專利名稱：：用于生產(chǎn)蛋白的轉(zhuǎn)基因蘆薈植物及其相關(guān)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因單子葉植物，并且更具體地涉及轉(zhuǎn)基因,薈植物，以及用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因蘆薈植物的方法和組合物，和從所述轉(zhuǎn)基因,薈植物提取蛋白的方法。
背景技術(shù)：
：具有生物活性的蛋白有持續(xù)增長(zhǎng)的市場(chǎng)，許多的所述生物活性蛋白被應(yīng)用于治療目的。目前已有超過(guò)160種市售的基于蛋白的藥物。未來(lái)的兩年，另外還有大約50種有希望被批準(zhǔn)?，F(xiàn)在對(duì)治療性蛋白生產(chǎn)的需求已經(jīng)超過(guò)了工業(yè)的產(chǎn)能。為了克服這個(gè)問(wèn)題，預(yù)計(jì)所述工業(yè)的產(chǎn)能需要提高4-5倍。然而，這些治療性蛋白的生產(chǎn)設(shè)備昂貴，并且其建造需要較長(zhǎng)的時(shí)間。因此，需要更加低成本的生產(chǎn)方法，并且需要所述方法能夠縮短達(dá)到大規(guī)模生產(chǎn)所需要的時(shí)間?？梢允褂靡恍┗趧?dòng)物的蛋白生產(chǎn)方法。但是，這些方法經(jīng)常會(huì)引入疾病造成的健康風(fēng)險(xiǎn)。這樣的風(fēng)險(xiǎn)可能來(lái)自于疾病的交叉感染，所述疾病可以同時(shí)感染所述動(dòng)物和例如人類患者的最終使用者。因此，存在一個(gè)對(duì)生產(chǎn)方法的需求，所述方法需要消除所述生產(chǎn)生物和所述終端使用者之間的交叉感染的可能性。另外，許多現(xiàn)有的生產(chǎn)方法需要大量的處理，以從所述動(dòng)物或產(chǎn)生治療性蛋白的其他宿主生物中提取所述治療性蛋白，并且使所述化合物處于患者可以利用的狀態(tài)。經(jīng)過(guò)純化以后，可以將所述蛋白與佐劑或其他栽體材料結(jié)合以穩(wěn)定所述蛋白并且使患者可以利用。然而，涉及對(duì)治療性蛋白處理的提取、純化、在其他溶劑中的再懸浮的過(guò)程是復(fù)雜和繁瑣的，并且可能不利于在對(duì)治療有普遍需求的發(fā)展中國(guó)家中使用。因此，需要一個(gè)簡(jiǎn)化生產(chǎn)方法，所述方法可以消除或減少治療性蛋白的提取后處理。
發(fā)明內(nèi)容根據(jù)本發(fā)明的組合物和方法可以解決上述的許多的需求和缺陷，并且將會(huì)提供另外的改進(jìn)和優(yōu)點(diǎn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)閱讀本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容將會(huì)理解這些改進(jìn)和優(yōu)點(diǎn)。在一方面，本發(fā)明可以提供一種穩(wěn)定地整合目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)基因聲薈植物。在另一方面，可以提供新的載體和構(gòu)建體，以將目標(biāo)DM序列整合進(jìn)聲薈植物的基因組中。所述目標(biāo)序列可以編碼一種生物活性的蛋白。所述生物活性的蛋白可以是干擾素、免疫球蛋白、淋巴因子、生長(zhǎng)因子、激素、血液因子、組織相容性抗原、酶、化妝品用蛋白和其他哺乳動(dòng)物蛋白，或其他目標(biāo)蛋白。在某些方面，所述目標(biāo)蛋白是人類蛋白。根據(jù)本發(fā)明的蘆薈植物可以將目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄并翻譯成目標(biāo)蛋白。在一方面，至少一些所述的目標(biāo)蛋白可以易位到所述蘆薈葉的中央部分。在其他方面，所述的目標(biāo)蛋白可以包含一個(gè)信號(hào)序列以便于其易位到所述，薈葉的中央部分。在其他方面，可以提供從聲薈植物上分離單細(xì)胞的新方法。仍然在其他的方面，本發(fā)明可以提供新的方法，所述方法用于將栽體整合到,薈植物中，并且再生這樣的轉(zhuǎn)基因聲薈植物。根據(jù)本發(fā)明的產(chǎn)生哺乳動(dòng)物蛋白的轉(zhuǎn)基因,薈植物可以提供用于生產(chǎn)目標(biāo)蛋白的、更加經(jīng)濟(jì)的可行的選擇，所述的目標(biāo)蛋白例如各種生物活性的蛋白和化妝品用蛋白。在一方面，所述的目標(biāo)蛋白可以定位于和/或集中在所述蘆薈葉的凝膠中。所述的目標(biāo)蛋白的這種定位可以簡(jiǎn)化從所述植物中移出所述蛋白。在這方面，所述的目標(biāo)蛋白可以與位于所述聲薈葉中央部分的非變性凝膠被共提取。因此，本發(fā)明可以提供一種轉(zhuǎn)基因植物，與例如煙草和玉米的大部分的轉(zhuǎn)基因植物相比，通?？梢愿菀椎貜乃鲛D(zhuǎn)基因植物獲得目標(biāo)蛋白。而且，本發(fā)明可以提供有效的蛋白分離方法。仍然在其他的方面，所述的目標(biāo)蛋白可能不是特別地位于所述蘆薈植物中。然而，所述蘆薈植物的解剖學(xué)和生理學(xué)仍然可以提供生產(chǎn)目標(biāo)蛋白的某些其他的優(yōu)點(diǎn)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過(guò)閱讀本公開(kāi)內(nèi)容將可以理解這些優(yōu)點(diǎn)。與在細(xì)菌和酵母中的產(chǎn)生目標(biāo)蛋白的常規(guī)方法相比，蘆薈植物有各種優(yōu)點(diǎn)。聲薈植物10的所述優(yōu)點(diǎn)可以包括以某些方式加工蛋白的能力，所述方式不適合于簡(jiǎn)單的單細(xì)胞細(xì)菌和酵母，并且是產(chǎn)生具有所需形式的蛋白必須的。例如，這種加工可以包括化學(xué)修飾(例如通過(guò)糖基化)和某些蛋白的折疊。而且，與基于動(dòng)物細(xì)胞的其他蛋白生產(chǎn)方法相比，蘆薈植物生產(chǎn)可以提供顯著的成本優(yōu)勢(shì)、規(guī)模優(yōu)勢(shì)和減少可能對(duì)人有害的污染的危險(xiǎn)。來(lái)自根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因蘆薈植物的蘆薈葉的中心部分的蛋白修飾凝膠從所述蘆薈植物取出就可以被直接應(yīng)用。這可以避免相對(duì)復(fù)雜的和昂貴的從天然植物材料中提取目標(biāo)蛋白的過(guò)程。在某些方面，從所述葉中提取的凝膠不需要蛋白的提取或處理就可以被直接應(yīng)用。所述凝膠可以以髓心的形式，所述髓心是從轉(zhuǎn)基因，薈植物的斷裂葉的脫落部分機(jī)械地提取的。本發(fā)明可以為具有生物活性和/或具有化妝品用途的人和其他哺乳動(dòng)物蛋白的生產(chǎn)提供經(jīng)濟(jì)、可行的選擇。通過(guò)閱讀本公開(kāi)內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解本發(fā)明的其他改進(jìn)和優(yōu)點(diǎn)o圖1顯示聲薈葉的橫斷面解剖的一個(gè)實(shí)例；圖2顯示產(chǎn)生胼胝體組織的示例性方法；圖3用圖表概述了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因,薈植物的各個(gè)步驟；圖4用圖表顯示包含序列信息的質(zhì)粒載體的組件；圖5列出來(lái)自玉米的泛素啟動(dòng)子的序列信息，并且突出顯示了所述泛素啟動(dòng)子區(qū)域；圖6A和6B顯示才艮據(jù)本發(fā)明的方面的質(zhì)粒載體系統(tǒng)的構(gòu)建；圖7A至7C顯示根據(jù)本發(fā)明的方面的另一個(gè)質(zhì)粒載體系統(tǒng)的構(gòu)建；圖8顯示根據(jù)本發(fā)明的方面的另外一個(gè)質(zhì)粒載體系統(tǒng)的構(gòu)建；和圖9顯示根據(jù)本發(fā)明的方面的整合系統(tǒng)的構(gòu)建。所有的附圖的顯示僅僅是為了易于解釋本發(fā)明的基本教導(dǎo)；在閱讀如下的說(shuō)明之后，所述附圖關(guān)于各種實(shí)施方案的數(shù)量、位置、序列、關(guān)系和組分的擴(kuò)展將能夠被本領(lǐng)域的技術(shù)人員解釋或者將在所述技術(shù)人員的理解范圍內(nèi)。而且，在閱讀如下的說(shuō)明之后，用于實(shí)踐本發(fā)明的各種方案、工具和組合物將在本領(lǐng)域的技術(shù)人員的理解范圍內(nèi)。具體實(shí)施例方式本說(shuō)明書(shū)中使用的，"一"或"一種"可能指一種或多種。如在權(quán)利要求中使用的，當(dāng)與詞語(yǔ)"包含"一塊使用的時(shí)候，詞語(yǔ)"一"或"一種"可能指一種或多于一種。如本文使用的"另一種"可能指至少第二種或更多。本文使用的，一種"轉(zhuǎn)化的蘆薈細(xì)胞"指一種用穩(wěn)定整合的、非天然的、重組DNA轉(zhuǎn)化(例如農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化或者通過(guò)使用包被有重組DNA的微粒或其他方法轟擊)的植物細(xì)胞。本發(fā)明的一種轉(zhuǎn)化的聲薈細(xì)胞可以是一種原始轉(zhuǎn)化的以一種微生物或者作為一種子代植物細(xì)胞形式存在的植物細(xì)胞，所述子代植物細(xì)胞再生成分化的組織，例如再生成具有穩(wěn)定整合的、非天然的重組DNA的轉(zhuǎn)基因蘆薈植物10，或者衍生自子代轉(zhuǎn)基因蘆薈植物10的種子或花粉。本文使用的"轉(zhuǎn)基因,薈植物"指一種基因組被穩(wěn)定整合的重組DNA改變的,薈植物。一個(gè)轉(zhuǎn)基因的蘆薈植物10包括從一個(gè)原始轉(zhuǎn)化的,薈細(xì)胞再生的蘆薈植物，以及來(lái)自轉(zhuǎn)化的聲薈植物10的后代或雜交的子代轉(zhuǎn)基因蘆薈植物。本文使用的"重組DNA"指經(jīng)過(guò)基因工程改造并且在細(xì)胞外構(gòu)建的DNA,包括含有天然存在的DNA、cDNA、合成的DNA和/或其他DNA。本文使用的"啟動(dòng)子"指起始轉(zhuǎn)錄的調(diào)控DNA。"植物啟動(dòng)子"是能夠起始聲薈細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，不管它是否來(lái)自于聲薈細(xì)胞，例如，眾所周知農(nóng)桿菌啟動(dòng)子在蘆薈細(xì)胞中起作用。因此，植物啟動(dòng)子包括從植物、植物病毒和細(xì)菌(例如農(nóng)桿菌和短根瘤菌)獲得的啟動(dòng)子DM。受發(fā)育控制的啟動(dòng)子的實(shí)例包括優(yōu)先在在特定組織中起始轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，所述組織例如葉、根或種子。這些啟動(dòng)子指的是"組6織優(yōu)選的"。僅僅在特定組織中起始轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子指的是"組織特異性的"。一種"細(xì)胞類型"特異性的啟動(dòng)子主要地驅(qū)動(dòng)在一種或多種器官中的特定細(xì)胞類型內(nèi)的表達(dá)，例如在根或葉中的維管細(xì)胞。"可誘導(dǎo)的，，或"可抑制的"啟動(dòng)子是一種受環(huán)境控制的啟動(dòng)子。可能影響誘導(dǎo)型啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的環(huán)境條件的實(shí)例包括缺氧條件、或者特定的化學(xué)試劑、或者光的存在。組織特異性的、組織優(yōu)選的、細(xì)胞類型特異性的和誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子構(gòu)成"非組成型"啟動(dòng)子的類。"組成型的"啟動(dòng)子是一種在大部分條件下有活性的啟動(dòng)子。所述啟動(dòng)子可能包含增強(qiáng)子或其他元件，所述其他元件影響轉(zhuǎn)錄的起始、轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄的水平、轉(zhuǎn)錄的末端位點(diǎn)或者所產(chǎn)生的核糖核酸的任何的后處理。本文使用的術(shù)語(yǔ)"遺傳構(gòu)建體"被限定為一段包含人工排列的至少兩個(gè)DM片段的DNA序列，所述DNA序列是為了產(chǎn)生一種轉(zhuǎn)基因的蘆薈植物。