專利名稱：一種構(gòu)建生產(chǎn)外源蛋白用的轉(zhuǎn)基因用模型雞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種構(gòu)建生產(chǎn)外源蛋白用的轉(zhuǎn)基因用模型雞的方法。
背景技術(shù)：
上個世紀(jì)70年代DNA重組技術(shù)的建立，使異源DNA可以被引入到真核細(xì)胞 中，這種基因轉(zhuǎn)移技術(shù)為人類提供了從遺傳上改變高等動物細(xì)胞的能力，并成為制 備轉(zhuǎn)基因動物和進(jìn)行基因治療的基礎(chǔ)。應(yīng)用DNA重組技術(shù)，目前人們已經(jīng)成功地 獲得了包括小鼠、牛、豬、兔、雞、魚、線蟲和海膽等多種轉(zhuǎn)基因動物，1990年， 轉(zhuǎn)基因方法也被用于人類基因治療的研究中。對于許多高等動物，特別是具有完善 的免疫系統(tǒng)的脊椎動物而言，基因傳遞系統(tǒng)存在潛在的免疫刺激性，異源基因的表 達(dá)容易引起宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答。通常情況下，無論是制備轉(zhuǎn)基因動物還是進(jìn)行基因 治療，其目的就是為了高效的獲得外源基因的表達(dá)產(chǎn)物。由于宿主本身并沒有這些 蛋白，自然將其識別為非自身抗原而加以清除，造成轉(zhuǎn)基因蛋白的瞬時表達(dá)，甚至 引發(fā)炎癥反應(yīng)。為了避免這種情況的發(fā)生，需要宿主對特定的外源蛋白產(chǎn)生免疫寬 容，不發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，即形成免疫耐受。
免疫耐受是指免疫系統(tǒng)與機(jī)體固有成分或被引入的抗原不發(fā)生破壞性免疫反 應(yīng)的一種生理狀態(tài)，這種狀態(tài)可以通過將抗原引入發(fā)育中的免疫系統(tǒng)而人為誘導(dǎo)。 根據(jù)抗體產(chǎn)生的克隆選擇學(xué)說，正常情況下，胚胎與外部抗原刺激是隔離開的，胚 胎的淋巴系統(tǒng)只會遇到自身抗原，從而導(dǎo)致了自身免疫反應(yīng)的消除(免疫寬容)。 免疫系統(tǒng)在發(fā)育過程中學(xué)會了耐受，它的任務(wù)是通過T細(xì)胞和B細(xì)胞抗原受體基因 的重排產(chǎn)生隨機(jī)的結(jié)構(gòu)多樣性，識別不期而遇的分子并作出反應(yīng)，因而是一種獲得 性現(xiàn)象，需要抗原誘導(dǎo)才能產(chǎn)生，即便是對自身抗原的耐受也是如此。但是對于大 多數(shù)轉(zhuǎn)基因動物，特別是作為生物反應(yīng)器的轉(zhuǎn)基因動物，外源基因通常在免疫系統(tǒng) 已發(fā)育完全的成年動物中表達(dá)，因此需要建立一種通過向發(fā)育早期的胚胎中引入外 源抗原誘導(dǎo)免疫耐受的方法。
抗原性物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體后能否誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫耐受，主要取決與抗原和機(jī)體兩方面 的原因， 一般而言，小分子可溶性、非聚合狀態(tài)的抗原，如血清蛋白、多糖和脂多 糖等多為耐受原。這些小分子可溶性抗原在體內(nèi)不易被吞噬細(xì)胞攝取，有可能以最 適濃度通過直接與淋巴細(xì)胞作用的方式誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫耐受。而大分子顆粒性物 質(zhì)和蛋白質(zhì)聚合物，如血細(xì)胞、細(xì)菌或人丙種球蛋白聚合物等為良好的免疫原。