專利名稱：在轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的奶中生產(chǎn)外源蛋白的方法以及從其中純化蛋白的方法
背景技術(shù)：
在過去十年已經(jīng)由制藥工業(yè)通過提取或通過重組技術(shù)來普遍地生產(chǎn)涉及人保健的蛋白因子和激素。涉及所需基因的遺傳構(gòu)建體在細(xì)菌、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中成功地得到了表達(dá)。然而，使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物來獲得復(fù)雜的蛋白質(zhì)，如需要適當(dāng)糖基化模式的那些，涉及高成本的方法。
在過去十年已經(jīng)日益增長(zhǎng)地使用重組DNA技術(shù)來生產(chǎn)商業(yè)上重要的生物材料。為此，已經(jīng)克隆了編碼各種醫(yī)學(xué)上重要的人蛋白質(zhì)的DNA序列。這些包括胰島素、纖溶酶原激活劑、α1-抗胰蛋白酶和凝固因子VIII和IX。目前，即使使用新出現(xiàn)的重組DNA技術(shù)，通常也從血液和組織中純化這些蛋白質(zhì)，這是昂貴而費(fèi)時(shí)的方法，可能帶有傳播感染物質(zhì)如導(dǎo)致ADIS和肝炎的那些的風(fēng)險(xiǎn)。
盡管在細(xì)菌中表達(dá)DNA序列來生產(chǎn)所需的醫(yī)學(xué)上重要的蛋白質(zhì)看起來是有吸引力的提議，實(shí)際上通常證明細(xì)菌作為宿主不能令人滿意，因?yàn)橥庠吹鞍自诩?xì)菌細(xì)胞中不穩(wěn)定并且沒有得到正確地加工。
認(rèn)識(shí)到這個(gè)問題，已經(jīng)嘗試了在哺乳動(dòng)物組織培養(yǎng)物中表達(dá)所克隆的基因并已經(jīng)在一些情況下證明了是可行的策略。然而，動(dòng)物細(xì)胞的批量發(fā)酵是昂貴的且需要技術(shù)的過程。
因此存在對(duì)用于生產(chǎn)生物物質(zhì)如正確修飾的真核多肽的高產(chǎn)量，低成本方法的需要。在該方法中不存在對(duì)人感染性的物質(zhì)將是一個(gè)優(yōu)勢(shì)。
為了在奶中獲得大量的人蛋白質(zhì)，獲得所需基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物如牛的可能性已經(jīng)引起了工業(yè)的極大興趣。文獻(xiàn)中的幾個(gè)小組報(bào)道了生產(chǎn)人血清清蛋白、α抗胰蛋白酶的成功以及在轉(zhuǎn)基因牛或山羊中的一些其它實(shí)例。
之前已經(jīng)在小鼠或大鼠中進(jìn)行了許多實(shí)驗(yàn)，通常優(yōu)選將轉(zhuǎn)基因表達(dá)限制于乳腺中，因?yàn)槭褂忙吕业鞍谆蛉榍宓鞍讍?dòng)子，其只響應(yīng)哺乳期雌性中的乳腺轉(zhuǎn)錄因子。
異源蛋白專門在奶中的表達(dá)意欲避免對(duì)宿主動(dòng)物健康的不利影響并提供容易的純化方法。
目前人們致力于建立幾個(gè)系統(tǒng)來提高細(xì)胞轉(zhuǎn)染或選擇的產(chǎn)量，并選擇同源胎兒體細(xì)胞的來源來提高克隆動(dòng)物的存活和免疫狀況。
另一方面，出于農(nóng)業(yè)和生物藥物的目的，存在對(duì)體細(xì)胞核移植的巨大興趣，主要是使原種家畜的繁殖和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的工程化變成可能。簡(jiǎn)要地，核移植(NT)包括受體卵母細(xì)胞的去核，接著將供體細(xì)胞移植至受體胞質(zhì)體緊密并置的卵周隙中，并使它們?nèi)诤?。通過化學(xué)或物理激活來人工誘導(dǎo)發(fā)育。通過體細(xì)胞核移植來產(chǎn)生克隆的后代已經(jīng)在綿羊(Campbell，K.H.等，Nature 38064-66(1996)，1996；Wells，D.N.等，Biol Reprod 57385-393(1997)；Wilmut，I.等，Nature385810-813(1997))；山羊(Baguisi，A.等，Nat Biotechnol17456-461(1999))和牛(Cibelli，J.B.等，Science 280.1256-1258(19981)；Kato，Y.等，Science 2822095-2098(1998)；Wells，D.N.等，Reprod Fertil Dev 10369-378(1998))中獲得了成功。
存在幾個(gè)影響NT結(jié)果的因素，包括去核、融合、激活和供體-受體細(xì)胞周期同步性的方法。已經(jīng)獲得了受體卵母細(xì)胞去核的高效率，使用DNA特異性活體染料來顯現(xiàn)染色質(zhì)(Stice，S.L.和Keefer，C.L.，Biol Reprod 48715-719(1993)；Westhusin，M.E.等，J ReprodFertil 95475-480(1992))。供體細(xì)胞和受體卵母細(xì)胞的融合取決于脈沖場(chǎng)中細(xì)胞對(duì)準(zhǔn)的準(zhǔn)確度、供體細(xì)胞和受體卵母細(xì)胞的接觸和供體細(xì)胞的大小(Collas，P.等，AnalBiochem 2081-9(1993))。NT重建胚胎的激活已經(jīng)得到精心的改進(jìn)并且發(fā)育成胚泡的速度等于體外授精的卵母細(xì)胞(Liu，L等，Mol Reprod Dev 49298-307(1998))。
已經(jīng)實(shí)現(xiàn)NT胚胎的成功發(fā)育，使用成熟的卵母細(xì)胞(Willadsen，S.M.，Nature 32063-65(1986))、合子(McGrath，J.和Solter，D.，Dev Biol N Y 437-55(1985))和卵裂期的胚胎(Tsunoda，Y.等，JReprod Fertil 96275-281(1992))作為受體胞質(zhì)體；然而，這取決于供體核的來源。受體胞質(zhì)體和供體細(xì)胞之間的細(xì)胞周期的相容性是影響NT胚胎發(fā)育的一個(gè)重要因素。需要適當(dāng)?shù)耐交瘉肀３种亟ㄅ咛サ谋缎浴?br> 有絲分裂的細(xì)胞周期具有以下連續(xù)的期復(fù)制前間期(G1)、DNA合成(S)、有絲分裂前間期(G2)和有絲分裂(M)。在單個(gè)細(xì)胞周期過程中，在有絲分裂前所有基因組DNA復(fù)制一次。移植至去核成熟卵母細(xì)胞(中期II)中的間期供體核經(jīng)歷幾次形態(tài)改變。融合后，但在供體核包膜分解(NEBD)之前，染色體濃縮(PCC)。這些改變通過促成熟/有絲分裂/減數(shù)分裂因子(MPF)和有絲分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)的活性來誘導(dǎo)(Collas，P.和Robl，J.M.，Biol Reprod45455-465(1991))。在所有減數(shù)分裂和有絲分裂的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了MPF和MAPK活性且在中期最高，這些高含量在哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞中還誘導(dǎo)了停止于中期II。通過授精或用鈣離子載體激活來減少M(fèi)PF和MAPK是完成減數(shù)分裂、第二極體發(fā)射、精核解凝和前核形成的信號(hào)。
NEBD和PCC對(duì)供體染色質(zhì)的直接作用取決于移植時(shí)供體核的細(xì)胞周期。二倍體G0/G1核濃縮成單染色單體，但是四倍體G2核濃縮成雙染色單體。然而，S期的核在移植時(shí)顯示出特征性的“粉碎”外觀；PCC產(chǎn)生大范圍的DNA破壞。因此，可以在激活時(shí)或激活之前將G1或G0的核移植至中期II的卵母細(xì)胞中來產(chǎn)生正確的倍性。第二種方法是將核移植至之前激活的S期的卵母細(xì)胞中，這種情況中，可以使用G1、G0或S期的供體細(xì)胞。因?yàn)镸PF和MAPK是低的；染色質(zhì)解凝，并經(jīng)歷DNA復(fù)制沒有PCC和NEBD。
已經(jīng)在小鼠中報(bào)道了第三種同步化方案，其中通過胚胎重建來產(chǎn)生活的后代的發(fā)育，使用G2或中期供體細(xì)胞和去核的中期2卵母細(xì)胞(Cheong，H.T.等，Biol Reprod 48958-963(1993)；Kwon，O.Y.和Kono，T.，Proc Natl Acad Sci USA 9313010-13013(1996))。報(bào)道了從NT重建胚胎中極體的擠出，導(dǎo)致單個(gè)二倍體胚胎和二倍體極體(Kwon，O.Y.和Kono，T.，Proc Natl Acad Sci USA 9313010-13013(1996))。然而，沒有報(bào)道在牛、綿羊或豬中NT進(jìn)入去核MII卵母細(xì)胞后極體的形成，提示物種之間在完整紡錘體的力學(xué)控制形成和極體的擠出中的差異。
已經(jīng)提出供體細(xì)胞和受體細(xì)胞周期的階段對(duì)于為供體細(xì)胞核重編程度也是重要的。增加供體核移植和合子轉(zhuǎn)錄之間的時(shí)間可以促進(jìn)核重編程序。為此，幾位作者在融合后幾小時(shí)激活了卵母細(xì)胞(Cibelli，J.B.等，Science 2801256-1258(1998))；Wakayama，T.等，Nature394369-374(1998)；Wells，D.N.等，Biol Reprod 60996-1005(1999))。其它報(bào)道應(yīng)用了順序核移植(Stice，S.L.和Keefer，C.L.，Biol Reprod 48715-719(1993))。
增加供體核重編程序時(shí)間的未考察過的方法是在間期II之前通過核移植。在生發(fā)泡破裂(GVBD)后，通過卵母細(xì)胞胞質(zhì)MPF和MAPK的實(shí)質(zhì)性增加來調(diào)控所有的核事件，其防止了核被膜的重建和進(jìn)入S期直至授精或激活。因此，成熟卵母細(xì)胞可以是用于間期或G2供體細(xì)胞的通用受體。如果激活在細(xì)胞分裂之前誘導(dǎo)了S期，甚至G1或G0也可以用作供體細(xì)胞。
當(dāng)G2或M的卵裂球用作供體細(xì)胞時(shí)，核重編程序是可能的(Cheong，H.T.等，Biol Reprod 48958-963(1993)；Kwon，O.Y.和Kono，T.，Proc Natl Acad Sci USA 9313010-13013(1996)；Li ，L.等，Mol Reprod Dev 47255-264(1997))。一種解釋是作為染色體濃縮的結(jié)果置換了染色質(zhì)中的一些因子。實(shí)際上，對(duì)于核移植，已經(jīng)認(rèn)為NEBD和PCC是核重編程序的形態(tài)學(xué)征兆。此外，授精時(shí)精子染色質(zhì)極端濃縮，它的體積比體細(xì)胞核的體積小得多，且卵母細(xì)胞具有除去精核蛋白的能力。在精子-卵母細(xì)胞融合的過程中，卵母細(xì)胞染色體也被濃縮。可能是濃縮的染色質(zhì)構(gòu)象具有一些生物關(guān)聯(lián)。因而，通過中期核移植模擬這種情況，中期去核的受體可以提高NT結(jié)果。然而，少數(shù)研究者已經(jīng)在家畜中使用該方法并使用卵裂球作為供體細(xì)胞(Liu，L.，等，Mol Reprod Dev447255-264(1997))。
本發(fā)明的一個(gè)目的是表征現(xiàn)有的體細(xì)胞核移植并將其精心改進(jìn)成用于從成體供體細(xì)胞生產(chǎn)遺傳上相同的牛的可靠而經(jīng)濟(jì)的技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物，其特征在于在其奶中以意想不到的高水平產(chǎn)生重組生長(zhǎng)激素。重組生長(zhǎng)激素可以是，但不限于，人生長(zhǎng)激素。非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物可以是，但不限于，牛物種的動(dòng)物。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及提供目標(biāo)蛋白在哺乳動(dòng)物乳房細(xì)胞中表達(dá)的質(zhì)粒，其中表達(dá)受到β酪蛋白啟動(dòng)子的調(diào)控。目標(biāo)蛋白可以是，但不限于，人生長(zhǎng)激素。