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，一個(gè)片段是一個(gè)調(diào)控序列，并且另一個(gè)片段編碼一種基因產(chǎn)物。本文使用的"有效連接(operablylinked)"的意思是在一個(gè)DNA構(gòu)建體中聯(lián)合兩段或多段DNA片段，以至于一段的功能(如編碼蛋白的DNA)被另一段調(diào)控(例如啟動(dòng)子、終止序列等)。本文使用的術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)錄"被限定為從一個(gè)DNA模板生成一個(gè)RNA分子。本文使用的術(shù)語(yǔ)"翻譯"被限定為從一個(gè)RNA模板生成一個(gè)多肽。本文使用的"表達(dá)的"指產(chǎn)生的，例如，當(dāng)一個(gè)蛋白的對(duì)應(yīng)的DNA被轉(zhuǎn)錄成mRM時(shí)，所述mRNA被翻譯成一個(gè)蛋白，所述蛋白在植物細(xì)胞中表達(dá)。本發(fā)明可以提供表達(dá)各種目標(biāo)蛋白的新轉(zhuǎn)基因蘆薈植物10、可以提供產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因蘆薈植物10的方法和組合物、可以提供從所述轉(zhuǎn)基因聲薈植物10中提取蛋白的方法，并且可以提供來(lái)自所述轉(zhuǎn)基因蘆薈植物10的組分與目標(biāo)蛋白的新組合物。根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的目標(biāo)蛋白可以包含一個(gè)分泌信號(hào)，以幫助所述蛋白在所述髓心l8中或者在蘆薈葉12的髓心中蓄積。在一方面，這種蓄積可以至少部分地出現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因蘆薈植物10的葉的musalegenous細(xì)胞中。所述髓心18或蘆薈葉12的漿包含所述葉的組分，當(dāng)從所述蘆薈葉12提取所述組分的時(shí)候，所述葉的組分通常至少部分地指的是"凝膠"。本文使用的"凝膠"將指所提取的髓心18和其他相關(guān)物質(zhì)，在從所述,薈葉12中提取髓心18的時(shí)候所述相關(guān)物質(zhì)伴隨于所述髓心18，而不管后續(xù)處理的程度。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)方面，來(lái)自所述蘆薈葉12的凝膠可以有修飾組分。在一個(gè)具體方面，所述凝膠的組分可以被修飾為包含至少一種外源性的蛋白組分，并被稱為"蛋白修飾凝膠"。提取含有相關(guān)的目的蛋白的蛋白修飾凝膠可以提供容易獲得的蛋白和/或有效的蛋白分離的方法。根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生和/或提取的蛋白修飾凝膠不需要進(jìn)行蛋白提取就可以直接被應(yīng)用。出于示例性目的，本發(fā)明的方面通常顯示在圖1至8中。本發(fā)明可以提供轉(zhuǎn)基因植物、組合物，以及通?？梢员粦?yīng)用于百合家族的聲薈屬的方法。典型地，對(duì)本發(fā)明的描述參考了在物種中的應(yīng)用，所述物種選自于蘆薈(Aloevera)(庫(kù)拉索蘆薈)、開(kāi)普蘆薈(Aloeferox)、木立蘆薈(Aloearborescence)。所述蘆薈屬通常包括一組大的無(wú)莖、叢生、多質(zhì)單子葉植物。這些植物通常指用于本公開(kāi)內(nèi)容目的的,薈植物10。聲薈植物產(chǎn)生的各種化合物已經(jīng)被應(yīng)用于藥用目的。當(dāng)存在于一種蛋白修飾凝膠中的時(shí)候，這些化合物可以補(bǔ)充根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因的,薈植物10的生物活性蛋白的藥學(xué)性質(zhì)。圖l顯示轉(zhuǎn)基因的聲薈植物10的,薈葉12的橫斷面。所述轉(zhuǎn)基因的蘆薈植物10的葉包含一種容易提取的凝膠狀蛋白混合物、碳水化合物和所述凝膠中包含的水，所述凝膠主要來(lái)自于髓心18。該凝膠狀混合物主要位于蘆薈葉12的中心區(qū)域。已經(jīng)顯示所述凝膠中的各種化合物具有多種藥用性質(zhì)和應(yīng)用。在一方面，所述凝膠和/或髓心18可以穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因的聲薈植物10產(chǎn)生的、并且位于所述凝膠和/或髓心18中的轉(zhuǎn)基因蛋白。圖l特別地顯示表皮14、皮層或葉肉16和髓心或髓18。所述表皮14形成所述葉的外層細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)方面，一個(gè)轉(zhuǎn)基因的蘆薈植物IO可以包含位于一種或多種這些組織中的,薈細(xì)胞，所述細(xì)胞暫時(shí)地或穩(wěn)定地整合一種遺傳的構(gòu)建體，所述遺傳構(gòu)建體被所述蘆薈細(xì)胞表達(dá)。所述皮層16包含富含葉綠體，以及維管束、木質(zhì)部和韌皮部的細(xì)胞。所述髓心18是海綿狀的薄壁組織并且至少部分地代表所述凝膠，所述薄壁組織幾乎僅由大的皮層細(xì)胞組成，所述凝膠可以有助于整合或蓄積一種或多種目標(biāo)轉(zhuǎn)基因蛋白。所述表皮14通常由單外層細(xì)胞組成。就在所述表皮14的下面是包含維管束網(wǎng)絡(luò)的皮層16。所述維管束的外支撐通常由鞘細(xì)胞提供。所述維管束由三種常見(jiàn)的管狀結(jié)構(gòu)組成木質(zhì)部、韌皮部和相關(guān)的大的中柱鞘管。所述木質(zhì)部將水和礦物質(zhì)從所述植物的根運(yùn)送到葉。所述韌皮部在整個(gè)植物中運(yùn)輸?shù)矸酆推渌铣傻奈镔|(zhì)。所述中柱鞘管包含一種膠乳或樹(shù)液，所述膠乳或樹(shù)液含有非常多的輕瀉劑蒽醌，特別是聲薈素。所述蒽醌吸收太陽(yáng)的紫外線，并且防止所述聲薈葉12的中央部分過(guò)熱，所述蘆薈葉12通常的功能是作為所述蘆薈植物的水貯藏器官。所述維管束的中柱鞘部分附著到所述表皮14上，而所述維管束的剩余部分突出到所述髓心18中。所述聲薈葉12的最里面和主要部分是髓心18，所述髓心18至少部分地組成所述凝膠。為了提取凝膠，通常認(rèn)為所述表皮14和皮層16可以包括含有凝膠的鞘。所述提取的凝膠(包含大量的髓心18)通常是稠的并粘的物質(zhì)，所述物質(zhì)在歷史上為了醫(yī)學(xué)的目的已經(jīng)被局部應(yīng)用于皮膚上，例如作為一種燒傷和創(chuàng)傷的治療物。所述凝膠通常的功能是作為所述，薈植物的物質(zhì)的蓄積器。所述皮層16通常合成多種碳水化合物和糖蛋白，所述碳水化合物和糖蛋白是所述聲薈植物需要的。過(guò)量合成的碳水化合物通常被轉(zhuǎn)運(yùn)到髓心18，與水和某些礦物質(zhì)一塊儲(chǔ)存。所述碳水化合物被韌皮部管轉(zhuǎn)運(yùn)到髓心18的皮層16的細(xì)胞的大液泡。然后，因?yàn)闈B透壓的原因水被所述碳水化合物吸收，從而使所述髓心18作為所述蘆薈植物的水貯藏器官。通過(guò)沿其縱軸破碎蘆薈葉12并且擠壓所述葉，將周圍的鞘中的所述凝膠通過(guò)所述斷裂面擠出來(lái)，可以相對(duì)容易地提取所述凝膠?？梢詫⑵渌奈镔|(zhì)與所述凝膠一塊從所述葉組織中提取出來(lái)。才法森迷根據(jù)一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因的蘆薈植物10通常包含一種或多種DM構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體穩(wěn)定地整合在所述植物中以表達(dá)一種或多種目標(biāo)蛋白。根據(jù)一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明產(chǎn)生一個(gè)轉(zhuǎn)基因的蘆薈植物可以涉及各種新的組合物和方法。典型地，開(kāi)發(fā)一種或多種DNA構(gòu)建體以在所述轉(zhuǎn)基因的蘆薈植物10中表達(dá)一種或多種蛋白。在一方面，單獨(dú)一種構(gòu)建體可以表達(dá)一種mRNA。在另一方面，單獨(dú)一種構(gòu)建體可以表達(dá)多種mRNA。在又另一方面，多種構(gòu)建體可以產(chǎn)生多種mRNA。每種mRNA可以產(chǎn)生一種或多種多肽。為了將所述構(gòu)建體引入到所述,薈植物中，聲薈細(xì)胞或未分化的胼胝體組織通常被應(yīng)用，如圖2的一般性地顯示。所述,薈細(xì)胞和胼胝體組織典型地來(lái)自于根或葉分生組織，或者來(lái)自于一個(gè)聲薈植物的種子。使用許多如圖3中圖表顯示的技術(shù)和/或構(gòu)建體，將所述DNA構(gòu)建體引入所述聲薈細(xì)胞中。通過(guò)閱讀本公開(kāi)內(nèi)容，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)知曉某些技術(shù)?？梢允褂酶鞣N技術(shù)篩選已整合有所需構(gòu)建體的蘆薈細(xì)胞或胼胝體組織。典型地，所述DNA構(gòu)建體將包含一種選擇性標(biāo)記。一旦將目標(biāo)構(gòu)建體穩(wěn)定地引入所述,薈細(xì)胞或胼胝體組織，通常從所述蘆薈細(xì)胞或胼胝體組織產(chǎn)生聲薈的小植物。可以發(fā)育成為包含所述DNA構(gòu)建的活的轉(zhuǎn)基因的蘆薈植物10的蘆薈小植物可以組成型地表達(dá)或者誘導(dǎo)性地表達(dá)目標(biāo)的一種或多種目標(biāo)蛋白。依賴于所產(chǎn)生的特定的蛋白和/或是否存在所述蛋白相關(guān)的信號(hào)序列，目標(biāo)蛋白可以在所述轉(zhuǎn)基因的聲薈植物10的局部，或者在所述轉(zhuǎn)基因的蘆薈植物10的全林中普遍存在。依賴于所述特定的構(gòu)建體和/或相關(guān)的目標(biāo)蛋白，然后可以通過(guò)無(wú)性或者有性的方式繁殖所述轉(zhuǎn)基因的,薈植物10?？梢允褂迷S多技術(shù)以從所述轉(zhuǎn)基因的,薈植物10中分離所述蛋白。然后可以進(jìn)一步地分離和/或進(jìn)一步地處理所述蛋白。這些處理可以包括酶修飾、化學(xué)修飾、摻入合適的佐劑，是可以知曉的。在一個(gè)方面，可以處理所述蛋白，將它從一種非活性(前體)的形式轉(zhuǎn)變成一種活性形式，以進(jìn)行所述特定蛋白的具體的應(yīng)用，。勿,^》、岸如圖2中的示例性序列所示，在整合目標(biāo)構(gòu)建體之前，通常從一個(gè)聲薈植物中分離蘆薈細(xì)胞或者蘆薈細(xì)胞群。通?；谄湓偕芰?lái)選擇用于DNA構(gòu)建體的聲薈細(xì)胞類型?？梢允褂脕?lái)自蘆薈植物的莖分生組織或根分生組織的分生細(xì)胞或者來(lái)自聲薈種子的胚的蘆薈細(xì)胞。然而，所述蘆薈植物的許多部分保持再生或形成胼胝體組織的能力，并且也可以使用所述部分。通?？梢允褂迷S多技術(shù)分離所述細(xì)胞，本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過(guò)閱讀本公開(kāi)內(nèi)容將會(huì)知曉所述技術(shù)。典型地，使用解剖刀機(jī)械地從所述聲薈植物分離所述細(xì)胞?；蛘?，其他機(jī)械的或非機(jī)械的技術(shù)可以被應(yīng)用于分離目標(biāo)細(xì)胞，這是本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過(guò)閱讀本公開(kāi)內(nèi)容后可以知曉的。一旦分離了合適的聲薈細(xì)胞或者聲薈細(xì)胞群，通常使所述聲薈細(xì)胞在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)以形成胼胝體組織。雖然某些技術(shù)不需要所述蘆薈細(xì)胞首先生長(zhǎng)成胼胝體組織，但是所述胼胝體組織提供了未分化聲薈細(xì)胞的集合的來(lái)源，所述未分化聲薈細(xì)胞保持產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的蘆薈植物10的能力。所述胼胝體組織通常在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。然而，所述胼胝體組織也可以被置于液體培養(yǎng)基中，并且懸浮生長(zhǎng)。所述分生細(xì)胞可以從聲薈植物的根尖或葉中分離。分生，薈細(xì)胞也可以從頂端分生組織中分離。