所述方法制得的轉(zhuǎn)基因植物及其細(xì)胞、組織或其后代。與對照植物相比，所述的轉(zhuǎn)基因植物或其后代具有改良的性狀。
17.由權(quán)利要求1-10任一所述方法制得的轉(zhuǎn)基因植物的用途，用于產(chǎn)生具有改良的性狀的植物種子。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種改良植物性狀的方法，首次揭示一種以提高植物的光能利用效率為目的的改良植物的新方法，所述方法通過在植物中表達(dá)光能吸收和傳遞蛋白(Light Energy Absorption and Transduction protein，LEAT蛋白)，利用吸收的光能與植物體內(nèi)相關(guān)的甲基醌衍生物，例如質(zhì)體醌，發(fā)生相互作用、催化水的裂解并釋放氧氣，從而提高植物光利用效率。本發(fā)明的方法可有效拓展植物對光能的利用，提高光合效率及產(chǎn)量。
文檔編號C12N15/12GK103194453SQ20121059434
公開日2013年7月10日 申請日期2012年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月5日
發(fā)明者蔡偉明, 孫衛(wèi)寧, 陳根云, 朱新廣, 米華玲, 陳海瑩 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院