本發(fā)明還涉及制造在其奶中產(chǎn)生重組生長(zhǎng)激素的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的不同方法。重組生長(zhǎng)激素可以是，但不限于，人生長(zhǎng)激素。非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物可以是，但不限于，牛物種的動(dòng)物。
本發(fā)明還涉及生產(chǎn)目標(biāo)蛋白的方法，包括制造在其奶中產(chǎn)生所述蛋白的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物，從所述非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物獲得所述奶并從奶中純化所述蛋白質(zhì)。目標(biāo)蛋白可以是，但不限于，人生長(zhǎng)激素。非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物可以是，但不限于，牛物種的動(dòng)物。
本發(fā)明還涉及從轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物奶中生產(chǎn)和純化重組生長(zhǎng)激素的方法。重組生長(zhǎng)激素可以是，但不限于，人成長(zhǎng)激素。非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物可以是，但不限于，牛物種的動(dòng)物。


圖1A-1B顯示了從轉(zhuǎn)基因奶牛收集的每日奶體積，該轉(zhuǎn)基因奶牛是通過融合去核的卵母細(xì)胞和之前用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞而獲得的，該質(zhì)粒含有編碼人生長(zhǎng)激素(hGH)的基因和指導(dǎo)其表達(dá)至乳房細(xì)胞的啟動(dòng)子。
圖2A-2C顯示了從相同轉(zhuǎn)基因奶牛收集的奶中發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌計(jì)數(shù)。
圖3A-3B顯示了在相同轉(zhuǎn)基因奶牛的奶中含有的hGH的生物活性。
圖4A顯示了在相同轉(zhuǎn)基因奶牛的奶中產(chǎn)生的hGH的每日質(zhì)量。該量值和從轉(zhuǎn)基因奶牛收集的每日奶體積一起作圖表示圖4B中。
圖5A顯示了在相同轉(zhuǎn)基因奶牛的血清中的hGH和胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF-1)的濃度，和在相同轉(zhuǎn)基因奶牛的奶中產(chǎn)生的hGH的每日質(zhì)量。將轉(zhuǎn)基因奶牛的血清中的hGH濃度和轉(zhuǎn)基因奶牛的奶中產(chǎn)生的hGH的每日質(zhì)量一起作圖表示于圖5B中。在圖5C中，將轉(zhuǎn)基因奶牛的hGH和IGF-1血清濃度的時(shí)間特征一起作圖。
圖6A和6B顯示了在通過在其奶中產(chǎn)生hGH的轉(zhuǎn)基因奶牛的亞克隆而獲得的兩個(gè)轉(zhuǎn)基因小牛中hGH和胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF-1)的血清濃度。在圖6C和6D中，對(duì)這些轉(zhuǎn)基因小牛中每個(gè)的hGH和IGF-1血清濃度的時(shí)間特征一起作圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物，其特征在于在其奶中以意想不到的高水平產(chǎn)生重組生長(zhǎng)激素。該哺乳動(dòng)物可以是，但不限于，牛物種的動(dòng)物。轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的其它物種可以是，但不限于，豬物種、綿羊物種、山羊物種或嚙齒動(dòng)物物種。
重組生長(zhǎng)激素可以是，但不限于，人生長(zhǎng)激素。該分子，也稱為促生長(zhǎng)素，是由191個(gè)氨基酸構(gòu)成的蛋白質(zhì)，具有約22kD的分子量。它對(duì)于線性生長(zhǎng)是必要的且其應(yīng)用得到了很好地建立。
本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其特征在于為了產(chǎn)生更多的含有所述激素的奶在其奶中產(chǎn)生的重組生長(zhǎng)激素自我刺激了動(dòng)物乳腺的事實(shí)。
本發(fā)明還涉及質(zhì)粒，該質(zhì)粒包含可操作地連接于β酪蛋白啟動(dòng)子和β內(nèi)酰胺酶基因的編碼目標(biāo)蛋白的基因。該目標(biāo)蛋白可以是，但不限于，人生長(zhǎng)激素。該質(zhì)?？梢允莗RβhGH。
進(jìn)一步的實(shí)施方案中，質(zhì)粒另外包括新霉素抗性基因用于遺傳霉素抗性細(xì)胞的選擇。這樣質(zhì)粒的實(shí)例是pRNeo。
進(jìn)一步的實(shí)施方案中，質(zhì)粒包括編碼綠色熒光蛋白如GFP的基因，其在巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子的控制下。這樣質(zhì)粒的實(shí)例是pRNeoGreen。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及質(zhì)粒如上述的那些，其已經(jīng)通過限制酶消化而線性化。尤其是，使用限制酶ApaLI并切除β內(nèi)酰胺酶基因。
根據(jù)布達(dá)佩斯條約正在進(jìn)行上述質(zhì)粒的保藏程序。保藏單位的名稱和地址是DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH(德國(guó)微生物保藏中心)，Mas cheroder Weg 1b，38124Braunschweig，德國(guó)。在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候?qū)⑻峁┫鄳?yīng)的保藏號(hào)。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及基于含有Neo抗性基因的質(zhì)粒而構(gòu)建的質(zhì)粒，其中在hGH編碼區(qū)上游插入了修飾的較短的β酪蛋白啟動(dòng)子區(qū)，如pVEβcashGH。通過切除β內(nèi)酰胺酶基因可以從質(zhì)粒pVE βcashGH獲得線性片段。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的方法，使用用于脂質(zhì)體應(yīng)用的陽離子脂質(zhì)的組合。
還描述了在合適培養(yǎng)基中選擇新霉素抗性細(xì)胞的方法，如選擇綠色熒光轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的方法。小心地挑選這些細(xì)胞，使得避免細(xì)胞損傷。
本發(fā)明還涉及將停止于G0或細(xì)胞周期不同時(shí)間的細(xì)胞核移植至去核牛卵母細(xì)胞中的方法。
本發(fā)明涉及將轉(zhuǎn)基因胚胎移植至激素刺激的奶牛子宮中的方法。
根據(jù)本發(fā)明，公開了測(cè)定動(dòng)物健康參數(shù)的方法。為了測(cè)定這些參數(shù)，對(duì)動(dòng)物的血清和奶兩者進(jìn)行了分析。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及制造非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的方法，包括獲得編碼生長(zhǎng)激素的基因，將基因克隆進(jìn)質(zhì)粒中，借此將基因可操作地連接至指導(dǎo)基因在乳房細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子，形成表達(dá)質(zhì)粒，用該表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體細(xì)胞使得質(zhì)粒摻入到細(xì)胞的基因組中，形成轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞，將成熟卵母細(xì)胞去核，形成去核的卵母細(xì)胞，將一個(gè)轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞與去核的卵母細(xì)胞融合形成單細(xì)胞胚胎，將胚胎植入受體哺乳動(dòng)物的子宮中，并監(jiān)控懷孕直至轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的出生。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及制造非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的方法，包括從雌性哺乳動(dòng)物中提取體細(xì)胞，任選地為成纖維細(xì)胞，該哺乳動(dòng)物是轉(zhuǎn)基因的以在其奶中產(chǎn)生重組生長(zhǎng)激素，將成熟卵母細(xì)胞去核，形成去核的卵母細(xì)胞，將一個(gè)轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞與去核的卵母細(xì)胞融合形成單細(xì)胞胚胎，將胚胎植入受體哺乳動(dòng)物的子宮中，并監(jiān)控懷孕直至轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的出生。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及制造非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的方法，包括使雌性非人哺乳動(dòng)物超排卵，該哺乳動(dòng)物是轉(zhuǎn)基因的以在其奶中產(chǎn)生重組生長(zhǎng)激素，將該哺乳動(dòng)物用從雄性非人非轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物獲得的精子人工授精來產(chǎn)生胚胎，收集胚胎，將胚胎植入受體哺乳動(dòng)物的子宮中，并監(jiān)控懷孕直至轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的出生。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及制造非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的方法，包括使雌性非人哺乳動(dòng)物超排卵，該哺乳動(dòng)物是轉(zhuǎn)基因的以在其奶中產(chǎn)生重組生長(zhǎng)激素，將該哺乳動(dòng)物用從雄性非人哺乳動(dòng)物獲得的精子人工授精來產(chǎn)生胚胎，從中獲得精子的哺乳動(dòng)物是轉(zhuǎn)基因的以產(chǎn)生重組生長(zhǎng)激素，收集胚胎，將胚胎植入受體哺乳動(dòng)物的子宮中，并監(jiān)控懷孕直至轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的出生。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及制造非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的方法，包括使雌性非人非轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物超排卵，將該哺乳動(dòng)物用從雄性非人哺乳動(dòng)物獲得的精子人工授精來產(chǎn)生胚胎，從中獲得精子的哺乳動(dòng)物是轉(zhuǎn)基因的以產(chǎn)生重組生長(zhǎng)激素，收集胚胎，將胚胎植入受體哺乳動(dòng)物的子宮中，并監(jiān)控懷孕直至轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的出生。