典型地，用于分離所述組織的,薈植物是年輕健康的,薈植物。通常選擇的所述蘆薈植物不高于八(8)英寸，并具有六(6)個(gè)或少于6個(gè)的出生莖。通常通過(guò)切割成段在一個(gè),薈植物的莖上形成創(chuàng)傷。所述創(chuàng)面可以刺激所述蘆薈細(xì)胞生長(zhǎng)。通常，所述胼胝體將主要在所述切表面上開(kāi)始生長(zhǎng)。為了從,薈葉12分離,薈細(xì)胞，通常從新生枝的遠(yuǎn)端切段。然后將所述段部分置于生長(zhǎng)培養(yǎng)基上。枝頂端分生組織源自于距新生蘆薈植物的底端一英寸處的切割。將所述,薈葉12從所述切面去除，并且防止所述段。在所述"切口"中發(fā)現(xiàn)所述分生組織,薈細(xì)胞。通過(guò)它們?cè)谂囵B(yǎng)皿上不斷生長(zhǎng)一形成胼胝體組織或再生枝的能力"選擇"或"分離"它們。一旦分離所述分生組織蘆薈細(xì)胞，就將它們培養(yǎng)在合適的培養(yǎng)基上，并且處于促進(jìn)胼胝體組織形成的條件下。從種子分離所述胚的蘆薈細(xì)胞通常包括去除所述種皮以暴露所述胚，并且從所述胚機(jī)械地剝離目標(biāo),薈細(xì)胞。所述聲薈種子經(jīng)典型地滅菌處理，并且除去所述種子的外殼。為了從蘆薈植物或者聲薈胚機(jī)械地移出所述^"薈細(xì)胞，通?？梢允褂媒馄实?。一旦從所述種皮中分離胚的聲薈細(xì)胞，就將它們培養(yǎng)在合適的培養(yǎng)基上，并且處于促進(jìn)胼胝體組織形成的條件下。當(dāng)需要胼胝體組織時(shí)，所述分離的,薈細(xì)胞通常在有利于胼胝體組織的條件下生長(zhǎng)，這是本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過(guò)閱讀本公開(kāi)內(nèi)容可以知曉的。典型地，將所述分離的聲薈細(xì)胞在合適的固體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中放置并生長(zhǎng)，以在轉(zhuǎn)化之前形成直徑大約為lcm大小的胼胝體組織。,薈細(xì)胞通常生長(zhǎng)在攝氏23-26度下。合適的培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)固體或液體培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基將通常包含補(bǔ)充的無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)素一常量元素(例如氮、硫、磷、鈣、鎂和鉀)和微量元素(例如鐵、硼、鈷、銅、碘、錳、鉬和鋅)；包括糖(蔗糖或麥芽糖)和維生素以及輔因子(硫胺素、煙酸、生物素、吡哆素、尤其是肌醇)的有機(jī)營(yíng)養(yǎng)素；氨基酸(例如脯氨素和酪蛋白水解產(chǎn)物)；以及主要是生長(zhǎng)素源的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(通常是(NAA)，1-萘乙酸；(IAA)，-引哚-3-醋酸；或(2，4-D)，2，4-二氯苯氧代乙酸)和細(xì)胞分裂素的源(通常為(BAP)6-千氨基噤呤)。這些培養(yǎng)基和維生素通常是以預(yù)配制的組合物的形式市售，所述組合物具有各種濃度的無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)素和維生素，并且已知有MS培養(yǎng)基(Murashige-Skoog)、Gamborg培養(yǎng)基或ChuN6培養(yǎng)基。另外，在培養(yǎng)皿(Petridishe)上生長(zhǎng)的細(xì)胞通常需要固體基質(zhì)載體，例如在所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基中加入瓊脂。扁種建傳^^4'合適的DNA構(gòu)建體通常被引入到由分離的,薈細(xì)胞衍生的胼胝體組織，以通過(guò)形成轉(zhuǎn)基因的蘆薈植物IO產(chǎn)生目標(biāo)蛋白。也可以將DNA構(gòu)建體引入分離的聲薈細(xì)胞或成熟的蘆薈細(xì)胞，這是本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過(guò)閱讀本公開(kāi)內(nèi)容后可以知曉的。為了增殖所述構(gòu)建體并且將其引入所述蘆薈細(xì)胞，DNA構(gòu)建體通常被整合進(jìn)入栽體(例如質(zhì)?；虿《?中。一種示例性質(zhì)粒載體可以包括由Invitrogen(Carlsbad,California)生產(chǎn)的商品名為pZErO的質(zhì)粒，出于示例性目的顯示在圖4的圖表中，并且，例如可以包含該質(zhì)粒的一種或多種功能組件。根據(jù)本發(fā)明的DNA構(gòu)建體可以包括能夠在聲薈細(xì)胞中起作用的啟動(dòng)子序列、編碼目的蛋白的序列、終止序列和能夠在蘆薈細(xì)胞中起作用的翻譯起始和終止位點(diǎn)。當(dāng)正確地配置并組合這些組件的時(shí)候，它們可以在蘆薈細(xì)胞中啟動(dòng)DNA的轉(zhuǎn)錄和mRNA的翻譯，以及它們各自的終止。所述DNA構(gòu)建體還可以包括分泌信號(hào)。另外，一些目標(biāo)蛋白，例如干擾素，可以包含一個(gè)天然的或合成的結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域指引干擾素的分泌。當(dāng)所述蛋白離開(kāi)所述細(xì)胞的時(shí)候這些分泌信號(hào)通常會(huì)被切下來(lái)，或者在某些情況下這些分泌信號(hào)可以保持在所述蛋白上而基本上不影響所述蛋白的功能。可以將分泌信號(hào)加到各種需要分泌信號(hào)來(lái)進(jìn)行易位的蛋白上。這些分泌信號(hào)可以來(lái)自于各種植物的分泌序列。所述DNA構(gòu)建體或一種相關(guān)載體也可以包含至少一種可選標(biāo)記。在一方面，所述DM構(gòu)建體可以包含用于所述載體在細(xì)菌中的增殖的第一可選標(biāo)記，和一種用于在,薈細(xì)胞中生長(zhǎng)的可選標(biāo)記。另外，所述DNA構(gòu)建體可以包含其他的調(diào)控元件，所述元件也是為了在所述聲薈植物10中的特定聲薈細(xì)胞中表達(dá)。其他構(gòu)建體元件可以包含額外的調(diào)控元件，例如增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的5，端引導(dǎo)序列和內(nèi)含子、3，端非翻譯區(qū)(例如多腺苷酸化信號(hào)和位點(diǎn))、運(yùn)輸肽的DNA。目標(biāo)DNA序列(例如編碼目標(biāo)治療蛋白的序列)的擴(kuò)增可以通過(guò)多聚酶鏈反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)(參見(jiàn)編號(hào)為4，683，202和5，928,906的美國(guó)專利，均通過(guò)引用納入本文)。通過(guò)閱讀本公開(kāi)內(nèi)容，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)明白，使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的方法可以修飾所述DNA構(gòu)建體以改變它們的功能，所述DNA構(gòu)建體包括啟動(dòng)子序列、調(diào)控序列、穩(wěn)定序列、靶向序列和/或終止序列。如上文所述，通?？梢允褂靡环N在,薈細(xì)胞中起作用的啟動(dòng)子。所述啟動(dòng)子通常包含調(diào)控蛋白和分子可以結(jié)合的遺傳元件。這些蛋白通常包括RNA聚合酶和其他轉(zhuǎn)錄因子。所述啟動(dòng)子可以在一個(gè)功能位置和/或方向上與核酸序列可操作地連接，以控制該序列的轉(zhuǎn)錄起始和/或表達(dá)?？梢詫⑺鰡?dòng)子與或者不與一個(gè)"增強(qiáng)子"連接，所述增強(qiáng)子是指一種順式作用調(diào)控序列，所述調(diào)控序列涉及一段核酸序列的轉(zhuǎn)錄激活。自然地，使用一種啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子是重要的，所述啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子在表達(dá)必需的蘆薈植物10的至少一種細(xì)胞類型中可以有效地指導(dǎo)所述DM片段表達(dá)。那些分子生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常知曉啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和細(xì)胞型組合在蛋白表達(dá)中的用途，例如參見(jiàn)Sambrooketal.(1989)，通過(guò)引用的方式納入本文中。所述使用的啟動(dòng)子可以是組成型的、組織特異性的、誘導(dǎo)型的和/或在合適的條件下起作用的啟動(dòng)子，以指導(dǎo)所述引入的DNA片段的高水平的表達(dá)，這對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白和/或肽是有利的。所述啟動(dòng)子可以是異源的或者內(nèi)源的。所述DNA構(gòu)建體通常需要能夠在,薈細(xì)胞中起作用的轉(zhuǎn)錄和翻譯起始和終止調(diào)控信號(hào)?？梢允褂么罅康恼{(diào)控轉(zhuǎn)錄起始的序列。控制轉(zhuǎn)錄起始的DNA序列可以來(lái)自于農(nóng)桿菌、病毒或植物。來(lái)自花椰菜花葉病毒的35S病毒轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域(35S-CaMV)可以被用于聲薈植物10。可以被應(yīng)用于,薈植物10的植物啟動(dòng)子還可以包括來(lái)自各種單子葉或雙子葉植物的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶UUBISCO)小亞基啟動(dòng)子或者來(lái)自玉米的泛素啟動(dòng)子。可以使用其他合適啟動(dòng)子，并且這是本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過(guò)閱讀本公開(kāi)內(nèi)容后可以知曉的。如果需要誘導(dǎo)型調(diào)控，那么結(jié)構(gòu)域可以來(lái)自不同的來(lái)源，使得來(lái)自一個(gè)來(lái)源的調(diào)控區(qū)域與來(lái)自另一個(gè)來(lái)源的RNA多聚酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域組合。表達(dá)的調(diào)控可以是在轉(zhuǎn)基因的蘆薈植物的io發(fā)育的特定階段、在所述轉(zhuǎn)基因的聲薈植物10的特定部分(如根、葉、種子、花、樹(shù)液)中，或者可以是在植物部分和發(fā)育階段的組合中。對(duì)一個(gè)特定發(fā)育階段或組織的表達(dá)調(diào)控可能需要其他的DNA元件，這是本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過(guò)閱讀本公開(kāi)內(nèi)容后是可以知曉的。許多在植物細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子已經(jīng)在文獻(xiàn)中有所描述，并且可能被應(yīng)用于聲薈細(xì)胞中。它們包括存在于植物基因組中的啟動(dòng)子，以及其他來(lái)源的啟動(dòng)子，包括根瘤土壤桿菌的根瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒上攜帶的胭脂堿合酶(N0S)啟動(dòng)子和章魚(yú)堿合酶(0CS)啟動(dòng)子；和例如花椰菜花葉病毒的花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子。