這 些大分子物質(zhì)易被吞噬細(xì)胞攝取，經(jīng)加工處理后可有效刺激淋巴細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng) 答。誘導(dǎo)耐受所需的抗原劑量隨抗原種類、耐受細(xì)胞類型、動物屬種、品系和年齡 而異。 一般而言，抗原經(jīng)靜脈注射最易產(chǎn)生免疫耐受，腹腔注射次之，皮下和肌肉 注射最難，但不同部位靜脈注射引起的結(jié)果也不相同。例如人丙種球蛋白經(jīng)腸系膜 靜脈注入可引起耐受，經(jīng)頸靜脈注入則引起免疫應(yīng)答；IgG或白蛋白注入門靜脈能 引起耐受，注入周圍靜脈則引起免疫應(yīng)答。誘導(dǎo)免疫耐受形成的難易還與機(jī)體免疫 系統(tǒng)的發(fā)育程度有關(guān)， 一般在胚胎期最容易，新生期次之，成年期最難。體外實驗 證實，未成熟免疫細(xì)胞易于誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫耐受，成熟免疫細(xì)胞則難以誘導(dǎo)產(chǎn)生耐受； 誘導(dǎo)成熟免疫細(xì)胞耐受所需的抗原量比誘導(dǎo)未成熟免疫細(xì)胞耐受所需的抗原量高 數(shù)十倍。目前大量的實驗證據(jù)表明，免疫耐受的形成與免疫系統(tǒng)初次接觸抗原時所 處的發(fā)育階段密切相關(guān)，免疫耐受可以通過對胚胎或新生幼雛接種抗原而誘導(dǎo)。
與哺乳動物不同的是，禽類的胚胎發(fā)育是在離開母體的密閉蛋殼內(nèi)獨立完成 的，這為胚胎期接種抗原提供了更為方便的條件。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種構(gòu)建生產(chǎn)外源蛋白用的轉(zhuǎn)基因用模型雞的方法。 本發(fā)明所提供的構(gòu)建生產(chǎn)外源蛋白用的轉(zhuǎn)基因用模型雞的方法包括以下步驟
1) 將外源蛋白導(dǎo)入種蛋的卵黃囊內(nèi)；
2) 將上述步驟l)的種蛋靜置孵育46 — 50小時后，再繼續(xù)孵化至出雛，得到生 產(chǎn)外源蛋白用的轉(zhuǎn)基因用模型雞。
上述方法中，所述種蛋的胚齡為5-7天。
所述外源蛋白為牛血清白蛋白、牛乳酪蛋白或人血清白蛋白，優(yōu)選為牛血清白 蛋白；所述牛血清白蛋白的濃度為0.8 —1.2g/L，導(dǎo)入的劑量為每只種蛋80 — 120pl。
具體操作時，可在種蛋的氣室上打兩個孔，其中一個孔位置在于氣室邊緣下方 0.3-0.5cm處，通過氣室上的窗孔將外源蛋白導(dǎo)入卵黃囊中。
本發(fā)明在雞胚胎發(fā)育早期，其免疫系統(tǒng)尚未完善之前，通過向種蛋的卵黃囊中 導(dǎo)入外源蛋白，使其與卵黃營養(yǎng)物質(zhì)一起被發(fā)育中的胚胎吸收，進(jìn)入到胚胎的血液 循環(huán)系統(tǒng)，隨著血液循環(huán)經(jīng)過胸腺時與正在發(fā)育的免疫細(xì)胞相互作用，誘導(dǎo)雞胚免 疫系統(tǒng)產(chǎn)生對外源蛋白的免疫沉默，最終獲得對特定外源蛋白免疫耐受的轉(zhuǎn)基因用
模型雞。
在對種蛋卵黃囊導(dǎo)入外源蛋白時，要盡量縮短時間，平均每只種蛋的操作時間 控制在1-1.5分鐘。整個過程需在超凈工作臺中進(jìn)行，封閉蛋殼上的針孔時不能出 現(xiàn)滲漏的情況。整個操作過程可以在室溫條件下完成，為縮短操作時間，可一人扎 孔、 一人導(dǎo)入外源蛋白、 一人封蛋，盡量縮短每只種蛋在孵化器外的時間，以減少 環(huán)境變化對雞胚孵化的影響，大大提高其孵化率，進(jìn)而提高免疫耐受率。
本發(fā)明的方法具有操作條件簡單易得、成本低廉、可操作性強(qiáng)、外源蛋白的導(dǎo) 入劑量低、可重復(fù)性好、耐受率和孵化率高及維持耐受的時間久等優(yōu)點，且本發(fā)明