重組生長(zhǎng)激素可以是，但不限于，人生長(zhǎng)激素。非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物可以是，但不限于，牛物種的動(dòng)物。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，包括制造在其奶中以意想不到的高產(chǎn)量產(chǎn)生目標(biāo)蛋白的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物，從該非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物獲得奶，并從奶中純化目標(biāo)蛋白。
本發(fā)明還涉及在非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物中生產(chǎn)目標(biāo)蛋白的方法，該哺乳動(dòng)物是通過包括以下步驟的方法制得的獲得編碼所述目標(biāo)蛋白的基因，將基因克隆進(jìn)質(zhì)粒中，借此將基因可操作地連接至指導(dǎo)基因在乳房細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子，形成表達(dá)質(zhì)粒，用表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體細(xì)胞，任選地為成纖維細(xì)胞，使得質(zhì)粒摻入到所述體細(xì)胞的基因組中，形成轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞，將成熟卵母細(xì)胞去核，形成去核的卵母細(xì)胞，將一個(gè)轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞與去核的卵母細(xì)胞融合形成單細(xì)胞胚胎，將胚胎植入受體哺乳動(dòng)物的子宮中，并監(jiān)控懷孕直至轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的出生。
本發(fā)明還涉及在非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物中生產(chǎn)目標(biāo)蛋白的方法，該哺乳動(dòng)物通過包括以下步驟的方法制得從雌性哺乳動(dòng)物提取體細(xì)胞，任選地為成纖維細(xì)胞，該哺乳動(dòng)物是轉(zhuǎn)基因的以在其奶中產(chǎn)生，將成熟的卵母細(xì)胞去核，形成去核的卵母細(xì)胞，將一個(gè)轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞與去核的卵母細(xì)胞融合形成單細(xì)胞胚胎，將胚胎植入受體哺乳動(dòng)物的子宮中，并監(jiān)控懷孕直至轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的出生。
本發(fā)明還涉及在非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物中生產(chǎn)目標(biāo)蛋白的方法，該哺乳動(dòng)物通過包括以下步驟的方法制得使雌性非人哺乳動(dòng)物超排卵，該哺乳動(dòng)物是轉(zhuǎn)基因的以在其奶中產(chǎn)生所述的目標(biāo)蛋白，將該哺乳動(dòng)物用從雄性非人非轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物獲得的精子人工授精來產(chǎn)生胚胎，收集胚胎，將胚胎植入受體哺乳動(dòng)物的子宮中，并監(jiān)控懷孕直至轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的出生。
本發(fā)明還涉及在非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物中生產(chǎn)目標(biāo)蛋白的方法，該哺乳動(dòng)物通過包括以下步驟的方法制得使雌性非人哺乳動(dòng)物超排卵，該哺乳動(dòng)物是轉(zhuǎn)基因的以在其奶中產(chǎn)生所述的目標(biāo)蛋白，將該哺乳動(dòng)物用從雄性非人哺乳動(dòng)物獲得的精子人工授精來產(chǎn)生胚胎，從中獲得精子的哺乳動(dòng)物是轉(zhuǎn)基因的以產(chǎn)生所述的目標(biāo)蛋白，收集胚胎，將胚胎植入受體哺乳動(dòng)物的子宮中，并監(jiān)控懷孕直至轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的出生。
本發(fā)明還涉及在非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物中生產(chǎn)目標(biāo)蛋白的方法，該哺乳動(dòng)物通過包括以下步驟的方法制得使雌性非人非轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物超排卵，將該哺乳動(dòng)物用從雄性非人哺乳動(dòng)物獲得的精子人工授精來產(chǎn)生胚胎，從中獲得精子的哺乳動(dòng)物是轉(zhuǎn)基因的以產(chǎn)生所述的目標(biāo)蛋白，收集胚胎，將胚胎植入受體哺乳動(dòng)物的子宮中，并監(jiān)控懷孕直至轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的出生。
其特征在于在其奶中以意想不到的高水平產(chǎn)生目標(biāo)蛋白的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物可以是，但不限于，牛物種的動(dòng)物。轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的其它物種可以是，但不限于，豬物種、綿羊物種、山羊物種或嚙齒動(dòng)物動(dòng)物。目標(biāo)蛋白可以是，但不限于，人生長(zhǎng)激素。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及在其奶中產(chǎn)生重組人生長(zhǎng)激素的牛物種的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物，它的基因組包含整合的質(zhì)粒，所述的質(zhì)粒包含人生長(zhǎng)激素基因和指導(dǎo)所述基因在哺乳動(dòng)物的乳房細(xì)胞中表達(dá)的β酪蛋白啟動(dòng)子。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及以意想不到的高水平產(chǎn)生hGH的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物，但沒有顯示以這樣高水平的hGH產(chǎn)生所期望的自然生長(zhǎng)。由于轉(zhuǎn)基因牛受到人生長(zhǎng)激素存在的影響，預(yù)期動(dòng)物生長(zhǎng)將超過非轉(zhuǎn)基因的生長(zhǎng)速率，并患病如糖尿病、高血壓、心血管疾病提高的風(fēng)險(xiǎn)和身體器官的擴(kuò)大，包括肝臟、脾臟、腎臟和心臟。理論上，這樣高含量的hGH應(yīng)使得動(dòng)物不能存活。然而，情況并非如此。哺乳動(dòng)物，如奶牛，在其血液中含有令人擔(dān)憂的高水平的外源激素，但是其完全健康并產(chǎn)生顯著的重組蛋白生產(chǎn)力，構(gòu)成意想不到的和創(chuàng)新的貢獻(xiàn)。
本發(fā)明的重組人生長(zhǎng)激素以意想不到的高水平產(chǎn)生。所產(chǎn)生的人生長(zhǎng)激素的含量高于約1.0g/L奶。hGH的含量可以高于約2.0g/L奶。所產(chǎn)生的hGH的含量還可以高于約3.0g/L奶。另一實(shí)施方案中，所產(chǎn)生的hGH的含量可以高于約4.0g/L奶。仍然另一實(shí)施方案中，所產(chǎn)生的hGH含量可以高于約5.0g/L奶。進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所產(chǎn)生的hGH含量可以高于約6.0g/L奶。仍然進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所產(chǎn)生的hGH含量為約1.0g/L奶至約7.0g/L奶。進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所產(chǎn)生的hGH含量為約2.0g/L奶至約6.0g/L奶。仍然另一實(shí)施方案中，所產(chǎn)生的hGH含量為約2.0g/L奶至約5.0g/L奶。
此外，本發(fā)明涉及從轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的奶中純化重組生長(zhǎng)激素的方法，以及所述激素的測(cè)定法。純化方法可以包括色譜和濃縮步驟。可以使用不同類型的色譜，包括離子交換色譜、反相色譜、分子排阻色譜或親和色譜。離子交換色譜可以是陰離子交換色譜。親和色譜可以是免疫親和色譜。此外，可以進(jìn)行多個(gè)色譜步驟。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及從產(chǎn)生重組生長(zhǎng)激素的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的奶中純化重組生長(zhǎng)激素的方法，包括將非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的奶澄清，得到澄清的奶，并對(duì)澄清的奶進(jìn)行色譜，得到純化的重組生長(zhǎng)激素。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及從產(chǎn)生重組生長(zhǎng)激素的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的奶中純化重組生長(zhǎng)激素的方法，包括將非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的奶澄清，得到澄清的奶，并對(duì)澄清的奶進(jìn)行膨脹床陰離子交換色譜，得到陰離子交換色譜過的物料，對(duì)陰離子交換色譜過的物料進(jìn)行反相色譜，得到反相色譜過的物料，對(duì)反相色譜過的物料進(jìn)行陰離子交換色譜，得到陰離子交換色譜過的物料，對(duì)陰離子色譜交換過的物料進(jìn)行分子排阻色譜，得到分子排阻色譜過的物料，將分子排阻色譜過的物料濃縮，得到濃縮的物料，并對(duì)濃縮的物料進(jìn)行分子排阻色譜，得到純的重組生長(zhǎng)激素。
本發(fā)明還涉及從產(chǎn)生重組生長(zhǎng)激素的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的奶中純化重組生長(zhǎng)激素的方法，包括將非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的奶澄清，得到澄清的奶，并對(duì)澄清的奶進(jìn)行免疫親和色譜，得到免疫親和色譜過的物料，對(duì)免疫親和色譜過的物料進(jìn)行反相色譜，得到反相色譜過的物料，對(duì)反相色譜過的原料進(jìn)行陰離子交換色譜，得到陰離子交換色譜過的物料，對(duì)陰離子交換色譜過的物料進(jìn)行分子排阻色譜，得到分子排阻色譜過的物料，對(duì)分子排阻色譜過的物料進(jìn)行濃縮，得到濃縮的物料，并對(duì)濃縮的物料進(jìn)行分子排阻色譜，得到純的重組生長(zhǎng)激素。
上述純化方法的重組生長(zhǎng)激素可以是，但不限于，人生長(zhǎng)激素。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以是，但不限于，牛物種的哺乳動(dòng)物。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例是本發(fā)明方法和組合物的說明，而不是限制。在化學(xué)物質(zhì)的酶生產(chǎn)和蛋白質(zhì)純化方法中通常遇到的各種條件和參數(shù)的其它合適的本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的修改和改進(jìn)在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)。