另外，在各種參考文獻(xiàn)中也已經(jīng)鑒定了各種其他的啟動(dòng)子，所述參考文獻(xiàn)包括但不限于編號(hào)為5,858,742和5,322,938的美國(guó)專利，所述專利公開(kāi)了來(lái)自于花椰菜花葉病毒(CaMV35S)的組成型啟動(dòng)子版本；編號(hào)為5，641，876的美國(guó)專利，所述專利公開(kāi)了一種水稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子；公布號(hào)為2002/0192813A1的美國(guó)專利申請(qǐng)，所述申請(qǐng)公開(kāi)了在有效植物表達(dá)載體設(shè)計(jì)中有用的5，，3，和內(nèi)含子元件；序列號(hào)為09/757，089的美國(guó)專利申請(qǐng)，所述申請(qǐng)公開(kāi)了一種玉米葉綠體醛縮酶啟動(dòng)子；序列號(hào)為08/706,946的美國(guó)專利申請(qǐng)，所述申請(qǐng)公開(kāi)了一種水稻谷蛋白啟動(dòng)子；序列號(hào)為09/757,089的美國(guó)專利申請(qǐng)，所述申請(qǐng)公開(kāi)了一種玉米醛縮酶(FDA)啟動(dòng)子；和序列號(hào)為No.60/310，370的美國(guó)專利申請(qǐng)，所述申請(qǐng)公開(kāi)了一種煙胺合酶啟動(dòng)子，所有這些專利和專利申請(qǐng)通過(guò)引用的方式納入本文。這些和大量的在植物細(xì)胞中發(fā)揮功能的其他啟動(dòng)子可以被應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因蘆薈植物中，用于表達(dá)目標(biāo)治療蛋白。作為一個(gè)具體的實(shí)例，可以使用來(lái)自玉米的所述泛素啟動(dòng)子(SEQ.ID.NO.44)。所述來(lái)自玉米的泛素啟動(dòng)子是一個(gè)大的元件，接近2kb長(zhǎng)，它由至少三段普通區(qū)域組成。所述的啟動(dòng)子的序列在圖5中給出，并且標(biāo)出了特別相關(guān)的特征。所述泛素啟動(dòng)子的第一段位于最5，端，并包含基質(zhì)結(jié)合區(qū)(MAR),所述MAR是與組蛋白和其他核蛋白相互作用的元件，并且作為"伸向環(huán)外的"側(cè)翼序列，使之更易于接近所述細(xì)胞轉(zhuǎn)錄裝置。它們也協(xié)助將轉(zhuǎn)錄元件彼此分開(kāi)，這對(duì)于防止在一個(gè)位置起始的轉(zhuǎn)錄"通讀"到第二個(gè)序列是重要的。這可以有利于減少形成反義信使的危險(xiǎn)。所述第二段包含增強(qiáng)子元件和真正的啟動(dòng)子。所述增強(qiáng)子元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，所述轉(zhuǎn)錄因子負(fù)責(zé)指導(dǎo)所述轉(zhuǎn)錄裝置(polII復(fù)合體)結(jié)合啟動(dòng)子并且起始化轉(zhuǎn)錄。雖然"啟動(dòng)子"具體地指與所述核心轉(zhuǎn)錄起始裝置相互作用必需的必要DNA元件，但是所述術(shù)語(yǔ)啟動(dòng)子更廣泛地被應(yīng)用于包括涉及轉(zhuǎn)錄起始的所有的DM元件，并且在這種情況下，所述"泛素啟動(dòng)子"被泛指目標(biāo)克隆基因5'端的2kb區(qū)域或其修飾。第三段包含一段大約lkb的內(nèi)含子。內(nèi)含子是轉(zhuǎn)錄的基因的區(qū)域，所述區(qū)域被通過(guò)剪接的步驟從最終翻譯的信使(mRNA)中去除。也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)備選的增強(qiáng)子元件以及通過(guò)促進(jìn)RNA信使從核到細(xì)胞質(zhì)的易位(部分地與剪接相關(guān)的過(guò)程)增加蛋白的翻譯，內(nèi)含子可以直接地影響基因表達(dá)。然而，在轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)中存在內(nèi)含子不一定總是導(dǎo)致RM表達(dá)或者蛋白翻譯水平的提高。在某些方面，所述泛素內(nèi)含子可以被修飾以減少所述載體的總大小，并且以評(píng)估它們對(duì)所述聲薈中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的作用。在本發(fā)明的其他方面，可能需要在所述蘆薈植物的綠色組織中優(yōu)先表達(dá)。這種用途需要的啟動(dòng)子可以包括那些來(lái)自于如擬南芥核酮糖-1，5-二磷酸羧4匕酶(Rubisco)小亞基(Fischhoffetal.(1992)PlantMolBiol.20:81-93)、醛縮酶和丙酮酸正磷酸雙激酶(PPDK)(Taniguchietal.(2000)PlantCellPhysiol.41(1):42-48)的基因的啟動(dòng)子。如前所述，可以改變所述啟動(dòng)子以包含多個(gè)"增強(qiáng)子序列"，以協(xié)助增強(qiáng)基因表達(dá)。這樣的增強(qiáng)子是本領(lǐng)域中已知的。通過(guò)在這樣的構(gòu)建體中包含一個(gè)增強(qiáng)子序列，可以增強(qiáng)所選蛋白的表達(dá)。雖然這些增強(qiáng)子通常存在于一個(gè)在真核細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始的5，端，但是也可以將它們插入到所述編碼序列的上游(5，)或下游(3，)。在某些情況下，這些5，端增強(qiáng)元件是內(nèi)含子。作為增強(qiáng)子特別有用的是水稻肌動(dòng)蛋白1(參見(jiàn)編號(hào)為5,641,876的美國(guó)專利)和水稻肌動(dòng)蛋白2基因的5，端內(nèi)含子、玉米乙醇脫氫酶基因內(nèi)含子、玉米熱休克蛋白70基因內(nèi)含子(編號(hào)為5，593，874的美國(guó)專利)和玉米皺縮l基因。根據(jù)本發(fā)明的方面的構(gòu)建體可以包含一個(gè)3，端元件，所述元件通常包含一個(gè)多腺苷信號(hào)和位點(diǎn)。眾所周知的3，端元件包括那些來(lái)自于根癌農(nóng)桿菌基因的3，端元件，如nos3，、tml3，、tmr3，、tms3，、ocs3，、tr73，，例如在編號(hào)為6,090,627的美國(guó)專利中公開(kāi)的，通過(guò)引用的方式納入本文；來(lái)自如小麥(TriticumaesevUum)熱休克蛋白17(Hspl73，)、小麥泛素基因、小麥果糖-l，6-二磷酸酶基因、水稻谷蛋白基因、水稻乳酸脫氫酶基因和水稻P微管蛋白基因的植物基因的3，端元件，所有這些元件都在美國(guó)公布的專利申請(qǐng)2002/0192813Al中公開(kāi)，該文獻(xiàn)通過(guò)引用的方式納入本文；和豌豆(Pisumsativum)核酮糖二磷酸羧化酶基因(rbs3，)，以及來(lái)自宿主植物內(nèi)部的基因的3，端元件?？梢员徽线M(jìn)所述DNA構(gòu)建體中的結(jié)構(gòu)基因編碼一種目標(biāo)蛋白。所述結(jié)構(gòu)基因可以是一個(gè)哺乳動(dòng)物基因或哺乳動(dòng)物基因的一部分。目標(biāo)結(jié)構(gòu)基因可以編碼干擾素、免疫球蛋白、淋巴因子、生長(zhǎng)因子、激素、血液因子、組織相容性抗原、酶或其他蛋白。出于示例性目的，干擾素a-2的序列被作為SEQ.ID.NO.33列出。結(jié)構(gòu)基因也可以編碼標(biāo)記蛋白，例如來(lái)自水母的綠色熒光蛋白(GFP)?？梢孕揎椝鼋Y(jié)構(gòu)基因的DNA序列以使其在,薈植物10中高水平表達(dá)。所述,薈植物10的密碼子偏好可能不同于用于分離所述結(jié)構(gòu)基因的原始物種的密碼子偏好?？梢愿脑焯烊坏慕Y(jié)構(gòu)基因以優(yōu)化所述,薈植物10中編碼的蛋白的產(chǎn)生。此外，可以改造所述結(jié)構(gòu)基因的DNA序列以在,薈植物10中提供合適的糖基化，所述糖基化不影響所述蛋白的結(jié)構(gòu)。可以通過(guò)能夠在聲薈植物10中起作用的各種轉(zhuǎn)錄和翻譯終止序列提供轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止。在一方面，所述終止序列可以包括來(lái)自于農(nóng)桿菌的胭脂堿合酶(NOS)基因的序列。在另一方面，所述終止序列可以衍生自蘆薈本身的基因和蛋白的終止序列。在所述DNA構(gòu)建體中經(jīng)常整合一個(gè)標(biāo)記基因。利用所述標(biāo)記基因，可以從所有不包含所述標(biāo)記基因的細(xì)胞群中選擇包含目標(biāo)基因結(jié)構(gòu)的細(xì)胞。標(biāo)記基因可以包括酶或其他蛋白，所述其他蛋白提供卡那霉素、氯霉素、G418和慶大霉素等抗性。如果以例如農(nóng)桿菌作為一種栽體，那么可能還需要其他特異性的DNA序列。如果所述DNA被定位于特定的細(xì)胞類型，那么可以有其他區(qū)域。如上文所述，所述DNA構(gòu)建體也可以包括一種分泌信號(hào)。構(gòu)建體還可以包含編碼一種信號(hào)肽的易位序列，所述信號(hào)肽可以定位所述治療蛋白，用于將所述蛋白從產(chǎn)生它的細(xì)胞中移出。在文獻(xiàn)中已經(jīng)鑒定了多種信號(hào)序列，所述信號(hào)序列在植物中發(fā)揮作用，更具體地說(shuō)是在如聲薈植物的單子葉植物中發(fā)揮作用。這些信號(hào)序列可以被可操作地整合進(jìn)入所述構(gòu)建體中或者目標(biāo)基因中。在一個(gè)方面，可以使用來(lái)自于水稻(0ryzasativa)的ct淀粉酶分泌序列(SEQ.IDNO.29)。對(duì)這個(gè)信號(hào)序列的特征的描述參見(jiàn)"Thealpha-amylasegenesinOryzasativa"MolGenGenet.，1990April;221(2):235-44，它的全文通過(guò)引用的方法納入本文?；蛘撸恍┠繕?biāo)基因一一例如干擾素——可以包含一個(gè)結(jié)構(gòu)域(天然的或合成的)，所述結(jié)構(gòu)域指導(dǎo)干擾素的分泌。所述分泌信號(hào)在所述蛋白離開(kāi)細(xì)胞時(shí)被切掉，或者在某些情況下，可以被所述蛋白保留而基本上不影響所述蛋白的功能。分泌信號(hào)可以被加到各種需要分泌信號(hào)進(jìn)行易位的蛋白上。這些分泌序列可以衍生自各種植物分泌序列。圖6A至6B顯示構(gòu)建體的示例性集合，所述構(gòu)建體用于從,薈植物產(chǎn)生蛋白。用pzUI(TGC9)標(biāo)記所述質(zhì)粒構(gòu)建體。TGC9包含啟動(dòng)人干擾素oc-2和pzUEK(TGC12)(SEQ.ID.NO.38)表達(dá)的全長(zhǎng)的泛素啟動(dòng)子、啟動(dòng)包含eGFP(增強(qiáng)的綠色熒光蛋白)(SEQ.ID.NO.31)和卡那霉素抗性蛋白的融合蛋白表達(dá)的全長(zhǎng)的泛素啟動(dòng)子。所述融合蛋白將兩個(gè)蛋白(選擇和顯示)的篩選性質(zhì)合并為一。如圖所示，使用每條都包含兩個(gè)不同限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(引物序列見(jiàn)表I)的PCR引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增人干擾素oc-2基因產(chǎn)生所述質(zhì)粒pzI(TGC8)。所述擴(kuò)增的干擾素(IFN)基因具有5，端的A"和勘/hHI側(cè)位點(diǎn)，以及3'端的5^cl和側(cè)位點(diǎn)。所述PCR生成的IFN然后作為一個(gè)戶Wl/J力o1片段克隆進(jìn)pZErO載體以產(chǎn)生所述構(gòu)建體pzI(TGC8)，并且為后續(xù)的克隆引入所述勘/aHI和^cl。這個(gè)構(gòu)建體包含全長(zhǎng)的IFNa基因和其信號(hào)序列，負(fù)責(zé)指導(dǎo)IFN蛋白從所述細(xì)胞的分泌。這顯示在滑動(dòng)圖(slide)3上。對(duì)這些PCR生成的克隆測(cè)序以確定不存在任何的DNA突變。如圖所示，通過(guò)將IFNa-2基因克隆到所述全長(zhǎng)的泛素啟動(dòng)子的下游產(chǎn)生所述質(zhì)粒載體pzUI(TGC9)。將所述IFN的尸Wl/J7o1片段從pzl(TGC8)中釋放，并且與pzU(TGCl)連接以產(chǎn)生所述構(gòu)建體pzUI(TGC9)。這在滑動(dòng)圖3上顯示。如圖所示，使用包含勘/hHI(5'端)和(3'端)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(引物序列見(jiàn)表I)的引物進(jìn)行eGFP基因的PCR擴(kuò)增。