專利名稱：一種減少細胞產(chǎn)品中異源蛋白殘留量的細胞培養(yǎng)方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種細胞培養(yǎng)方法，尤其是一種減少細胞產(chǎn)品中異源蛋白殘留量的細 胞培養(yǎng)方法。
背景技術：
目前在實驗室里，一般使用含有動物來源血清的細胞培養(yǎng)基進行小批量的貼壁細 胞培養(yǎng)工作，但是，如果是在產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模應用當中，尤其是培養(yǎng)出的貼壁細胞作為藥用 時，使用含有動物來源血清的細胞培養(yǎng)基有著許多不利因素(1)用于細胞培養(yǎng)的血清一般要經(jīng)過熱滅活，熱滅活的過程可以防止血清對細胞 的溶解作用，但是這個過程也可以使血清中的許多重要成分失活。(2)由于不同批次血清所來源的生物體不同，不同批次血清之間也不可避免地含 有不同的成分，其中有些成分會給所培養(yǎng)的細胞帶來變化，導致給終產(chǎn)品帶來無法預知的 影響，使得其產(chǎn)品質(zhì)量難以達到標準化。(3)血清中的成分并沒有也不可能在短時間內(nèi)完全被闡明，因此，它們對所培養(yǎng)細 胞的影響既是未知的，也是不能控制的。在細胞治療產(chǎn)品中去除細胞培養(yǎng)基中的動物成分，將提高產(chǎn)品的安全性，減弱或 降低免疫排斥反應。理論上在細胞治療產(chǎn)品中使用無血清培養(yǎng)基也更利于生產(chǎn)的標準化。但是，到目前為止還沒有真正適合于大規(guī)模制備細胞產(chǎn)品的無血清培養(yǎng)基(1)用于細胞治療產(chǎn)品的無血清培養(yǎng)基由于要添加各種細胞因子，導致成本遠遠 高于含血清培養(yǎng)基。(2)到目前為止，我們還不了解血清中哪些成分對細胞增殖、分化、基因穩(wěn)定性等 等產(chǎn)生相應作用；所以，應用無血清培養(yǎng)基大規(guī)模制備細胞治療產(chǎn)品的時候，很難通過配方 的改進和調(diào)整達到和含血清培養(yǎng)基同樣的效果。(3)到目前為止，各國還沒有對用于培養(yǎng)治療用細胞的無血清培養(yǎng)基制定出相應 的標準；但對牛血清等是有相應的要求。因此在目前，為了在產(chǎn)業(yè)化應用中更快、更好的擴增細胞，我們還是需要在培養(yǎng)時 添加血清。最終得到的產(chǎn)品當中里會存在較多的異種蛋白，若是用于臨床，則大大增加了使 用時的隱患，所以亟需一種減少終產(chǎn)品當中異種蛋白含量的細胞培養(yǎng)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種保證細胞其它生理生化參數(shù)不變的前提下，減少外源蛋 白殘留量的細胞培養(yǎng)方法，使得培養(yǎng)出的細胞更適合臨床使用。為了解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案是一種減少細胞產(chǎn)品中異源蛋 白殘留量的細胞培養(yǎng)方法，包括以下步驟將細胞接種到含血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置于二 氧化碳培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，在細胞進入對數(shù)增長期時，將含血清培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基。
所述細胞培養(yǎng)方法為貼壁培養(yǎng)。所述細胞為在培養(yǎng)時具有貼壁特性的細胞。所述細胞經(jīng)過傳代培養(yǎng)后，再將含血清培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基。所述細胞為干細胞。所述干細胞為人干細胞。所述干細胞為亞全能干細胞。所述干細胞為人間充質(zhì)干細胞。所述干細胞為從體外臍帶胎盤來源的人間充質(zhì)干細胞。所述含血清培養(yǎng)基為DMEM/F12、DMEM, MCDB-201或M199中的一種或幾種的組合， 其中含體積比2% 20%的血清。所述血清為牛血清或馬血清。所述培養(yǎng)基中還加入有細胞因子。所述細胞因子為EGF、bFGF或VEGF中的一種或幾種組合。所述EGF、bFGF 或 VEGF 的含量均為 1 100ng/ml。所述二氧化碳培養(yǎng)的條件為37°C、飽和濕度、二氧化碳濃度5%，氧濃度為 20%。所述細胞接種于培養(yǎng)瓶時的密度為(0. 1 2) X 104/cm2。本發(fā)明的有益效果是用本發(fā)明所提供的培養(yǎng)方法得到的貼壁細胞，由于在最后 步驟中將含血清培養(yǎng)基替換為無血清培養(yǎng)基，所以可以在不影響最終培養(yǎng)效果的基礎上， 有效地降低成品中異種蛋白的含量，若是應用于人類干細胞的培養(yǎng)，則得到的最終產(chǎn)品適 合于臨床直接使用，不良反應明顯少于始終使用含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)出的產(chǎn)品。