實(shí)施例1表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建我們生產(chǎn)了帶有大部分牛β酪蛋白基因啟動(dòng)子的構(gòu)建體，包括5’-非編碼β酪蛋白基因區(qū)的短片段，與人生長(zhǎng)激素基因的編碼序列融合。不同構(gòu)建體中所用的β酪蛋白區(qū)從3.8kbp減小至約1.3kbp。根據(jù)是否包括內(nèi)在的poly A信號(hào)，hGH基因包括約2至2.2kbp。
在pUC或pBS類型的通常的克隆載體的多接頭中容納表達(dá)盒。
該啟動(dòng)子確?；虻慕M織特異性和發(fā)育可調(diào)型表達(dá)在其控制下，如β酪蛋白，和這種情況中的異源hGH。
最具代表性的質(zhì)粒是pR βhGH，其攜帶全長(zhǎng)牛β酪蛋白啟動(dòng)子，與人生長(zhǎng)激素基因的編碼序列融合。
公開的其它構(gòu)建體主要源自如所述的原始的構(gòu)建體，來提高轉(zhuǎn)染細(xì)胞的選擇或DNA進(jìn)入牛細(xì)胞基因組的整合效率。
第一階段中，用含有遺傳霉素抗性基因的質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染來幫助選擇，但是接著，使用其它構(gòu)建體，在含有hGH表達(dá)盒的相同載體中帶有用于新霉素抗性的NPT基因。這樣質(zhì)粒的實(shí)例是pRNeo。
獲得用于組成型表達(dá)綠色熒光蛋白的另一種質(zhì)粒，其包括CMV啟動(dòng)子，植物來源(苜蓿)的增強(qiáng)子和來自水母A.victoria的綠色熒光蛋白基因。這樣質(zhì)粒的實(shí)例是pRNeoGreen。
此外，生產(chǎn)了另一種質(zhì)粒。這是基于含有Neo抗性基因的質(zhì)粒來構(gòu)建的，其中在hGH編碼區(qū)上游插入了修飾的較短的β酪蛋白啟動(dòng)子區(qū)。該質(zhì)粒是pVE βcashGH。
生產(chǎn)了其它構(gòu)建體，其中通過ApaLI限制酶切除了β內(nèi)酰胺酶區(qū)，并在瓊脂糖凝膠電泳和凝膠提取后純化含有完整表達(dá)盒的線性片段。
通過限制酶和DNA測(cè)序來分析構(gòu)建體，并預(yù)先在乳腺細(xì)胞系中通過熒光抗體識(shí)別測(cè)試它們進(jìn)行hGH表達(dá)的能力。
將作為涉及遺傳構(gòu)建體這部分的實(shí)例來詳細(xì)描述質(zhì)粒pVEβcashGH的制備。
pVE βcashGH的制備該構(gòu)建體的目的是提供β酪蛋白啟動(dòng)子區(qū)的最小延伸以指導(dǎo)下游立即融合的hGH基因，與其在宿主生物中的polyA信號(hào)一起的特定可調(diào)型轉(zhuǎn)錄。
使用pVEX作為原始載體允許使用通過已經(jīng)存在于該質(zhì)粒中的t k啟動(dòng)子調(diào)控的新霉素抗性基因。通過用StuI和NdeI限制來消除包括554bp的早期SV40啟動(dòng)子，最后的位點(diǎn)用Klenow填補(bǔ)，且自我連接所得到的載體。
PCR擴(kuò)增來自3.8kbp原始基因啟動(dòng)子區(qū)的1.3kbp片段后獲得了β酪蛋白短的啟動(dòng)子，使用以下寡聚物作為引物PB1 5’TCTACTCGAGGATCATCTATCTGTCCCAAAG(SEQ ID NO1)和PB2 5’CTAGGATCCAATGATCTGATTTTGTGG(SEQ ID NO2)該片段包括1230bp的規(guī)范啟動(dòng)子加49bp的β酪蛋白基因的第一個(gè)非編碼外顯子。
通過PCR技術(shù)獲得了hGH基因片段，基于原始的?；蚪MhGH克隆，使用以下的寡聚物作為引物PB4 5’CTAGGATCCATGGCTACAGGTAAGCGCC(SEQ ID NO3)和GHTE 5’ATGCTGTGTCTGGACGTCCT(SEQ ID NO4)。
用Klenow酶將β酪蛋白啟動(dòng)子片段平截并插入pVEX的BamH I填補(bǔ)的位點(diǎn)。選擇重組克隆后，我們選擇適于使用位于pVEX下游的唯一HindIII位點(diǎn)的特定方向來插入hGH編碼區(qū)。
為此，將hGH片段也平截了并填補(bǔ)了質(zhì)粒HindIII位點(diǎn)。選擇含有β酪蛋白啟動(dòng)子和恰當(dāng)融合的hGH的克隆使得只在該啟動(dòng)子的控制下表達(dá)hGH。
該質(zhì)粒的大小約為8.5kbp。
體細(xì)胞的轉(zhuǎn)染然后將質(zhì)粒pR βhGH(與另一帶有遺傳霉素抗性基因的質(zhì)粒一起)、pRNeo、pRNeoGreen或pVE βcashGH用于轉(zhuǎn)染體細(xì)胞的初級(jí)培養(yǎng)物，使用磷酸鈣或脂質(zhì)體方法。通常使用胎牛成纖維細(xì)胞來待轉(zhuǎn)染。
將遺傳霉素加入培養(yǎng)物中來選擇轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。2至8周后，對(duì)遺傳霉素具有抗性的細(xì)胞適于用作供體細(xì)胞來獲得轉(zhuǎn)基因克隆。通過PCR分析轉(zhuǎn)染的所選擇的細(xì)胞含有表達(dá)盒，以確保合適的核移植來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚胎。
實(shí)施例2卵母細(xì)胞的去核和成熟去核卵母細(xì)胞中的中期核移植牛卵母細(xì)胞的收集和體外成熟從屠宰場(chǎng)卵巢中吸出牛的卵母細(xì)胞并在TCM-199+5％FCS中于39℃成熟24小時(shí)。在使用前用CO2平衡成熟培養(yǎng)基至少2小時(shí)。在含有1mg/ml牛睪丸透明質(zhì)酸酶的溫?zé)酺L-HEPES中渦旋2分鐘使成熟的卵母細(xì)胞裸露。
使用卵丘細(xì)胞進(jìn)行核移植去核使用Narishige液壓顯微操作器和Nikon Diaphot顯微鏡將卵母細(xì)胞機(jī)械去核。用20μm斜角的和削尖的吸管進(jìn)行去核。之前用5μg/ml的bisbenzimidine(Hoechst 333421)染料將卵母細(xì)胞染色20分鐘。在紫外線下通過觀察被染色的染色體將中期去核。在吸管之內(nèi)抽吸后評(píng)估中期染色體。將轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞移植至卵周隙中并嚴(yán)格地與去核的卵母細(xì)胞相對(duì)。
融合將轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞和去核的卵母細(xì)胞在融合室中人工對(duì)準(zhǔn)使得待融合的膜平行于電極。使用玻璃的胚胎操作吸管來進(jìn)行。
通過電方式進(jìn)行融合使用180伏特/cm的一個(gè)電脈沖進(jìn)行融合15μs(BTX ElectroCell Manipulator 200)2并用BTX Optimizer-Graphic Pulse Analyzer來監(jiān)控。用于脈沖胚胎的室由相隔0.5mm放置于玻璃的顯微鏡載玻片上的兩個(gè)0.5mm的不銹鋼絲電極組成。監(jiān)控假定合子的融合、溶胞和斷裂。
發(fā)育能力的評(píng)估在授精后48小時(shí)評(píng)價(jià)合子的斷裂并在7至9天后評(píng)價(jià)發(fā)育成桑椹胚或胚泡。
1Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA2BTX Inc.，San Diego，Ca，USA實(shí)施例3細(xì)胞和胚胎培養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)中測(cè)試不同的供體細(xì)胞、培養(yǎng)系統(tǒng)和卵母細(xì)胞受體處理，目的在于簡(jiǎn)化牛克隆程序中的方法并提高胚胎的存活率。當(dāng)成體成纖維細(xì)胞用作供體細(xì)胞時(shí)，使用了重建胚胎的三種培養(yǎng)系統(tǒng)TCM-199+5％FCS，Menezo+5％FCS(兩者都含有VERO細(xì)胞作為共培養(yǎng)物)和無共培養(yǎng)物但是具有較低O2濃度的SOF。當(dāng)供體細(xì)胞是遺傳上和非遺傳上修飾的胎兒成纖維細(xì)胞時(shí)，也將SOF培養(yǎng)基用于培養(yǎng)重建的胚胎。最后，當(dāng)遺傳上修飾的胎兒成纖維細(xì)胞用作供體細(xì)胞時(shí)，之前用roscovitine(R)處理受體卵母細(xì)胞來中止減數(shù)分裂并最佳化受體的適用性。從屠宰場(chǎng)卵巢中吸出卵母細(xì)胞并在TCM-199+5％FCS中于39℃成熟24小時(shí)。對(duì)于R處理的組，在成熟之前，在TCM-199+5％FCS中將卵母細(xì)胞與25μM R在39℃溫育24小時(shí)。在含有1mg/ml牛睪丸透明質(zhì)酸的TL HEPES中渦旋3分鐘使成熟的卵母細(xì)胞裸露。評(píng)估中期并在紫外線下(＜6秒)通過用Hoechst 33342(5μg/ml)觀察將卵母細(xì)胞去核。將來自Augus公牛的成體成纖維細(xì)胞和來自45天大的Jersey雌性胎兒的胎兒成纖維細(xì)胞用作供體細(xì)胞。使用脂質(zhì)體進(jìn)行用含有新霉素抗性基因的構(gòu)建體的轉(zhuǎn)染。用遺傳霉素選擇10-15天后，通過電脈沖將G0/G1期的供體細(xì)胞與去核的卵母細(xì)胞融合。3小時(shí)后，通過在TL-HEPES中與5μM離子霉素孵育4分鐘和與2mM 6-DMAP孵育3小時(shí)來誘導(dǎo)激活。然后用TL-HEPES 洗滌卵母細(xì)胞并在TCM-199+5％FCS+10g/l清蛋白中或在Menezo+2％FCS中(兩者都含有VERO細(xì)胞)，或在SOF培養(yǎng)基和5％CO2+5％O2+90％N2中共培養(yǎng)。通常，每個(gè)受體奶牛非外科手術(shù)地移植兩個(gè)胚泡，并通過超聲波在30-35天測(cè)定懷孕。記錄卵裂(48小時(shí))、發(fā)育成胚泡(第7至9天)并通過Chi-square來分析。在SOF中培養(yǎng)胚胎時(shí)，卵裂率和發(fā)育成胚泡較高。然而，沒有觀察到由于不同培養(yǎng)條件或供體細(xì)胞來源的懷孕率的差異。中止減數(shù)分裂成熟24小時(shí)沒有損害受體卵母細(xì)胞的發(fā)育能力。因此，用roscovitine處理可以用于提高NT方法中的卵母細(xì)胞的有效性。參見以下的表1。
表1

欄中具有不同上標(biāo)的百分?jǐn)?shù)是有差異的(P＜0.05)。
使植入的奶牛正常通過懷孕直至自然分娩。最后，chirurgic方法(Caesarea)可以用于分娩。在頭48小時(shí)期間給新生兒喂養(yǎng)富含Ig的初乳，然后使用合成的，之后天然的食物(所有都不含動(dòng)物來源的化合物)。
實(shí)施例4對(duì)轉(zhuǎn)基因小牛和所產(chǎn)生的重組蛋白進(jìn)行的測(cè)試該實(shí)施例中，我們呈現(xiàn)了對(duì)特定的轉(zhuǎn)基因小牛及其產(chǎn)生的重組蛋白所進(jìn)行測(cè)試的完整描述，該轉(zhuǎn)基因小牛是作為實(shí)施例1至3中所述方法的結(jié)果而獲得的。盡管如此，尚須清楚的是對(duì)作為其它獲得轉(zhuǎn)基因小牛方法，如以下實(shí)施例5和6中所述的那些方法的結(jié)果而出生的動(dòng)物進(jìn)行了同一套的測(cè)定。
通過對(duì)從小牛白細(xì)胞中純化得到的DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，使用非轉(zhuǎn)基因jersey小牛的DNA作為負(fù)對(duì)照，證明了在轉(zhuǎn)基因小牛細(xì)胞的基因組中包括牛β酪蛋白啟動(dòng)子和hGH編碼基因?？梢宰鳛椴煌趧?dòng)物的同源β酪蛋白基因的單一DNA片段一起發(fā)現(xiàn)它們。
使用Pharmacia自動(dòng)測(cè)序儀，證實(shí)了插入的基因序列100％對(duì)應(yīng)于hGH編碼基因。其包括內(nèi)含子、分泌信號(hào)和終止子。將控制在我們的小牛中相同hGH基因表達(dá)的牛β酪蛋白啟動(dòng)子也進(jìn)行了測(cè)序。所有那些元件與其預(yù)期的理論序列精確地一致，該理論序列來自用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的遺傳構(gòu)建體，從該細(xì)胞產(chǎn)生了克隆。
一旦已知該實(shí)驗(yàn)遺傳階段的正確性，我們便轉(zhuǎn)向證明所產(chǎn)生的重組蛋白是所期望的并在每一個(gè)物理和化學(xué)特性方面都與天然hGH相一致。