這個(gè)PCR產(chǎn)生的eGFP基因沒(méi)有終止密碼子(以最終使一種eGFP-kan融合蛋白可以4皮表達(dá))。因此，翻譯不在所述eGFP序列末端終止。用限制性內(nèi)切酶勘威I17和消化所述PCR擴(kuò)增的片段，并且連接到pZEr0的勘/hHI和位點(diǎn)中，產(chǎn)生pzEnostop(TGCIO)。這顯示在滑動(dòng)圖3上。對(duì)這些PCR生成的克隆測(cè)序以確定不存在任何的DNA突變。如圖所示，pzEK(TGCll)形成一種eGFP基因和卡那霉素抗性基因之間的融合構(gòu)建體。將eGFP以勘iaHI/Z力o1片段形式從pzEnostop(TGC10)釋放，并且與pzK(TGC4)連接以產(chǎn)生所述構(gòu)建體pzEK(TGCll)。所述eGFP基因被克隆到閱讀框內(nèi),并且在kan/nos(SEQ.ID.NO.35)的5，。如圖所示，包含eGFP/kan/nos盒的來(lái)自pzEK(TGC11)的勘/aHI/J6al片段被克隆到pzUI(TGC9)的勘/hHI和J6al位點(diǎn)，以使eGFP/kan融合基因可以表達(dá)。所述IFN序列因此被去除。這個(gè)新構(gòu)建體(pzUEK(TGC12))從全長(zhǎng)的泛素啟動(dòng)子(在滑動(dòng)圖4中描述)開(kāi)始表達(dá)所述eGFP/kan融合蛋白。該融合蛋白保持每個(gè)單獨(dú)的蛋白的特性，并且因此明顯同時(shí)具有顯示標(biāo)記和選擇性試劑雙功能。圖7A至7C顯示一個(gè)其他示例性構(gòu)建體集合，所述構(gòu)建體用于從聲薈植物產(chǎn)生目標(biāo)蛋白。所示栽體使兩種基因可以作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄子表達(dá)，雖然所述轉(zhuǎn)錄子仍然被翻譯成兩個(gè)不同的蛋白。為了實(shí)現(xiàn)這個(gè)目的，通過(guò)插入IRES元件(內(nèi)部核糖體進(jìn)入序列)(SEQ.ID.NO.34)將兩個(gè)基因彼此分開(kāi)。所述IRES元件可為核糖體附著和翻譯提供一個(gè)第二內(nèi)部位點(diǎn)。所述第二位點(diǎn)使轉(zhuǎn)錄子克隆到所述IRES元件的3，端，以獨(dú)立地翻譯。這些載體，即pzUSEIrK(TGC18)(SEQ.ID.NO.43)和pzUIIrK(TGC19)(SEQ.ID.NO.39)被分步驟地構(gòu)建，最終使eGFP或IFN(分別地)與所述卡那霉素抗性標(biāo)記同時(shí)表達(dá)。如圖所示，通過(guò)首先使用包含勘/aHI(5，端)和(3，端)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(引物序列見(jiàn)表I)的引物進(jìn)行eGFP基因的PCR擴(kuò)增來(lái)產(chǎn)生pzEnostart(TGC13)載體。該P(yáng)CR產(chǎn)物作為一個(gè)Aa/DHI/5^cI片段凈皮克隆進(jìn)pZErO。在這個(gè)構(gòu)建體中的所述eGFP基因缺少ATG翻譯起始位點(diǎn)，因?yàn)樵摰鞍资亲鳛榕c所述oc淀粉酶信號(hào)序列(見(jiàn)構(gòu)建體pzSE，TGC14)的融合體表達(dá)的。這顯示在滑動(dòng)圖5上。對(duì)這些PCR生成的克隆測(cè)序以確定不存在任何DM的突變。如圖所示，合成所述oc淀粉酶基因的信號(hào)序列的一條鏈，然后通過(guò)使用PCR(引物序列見(jiàn)表I)進(jìn)行填補(bǔ)生成雙鏈。然后，用限制性內(nèi)切酶戶WI和勘/hHI消化并克隆進(jìn)pzEnostart(TGC13)。這顯示在滑動(dòng)圖5上。所述信號(hào)序列被克隆到閱讀框中，eGFP的5'端，并且為信號(hào)序列eGFP融合體提供翻譯起始位點(diǎn)。對(duì)產(chǎn)生的pzSE(TGC14)克隆測(cè)序以確定不存在任何的DNA突變。如圖所示，構(gòu)建所述載體pzUSE(TGC15)以將oc淀粉酶信號(hào)序列(ss)-eGFP融合體與具有泛素啟動(dòng)子相連接。來(lái)自pzSE(TGC14)的包含所述ss-eGFP的基因盒被作為一個(gè)A"/5^cI片段克隆到pzUI(TGC9)中。這替代所述IFN基因盒(通過(guò)用限制性內(nèi)切酶戶WI和wcl消化從pzUI(TGC9)釋放)產(chǎn)生pzUSE(TGC15)。這顯示在滑動(dòng)圖5上。如圖所示，使用包含AcI(5，端)和(3，端)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的引物進(jìn)4亍PCR擴(kuò)增從pIRES2-EGFP(Clontech，BDBiosciences)產(chǎn)生IRES元件。所擴(kuò)增的IRES元件作為一個(gè)Acl/Z&ol片段被克隆到pZEr0中以形成pzlr(TGC16)。這顯示在滑動(dòng)圖6上。對(duì)這些PCR生成的克隆測(cè)序以確定不存在任何的DNA突變。如圖所示，然后將來(lái)自pzlr(TGC16)的IRES元件作為一個(gè)AcI/J7o1片段克隆到pzK(TGC4)中以形成pzIrK(TGC17)。因此，定位所述kan/nos基因盒的IRES上游。如圖所示，所述IRES-kan/nos基因盒作為Acl/Z6al片段被克隆到pzUSE(TGC15)中以形成pzUSEIrK(TGC18)。這顯示在滑動(dòng)圖6上。該構(gòu)建體將eGFP作為與所述ot淀粉酶信號(hào)序列的融合體表達(dá)，定位所述eGFP以從所述細(xì)胞中分泌。這使得可視地監(jiān)視蛋白在所述轉(zhuǎn)化的植物內(nèi)的運(yùn)輸和聚積成為可能。該載體還表達(dá)所述卡那霉素抗性蛋白(由所述IRES內(nèi)部元件翻譯)，并且使得可以在轉(zhuǎn)基因植物中選擇。如圖所示，所述IRES-kan/nos基因盒可以作為Acl/Z6al片段被克隆到pzUI(TGC9)中以形成pzUIIrK(TGC19)。這顯示在滑動(dòng)圖7上。該構(gòu)建體表達(dá)IFNoc-2，它具有用于分泌的信號(hào)序列。該載體還表達(dá)所述卡那霉素抗性蛋白(由所述IRES內(nèi)部元件翻譯)，并且可以在轉(zhuǎn)基因植物中選擇。TGC18和TGC19都以單個(gè)的轉(zhuǎn)錄子形式表達(dá)兩個(gè)基因，省去了對(duì)第二啟動(dòng)子的需求，并且因此縮小了每個(gè)栽體的總大小。這是重要的，因?yàn)榭s小轉(zhuǎn)染的構(gòu)建體的總大小會(huì)增加這些元件轉(zhuǎn)移到核中的效率，導(dǎo)致了穩(wěn)定的整合以及轉(zhuǎn)基因植物的選擇。單啟動(dòng)子系統(tǒng)還會(huì)降低破壞側(cè)翼基因的表達(dá)的風(fēng)險(xiǎn)或者其他可能最終影響轉(zhuǎn)基因表達(dá)的情況。上面列出的質(zhì)?？梢杂闷渌繕?biāo)編碼序列替代所述oc干擾素。如本領(lǐng)域的技術(shù)人員知曉的，這些替代可以在所述質(zhì)粒中的相同位點(diǎn)或者其他位點(diǎn)。根據(jù)本發(fā)明的方面，也可以將一種凝血酶原編碼序列(SEQ.ID.NO.36)整合進(jìn)一個(gè)質(zhì)粒載體，如圖8中所圖示顯示的。凝血酶原是凝血酶的前體蛋白。它被活化的因子X(jué)(FactorX)在2位切割以釋放活化的凝血酶，所述凝血酶是一種凝結(jié)蛋白，可以將可溶性的血纖蛋白原轉(zhuǎn)化成不溶的纖維蛋白原帶。使用PCR引物(引物序列見(jiàn)表I)擴(kuò)增所述凝血酶原基因盒(1874堿基對(duì))。利用限制性內(nèi)切酶勘/HHI將所述eGFP基因盒從pzUSEIrK(TGC18)栽體上釋放。隨后將所產(chǎn)生的5，突出粘性末端用綠豆核酸酶除去以形成平端。使用小牛腸磷酸酶(CIP)通過(guò)在攝氏50度下孵育2個(gè)小時(shí)進(jìn)行所述平端的去磷酸化，之后在攝氏15度下與所述凝血酶原基因盒連接過(guò)夜。這產(chǎn)生pzUSTIrK(TGC20)(SEQ.ID.NO.42)。對(duì)PCR生成的克隆測(cè)序以確定不存在任何的DNA突變。根據(jù)本發(fā)明的方面，也可以將一種皮離蛋白(Dermcidin)(DCD)編碼序列(SEQ.ID.NO.30)整合進(jìn)一個(gè)質(zhì)粒載體，如圖8中所圖示顯示的。皮離蛋白是一種最近報(bào)道的寬光鐠抗菌肽，被發(fā)現(xiàn)在汗腺中組成型的表達(dá)。該蛋白分泌到汗液中，并且被轉(zhuǎn)運(yùn)到表皮的表面。所述PCR擴(kuò)增的DCD基因盒具有側(cè)翼的勘/aHI限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)(引物序列見(jiàn)表I)。所述勘izHI消化的DCD基因盒與原來(lái)被eGFP占據(jù)的pzUSEIrK(TGC18)的位點(diǎn)連接，形成pzUSDIrK(TGC21)載體(SEQ.ID.NO.40)。對(duì)PCR生成的克隆測(cè)序以確定不存在任何的DNA突變。根據(jù)本發(fā)明的方面，也可以將一種人生長(zhǎng)激素(hGH)編碼序列(SEQ.ID.NO.32)整合進(jìn)一個(gè)質(zhì)粒載體，也如圖8中所圖示顯示的。所述hGH基因盒通過(guò)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生，具有側(cè)翼的勘感I限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)(引物序列見(jiàn)表I)。然后將所述AirfH消化的hGH基因盒與原來(lái)被eGFP占據(jù)的pzUSEIrK(TGC18)的勘威I位點(diǎn)連接，形成pzUSHIrK(TGC22)載體(SEQ.ID.NO.41)。對(duì)PCR生成的克隆測(cè)序以確定不存在任何的DNA突變。根據(jù)本發(fā)明的方面，也可以將一種人干擾素Y(hIFNg)編碼序列(SEQ.ID.NO.32)整合進(jìn)一個(gè)質(zhì)粒載體，也如圖8中所圖示顯示的。所述hlFNg基因盒通過(guò)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生，具有側(cè)翼的勘感I限制性內(nèi)切酶的側(cè)位點(diǎn)(引物序列見(jiàn)表I)。所然后將述勘/hHI消化的hIFNg基因盒與原來(lái)被eGFP占據(jù)的pzUSEIrK(TGC18)的勘/sHI位點(diǎn)連接，形成pzUSIfglrK(TGC23)載體(SEQ.ID.NO.37)。對(duì)PCR生成的克隆測(cè)序以確定不存在任何的DNA突變。表I用于產(chǎn)生其他表達(dá)基因的引物序列表<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>常對(duì)這些DNA構(gòu)建體進(jìn)行設(shè)計(jì)以促進(jìn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的聲薈植物10的形成。本領(lǐng)域中已知許多用重組DM轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法，所述方法可以被應(yīng)用到本發(fā)明中。用于將包含在栽體中的DNA構(gòu)建體整合進(jìn)聲薈細(xì)胞或組織以形成穩(wěn)定的聲薈轉(zhuǎn)化體的一些方法可以包括用根癌農(nóng)桿菌或毛根農(nóng)桿菌感染、用復(fù)制缺陷病毒感染、基因槍轉(zhuǎn)化(biolistictransformation)、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、基因轉(zhuǎn)移至花粉中、注射至生殖器官中、注射至未成熟胚中或者類似的方法。現(xiàn)在，兩種最常用于植物轉(zhuǎn)化的方法是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化和基因槍轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化的，薈細(xì)胞或胼胝體組織通常在合適的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，以篩選轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。經(jīng)常地，選擇培養(yǎng)基包含一種毒素或其他殺死非轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的選擇因子。