圖1是人絨毛膜亞全能干細胞不同培養(yǎng)條件MTT結(jié)果；圖2是人絨毛膜亞全能干細胞牛血清白蛋白殘留ELISA檢測結(jié)果；圖3是人骨髓間充質(zhì)干細胞牛血清白蛋白殘留ELISA檢測結(jié)果；圖4是人臍帶血來源細胞牛血清白蛋白殘留ELISA檢測結(jié)果；圖5是不同換液時間人絨毛膜亞全能干細胞制劑牛血清白蛋白殘留ELISA檢測結(jié) 果；圖6是大鼠胎盤來源間充質(zhì)干細胞牛血清白蛋白殘留ELISA檢測結(jié)果。
具體實施例方式下面具體實施方式
對本發(fā)明作進一步詳細說明實施例1(1)從合格的細胞庫取出凍存細胞，在37°C解凍復蘇細胞；(2)用含體積比濃度 10% (下同)血清的DMEM/F12培養(yǎng)基按2X104/cm2的密度接種到培養(yǎng)瓶中，置于37°C、 飽和濕度、5%的C02培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，細胞到80-90%融合時，用消化酶消化細胞，計數(shù)； (3)分別用配制好含10%血清的DMEM/F12培養(yǎng)基和DMEM/F12培養(yǎng)基按合適濃度重懸細 胞；(4)分成三組含10%血清的DMEM/F12培養(yǎng)基組、DMEM/F12培養(yǎng)基組和先用含10%血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)到70%融合后再用DMEM/F12培養(yǎng)基換液組，將各組細胞用96孔 板培養(yǎng)，每組6復孔；(5)培養(yǎng)結(jié)束前四小時加入10微升MTT，到培養(yǎng)結(jié)束用專業(yè)人事熟知 的MTT方法檢測每組OD值，OD值高代表活細胞數(shù)高。結(jié)果無血清培養(yǎng)組OD值最低；換液組OD值略低于含血清組，但P值大于0. 05， 統(tǒng)計學沒有顯著差異(圖1)實施例2人絨毛膜亞全能干細胞的擴增和牛血清白蛋白殘留檢測(1)從合格的細胞庫取出凍存細胞，在37°C解凍復蘇細胞；(2)用含體積比濃度 10% (下同)血清的DMEM/F12培養(yǎng)基按2X 104/cm2的密度接種到培養(yǎng)瓶中，置于37°C、飽 和濕度、5%的C02培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，細胞到80-90%融合時按1 3傳代，經(jīng)過3次傳代； (3)在第三次傳代細胞融合度達70%時換完全無血清的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)12小時，對 照組不進行該換液步驟；(4)用消化酶消化細胞，計數(shù)，用配制好細胞保護液按合適濃度重 懸細胞，分裝入無菌容器中，密封后，放置在合適環(huán)境保存；(5)取部分制劑用專業(yè)人事熟 知的ELISA方法進行牛血清白蛋白殘留物檢測。結(jié)果細胞在換液12小時后達到80-90%融合。制備得到的制劑，牛血清白蛋白 殘留為6. 2ng/l X IO7細胞對照組37. 3ng/l X IO7細胞(圖2)。實施例3人骨髓間充質(zhì)干細胞的擴增和牛血清白蛋白殘留檢測(1)從合格的細胞庫取出凍存細胞，在37 °C解凍復蘇細胞；(2)用含60% DMEM/F12培養(yǎng)液和40 % MCDB-201培養(yǎng)液混合組成，體積比濃度2_10 %的血清，ICT8M dexamethasone (地塞米松)，0. 2-5 X ITS,，0. 1-lOmML-glutamine (L-谷氨酰胺)，I-IOOng/ ml人表皮細胞生長因子，和Ι-lOOng/ml堿性成纖維細胞生長因子等的培養(yǎng)基按2X IO4/ cm2的密度接種到培養(yǎng)瓶中，置于37°C、飽和濕度、5%的C02培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，細胞到 80-90%融合時按1 3傳代，經(jīng)過3次傳代；(3)在第三次傳代細胞融合度達70%時換完 全無血清的60% DMEM/F12培養(yǎng)液和40% MCDB-201培養(yǎng)液混合培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時，對照 組不進行該換液步驟；(4)用消化酶消化細胞，計數(shù)，用配制好細胞保護液按合適濃度重懸 細胞，分裝入無菌容器中，密封后，放置在合適環(huán)境保存；(5)取部分制劑用專業(yè)人事熟知 的ELISA方法進行牛血清白蛋白殘留物檢測。結(jié)果細胞在換液24小時后達到80-90%融合。制備得到的制劑，牛血清白蛋白 殘留為2. 7ng/l X IO7細胞，對照組32. 7ng/l X IO7細胞(圖3)。