為此，我們不得不從小牛獲得奶，由于當(dāng)動(dòng)物處于產(chǎn)奶時(shí)間時(shí)，β酪蛋白啟動(dòng)子使得重組蛋白只在乳腺中表達(dá)。
然后通過激素處理來誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因小牛使其到滿十個(gè)月時(shí)產(chǎn)奶。到那個(gè)時(shí)間小牛稱重為240kg(約530lbs)。
所述處理的第一階段包括通過皮下途徑，聯(lián)合給予雌激素(雌二醇苯甲酸酯，Histeren，Instituto Rosenbusch)和孕激素(甲孕酮醋酸酯，Pronal，Aton)，包括5次連續(xù)應(yīng)用每種藥物，劑量分別為0.1mg/kg和0.25mg/kg，每48小時(shí)(即，第1、3、5、7和9天，假定處理開始于第一天)。
第二個(gè)階段包括通過皮下途徑，給予地塞米松(Decadron，Sidus)和催產(chǎn)素(Orasthin，Hoechst Marion Roussel)；將總量為20mg的前者在第18至20天的時(shí)間段內(nèi)進(jìn)行注射(每天為所述總量的三分之一)，而在第21至23天應(yīng)用三次50IU的后者。
上述信息總結(jié)于表2中表2

*每天給予總量(20mg)的約三分之一如所期望的，在處理結(jié)束后奶牛開始產(chǎn)生初乳，然后所產(chǎn)生流體的品質(zhì)逐漸變成奶。將收集的流體適當(dāng)?shù)乇４娌氐椎胤治觥?br> 對(duì)初乳和奶(為了簡(jiǎn)化，初乳和奶在下文中都稱為“奶”，除了當(dāng)應(yīng)該進(jìn)行區(qū)分時(shí))進(jìn)行了幾個(gè)測(cè)試，其結(jié)果顯示于圖1-4中。首先，測(cè)量所收集奶的體積。開始的奶生產(chǎn)力(頭五個(gè)泌乳日)約為1，650mL/天。在第一個(gè)產(chǎn)奶月中，每天進(jìn)行兩次手工擠奶，一次在上午，一次在下午(可以注意每個(gè)乳房對(duì)終體積的貢獻(xiàn))；而從第二個(gè)月起，因?yàn)槟痰漠a(chǎn)生開始增加，每天進(jìn)行三次擠奶(在上午、中午和下午)。每天的體積以或多或少的連續(xù)方式增加，直至頭次擠奶后三個(gè)月達(dá)到接近于10,000mL。在每日奶體積對(duì)日期的曲線(圖1B)中可以觀察到關(guān)于該主題的詳細(xì)信息(圖1A)。
與奶體積的測(cè)量平行，對(duì)奶進(jìn)行了微生物學(xué)測(cè)定，其結(jié)果(圖2A)顯示于每ml CFU(菌落形成單位)對(duì)日期的相應(yīng)曲線中(圖2B-2C)。
還通過在NB2細(xì)胞培養(yǎng)物中的體外生物活性測(cè)定評(píng)估了(hGH的)生物活性(圖3A-3B)。證明了小母牛的奶中產(chǎn)生的重組hGH的生物活性在母親的誤差等級(jí)內(nèi)，處于人天然hGH的正常值。此外，通過蛋白質(zhì)印跡研究了所獲得的奶，檢測(cè)了其中主要的條帶，對(duì)應(yīng)于完整hGH。還發(fā)現(xiàn)了對(duì)應(yīng)于斷裂變體和聚集體的其它次要條帶，如在這些生產(chǎn)系統(tǒng)中所預(yù)期的。
利用關(guān)于生物活性和每日體積的信息，可以使用公式1來計(jì)算hGH的日產(chǎn)量，其中mhGH是以毫克計(jì)的每日產(chǎn)生的hGH質(zhì)量；BA，以國(guó)際單位表示的生物活性；SA，hGH的比活性(3IU/mg)；和V，每日收集奶的體積。數(shù)據(jù)顯示于圖4A中。hGH每日質(zhì)量的曲線顯示于圖4B中。為了建立hGH每日質(zhì)量和每日奶體積之間的直觀關(guān)聯(lián)，也將后者作圖表示于圖4B中。
mhGH=BASA×V]]>(公式1)可以從該信息觀察到，奶中hGH的每日質(zhì)量和每日奶體積隨著奶牛的發(fā)育趨于增加(盡管，前者以更大的比例)，其構(gòu)成重組激素生產(chǎn)力(每升奶中的hGH克數(shù))的上升趨勢(shì)。可以注意到該生產(chǎn)力從產(chǎn)物是初乳時(shí)的約每升2g hGH(頭次擠奶)至從第二個(gè)泌乳月起的每升奶5g hGH的平均量。因此，隨著生產(chǎn)力的提高獲得了意想不到高產(chǎn)量的人生長(zhǎng)激素，隨著流體的品質(zhì)從初乳變成奶以或多或少連續(xù)的方式。
盡管目前每天產(chǎn)生的hGH質(zhì)量是相當(dāng)顯著的，但是應(yīng)該注意到，因?yàn)槟膛＿€沒有完全生長(zhǎng)，每天產(chǎn)生的重組蛋白的質(zhì)量上升趨勢(shì)應(yīng)該會(huì)在將來持續(xù)，直至達(dá)到最大值。
對(duì)奶進(jìn)行測(cè)試的同時(shí)，對(duì)奶牛的血清進(jìn)行了一套不同的測(cè)定，其結(jié)果顯示于圖5A-5C中。首先，進(jìn)行奶牛血清中hGH濃度的測(cè)量。將結(jié)果(圖5A)與奶中hGH的每日質(zhì)量一起作曲線于圖中，使得可以比較兩個(gè)量值(圖5B)。
(人)血清中GH的參考范圍是0.06-5ng/ml。假定對(duì)于牛是假設(shè)的相似范圍，可以注意到，除了開始時(shí)，轉(zhuǎn)基因奶牛血清中hGH對(duì)日期的整個(gè)曲線完全超過所述范圍的上限。盡管該事實(shí)，必須考慮盡管對(duì)于它們的氨基酸序列和3D-結(jié)構(gòu)，hGH和相應(yīng)的牛激素(bGH)非常相似，前者，盡管是完全功能性的，但在牛中不是完全活性的。
因此，為了評(píng)估由于在其血清中這些高含量的hGH對(duì)奶牛健康的潛在風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)進(jìn)行了IGF-1(胰島素樣生長(zhǎng)因子1，也稱為促生長(zhǎng)因子C)血清濃度的測(cè)量(圖5A)。生長(zhǎng)激素主要通過在肝臟中形成的IGF-1執(zhí)行其功能。因?yàn)镮GF-1介導(dǎo)許多體內(nèi)細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)激素的代謝作用，所以IGF-1評(píng)估對(duì)于可疑的生長(zhǎng)激素失調(diào)的間接評(píng)價(jià)是有價(jià)值的診斷工具。因此，IGF-1代表生物可利用的生產(chǎn)激素的可靠指示物。這些分析的結(jié)果與對(duì)應(yīng)于hGH的結(jié)果一起顯示于圖5C中，可以同時(shí)觀察兩個(gè)量值。
此外，為了具有對(duì)照組并因此建立與對(duì)應(yīng)于轉(zhuǎn)基因奶牛數(shù)據(jù)的比較，測(cè)量了非轉(zhuǎn)基因奶牛組血清中的IGF-1和hGH。對(duì)于非轉(zhuǎn)基因組和轉(zhuǎn)基因奶牛的兩種蛋白質(zhì)測(cè)量的平均值顯示于以下的表3中。
表3

值得注意的是非轉(zhuǎn)基因組中hGH的平均血清濃度位于假設(shè)參考范圍內(nèi)，而轉(zhuǎn)基因奶牛的平均值完全超過所述范圍的上限。此外，無容置疑的是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物血清中的IGF-1平均含量絕對(duì)高于對(duì)應(yīng)于非轉(zhuǎn)基因奶牛的，其構(gòu)成根本的差異。
因此，盡管轉(zhuǎn)基因奶牛血清中hGH的高濃度(已知其在人中導(dǎo)致具有嚴(yán)重后果的疾病，如糖尿病、高血壓、心血管疾病提高的風(fēng)險(xiǎn)和身體器官的擴(kuò)大，包括肝臟、脾臟、腎臟和心臟)理論上將使得動(dòng)物不能存活，這明顯地并不能代表對(duì)其健康和保持良好狀態(tài)的障礙。在其血液中具有令人驚訝高含量的外源激素，但是其完全健康并產(chǎn)生突出產(chǎn)量的重組蛋白的奶牛構(gòu)成意想不到的和創(chuàng)新的貢獻(xiàn)。
本發(fā)明另一創(chuàng)新的方面是進(jìn)入奶牛血流中的重組hGH，刺激乳腺產(chǎn)生更多的奶。該作用是間接獲得的，即，通過IGF-1的作用。該分子提高了通過乳腺的血液流動(dòng)，提供了用于合成乳脂、蛋白質(zhì)和乳糖的關(guān)鍵前體物質(zhì)。因此，IGF-1起指導(dǎo)營(yíng)養(yǎng)物通過血液流向乳房細(xì)胞的作用，在乳房中它們幫助產(chǎn)生奶。因此，獲得了自我刺激的動(dòng)物，因?yàn)檗D(zhuǎn)基因奶牛的奶中產(chǎn)生的重組hGH通過乳腺刺激促進(jìn)了動(dòng)物產(chǎn)生的奶體積的持續(xù)增加，相應(yīng)地在其奶中分泌更多的hGH。
實(shí)施例5通過亞克隆獲得轉(zhuǎn)基因小牛使用1.5mm直徑的針從轉(zhuǎn)基因小牛的耳朵取出五個(gè)組織樣品，為了該目的之前已經(jīng)將針的末端做成了斜角。將樣品在含有抗生素和抗真菌劑的基于PBS的培養(yǎng)基中冷凍運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。
然后，將組織樣品在含有10％胎牛血清和抗生素的MEM培養(yǎng)基中在39℃和5％CO2氣氛下溫育72小時(shí)。最終，取出組織樣品，使平板周圍的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)直至連生。一旦達(dá)到連生，為了獲得它們?cè)贕0期的同步化，將成纖維細(xì)胞至少孵育5天而沒有改變培養(yǎng)基，通過用顯微鏡觀察來評(píng)估。
胰蛋白酶作用后，將單個(gè)成纖維細(xì)胞與根據(jù)實(shí)施例2的去核牛卵母細(xì)胞融合，將因此獲得的胚胎在SOF培養(yǎng)基中和5％CO2+5％O2+90％N2氣氛下培養(yǎng)直至胚泡的階段。然后，通常在每個(gè)受體奶牛中非外科手術(shù)地移植兩個(gè)胚泡，并通過超聲波在30-35天測(cè)定懷孕。
使植入的奶牛正常地從懷孕直至自然分娩。最終，可以使用chirurgic方法(Caesarea)來分娩。在頭48小時(shí)給新生兒喂養(yǎng)富含Ig的初乳，然后使用合成的，之后天然的食物(它們都不含動(dòng)物來源的化合物)。
圖6A和6B顯示了同時(shí)進(jìn)行的通過亞克隆轉(zhuǎn)基因奶牛獲得的兩個(gè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的hGH和IGF-1血清濃度的測(cè)量，并將這些分析的結(jié)果分別作圖于圖6C和6D中，使得可以同時(shí)觀察每個(gè)動(dòng)物的兩個(gè)量值。由于目前小牛是年輕的，hGH和IGF-1兩者的值仍然位于各自的參照范圍內(nèi)，但是預(yù)期它們將與從中獲得了這兩個(gè)克隆的轉(zhuǎn)基因奶牛一樣升高。
實(shí)施例6通過將超排卵的轉(zhuǎn)基因奶牛人工授精來獲得轉(zhuǎn)基因小牛該實(shí)施例中將公開獲得轉(zhuǎn)基因牛的可替換的方法。該方法包括通過激素處理使轉(zhuǎn)基因奶牛超排卵；將所述的奶牛人工授精；收集因此產(chǎn)生的胚胎；將所述胚胎植入代孕奶牛中；并產(chǎn)生懷孕直至動(dòng)物的出生。以下呈現(xiàn)了該方法的描述。
超排卵在第1天(即，方法開始的那天)的早晨，通過肌內(nèi)途徑將150μg的前列腺素(D(+)-clorprostenol，Arsaprost，Arsa)給藥于轉(zhuǎn)基因奶牛。使動(dòng)物接受每天4kg的含有約15％蛋白質(zhì)的膳食(在第1天之前，動(dòng)物已經(jīng)給予2kg食物，含有相同含量的蛋白質(zhì))。在第8天的早晨，陰道內(nèi)放入黃體酮的CIDR(受控內(nèi)部藥物釋放)裝置。此外，通過肌內(nèi)途徑給予50mg黃體酮和雌二醇。喂養(yǎng)動(dòng)物的食物量提高至6kg/天，含有相同含量的蛋白質(zhì)。然后，在第12、13和14天兩次肌內(nèi)注射FSH和LH(PLUSET，Calier)(一次在早晨，另一次在下午)。接下來的一天(第15天)，通過肌內(nèi)途徑繼續(xù)給藥處理，兩次注射PLUSET(一次在早晨，另一次在下午)和兩次注射每次150μg前列腺素(相同給藥方案)。在第16天的早晨，除去CIDR。整個(gè)超排卵期給予的PLUSET總量為350IU。