培養(yǎng)基的各種改變將會(huì)產(chǎn)生包含目標(biāo)基因的聲薈植物10，這是本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過(guò)閱讀本>5^開(kāi)內(nèi)容可以知曉的。在轉(zhuǎn)化的實(shí)施中，任何一次轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)通常將DNA引入僅少部分的靶植物細(xì)胞中。標(biāo)記基因被應(yīng)用于為細(xì)胞的鑒定提供一個(gè)有效的系統(tǒng)，所述被鑒定的細(xì)胞是通過(guò)將轉(zhuǎn)基因DNA構(gòu)建體接受和整合進(jìn)其基因組中以獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化。優(yōu)選的標(biāo)記基因提供選擇性標(biāo)記，所述標(biāo)記提供對(duì)一種選擇劑(例如抗生素或除草劑)的抗性。對(duì)于選擇性標(biāo)記來(lái)說(shuō)，被本發(fā)明的植物抵抗的任何除草劑都是有用的試劑。潛在的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞被暴露于所述選擇劑。存活的細(xì)胞群通常將是整合賦予抗性的基因、并且以足夠水平表達(dá)以使細(xì)胞存活的那些細(xì)胞?？梢赃M(jìn)一步地檢測(cè)細(xì)胞以確定所述外源DNA的穩(wěn)定整合。通常使用的選擇性標(biāo)記基因包括那些賦予抗生素抗性的基因，所述抗生素例如卡那霉素和巴龍霉素(nptll)、潮霉素B(aphIV)和慶大霉素(aac3和aacC4);或者賦予除草劑抗性的基因，所述除草劑例如草胺磷(barorpat)和草甘膦(aroA或EPSPS)。這些選擇的實(shí)例在編號(hào)為5,550,318、5,633,435、5,780,708和6,118,047的美國(guó)專利中有說(shuō)明，所有這些專利通過(guò)引用的方式納入本文。也可以使用能夠用于可視化鑒定轉(zhuǎn)化體的選擇性標(biāo)記，例如一種表達(dá)有色蛋白或熒光蛋白(例如螢光素酶或綠色熒光蛋白(GFP))的基因，或者一種表達(dá)P葡萄糖苷酸酶的基因，或者其各種顯色底物已知的uidA基因(GUS)。通常，在一種耙植物系的基因組中隨機(jī)地引入重組DNA(即在非特異性位點(diǎn))是有用的。在特定的情況下，靶向重組DNA插入以獲得位點(diǎn)特異性的整合可能是有用的，例如替換基因組中存在的基因、使用所述植物基因組中存在的啟動(dòng)子或者在已知會(huì)活化基因表達(dá)的預(yù)定位點(diǎn)插入一段重組多核苷酸。存在幾種已知是功能性插入的特異性的重組系統(tǒng)，所述重組系統(tǒng)包括編號(hào)為4,959,317的美國(guó)專利公開(kāi)的cre-lox和編號(hào)為5,527,695的美國(guó)專利公開(kāi)的FLP-FRT,所述兩個(gè)專利通過(guò)引用的方式納入本文并且在下文中更詳細(xì)的敘述。對(duì)于基于根癌農(nóng)桿菌的植物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，存在于轉(zhuǎn)化構(gòu)建體上的其他元件將包括T-DNA左側(cè)和右側(cè)序列，以有利于將所述重組體多核苷酸整合進(jìn)入所述植物基因組中。用農(nóng)桿菌(根癌農(nóng)桿菌)侵染，在室溫下將聲薈的胼胝體組織與農(nóng)桿菌的過(guò)夜培養(yǎng)物(包含整合有所述DNA構(gòu)建體的栽體)共孵育1個(gè)小時(shí)。所述農(nóng)桿菌可以在合適的選擇性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。所述選擇性培養(yǎng)基通常包含鏈霉素和卡那霉素。所述選擇性培養(yǎng)基還可以包含乙酰丁香酮。濃度為50uM-250uM的乙酰丁香酮通常增加單子葉植物侵染性的效率。在所述選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)之后，可以將侵染的蘆薈組織轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿的無(wú)選擇性培養(yǎng)基中，在攝氏25度下黑暗中維持兩(2)天。一種合適的示例性培養(yǎng)基可以是含有乙酰丁香酮的MS培養(yǎng)基。然后可以加入頭孢嚷肟(cefotaxime),維持兩(2)天以殺死農(nóng)桿菌。然后為細(xì)胞更換含有50mg/L的卡那霉素(用于篩選轉(zhuǎn)化的蘆薈細(xì)胞)和枝誘導(dǎo)生長(zhǎng)因子(0.2mg/LNAA，2mg/LBAP)的培養(yǎng)基，維持四(4)周，16小時(shí)光照。然后可以將再生的枝轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中(含0.2mg/LNAA的1/2MS)以生成根(約4-6周后)，之后轉(zhuǎn)移至土壤。利用基因槍轉(zhuǎn)化，直接用所述載體構(gòu)建體轟擊聲薈細(xì)胞或胼胝體組織?；驑屴D(zhuǎn)化的各種實(shí)施方案和方面在編號(hào)為5,015,580(大豆)、5,550,318(玉米)、5,538,880(玉米)、5,914,451(大豆)、6,160,208(玉米)、6,399,861(玉米)和6，153，812(小麥)的美國(guó)專利中公開(kāi)，并且農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化在編號(hào)為5,159,135(棉花)、5,824,877(大豆)、5,591,616(玉米)和6,384，301(大豆)的美國(guó)專利中描述，所有這些專利通過(guò)引用的方式納入本文。此外，可以使用各種基因槍轉(zhuǎn)化的裝置，例如Bio-Rad，Inc的BiolisticPDS-1000/He津立子傳遞系統(tǒng)。在這種方法中，所述載體和關(guān)聯(lián)的DNA構(gòu)建體可以被綁定在金或其他顆粒上，并且被直接射進(jìn)所述，薈細(xì)胞。所述被轟擊的,薈細(xì)胞在黑暗中無(wú)選擇性地生長(zhǎng)4天，之后被轉(zhuǎn)移到選擇性的培養(yǎng)基。同樣，所述選擇性培養(yǎng)基可以包含50mg/L的卡那霉素。通常在8-12周內(nèi)開(kāi)始形成轉(zhuǎn)化體，并且可以將其轉(zhuǎn)移到長(zhǎng)枝和生根培養(yǎng)基繼續(xù)維持8-12周。一旦開(kāi)始形成根，可以將小植物轉(zhuǎn)移至土壤。也可以使用各種其他技術(shù)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。這些技術(shù)包括使用復(fù)制妥協(xié)的病毒載體系統(tǒng)(replicationcompromisedviralvectorsystem)的病毒感染、電穿孔(特別是對(duì)胼胝體細(xì)胞或生長(zhǎng)在液體培養(yǎng)中的原生質(zhì)體)，以及PEG或脂質(zhì)介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)移。然后可以按照與基因槍轉(zhuǎn)化的步驟相同的基本步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)化體的選擇。一旦被引入所述,薈胼胝體組織中，構(gòu)建體可以被整合進(jìn)入所述植物的遺傳物質(zhì)中，如圖3中一般性顯示的。在其他方面，所述構(gòu)建體可以被穩(wěn)定地整合到所述蘆薈植物10的遺傳物質(zhì)外的細(xì)胞中。根據(jù)所述構(gòu)建體，如果沒(méi)有某種形式的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)中，目標(biāo)蛋白可以表達(dá)也可以不表達(dá)。在一方面，構(gòu)建體一旦被引入蘆薈細(xì)胞，就可以指導(dǎo)蛋白的合成或者指導(dǎo)運(yùn)輸至所述,薈10的特定組織。典型地，這在目標(biāo)蛋白中包含靶向信號(hào)序列的時(shí)候發(fā)生。在一方面，本發(fā)明可以利用位點(diǎn)特異性的整合或切出引入蘆薈植物中的DNA構(gòu)建體。位點(diǎn)特異性的整合或切出的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它可以被用來(lái)克服傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化技術(shù)涉及到的問(wèn)題，其中轉(zhuǎn)化構(gòu)建體通常以多拷貝的形式隨機(jī)地整合進(jìn)一個(gè)宿主基因組中。如果所述外源DNA插入到一個(gè)必需基因中，這種將所要引入的DNA隨機(jī)插入所述宿主細(xì)胞的基因組中可能是致死的。另外，一個(gè)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)可能被"位置效應(yīng)"影響，所述位置效應(yīng)是由周圍基因組DM引起。此外，因?yàn)榕c植物處理多轉(zhuǎn)基因拷貝相關(guān)的困難，所述困難包括基因沉默、重組和不可預(yù)料的遺傳，所以通常需要控制插入到所述轉(zhuǎn)基因的蘆薈植物10基因組中的DNA構(gòu)建體的拷貝數(shù)量，并且經(jīng)常僅需要插入單拷貝的所述DNA構(gòu)建體。通過(guò)同源重組可以在植物中完成轉(zhuǎn)基因或部分的轉(zhuǎn)基因的位點(diǎn)特異性的整合或切出(例如見(jiàn)編號(hào)為5，527，695的美國(guó)專利，所述專利的全文通過(guò)引用的方式明確地納入本文)。同源重組是任何具有相似核苷酸序列的DM序列對(duì)之間的反應(yīng)，其中所述兩個(gè)序列相互作用(重組)以形成新的重組DM片段。隨著所述共享的核苷酸DNA序列長(zhǎng)度的增加同源重組的頻率增加，并且線性化的質(zhì)粒分子的同源重組的頻率比環(huán)形質(zhì)粒分子高。在兩個(gè)不完全相同的DNA序列之間可以出現(xiàn)同源重組，但是隨著兩個(gè)序列間差異的增加所述重組頻率會(huì)降低。通過(guò)將目標(biāo)DNA分子和與所述宿主細(xì)胞的內(nèi)源序列有同源性的序列連接，通過(guò)同源重組可以定向引入的DNA序列。一旦所述DNA進(jìn)入所述蘆薈細(xì)胞，所述的兩個(gè)同源序列可以相互作用，以在所述同源的基因組DNA序列所處位置插入所述引入的DNA序列。因此，對(duì)所述引入的DNA上包含的同源序列的選擇將決定所述引入的DNA通過(guò)同源重組整合的位點(diǎn)。例如，如果目標(biāo)DNA序列和與一個(gè)宿主聲薈細(xì)胞的單拷貝基因同源的DNA序列連接，那么目標(biāo)DNA序列將通過(guò)同源重組僅插入到單個(gè)特異性位點(diǎn)。然而，如果目標(biāo)DNA序列和與所述宿主真核細(xì)胞的多拷貝基因同源的DNA序列連接，那么目標(biāo)DM序列可以通過(guò)同源重組在每個(gè)所述基因拷貝存在的特異性位點(diǎn)進(jìn)行插入。通過(guò)涉及單互惠重組(導(dǎo)致插入全長(zhǎng)的引入DNA)或者通過(guò)雙互惠重組(導(dǎo)致僅僅插入位于所述兩個(gè)重組事件之間的DNA)的同源重組反應(yīng)，可以在所述宿主基因組中插入DNA。例如，如果希望將一個(gè)外源基因插入到一個(gè)選定基因所處的基因組位點(diǎn)中，所述引入的DNA應(yīng)該包含與所述選定的基因同源的序列。然后單個(gè)的重組事件會(huì)導(dǎo)致所述整個(gè)的引入DNA序列被插入到所選定的基因中?；蛘?，通過(guò)將目標(biāo)DNA序列(所述意欲插入到所述基因組中的序列)的每一端側(cè)接與所選定的基因同源的DNA序列，可以實(shí)現(xiàn)雙重組事件。涉及每個(gè)所述同源側(cè)翼區(qū)的同源重組事件將導(dǎo)致所述外源DNA的插入。因此，僅僅那些位于共享基因組同源性的兩個(gè)區(qū)域之間的DNA序列可以被整合進(jìn)入所述基因組中。雖然引入的DNA序列可以通過(guò)同源重組被定向插入到特異性基因組位點(diǎn)，但是在高等真核生物中，與隨機(jī)插入事件相比，同源重組是相對(duì)少的事件。在蘆薈細(xì)胞中，外源DNA分子在所述蘆薈植物的基因組中發(fā)現(xiàn)同源序列，并且以大約0.5-4.2x10—4的頻率重組。