實施例4人臍帶血來源內(nèi)皮祖細胞的擴增和牛血清白蛋白殘留檢測(1)從合格的細胞庫取出凍存細胞，在37°C解凍復蘇細胞；(2)用含20%血清、 10ng/ml的VEGF、10U/ml的肝素和4ng/ml的bFGF的M199培養(yǎng)基按2 X 10Vcm2的密度接種 到培養(yǎng)瓶中，置于37°C、飽和濕度、5%的C02培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，細胞到80-90%融合時按 1 3傳代，(3)在傳代細胞融合度達80%時換完全無血清，含lOng/ml的VEGF、10U/ml的 肝素和4ng/ml的bFGF的M199培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時，對照組不進行該換液步驟；(4)用消化 酶消化細胞，計數(shù)，用配制好細胞保護液按合適濃度重懸細胞，分裝入無菌容器中，密封后， 放置在合適環(huán)境保存；(5)取部分制劑用專業(yè)人事熟知的ELISA方法進行牛血清白蛋白殘 留物檢測。結(jié)果細胞在換液24小時后達到80-90%融合。制備得到的制劑，牛血清白蛋白 殘留為8. 3ng/l X IO7細胞，對照組52. 8ng/l X IO7細胞(圖4)。
實施例5不同換液時間對人絨毛膜亞全能干細胞制劑牛血清白蛋白殘留的影響(1)從合格的細胞庫取出凍存細胞，在37°C解凍復蘇細胞；(2)用含體積比濃度 10% (下同)血清的DMEM/F12培養(yǎng)基按2X 104/cm2的密度接種到培養(yǎng)瓶中，置于37°C、飽 和濕度、5%的C02培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，細胞到80-90%融合時按1 3傳代，經(jīng)過2次傳代； (3)在第2次傳代細胞進入對數(shù)增長期時，分換液4小時、12小時、24小時及對照組4組，對 照組不進行該換液步驟；(4)用消化酶消化細胞，計數(shù)，用配制好細胞保護液按合適濃度重 懸細胞，分裝入無菌容器中，密封后，放置在合適環(huán)境保存；(5)取部分制劑用專業(yè)人事熟 知的ELISA方法進行牛血清白蛋白殘留物檢測。結(jié)果同時收獲細胞，制備得到的制劑；檢測牛血清白蛋白殘留4小時、12小 時、24小時及對照組分別為24. Ing/lXlO7細胞、6. 9ng/l X 107細胞、3. 2ng/lX107細胞、 35. Ing/lXlO7 細胞(圖 5)。實施例6大鼠胎盤來源間充質(zhì)干細胞的擴增和牛血清白蛋白殘留檢測(1)取出凍存的大鼠胎盤來源間充質(zhì)干細胞，在37°C解凍復蘇細胞；(2)用含體 積比濃度(下同)10%血清的DMEM/F12培養(yǎng)基按2X 104/cm2的密度接種到培養(yǎng)瓶中，置 于37°C、飽和濕度、5%的C02培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，細胞到80-90%融合時按1 3傳代，經(jīng) 過2次傳代；(3)在第2次傳代細胞進入對數(shù)增長期時，實驗組進行換液，對照組不進行該 換液步驟；(4) 12小時后用消化酶消化細胞，計數(shù)，用配制好細胞保護液按合適濃度重懸細 胞，分裝入無菌容器中，密封后，放置在合適環(huán)境保存；(5)取部分制劑用專業(yè)人事熟知的 ELISA方法進行牛血清白蛋白殘留物檢測。結(jié)果細胞在換液12小時后達到80-90%融合。制備得到的制劑，牛血清白蛋白 殘留為4. 7ng/l X 107細胞對照組27. 7ng/l X 107細胞(圖6)。上述實施例中用的是牛血清，用馬血清也可以，不再舉例。本發(fā)明的方法雖然換液去除了牛血清支持，但對數(shù)增長期細胞能大量分泌細胞生 長需要的細胞因子，可以保證細胞正常擴增；利用該培養(yǎng)方法這樣既保證了細胞能良好擴 增細胞，也可以大大減少最終收獲細胞中的異源蛋白含量。綜上所述，本發(fā)明的內(nèi)容并不局限在上述的實施例中，相同領域內(nèi)的有識之士可 以在本發(fā)明的技術指導思想之內(nèi)可以輕易提出其他的實施例，但這種實施例都包括在本發(fā) 明的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種減少細胞產(chǎn)品中異源蛋白殘留量的細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟將細胞接種到含血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，在細胞進入對數(shù)增長期時，將含血清培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的減少細胞產(chǎn)品中異源蛋白殘留量的細胞培養(yǎng)方法，其特征在 于，所述細胞培養(yǎng)方法為貼壁培養(yǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的減少細胞產(chǎn)品中異源蛋白殘留量的細胞培養(yǎng)方法，其特征在 