授精該階段包括來自供體jersey公牛的精子的三次連續(xù)給予(第一次和第二次，各自在第17天的早晨和下午，最后一次，在第18天的早晨)，之前已經(jīng)獲得精子并冰凍保存以保持游動(dòng)精子的存活力。
收集胚胎并將它們植入代孕奶牛中在第26天的早晨通過用1L DMPBS(Nutricell)沖洗奶牛子宮的兩個(gè)角來收集胚胎。此后立刻在每個(gè)受體奶牛中非外科手術(shù)地移植兩個(gè)胚胎，并通過超聲波在30-35天測(cè)定懷孕。
使植入的奶牛正常地從懷孕直至自然分娩。最后可以使用chirurgic方法(Caesarea)來分娩。在頭48小時(shí)給新生兒喂養(yǎng)富含Ig的初乳，然后使用合成的，之后天然的食物(它們都不含動(dòng)物來源的化合物)。
由于生物后代的產(chǎn)生遵循孟德爾遺傳定律，作為上述方法的結(jié)果出生的動(dòng)物的一半是轉(zhuǎn)基因的，這些中的一半是雄性，而另一半是雌性。因此，存在獲得轉(zhuǎn)基因雄性(起始動(dòng)物)的高概率，為了擴(kuò)大轉(zhuǎn)基因畜群，其精子可以用于建立jersey轉(zhuǎn)基因精子的母種庫(MasterBank)，用于超排卵的轉(zhuǎn)基因/非轉(zhuǎn)基因奶牛的授精。
實(shí)施例7從奶中純化重組hGH一旦證實(shí)近似分子量、蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果和小牛的奶中產(chǎn)生的重組hGH的生物活性是正確的，就進(jìn)行徹底的純化過程，因?yàn)楫?dāng)制造生物藥物產(chǎn)品時(shí)，為了避免所述產(chǎn)品中存在可能的污染物，必不可少的是應(yīng)該將目標(biāo)蛋白純化至均一性。該過程包括以下步驟通過離心獲得奶的撇渣并將獲得的上清液稀釋以達(dá)到最終保留于酪蛋白膠束中的重組hGH更好的溶解度(澄清)；并使該溶液通過膨脹床陰離子交換色譜柱(該步驟可替換的方案是使用免疫親和柱，參見以下的實(shí)施例8)；使所得到的溶液接受反相HPLC(C4)步驟；然后對(duì)富含重組hGH的級(jí)分進(jìn)行陰離子交換色譜。
將純化的物料脫鹽、濃縮并接受分子排阻色譜。為了獲得純的重組hGH，通過分子量來分離。
從奶中純化人生長(zhǎng)激素(hGH)的方法包括以下步驟，依次為(a)澄清(b)膨脹床陰離子交換色譜，(c)反相色譜，(d)陰離子交換色譜，(e)分子排阻色譜(脫鹽)，(f)濃縮和(g)分子排阻色譜。
澄清為了獲得0.5％的溶液，將新鮮的奶與足量的吐溫80混合。加入吐溫80后，加入2M的Tris-HCl來獲得7.3±0.1的pH。然后，將產(chǎn)物均化30分鐘，然后為了分離脂肪層在14000g下離心。之后，將所得到的溶液用0.5％的吐溫80稀釋直至低于或等于1500S/cm的傳導(dǎo)率。用2M Tris-HCl將pH調(diào)節(jié)至7.3±0.1，然后將產(chǎn)物通過0.8μm孔的膜過濾并方便地保存。
膨脹床陰離子交換色譜根據(jù)以下參數(shù)，使用陰離子交換基質(zhì)將前一步驟所獲得的物料進(jìn)行色譜1.設(shè)備A.柱子1)直徑5cm2)床高30cm(壓實(shí)的床)3)基質(zhì)a)Streamline Q XL(Amersham)b)體積600ml2.溶液和緩沖液A.0.5N NaOHB.20％乙醇
C.緩沖液A20mM Tris.HCl，pH7.3D.緩沖液B500mM Tris.HCl，pH7.3E.緩沖液C20mM Tris.HCl，150mM NaCl，pH7.3F.緩沖液D20mM Tris.HCl，500mM NaCl，pH7.33.待色譜的物料A.澄清的奶B.樣品條件1)體積25±5L2)傳導(dǎo)率≤1500S/cm3)pH7.3±0.1為了平衡柱子，使1.5倍柱體積(“vc”)(900mL)的純水通過柱子，流速為115±5cm/小時(shí)(下行流)。然后，使下列溶液或緩沖液以下文中詳述的量按次序通過柱子，流速為230±30cm/小時(shí)(上行流)3.0vc(1,800ml)的0.5N NaOH；3.0vc(1,800ml)的純水；1.0vc(600ml)的緩沖液B；和最后，3.0vc(1,800ml)的緩沖液A。
一旦柱子得到了平衡，裝載待色譜的物料。所述裝載在12±3℃下和以230±30cm/小時(shí)的流速進(jìn)行。此后，以115±15cm/小時(shí)的流速和在相同的溫度下進(jìn)行洗脫。首先，使足夠量的緩沖液A通過柱子(上行流)，其次使下文中詳述的溶液和緩沖液以下列次序通過柱子(下行流)1.5vc(900ml)的緩沖液A；2.0vc(1,200ml)的緩沖液C；和最后，2.0vc(1,200ml)的緩沖液D。
一旦完成該步驟，為了清洗柱子，使以下的溶液或緩沖液以下文中詳述的量按次序通過柱子1.5vc(900ml)的純水；1.5vc(900ml)的0.5N NaOH；2.0vc(1,200ml)的純水；1.0vc(600ml)的緩沖液B；1.5vc(900ml)的純水；和最后，1.5vc(900ml)的20％乙醇。
測(cè)定所選擇的含有hGH級(jí)分的總蛋白(通過Bradford方法)和目標(biāo)蛋白(通過RIA)，并保存于2-8℃。
反相色譜根據(jù)以下參數(shù)將前一步驟所獲得的物料進(jìn)行色譜1.設(shè)備A.柱子1)直徑4cm2)床高48cm3)基質(zhì)a.BakerBond Wide-Pore Butyl(C4)15μm prep LC Packing(Baker)b.體積600ml2.溶液和緩沖液A.移動(dòng)相1(MP1)30mM NaHCO3，pH7.2∶純水∶乙腈(35∶55∶10)B.移動(dòng)相2(MP2)30mM NaHCO3，pH7.2∶純水∶乙腈(20∶10∶70)C.50％甲醇3.待色譜的物料A.從前一步驟得到的所選級(jí)分的集合體B.樣品條件1)體積30±15L2)pH7.3±0.3為了平衡柱子，使以下溶液或緩沖液以下文中詳述的量按次序通過柱子，流速低于或等于478cm/小時(shí)0.3vc(180ml)50％甲醇；此后，運(yùn)用50％甲醇-MP2的梯度，從所述溶液100∶0的比例開始直至達(dá)到在1.0vc(600ml)的總體積中所述溶液0∶100的比例；一旦完成梯度，使1.0vc(600ml)的MP2通過柱子；此后，運(yùn)用MP2-MP1的梯度，從所述溶液100∶0的比例開始直至達(dá)到在1.0vc(600ml)的總體積中所述溶液0∶100的比例；和最后，使2.0vc(1,200ml)的MP1通過柱子。
一旦柱子得到了平衡，使待色譜的物料通過0.45μm孔的膜過濾，此后立即裝載。所述裝載在20±5℃和低于或等于238cm/小時(shí)的流速下進(jìn)行。此后，在478±78cm/小時(shí)的流速和相同的溫度下進(jìn)行洗脫，使下文中詳述的溶液和緩沖液以以下的次序通過柱子1.0vc(600ml)的MP1；MP1-MP2的梯度，從所述溶液65∶35的比例開始直至達(dá)到在18.0vc(9,000ml)的總體積中所述溶液45∶55的比例；1.0vc(600ml)45∶55比例的MP1-MP2；和最后，2.0vc(1,200ml)的MP2。
一旦完成該步驟，為了清洗柱子，運(yùn)用MP2-50％甲醇的梯度，從所述溶液100∶0的比例開始直至達(dá)到在1.0vc(600ml)的總體積中所述溶液0∶100的比例；和最后，使2.0vc(1,200ml)的50％甲醇通過柱子。
通過SDS-PAGE測(cè)定該色譜所得到的級(jí)分，均質(zhì)性為20％且對(duì)于氧化的hGH，根據(jù)結(jié)果，進(jìn)行選擇。此后，測(cè)定所選擇的含有hGH級(jí)分的總蛋白(通過Bradford方法)，并保存于2-8℃。
陰離子交換色譜使用陰離子交換基質(zhì)將前一步驟所獲得的物料進(jìn)行色譜，如下1.設(shè)備A.柱子1)直徑5cm2)床高25cm3)基質(zhì)a.Source 30Q(Pharmacia)b.體積500ml2.溶液和緩沖液A.20％乙醇B.溶液K0.5N NaOH，3M NaClC.溶液L50mM Tris，pH7.50D.溶液M0.1N HCl，3M NaClE.移動(dòng)相3(MP3)溶液L∶乙腈(70∶30)
F.移動(dòng)相4(MP4)50mM Tris，0.1M NaCl，pH7.50∶乙腈(70∶30)3.待色譜的物料A.從前一步驟獲得的所選級(jí)分B.樣品條件1)體積4.5±1L2)pH7.2±0.2為了平衡和清潔柱子，使以下的溶液或緩沖液以下文中詳述的量按次序通過柱子，流速低于或等于183±20cm/小時(shí)1.0vc(500ml)純水；1.0vc(500ml)的溶液K；1.0vc(500ml)的溶液L；和最后，1.0vc(500mL)的MP3。
一旦柱子得到了平衡，裝載待色譜的物料。所述裝載在20±5℃和低于或等于183cm/小時(shí)的流速下進(jìn)行。此后，在183±20cm/小時(shí)的流速和相同的溫度下進(jìn)行洗脫，使下文中詳述的溶液和緩沖液以以下的次序通過柱子1.0vc(500ml)的MP3；MP3-MP4的梯度，從所述溶液15∶85的比例開始直至達(dá)到在5.0vc(2500ml)的總體積中所述溶液25∶75的比例；和最后，使2.0vc(1000ml)的MP 4通過柱子。
一旦完成該步驟，為了清洗柱子，將以下溶液或緩沖液以下文中詳述的量按次序通過柱子MP4-純水的梯度，從所述溶液100∶0的比例開始直至達(dá)到在0.5vc(250ml)的總體積中所述溶液0∶100的比例；0.5vc(250ml)的純水；純水-溶液K的梯度，從所述溶液100∶0的比例開始直至所述達(dá)到在0.5vc(250ml)的總體積中溶液0∶100的比例；1.0vc(500ml)的溶液K；溶液K-純水的梯度，從所述溶液100∶0的比例開始直至達(dá)到在0.5vc(250ml)的總體積中所述溶液0∶100的比例；0.5vc(250ml)的純水；純水-溶液M的梯度，從所述溶液100∶0的比例開始直至達(dá)到在0.5vc(250ml)的總體積中所述溶液0∶100的比例；1.0vc(500ml)的溶液M；溶液M-純水的梯度，從所述溶液100∶0的比例開始直至達(dá)到在0.5vc(250ml)的總體積中所述溶液0∶100的比例；1.0vc(500ml)的純水；純水-溶液L的梯度，從所述溶液100∶0的比例開始直至達(dá)到在0.5vc(250ml)的總體積中所述溶液0∶100的比例；0.5vc(250ml)的溶液L；溶液L-純水的梯度，從所述溶液100∶0的比例開始直至達(dá)到在0.5vc(250ml)的總體積中所述溶液0∶100的比例；和最后，1.5vc(750ml)的純水。
測(cè)定所選的含有hGH級(jí)分的總蛋白(通過Bradford方法)，并保存于2-8℃。
分子排阻色譜使用分子排阻基質(zhì)將前一步驟所獲得的物料進(jìn)行色譜，如下1.設(shè)備A.柱子1)直徑5cm2)床高25cm3)基質(zhì)a.Cellufine GH25(Millipore)b.體積500ml2.溶液和緩沖液A.0.5N NaOHB.20％乙醇C.緩沖液C150mM NaH2PO4，pH7.2D.緩沖液G320mM甘氨酸，10mM NaH2PO4，0.1％吐溫80，pH6.93.待色譜的物料A.從前一步驟得到的所選級(jí)分B.樣品條件1)體積0.5±0.2L2)pH7.5±0.5為了平衡和清潔柱子，使以下溶液或緩沖液以下文中詳述的量按次序通過柱子，流速低于或等于180cm/小時(shí)1.0vc(500ml)的純水；1.0vc(500mL)的0.5N NaOH；0.5vc(250ml)的純水0.5vc(250ml)的緩沖液C；和最后，2.0vc(1000ml)的緩沖液G。
一旦柱子得到了平衡，裝載待色譜的物料。所述裝載在20±5℃和183±20cm/小時(shí)的流速下進(jìn)行。此后，在相同流速和溫度下進(jìn)行洗脫，并使1.0vc(500ml)的緩沖液G通過柱子，運(yùn)行所需進(jìn)行的次數(shù)。
一旦完成該步驟，為了清洗柱子，使以下溶液或緩沖液以下文中詳述的量按次序通過柱子0.5vc(250ml)的純水；1.0vc(500ml)的0.5N NaOH；0.5vc(250ml)的純水；0.5vc(250ml)的緩沖液C；0.5vc(250ml)的純水；和最后，1.5vc(750ml)的20％乙醇。
測(cè)定所選的含有hGH級(jí)分的總蛋白(通過Bradford方法)，并保存于2-8℃。