因此，包含通過(guò)同源重組整合的引入DNA序列的任何轉(zhuǎn)化的細(xì)胞將也可能包含許多拷貝的隨機(jī)整合引入的DM序列。避免這些隨機(jī)插入的一種方法是^f吏用一種位點(diǎn)特異性重組酶系統(tǒng)。通常，一種位點(diǎn)特異性重組酶系統(tǒng)由三個(gè)元件組成兩對(duì)DNA序列(所述位點(diǎn)特異性重組序列)和一種特異性酶(所述位點(diǎn)特異性重組酶)。所述位點(diǎn)特異性重組酶將僅催化兩個(gè)位點(diǎn)特異性重組序列之間的重組反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明，可以使用大量的不同的位點(diǎn)特異性重組酶系統(tǒng)，包括但不限于噬菌體P1的Cre/lox系統(tǒng)(編號(hào)為5,658,772的美國(guó)專利，所述專利的全文通過(guò)引用的方式明確地納入本文)、酵母的FLP/FRT系統(tǒng)(GolicandLindquist，1989)、喧菌體Mu的Gin重組酶(MaeserandKahmann，1991)、E.coli的Pin重組酶(Enomotoetal.，1983)和pSRl質(zhì)粒的R/RS系統(tǒng)(Arakietal.，1992)。所述噬菌體PICre/lox和酵母FLP/FRT系統(tǒng)組成用于轉(zhuǎn)基因的位點(diǎn)特異性整合或切出的兩種特別有用的系統(tǒng)。在這些系統(tǒng)中，一種重組酶(Cre或FLP)將特異性地與其各自的位點(diǎn)特異性重組序列(分別是lox或FRT)相互作用，以反轉(zhuǎn)或切出所述間隔序列。這兩個(gè)系統(tǒng)的序列相對(duì)比較短(lox為34bp并且FRT為47bp)，并且因此方便與轉(zhuǎn)化載體聯(lián)合使用。圖8顯示了使用Flp/Frt和Cre/Loxp重組酶系統(tǒng)的一種具體的示例性方案。在一個(gè)這樣的系統(tǒng)中，來(lái)自噬菌體和酵母的位點(diǎn)特異性重組酶可以被用作在試管中和在活體器官中操作DNA的工具。重組酶/重組位點(diǎn)的組合可以包括Cre-Lox、FLP-FRT和R-RS,其中Cre、FLP和R是重組酶，并且Lox、FRT和RS是重組位點(diǎn)。為了使用這個(gè)系統(tǒng)，可以產(chǎn)生一種包含用于重組的特異性位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因植物。通過(guò)轉(zhuǎn)染一種載體、表達(dá)一種選擇性標(biāo)記并且設(shè)計(jì)包含串聯(lián)排列的Frt和Lox位點(diǎn)，產(chǎn)生一種親代的轉(zhuǎn)基因的蘆薈植物10。所述Frt和Lox位點(diǎn)都由三個(gè)元件組成，在每個(gè)長(zhǎng)度都是十三個(gè)(13)核苷酸的兩個(gè)(2)反向重復(fù)之間的長(zhǎng)度為八個(gè)(8)核苷酸的間隔序利。所述反向重復(fù)序列作為所述特異性重組酶的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，而所述間隔元件是可變的，但是對(duì)于同源重組是必須的。通過(guò)改變LoxP或者FRT位點(diǎn)處的間隔元件，可以產(chǎn)生用于重組的多個(gè)不同位點(diǎn)。通過(guò)改變Frt和Lox位點(diǎn)，可以形成一個(gè)允許多位點(diǎn)定向整合的系統(tǒng)(如在圖8中列出的)。該系統(tǒng)可以具有許多優(yōu)點(diǎn)。生成所述的初始的親代植物之后，使內(nèi)源基因的破壞最小。通過(guò)位點(diǎn)特異性重組酶的表達(dá)可以提高所述轉(zhuǎn)化的效率。使用串聯(lián)排列的lox和frt位點(diǎn)使得可以選擇性的除去選擇的標(biāo)記而保留目標(biāo)基因。并且一旦形成一林親代植物，細(xì)胞的增殖和再生能力會(huì)得到提高。然而，所述親代植物是第一步，并且按照標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)化方法(基因槍或農(nóng)桿菌)形成。通過(guò)一種包含LoxP和Frt位點(diǎn)以及目標(biāo)基因和一種選擇性標(biāo)記的載體與一種表達(dá)所述Cre重組酶的載體共轉(zhuǎn)染，形成后續(xù)的轉(zhuǎn)基因植物。Cre重組酶的表達(dá)誘導(dǎo)所述載體的LoxP位點(diǎn)和所述親本植物的同源重組。通過(guò)表達(dá)選擇性標(biāo)記選擇轉(zhuǎn)化體，并且誘導(dǎo)所述轉(zhuǎn)化體再生。用表達(dá)Flp重組酶的后續(xù)轉(zhuǎn)化可以除去所述選擇性標(biāo)記并且使得可以隨后整合到其他Loxp位點(diǎn)中。在聲薈細(xì)胞或f薈組織轉(zhuǎn)化之后，所述轉(zhuǎn)化的聲薈細(xì)胞或蘆薈組織可以生長(zhǎng)成小植物。可以在再生培養(yǎng)基中培養(yǎng)在所述選擇劑暴露中存活的,薈細(xì)胞或者在篩選實(shí)驗(yàn)中得分為正的聲薈細(xì)胞，并且使它們發(fā)育成轉(zhuǎn)基因的蘆薈植物10?？梢詫⒂赊D(zhuǎn)化的，薈細(xì)胞再生的發(fā)育中的蘆薈小植物轉(zhuǎn)移到植物生長(zhǎng)基質(zhì)并硬化，例如在一個(gè)大約85%的相對(duì)濕度、600ppmC02和25-250微愛(ài)因斯坦(microeinstein)m—2S—1的光照的環(huán)境控制箱中，然后轉(zhuǎn)移至一個(gè)溫室或生長(zhǎng)室中成熟。依賴于所述初始組織，在轉(zhuǎn)化體被鑒定后，所述轉(zhuǎn)化的聲薈植物IO再生大約6周至10個(gè)月。通?？梢詼y(cè)試所述再生的轉(zhuǎn)化蘆薈植物10或其子代種子或植物的所述重組DNA的表達(dá)。從轉(zhuǎn)化的未分化的胼胝體組織或分生組織再生的轉(zhuǎn)基因,薈植物10主要涉及生長(zhǎng)因子生長(zhǎng)素和激動(dòng)素的處理。所述第一步是啟動(dòng)枝的生長(zhǎng)。枝誘導(dǎo)培養(yǎng)基通常包含低濃度的生長(zhǎng)素(0.2mg/LNAA)和相對(duì)高濃度的細(xì)胞分裂素(2mg/LBAP)。降低糖濃度至2%的蔗糖(影響滲透壓)也可有助于植物的再生。在生枝培養(yǎng)基上的細(xì)胞被置于25t:的培養(yǎng)箱中，以12小時(shí)的白晝循環(huán)。在開(kāi)始形成的枝達(dá)到約2cm的長(zhǎng)度后將其從所述原始胼胝體上切除，并且置于生根培養(yǎng)基中。也可以將這些根維持在生枝培養(yǎng)基中以促進(jìn)其他枝的發(fā)育。生根培養(yǎng)基促進(jìn)根的發(fā)育，并且通常包含1/2的MS培養(yǎng)基和相對(duì)低濃度的生長(zhǎng)素(0.2mg/LNAA)。在根開(kāi)始發(fā)育之后(1-2cm),將所述小植物轉(zhuǎn)移至土壤眾并且逐漸減少所述相對(duì)濕度使之適應(yīng)環(huán)境。一旦產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的蘆薈植物IO之后，可以通過(guò)種子、克隆繁殖的方法或其他的方法繁殖所述轉(zhuǎn)基因的蘆薈植物10，所述其他方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過(guò)閱讀本公開(kāi)內(nèi)容后可以知曉的。雙控參4'控參勿/敏提承并遂必f冷于所述蘆薈植物io的各種組織中，所述組織包括根、塊莖、葉、種子、花、樹(shù)液或植物部分和發(fā)育階段的結(jié)合。在一方面，目標(biāo)一種或多種蛋白可以富集在所述葉的中央部分的凝膠基質(zhì)中。在另一方面，當(dāng)從所述聲薈葉12中提取之后，一種或多種目標(biāo)蛋白可以是生物活性的并且可以提供某種程度的藥用效果。在另一方面，一種或多種目標(biāo)蛋白與在所述凝膠基質(zhì)中存在的至少一種自身的蘆薈蛋白、碳水化合物和/或其他化合物協(xié)同地作用，以便為患者提供所需的治療?？梢詮目偵锪炕騻€(gè)別的組織提取蛋白。從植物細(xì)胞提取蛋白的方法可以包括物理的和化學(xué)的方法。從葉中或樹(shù)液中提取蛋白的方法可以涉及到過(guò)濾、超速離心、化學(xué)萃取和親和層析。在一方面，目標(biāo)蛋白可能積聚在所述轉(zhuǎn)化的,薈植物10的葉的凝膠中。這個(gè)區(qū)域主要是水，大約99%，并且沒(méi)有有害的蛋白酶。所述凝膠的提取是本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解的已知技術(shù)。一些蛋白，特別是化妝品用的蛋白，可以直接被用于補(bǔ)充所述聲薈凝膠，并且絕不需要從所述凝膠中將其單獨(dú)地分離出來(lái)。實(shí)施例分離植物細(xì)胞的方法在第一個(gè)實(shí)例中，用于直接應(yīng)用或用于胼胝體的初始化的枝分生組織分離自所述蘆薈的莖，所述蘆薈是聲薈(Aloevera)(庫(kù)拉索蘆薈)、開(kāi)普蘆薈(Aloeferox)或木立蘆薈(Aloearborescence)。去除葉部分，并且沿所述,薈葉的縱軸方向從側(cè)面將莖切開(kāi)。用吐溫20(0.05%)和次氯酸鹽(5%)的混合液將組織滅菌10分鐘，之后用乙醇浸泡30秒鐘，用3x的無(wú)菌水沖洗。然后將切片暴露表面?zhèn)认蚍胖迷诤傊?0.8-1%)的MS培養(yǎng)基的平亞中，所述MS培養(yǎng)基包含各種濃度的所述生長(zhǎng)因子、生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素，以及2-3%的蔗糖。根據(jù)所需的過(guò)程，改變生長(zhǎng)條件。無(wú)枝發(fā)育的胼胝體培養(yǎng)通常是通過(guò)在沒(méi)有BAP或含有低濃度的BAP(0.2mg/L)的NAA(2-5mg/L)中培養(yǎng)這些切片開(kāi)始。未分化的細(xì)胞開(kāi)始沿被切割的莖的區(qū)域生長(zhǎng)，并且可以在不同的皿上傳代和維持。通過(guò)將這種片段置于生枝培養(yǎng)基上可以直接開(kāi)始枝誘導(dǎo)，所述生枝培養(yǎng)基是包含O.2mg/LNAA(或IAA0.2mg/L)和2mg/LBAP的MS培養(yǎng)基。NAA和IAA二者都可以作為生長(zhǎng)素的來(lái)源，并且有效果的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素都有一個(gè)濃度范圍。來(lái)自未成熟胚的胼胝體細(xì)胞可以從市售的種子發(fā)育而來(lái)。所述種子首先被滅菌(乙醇30秒，5%次氯酸鹽加0.05%的吐溫20中15分鐘，并在無(wú)菌水中清洗3次)。然后將滅菌的種子置于水中，4攝氏度下過(guò)夜。通過(guò)除去種皮分離未成熟胚。在所述三角形的種子的一個(gè)角切開(kāi)一個(gè)小口，并且將胚擠出。然后將它置于MS培養(yǎng)基上，所述培養(yǎng)基僅包含生長(zhǎng)素(NAA2-5mg/L)以誘導(dǎo)胼胝體，或者包含生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素(NAA0.2mg/L，BAP2mg/L)以誘導(dǎo)驕胝體和枝增殖。糖濃度通常是2-3%。在去葉的年輕,薈植物10的底部剪下的1-2厘米的片段，由所述片段可以發(fā)育成來(lái)自所述枝頂端分生組織的胼胝體細(xì)胞。所述片段經(jīng)過(guò)表面滅菌，重新放置于含1%瓊脂的MS培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基含生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素(2mg/LNAA、0.2mg/LBAP)。在1-2周內(nèi)開(kāi)始胼胝體細(xì)胞的誘導(dǎo)。然后可以從這些培養(yǎng)物中分離細(xì)胞，并且將所述細(xì)胞用作轉(zhuǎn)化的起始材料?！鰳?gòu)建體i.pBI121泛素干擾素栽體(pBI-UI)。所述pBI121農(nóng)桿菌二元載體被用作產(chǎn)生pBI-UI的骨架。使用包含5，Pstl和3，Sacl/Xhol限制性位點(diǎn)的基因特異性引物從人293個(gè)細(xì)胞中擴(kuò)增具有信號(hào)序列的人干擾素oc-2基因。所述587bp的千擾素PCR產(chǎn)物被克隆到pZEr0中并測(cè)序。