于，所述細胞為在培養(yǎng)時具有貼壁特性的細胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的減少細胞產(chǎn)品中異源蛋白殘留量的細胞培養(yǎng)方法，其特征在 于，所述細胞經(jīng)過傳代培養(yǎng)后，再將含血清培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或4所述的減少細胞產(chǎn)品中異源蛋白殘留量的細胞培養(yǎng)方法， 其特征在于，所述細胞為干細胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的減少細胞產(chǎn)品中異源蛋白殘留量的細胞培養(yǎng)方法，其特征在 于，所述干細胞為人干細胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的減少細胞產(chǎn)品中異源蛋白殘留量的細胞培養(yǎng)方法，其特征在 于，所述干細胞為亞全能干細胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的減少細胞產(chǎn)品中異源蛋白殘留量的細胞培養(yǎng)方法，其特征在 于，所述干細胞為人間充質(zhì)干細胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述干細胞為從體外臍帶胎盤 來源的人間充質(zhì)干細胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的減少細胞產(chǎn)品中異源蛋白殘留量的細胞培養(yǎng)方法，其特征 在于，所述含血清培養(yǎng)基為DMEM/F12、DMEM、MCDB-201或M199中的一種或幾種的組合，其中 含體積比2 % 20 %的血清。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的減少細胞產(chǎn)品中異源蛋白殘留量的細胞培養(yǎng)方法，其特征 在于，所述血清為牛血清或馬血清。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的減少細胞產(chǎn)品中異源蛋白殘留量的細胞培養(yǎng)方法，其特征 在于，所述培養(yǎng)基中還加入有細胞因子。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的減少細胞產(chǎn)品中異源蛋白殘留量的細胞培養(yǎng)方法，其特征 在于，所述細胞因子為EGF、bFGF或VEGF中的一種或幾種組合。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述EGF、bFGF或VEGF的含 量均為1 100ng/ml。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的減少細胞產(chǎn)品中異源蛋白殘留量的細胞培養(yǎng)方法，其特 征在于，所述二氧化碳培養(yǎng)的條件為37°C、飽和濕度、二氧化碳濃度5%，氧濃度為 20%。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的減少細胞產(chǎn)品中異源蛋白殘留量的細胞培養(yǎng)方法，其特征 在于，所述細胞接種于培養(yǎng)瓶時的密度為(0. 1 2) X104/cm2。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種減少細胞產(chǎn)品中異源蛋白殘留量的細胞培養(yǎng)方法，包括以下步驟將細胞接種到含血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，在細胞進入對數(shù)增長期時，將含血清培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基。用本發(fā)明所提供的培養(yǎng)方法得到的貼壁細胞，由于在最后步驟中將含血清培養(yǎng)基替換為無血清培養(yǎng)基，所以可以在不影響最終培養(yǎng)效果的基礎上，有效地降低成品中異種蛋白的含量，若是應用于人類干細胞的培養(yǎng)，則得到的最終產(chǎn)品適合于臨床直接使用，不良反應明顯少于始終使用含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)出的產(chǎn)品。
文檔編號C12N5/074GK101892192SQ20101022376
公開日2010年11月24日 申請日期2010年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月12日
發(fā)明者王濤, 韓之海 申請人:北京漢氏聯(lián)合生物技術有限公司