方法對雞胚胎發(fā)育的影響較小，可以獲得73-83%的孵化率，成功地解決了轉(zhuǎn)基因 產(chǎn)物可能引起生物個體免疫應(yīng)答的問題，并且免疫耐受維持的時間較久，60日齡的 轉(zhuǎn)基因用模型雞仍然存在對特定外源蛋白抗原的免疫耐受。本發(fā)明方法為解決轉(zhuǎn)基 因產(chǎn)物引起的免疫應(yīng)答提供了一個簡單、高效的解決方案，為在轉(zhuǎn)基因動物研究中 高效獲得外源基因產(chǎn)物，建立對基因產(chǎn)物免疫耐受的禽類模型和提高雞輸卵管生物 反應(yīng)器的應(yīng)用價值提供了科學(xué)依據(jù)和有效的方法。


圖1為對孵化3 — 7天的種蛋胚胎導(dǎo)入牛血清白蛋白后獲得的轉(zhuǎn)基因用模型雞 的血清ELISA檢測結(jié)果
具體實施例方式
下面通過具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。 實施例l、對不同胚齡的種蛋導(dǎo)入外源蛋白-牛血清白蛋白(BSA) 取胚齡分別為3、 4、 5、 6和7天的白萊航雞種蛋(購自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)種雞場) 各30枚，用酒精棉擦拭蛋殼表面消毒后，通過顯微光源照蛋確定胚胎所處的位置， 然后用鉛筆在胚胎對側(cè)的蛋殼上標(biāo)注出氣室的邊緣，這樣在打孔時可以有效的避開 胚胎血管網(wǎng)，避免導(dǎo)入外源蛋白時對胚胎血管的機(jī)械損傷。在標(biāo)注的氣室邊緣下方 0.3-0.5cm處做一個打孔標(biāo)記，為了保持氣室和胚室的氣壓平衡，在氣室頂部再做一 個打孔標(biāo)記，用酒精棉擦拭打孔標(biāo)記處，使用解剖針在種蛋打孔標(biāo)記處快速扎兩個 小孔(孔徑為lmm)。
用lml—次性注射器，使用1號針頭，針頭內(nèi)徑為0.1mm，吸取100pl濃度為 lg/L的外源蛋白-牛血清白蛋白溶液，自氣室邊緣下方0.3-0.5cm處的小孔處垂直種 蛋蛋殼切面扎入蛋內(nèi)直至針頭完全沒入種蛋中，輕推注射器活塞將外源蛋白-牛血
清白蛋白溶液導(dǎo)入卵黃囊內(nèi)。維持原角度緩緩地抽出注射器，用液體石蠟封閉兩孔。
將封閉后的種蛋放回孵化器中，在不轉(zhuǎn)蛋的條件下靜置孵育48小時后，再在 常規(guī)條件下繼續(xù)孵化直至出雛，得到轉(zhuǎn)基因用模型雞。
統(tǒng)計孵化率，結(jié)果表明，不同胚齡接種牛血清白蛋白的轉(zhuǎn)基因用模型雞的孵化 率分別為76.67%、 80.00%、 83.33%、 80.00%和73.33%，孵化率在73%-83%之間。
實施例2、利用酶聯(lián)免疫反應(yīng)(ELISA)檢測不同胚齡接種牛血清白蛋白的轉(zhuǎn) 基因用模型雞的免疫耐受結(jié)果
牛血清白蛋白經(jīng)弗氏佐劑(弗氏完全佐劑用于第一次免疫時抗原乳化，弗氏不 完全佐劑用于其他日齡階段的抗原乳化)乳化后，在上述實施例1獲得的不同胚齡 接種牛血清白蛋白的轉(zhuǎn)基因用模型雞孵出后的第20天、第30天、第40天和第50 天分別用lOOiil濃度為lg/L的牛血清白蛋白溶液，進(jìn)行4次皮下注射，第4次皮下 注射后的第7天，取轉(zhuǎn)基因用模型雞的血清，進(jìn)行ELISA檢測。同時以胚胎期未經(jīng) 處理的小雞出生后按照上述劑量進(jìn)行四次免疫后的雞血清作為陽性對照，以采用無 特定病原菌(SPF)處理的雞血清作為陰性對照。
在檢測各組雞血清樣本前，需要先通過系列倍比稀釋實驗組、陽性對照組和陰 性對照組的雞血清，以確定抗原抗體的最佳反應(yīng)濃度。選取陽性對照組OD值在1. 0 左右，且與同樣稀釋度下的陰性對照組OD值差異最大時對應(yīng)的抗原包被濃度以及 血清稀釋倍數(shù)作為檢測實驗組血清樣本時使用的抗原濃度和稀釋倍數(shù)。當(dāng)實驗組樣