濃縮根據(jù)以下所述的條件將前一實(shí)施例中所得到的級(jí)分濃縮1.設(shè)備A.蠕動(dòng)泵Watson Marlow-Cat.No.302SB.管道Watson Marlow-Cat.No.902.0080.016C.濃縮器Prep Scale Millipore-Cat.No.CDU F006LC2.溶液和緩沖液A.0.28％的十二烷基硫酸鈉(SDS)B.0.06％的TritonC.0.125N NaOHD.緩沖液G320mM甘氨酸，10mM的NaH2PO4，0.1％的吐溫80，pH6.93.待處理的物料A.從前一實(shí)施例獲得的所選級(jí)分B.樣品條件1)體積1.0±0.5L2)傳導(dǎo)率1200±100μS/cm3)pH6.9±0.1首先清洗、清潔和平衡設(shè)備，并使以下次序的溶液和緩沖液流過設(shè)備2L的0.125N NaOH；10L的純水；和最后，2L的緩沖液G。然后準(zhǔn)備好設(shè)備以便用于按照通常的方法，濃縮所選的級(jí)分。進(jìn)行濃縮程序直至達(dá)到15mg/ml的蛋白濃度(通過Bradford方法測(cè)得)。
使所選的級(jí)分通過0.22μm孔的膜過濾，測(cè)定總蛋白(通過Bradford方法)，并保存于4℃。
所選級(jí)分的傳導(dǎo)率和pH分別為1,100-1,300μS/cm和6.9±0.1。
分子排阻色譜使用分子排阻基質(zhì)將前一步驟所得到的物料進(jìn)行色譜，如下1.設(shè)備A.柱子1)直徑5cm2)床高92cm3)基質(zhì)a.Sephacryl S-200High Resolution(Amersham Pharmacia)b.體積1,800ml2.溶液和緩沖液A.0.5N NaOHB.20％乙醇C.緩沖液H320mM甘氨酸，2.2mM NaH2PO4，1.8mM Na2HPO4，pH7.303.待色譜的物料A.從前一步驟所選的，濃縮的級(jí)分B.樣品條件1)體積40±20ml2)傳導(dǎo)率1,200±100μS/cm3)pH7.3±0.1為了平衡和清潔柱子，使以下溶液或緩沖液以下文中詳述的量按次序通過柱子，流速低于46cm/小時(shí)1.0vc(1,800ml)的純水；1.0vc(1,800ml)的0.5N NaOH；和最后，2.0vc(3,600ml)的緩沖液H。
一旦柱子得到了平衡，裝載待色譜的物料。所述裝載在20±5℃和46±15cm/小時(shí)的流速下進(jìn)行。此后，在相同流速和溫度下進(jìn)行洗脫，并使1.0vc(1,800ml)的緩沖液H通過柱子，運(yùn)行所需進(jìn)行的次數(shù)。
一旦完成該步驟，為了清洗柱子，使以下溶液或緩沖液以下文中詳述的量按次序通過柱子1.0vc(1,800ml)的純水；和1.5vc(2,700ml)的20％乙醇。
將含有純hGH的級(jí)分通過0.22μm孔的膜無菌過濾至無菌的、去熱原的塑料瓶中，測(cè)定總蛋白，并保存于-20℃。
實(shí)施例8從奶中純化hGH的可替換的方法替代之前所述的純化方法，為了純化奶中所含有的重組hGH，可以使用可替換的方案。實(shí)施例7中所述方法和該實(shí)施例中所呈現(xiàn)的可替換方法之間的主要差異在于前者的第二個(gè)步驟包括膨脹床陰離子交換色譜，而后者相應(yīng)的步驟需要免疫親和色譜。兩種方法的澄清步驟也略有差別。因?yàn)閮蓚€(gè)純化方案的其余部分是相同的，以下只描述可替換方法的頭兩個(gè)步驟。
澄清為了獲得0.5％的溶液，將新鮮的奶與足量的吐溫80混合。加入吐溫80后，加入1M的Tris來獲得7.3±0.3的pH。此后，將產(chǎn)物均化30分鐘，然后為了分離脂肪層在14000g下離心。之后，用緩沖液S(50mM Tris.HCl，500mM NaCl，0.5％吐溫80，pH7.3)將所得到的溶液稀釋20倍，然后將產(chǎn)物通過0.45μm孔的膜過濾并方便地保存。
免疫親和色譜根據(jù)以下參數(shù)使用免疫親和相互作用基質(zhì)(Affigel 10 EsterAgarose，BioRad制造，共價(jià)連接的抗-GH單克隆抗體，BioSidus制造)將前一步驟所獲得的物料進(jìn)行色譜1.設(shè)備A.柱子1)直徑30cm2)床高15cm3)基質(zhì)a)Affigel 10Ester Agarose(BioRad)，共價(jià)連接的抗-GH單克隆抗體(Bio Sidus)b)體積10L2.溶液和緩沖液A.緩沖液A20mM Tris.HCl，500mM NaCl，pH7.2B.緩沖液B100mM檸檬酸，pH3.0C.緩沖液C150mM NaH2PO4，pH7.2D.緩沖液D50mM Tris.HCl，500mM NaCl，500mM胍.HCl，pH7.2E.緩沖液E50mM Tris.HCl，500mM NaCl，pH7.2，0.2％疊氮化鈉，0.1g/L慶大霉素3.待色譜的物料A.澄清的奶B.樣品條件1)體積30-50L2)傳導(dǎo)率45±15mS/cm3)pH7.3±0.3為了平衡和清潔柱子，如果在最近七天中沒有使用過，使以下溶液或緩沖液以下文中詳述的量按次序通過柱子，流速低于51cm/小時(shí)1.0柱體積(“vc”)(10L)的緩沖液A；2.0vc(20L)的緩沖液D；2.0vc(20L)的緩沖液A；1.0vc(10L)的緩沖液B；2.0vc(20L)的緩沖液C；和最后，1.0vc(10L)的緩沖液A。
另一方面，如果在最近七天中已經(jīng)用過柱子，使以下溶液或緩沖液以下文中詳述的量按次序通過柱子，流速低于51cm/小時(shí)1.0vc(10L)的緩沖液C；和最后，2.0vc(20L)的緩沖液A。
一旦柱子得到平衡，裝載待色譜的物料。所述裝載在5±3℃和低于51cm/小時(shí)的流速下進(jìn)行。此后，在42±9cm/小時(shí)的流速和相同的溫度下進(jìn)行洗脫。將下文中詳述的溶液和緩沖液以以下的次序通過柱子2.0vc(20L)的緩沖液A；和1.5vc(15L)的緩沖液B。
一旦完成該步驟，為了清洗柱子，使以下溶液或緩沖液以下文中詳述的量按次序通過柱子2.0vc(20L)的緩沖液D；2.0vc(20L)的緩沖液A；和最后，2.0vc(20L)的緩沖液E。
測(cè)定所選的含有hGH級(jí)分的總蛋白(通過Bradford方法)和目標(biāo)蛋白(通過RIA)，并保存于4℃。
實(shí)施例9純的重組hGH的質(zhì)量控制對(duì)兩批純的重組hGH進(jìn)行一系列的測(cè)定來證實(shí)該產(chǎn)物與天然hGH沒有差別。這樣的方法包括，但不限于，SDS/PAGE、蛋白質(zhì)印跡、體外(細(xì)胞nb 2)和體內(nèi)(切除垂體的大鼠)的生物活性、肽圖譜、完整氨基酸序列的測(cè)定、等電聚焦(IEF)，以及反相和大小排阻HPLC分析。對(duì)于重組的和天然的hGH，所有那些測(cè)定中所獲得的結(jié)果完全相同，其證明了純的重組hGH完全對(duì)應(yīng)于天然hGH，因此適用于制造生物藥物產(chǎn)品。
現(xiàn)在已經(jīng)充分地描述了本發(fā)明，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解可以在寬和相等范圍的條件、配制和其它參數(shù)下進(jìn)行相同的發(fā)明而不會(huì)影響本發(fā)明或其任何實(shí)施方案的范圍。在此所引用的所有專利和出版物在此以其整體全部引入作為參考。
序列表<110>Sterrenbeld Biotechnologie NorthMelo，Carlos AlbertoBaranao，LinoCarbonetto，Cesar<120>在轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物奶中生產(chǎn)外源蛋白的方法以及從其中純化蛋白的方法<130>1909.010PC02<160>4<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物PB1<400>1tctactcgag gatcatctat ctgtcccaaa g 31<210>2<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物PB2<400>2ctaggatcca atgatctgat tttgtgg 27<210>3<211>28<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>引物PB4<400>3ctaggatcca tggctacagg taagcgcc 28<210>4<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物GHTE<400>4atgctgtgtc tggacgtcct 20
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，包括a)制造在其奶中產(chǎn)生目標(biāo)蛋白的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物；b)從所述非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物獲得所述奶；和c)從所述奶中純化所述目標(biāo)蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物是通過以下方法制得的，該方法包括a)獲得編碼目標(biāo)蛋白的基因；b)將所述基因克隆至質(zhì)粒中，借此將所述基因可操作地連接至指導(dǎo)所述基因在乳房細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子，形成表達(dá)質(zhì)粒；c)用所述表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體細(xì)胞，使得所述質(zhì)粒摻入到所述體細(xì)胞的基因組中，得到轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞；d)將成熟卵母細(xì)胞去核，得到去核的卵母細(xì)胞；e)將一個(gè)所述的轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞與所述去核的卵母細(xì)胞融合，得到單細(xì)胞胚胎；f)將所述胚胎植入受體哺乳動(dòng)物的子宮中；和g)監(jiān)控懷孕直至轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的出生。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述啟動(dòng)子是β酪蛋白啟動(dòng)子，而其中所述的目標(biāo)蛋白是人生長(zhǎng)激素。
4.權(quán)利要求3的方法，其中表達(dá)質(zhì)粒是pRβhGH。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)一步包含新霉素抗性基因。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述表達(dá)質(zhì)粒是pRNeo。
7.權(quán)利要求2的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是在其奶中產(chǎn)生重組人生長(zhǎng)激素的牛，其基因組包含整合的質(zhì)粒，其中所述的質(zhì)粒包含人生長(zhǎng)激素基因和指導(dǎo)所述基因在所述哺乳動(dòng)物的乳房細(xì)胞中表達(dá)的β酪蛋白啟動(dòng)子。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述質(zhì)粒是pRβhGH。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述質(zhì)粒進(jìn)一步包含新霉素抗性基因。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述質(zhì)粒是pRNeo。
11.權(quán)利要求2的方法，其中所述體細(xì)胞是成纖維細(xì)胞。