通過(guò)擴(kuò)增來(lái)自所述載體pUBI-GFP的區(qū)域并克隆進(jìn)5，Hindin和3，Pstl限制性位點(diǎn)中，來(lái)自玉米的1962bp的泛素(Ubi)啟動(dòng)子元件也被克隆進(jìn)pZErO。然后，使用Hindm/Pstl(pZEr0UI)將所述Ubi片段亞克隆進(jìn)入所述pZero干擾素載體。然后使用Hindin/Pstl將所述完整的Ubi干擾素盒亞克隆到pBI121中，并且去除所述CaMV35S啟動(dòng)子和GUS基因形成pBIUI。該載體保留了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的感染和轉(zhuǎn)化必需的右側(cè)和左側(cè)T-元件邊緣區(qū)域，并且轉(zhuǎn)化和表達(dá)受Nos啟動(dòng)子控制的卡那霉素抗性基因(NPTII)。ii.pZErO泛素干擾素IRES卡那霉素。(pZUIIK)該載體的產(chǎn)生是通過(guò)將所述Ubi啟動(dòng)子克隆進(jìn)所述pZErO克隆栽體。在該片段的之后克隆一個(gè)盒，所述盒包含人干擾素cx-2、IRES(內(nèi)部核糖體進(jìn)入序列)和卡那霉素抗性基因。該單元被表達(dá)為單個(gè)的轉(zhuǎn)錄物，30但被翻譯成兩種不同的蛋白(由IRES提供的第二翻譯起始位點(diǎn)導(dǎo)致)。這使得所述選擇性標(biāo)記和干擾素都在所述Ubi啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。iii.使用Cre和Flp重組酶的雙質(zhì)粒系統(tǒng)。首先產(chǎn)生一個(gè)親代植物，所述植物可表達(dá)具有用于定向整合的ere和flp位點(diǎn)的選擇性標(biāo)記。引入具有目標(biāo)基因的載體的另一次轉(zhuǎn)染被靶向所述cre位點(diǎn)。然后使用flp去除不需要的遺傳物質(zhì)。將DNA構(gòu)建體導(dǎo)入分離的植物細(xì)胞i.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移用所述pBIUI栽體電穿孔農(nóng)桿菌菌林LB4404(Invitrogen，Carlsbad,CA)，并且在含50ug/ml的卡那霉素和100ug/ml鏈霉素的LB瓊脂平板上篩選陽(yáng)性克隆。攝氏30度下，使單克隆在含250uM的乙酰丁香酮的LB培養(yǎng)基中過(guò)夜生長(zhǎng)。感染的發(fā)生是通過(guò)將植物片段或胼胝體浸入所述過(guò)夜的培養(yǎng)物中，在無(wú)菌濾紙上干燥印跡，并且在攝氏25度于黑暗中放置于包含250uM的乙酰丁香酮的MS瓊脂平板上。感染兩天之后，將組織轉(zhuǎn)移到包含200uM的頭孢噢將(cefotaxime)的MS瓊脂平板上以殺死農(nóng)桿菌。然后將所述組織轉(zhuǎn)移到含50mg/L的卡那霉素、0.2mg/L的NAA和2mg/L的BAP的MS瓊脂平板上以篩選轉(zhuǎn)化體，并且誘導(dǎo)枝再生。所述組織在12小時(shí)光照和攝氏25度下生長(zhǎng)。使不定枝生長(zhǎng)到大約2cm的長(zhǎng)度，然后將其剪下并且移植到生根培養(yǎng)基上繼續(xù)篩選。檢測(cè)表達(dá)目標(biāo)基因的小植物的表達(dá)水平，并且將其轉(zhuǎn)移到土壤中。ii.基因槍基因轉(zhuǎn)移用包含所述DNA構(gòu)建體的載體包被金顆粒(0.6-1um)。所述金顆粒在70%的乙醇中攪拌并浸泡清洗15分鐘，之后在無(wú)菌水中清洗3次。然后將所述金顆粒重新懸浮于50%的丙三醇中至60mg/ml的濃度。為了在所述清洗的顆粒上包被載體DM，將3mg的顆粒加入1.5ml的微量離心管中。在所述微量離心管中加入5ul濃度為1ug/ul的DNA、50ul2.5MCaCl2和20ul0.1M亞精胺，并且攪拌2-3分鐘。使之沉降、離心l-2秒并棄去液體。加入140ul70%的乙醇，離心并棄去液體。加入140ul100%的乙醇，離心并棄去液體。在沉淀中加入48ul100%的乙醇并輕輕地再懸浮。將所述基因槍裝置(PDS1000/He，Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA)用70%的乙醇滅菌。使用巨攜帶子支撐物(macrocarrierholder)和停止屏(推薦設(shè)置)之間的最小間隙距離裝配所述基因槍裝置。用移液管將包被的金顆粒(8ul)滴入所述巨攜帶子中央。根據(jù)所述靶組織(6cm組織，9cm胼胝體)設(shè)定所述乾距離，破圓盤(pán)(rupturedisk)為600-1100psi。在第一實(shí)例中，在轟擊后細(xì)胞被置于包含2mg/LMA的無(wú)選擇性MS瓊脂平板上，在攝氏25度下的黑暗中培養(yǎng)1周。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含用于選擇的50mg/L的卡那霉素的MS瓊脂平板上繼續(xù)4-5周，所述瓊脂平板含生長(zhǎng)素(2mg/LMA)和細(xì)胞分裂素(0.2mg/L，6-節(jié)氨基嘌呤)。所述細(xì)胞在攝氏25度下以12小時(shí)的光照生長(zhǎng)。在第二實(shí)例中，在一個(gè)MS的平板(4g/LMS鹽、lmg/L(1000X)MS維生素儲(chǔ)液、2mg/LNAA、100mg/L肌醇、2.76g/L脯氨酸、30g/L蔗糖、100mg/L酪蛋白水解產(chǎn)物、36.4g/L山梨糖醇、36.4g/L甘露醇、2.5g/L固化劑(gelrite)，pH5.8)上進(jìn)行微粒轟擊。在轟擊后，所述轟擊的胼胝體留在MSOSM上1個(gè)小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移到MS初始培養(yǎng)基中(4g/LMS鹽、1mg/L(1000X)MS維生素儲(chǔ)液、2mg/LNAA、100mg/L肌醇、2g/L脯氨酸、30g/L蔗糖、100mg/L酪蛋白水解產(chǎn)物、2.5g/L固化劑(gelrite)，pH5.8)。在MS上7-10天之后，所述轟擊的胼胝體被轉(zhuǎn)移到含50mg/L的卡那霉素的MSS選擇培養(yǎng)基中(4g/LMS鹽、1mg/L(1000X)MS維生素儲(chǔ)液、2mg/LNAA、100mg/L肌醇、30g/L蔗糖、2.5g/L固化劑(gelrite)，pH5.8)用于篩選轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在3周后，單胼胝體碎片被轉(zhuǎn)移到新鮮MSS培養(yǎng)基中。在轟擊的6-8周內(nèi)，由選定的胼胝體碎片產(chǎn)生卡那霉素抗性克隆。iii.原生質(zhì)體原生質(zhì)體是沒(méi)有其外細(xì)胞壁的植物細(xì)胞。產(chǎn)生這些細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)是提高轉(zhuǎn)染的效率，并且可以將這樣的細(xì)胞融合形成一種體細(xì)胞雜種。體細(xì)胞雜種可以將來(lái)自不同植物的基因混合，有可能獲得完全新的細(xì)胞。使用根據(jù)本發(fā)明的原生質(zhì)體的技術(shù)可以包括在液體培養(yǎng)中生長(zhǎng)所述細(xì)胞(對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中的2-3天)。然后離心所述細(xì)胞(1000x重力，5分鐘)。所述細(xì)胞被重新懸浮于含纖維素酶、浸解酶和果膠酶的溶液中。在攝氏25度黑暗中振蕩過(guò)夜。離心(600x重力，5分鐘)并除去上清液。在培養(yǎng)基中重新懸浮所述原生質(zhì)體，并且多次離心以除去微量的酶。所述原生質(zhì)體不能被存儲(chǔ)或者用于增殖，并且必須被盡快用于轉(zhuǎn)染或體細(xì)胞融合。產(chǎn)生包含DNA構(gòu)建體的存活的植物在第一個(gè)實(shí)例中，利用其細(xì)胞毒素(例如卡那霉素)的抗性篩選成功的轉(zhuǎn)化體。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞必須表達(dá)所述抗性標(biāo)記和目標(biāo)基因，例如編碼干擾素的基因，以及能夠再生成完整的植物。將50mg/L的卡那霉素加到所述MS瓊脂平板以啟動(dòng)篩選。所述篩選過(guò)程部分地依賴于所述細(xì)胞復(fù)制的速度，但是可以在6-10周間發(fā)生。在這個(gè)時(shí)間中，通過(guò)在所述MS瓊脂平板中加入0.2mg/LNAA和2mg/LBAP誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的組織的再生，并且用12小時(shí)/光照循環(huán)促進(jìn)枝的發(fā)育(繼續(xù)使用選擇壓力)。當(dāng)不定枝開(kāi)始發(fā)育的時(shí)候，在大約2cm長(zhǎng)時(shí)可以對(duì)它們進(jìn)行基因表達(dá)的檢測(cè)。隨后將表達(dá)目標(biāo)基因產(chǎn)物的枝(利用RT-PCR、Western印跡和生物檢驗(yàn)測(cè)定)轉(zhuǎn)移到MS瓊脂平板上以誘導(dǎo)根形成(1/2MS加0.2mg/LNAA)。在第二個(gè)實(shí)例中，轉(zhuǎn)基因胼胝體的再生的實(shí)現(xiàn)是通過(guò)將大約15個(gè)小碎片(約4mm)轉(zhuǎn)移到含有經(jīng)過(guò)濾滅菌的卡那霉素(50mg/L)的再生培養(yǎng)基I中(4.3g/LMS鹽、1ml/L(1000X)MS維生素儲(chǔ)液、100mg/L肌醇、60g/L蔗糖、3g/L固化劑(gelrite)，pH5.8)，并且在攝氏25度下黑暗中孵育2-3周。在光照下將成熟的體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移至在含有經(jīng)過(guò)濾滅菌的卡那霉素(50mg/L)的再生培養(yǎng)基II中(4.3g/LMS鹽、1ml/L(1000X)MS維生素儲(chǔ)液、100mg/L肌醇、30g/L蔗糖、3g/L固化劑(gelrite)，pH5.8)以進(jìn)行萌發(fā)。權(quán)利要求1.一種治療組合物，所述組合物包含一種有生物活性的外源蛋白，所述蛋白由在一個(gè)聲薈植物中引入的編碼序列表達(dá)，并且至少部分的所述蛋白是從所述，薈植物的蘆薈細(xì)胞被易位到,薈葉的凝膠中；和一種或多種天然的和治療性蘆薈蛋白或碳水化合物。2.—種產(chǎn)生生物活性蛋白的方法，所述方法包含制備一種DNA構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體含有一個(gè)啟動(dòng)子、一個(gè)目的編碼序列、一個(gè)終止序列和一個(gè)易位序列；將所述DNA構(gòu)建體克隆到一個(gè)聲薈植物的基因組中；增殖所述含所述DNA構(gòu)建體的蘆薈植物；并且提取一種通過(guò)所述DNA構(gòu)建體表達(dá)的目的蛋白，其中至少部分的所述蛋白是從所述,薈植物的,薈細(xì)胞被易位到蘆薈葉的凝膠中。3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，所述方法進(jìn)一步包含誘導(dǎo)編碼目的蛋白的基因轉(zhuǎn)錄的步驟。全文摘要本發(fā)明可以提供轉(zhuǎn)基因的蘆薈植物和用于蘆薈植物轉(zhuǎn)化的重組構(gòu)建體，本發(fā)明的方面可以被應(yīng)用于其他單子葉植物。所述重組構(gòu)建體可以包含一個(gè)或多個(gè)編碼哺乳動(dòng)物蛋白的DNA序列，和至少一個(gè)能夠在蘆薈植物中指導(dǎo)所述重組蛋白表達(dá)的啟動(dòng)子。本發(fā)明還提供用于構(gòu)建和產(chǎn)生一個(gè)轉(zhuǎn)基因蘆薈植物的方法。本發(fā)明包括同時(shí)用數(shù)個(gè)目的基因轉(zhuǎn)染一個(gè)蘆薈植物的方法。本發(fā)明的所述蘆薈植物的制備方法可以提供經(jīng)濟(jì)地并更安全地大量生產(chǎn)某些生物活性化合物的可能并且更容易為不富裕國(guó)家所接受，所述化合物包括用于疾病治療、診斷和預(yù)防的生物藥劑。所述蘆薈植物產(chǎn)生方法還可以制備用作化妝品的蛋白。文檔編號(hào)C12N15/82GK101313071SQ200680043903公開(kāi)日2008年11月26日申請(qǐng)日期2006年9月26日優(yōu)先權(quán)日2005年9月26日發(fā)明者K·洛里克,M·佩奇斯,N·J·勞特,W·J·勞瑟,W-S·約申請(qǐng)人:綠色細(xì)胞有限公司