本的0D值大于陰性對照組0D值的2. l倍時，判定該樣本為陽性，反之則為陰性。 所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)用平均值士標(biāo)準(zhǔn)差 (mean士SEM)的方式表示。采用獨立樣本t檢驗(雙尾)，P<0. 05時認(rèn)為差異顯 著。
具體檢測結(jié)果如圖1所示。從圖1中可以看出，對胚齡為3天或4天的種蛋接 種牛血清白蛋白的轉(zhuǎn)基因用模型雞血清中的抗-牛血清白蛋白抗體的平均水平分別 為1.03±0.13 (n=21)和0.92土0.12 (n=20)，與陽性對照(1.02±0.04， n=6)相 比差異不顯著(p=0.984， p=0.636)，表明在胚齡為3天或4天時導(dǎo)入牛血清白蛋 白對誘導(dǎo)雞的耐受性的效果不好，其血液中仍具有較高水平的抗-牛血清白蛋白抗 體；而對胚齡為5天、6天或7天的種蛋接種牛血清白蛋白的轉(zhuǎn)基因用模型雞血清 中的抗-牛血清白蛋白抗體的平均水平分別為0.55±0.08 (n=21) 、 0.66±0.08 (n =20)和0.44士0.04 (n=16)，顯著低于陽性對照(p=0.003， 5天組;p=0.020， 6
天組；p<0.001， 7天組)，表明在胚齡為5天、6天或7天時導(dǎo)入牛血清白蛋白對 誘導(dǎo)雞的耐受性的效果較好。進(jìn)一步分析比較這五組數(shù)據(jù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胚齡為5天、 6天或7天組的雞血清中抗-牛血清白蛋白抗體的平均水平顯著低于胚齡為3天或4 天組的轉(zhuǎn)基因用模型雞血清中抗-牛血清白蛋白抗體的平均水平(p<0.05)，說明只 有在特定的發(fā)育時期接種外源抗原才能使雞血清中抗-牛血清白蛋白抗體的水平最 低，并非時間越早越好，在胚齡為5-7天時導(dǎo)入外源蛋白的效果最好。
實驗組的轉(zhuǎn)基因用模型雞經(jīng)過四次免疫后，此時小雞已達(dá)60日齡，其體內(nèi)抗-牛血清白蛋白抗體的平均水平顯著低于陽性對照(p=0.003， 5天組；p=0.020， 6天 組；pO.OOl， 7天組)，說明耐受期限可維持較長時間。
權(quán)利要求
1、一種構(gòu)建生產(chǎn)外源蛋白用的轉(zhuǎn)基因用模型雞的方法包括以下步驟1)將外源蛋白導(dǎo)入種蛋的卵黃囊內(nèi)；2)將上述步驟1)的種蛋靜置孵育46-50小時后，再繼續(xù)孵化至出雛，得到生產(chǎn)外源蛋白用的轉(zhuǎn)基因用模型雞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種構(gòu)建生產(chǎn)外源蛋白用的轉(zhuǎn)基因用模型雞的方法。本發(fā)明的方法包括以下步驟1)將外源蛋白導(dǎo)入種蛋的卵黃囊內(nèi)；2)將上述步驟1)的種蛋靜置孵育46-50小時后，再繼續(xù)孵化至出雛，得到生產(chǎn)外源蛋白用的轉(zhuǎn)基因用模型雞。本發(fā)明的方法具有操作條件簡單易得、成本低廉、可操作性強(qiáng)、外源蛋白的導(dǎo)入劑量低、可重復(fù)性好和孵化率高等優(yōu)點，且本發(fā)明方法對雞胚胎發(fā)育的影響較小，可以獲得73-83％的孵化率，并且免疫耐受維持的時間較久，60日齡的轉(zhuǎn)基因用模型雞仍然存在對特定外源蛋白抗原的免疫耐受。
文檔編號C12N15/09GK101352157SQ20081011843
公開日2009年1月28日 申請日期2008年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月15日
發(fā)明者李贊東, 晨 趙 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)