12.權(quán)利要求2的方法，其中經(jīng)從在其奶中產(chǎn)生所述目標(biāo)蛋白的轉(zhuǎn)基因雌性中分離來獲得所述的轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞是成纖維細(xì)胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物通過以下方法制得，該方法包括a)使在其奶中產(chǎn)生所述目標(biāo)蛋白的轉(zhuǎn)基因雌性非人哺乳動(dòng)物超排卵；b)將所述哺乳動(dòng)物與從雄性非人非轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物獲得的精子人工授精來產(chǎn)生胚胎；c)收集所述胚胎；d)將所述胚胎植入受體哺乳動(dòng)物的子宮中；和e)監(jiān)控懷孕直至轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的出生。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物通過以下方法制得，該方法包括a)使在其奶中產(chǎn)生所述目標(biāo)蛋白的轉(zhuǎn)基因雌性非人哺乳動(dòng)物超排卵；b)將所述哺乳動(dòng)物與從產(chǎn)生所述目標(biāo)蛋白的轉(zhuǎn)基因雄性非人哺乳動(dòng)物獲得的精子人工授精來產(chǎn)生胚胎；c)收集所述胚胎；d)將所述胚胎植入受體哺乳動(dòng)物的子宮中；和e)監(jiān)控懷孕直至轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的出生。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物通過以下方法制得，該方法包括a)使雌性非人非轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物超排卵；b)將所述哺乳動(dòng)物與從產(chǎn)生所述目標(biāo)蛋白的轉(zhuǎn)基因雄性非人哺乳動(dòng)物獲得的精子人工授精來產(chǎn)生胚胎；c)收集所述胚胎；d)將所述胚胎植入受體哺乳動(dòng)物的子宮中；和e)監(jiān)控懷孕直至轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的出生。
17.權(quán)利要求2、12、14、15或16任一項(xiàng)的方法，其中所述哺乳動(dòng)物屬于牛物種、豬物種、綿羊物種、山羊物種或嚙齒動(dòng)物物種。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述哺乳動(dòng)物屬于牛物種。
19.權(quán)利要求2、12、14、15或16任一項(xiàng)的方法，其中所述目標(biāo)蛋白是哺乳動(dòng)物生長(zhǎng)激素。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述哺乳動(dòng)物生長(zhǎng)激素是人生長(zhǎng)激素、牛生長(zhǎng)激素、豬生長(zhǎng)激素、綿羊生長(zhǎng)激素、山羊生長(zhǎng)激素或嚙齒動(dòng)物生長(zhǎng)激素。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述哺乳動(dòng)物生長(zhǎng)激素是人生長(zhǎng)激素。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述哺乳動(dòng)物以高于約1.0g hGH/L奶的水平來產(chǎn)生人生長(zhǎng)激素。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述哺乳動(dòng)物以高于約2.0g hGH/L奶的水平來產(chǎn)生人生長(zhǎng)激素。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述哺乳動(dòng)物以高于約3.0g hGH/L奶的水平來產(chǎn)生人生長(zhǎng)激素。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述哺乳動(dòng)物以高于約4.0g hGH/L奶的水平來產(chǎn)生人生長(zhǎng)激素。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述哺乳動(dòng)物以高于約5.0g hGH/L奶的水平來產(chǎn)生人生長(zhǎng)激素。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述哺乳動(dòng)物以高于約6.0g hGH/L奶的水平來產(chǎn)生人生長(zhǎng)激素。
28.權(quán)利要求19的方法，其中所述哺乳動(dòng)物所述哺乳動(dòng)物生長(zhǎng)激素的產(chǎn)生刺激了所述哺乳動(dòng)物產(chǎn)生更多的包含所述哺乳動(dòng)物生長(zhǎng)激素的奶。
29.權(quán)利要求2、12、14、15或16任一項(xiàng)的方法，其中在所述哺乳動(dòng)物的體細(xì)胞和生殖細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了編碼所述目標(biāo)蛋白的基因(連接于指導(dǎo)所述基因在乳房細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子)。
30.從產(chǎn)生重組生長(zhǎng)激素的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的奶中純化重組生長(zhǎng)激素的方法，包括a)將非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的奶澄清，得到澄清的奶；和b)對(duì)所述澄清的奶進(jìn)行色譜，得到純化的重組生長(zhǎng)激素。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述的色譜是離子交換色譜、反相色譜、分子排阻色譜或親和色譜。
32.權(quán)利要求31的方法，其中實(shí)施多個(gè)色譜步驟。
33.權(quán)利要求31的方法，其中所述離子交換色譜是陰離子交換色譜。
34.權(quán)利要求31的方法，其中親和色譜是免疫色譜。
35.權(quán)利要求31的方法，進(jìn)一步包括濃縮步驟。
36.從產(chǎn)生重組生長(zhǎng)激素的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的奶中純化重組生長(zhǎng)激素的方法，包括a)將非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的奶澄清，得到澄清的奶；和b)對(duì)所述澄清的奶進(jìn)行膨脹床陰離子交換色譜，得到陰離子交換色譜過的物料；c)對(duì)所述陰離子色譜過的物料進(jìn)行反相色譜，得到反相色譜過的物料；d)對(duì)所述反相色譜過的物料進(jìn)行陰離子交換色譜，得到陰離子交換色譜過的物料；e)對(duì)所述陰離子交換色譜過的物料進(jìn)行分子排阻色譜，得到分子排阻色譜過的物料；f)將所述分子排阻色譜過的物料濃縮，得到濃縮的物料；和g)對(duì)所述濃縮的物料進(jìn)行分子排阻色譜，得到純的重組生長(zhǎng)激素。
37.從產(chǎn)生重組生長(zhǎng)激素的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的奶中純化重組生長(zhǎng)激素的方法，包括a)將從轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物獲得的奶澄清，得到澄清的奶；和b)對(duì)所述澄清的奶進(jìn)行免疫親和色譜，得到免疫親和色譜過的物料；c)對(duì)所述免疫親和色譜過的物料進(jìn)行反相色譜，得到反相色譜過的物料；d)對(duì)所述反相色譜過的物料進(jìn)行陰離子交換色譜，得到陰離子交換色譜過的物料；e)對(duì)所述陰離子交換色譜過的物料進(jìn)行分子排阻色譜，得到分子排阻色譜過的物料；f)對(duì)所述分子排阻色譜過的物料進(jìn)行濃縮，得到濃縮的物料；和g)對(duì)所述濃縮的物料進(jìn)行分子排阻色譜，得到純的重組生長(zhǎng)激素。
38.權(quán)利要求36或37的方法，其中所述生長(zhǎng)激素是哺乳動(dòng)物生長(zhǎng)激素。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述哺乳動(dòng)物生長(zhǎng)激素是人生長(zhǎng)激素、牛生長(zhǎng)激素、豬生長(zhǎng)激素、綿羊生長(zhǎng)激素、山羊生長(zhǎng)激素或嚙齒動(dòng)物生長(zhǎng)激素。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述哺乳動(dòng)物生長(zhǎng)激素是人生長(zhǎng)激素。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述哺乳動(dòng)物以高于約1.0g hGH/L奶的水平來產(chǎn)生人生長(zhǎng)激素。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所述哺乳動(dòng)物以高于約2.0g hGH/L奶的水平來產(chǎn)生人生長(zhǎng)激素。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述哺乳動(dòng)物以高于約3.0g hGH/L奶的水平來產(chǎn)生人生長(zhǎng)激素。
44.權(quán)利要求43的方法，其中所述哺乳動(dòng)物以高于約4.0g hGH/L奶的水平來產(chǎn)生人生長(zhǎng)激素。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述哺乳動(dòng)物以高于約5.0g hGH/L奶的水平來產(chǎn)生人生長(zhǎng)激素。
46.權(quán)利要求45的方法，其中所述哺乳動(dòng)物以高于約6.0g hGH/L奶的水平來產(chǎn)生人生長(zhǎng)激素。
47.權(quán)利要求36或37的方法，其中所述非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物屬于牛物種。
48.權(quán)利要求36或37的方法，其中所述非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物是豬、綿羊、山羊或嚙齒動(dòng)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及生產(chǎn)目標(biāo)蛋白的方法，包括制造在其奶中產(chǎn)生所述蛋白的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物，從非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物獲得所述奶，并從奶中純化所述目標(biāo)蛋白。方便地克隆產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因牛動(dòng)物，其能夠在乳腺中產(chǎn)生人生長(zhǎng)激素。該方法包括在表達(dá)載體中方便地克隆編碼hGH基因和β酪蛋白啟動(dòng)子的遺傳構(gòu)建體。還包括胎牛體細(xì)胞，通常是成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染過程，并核移植進(jìn)去核的牛卵母細(xì)胞，因此產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚胎。該方法還包括產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚胎的其它過程用于進(jìn)一步擴(kuò)大轉(zhuǎn)基因畜群，如亞克隆轉(zhuǎn)基因雌性牛，使轉(zhuǎn)基因奶牛超排卵并與來自非轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因雄性牛的精子授精，以及使非轉(zhuǎn)基因奶牛超排卵并與來自轉(zhuǎn)基因雄性牛的精子授精。然后，轉(zhuǎn)基因胚胎產(chǎn)生在其奶中大量產(chǎn)生人生長(zhǎng)激素的轉(zhuǎn)基因牛，從奶中完全純化激素并分析以滿足制造純的生物藥物產(chǎn)品的所有要求。
文檔編號(hào)C07K16/00GK1882685SQ200480031507
公開日2006年12月20日 申請(qǐng)日期2004年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月30日
發(fā)明者C·A·梅洛, L·巴拉瑙, C·卡爾博內(nèi)托 申請(qǐng)人:斯特林貝爾德生物技術(shù)北美公司