專利名稱：：使用含糊精的物質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)化合物的制作方法使用含糊精的物質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)化合物所述有機(jī)化合物具有至少3個(gè)C原子或具有至少兩個(gè)C原子和至少一個(gè)N原子，所述培養(yǎng)基包含淀粉原料(feedstock)的至少部分非淀粉固體組分。含糖的液體培養(yǎng)基是用于多種發(fā)酵過程的一種基本營(yíng)養(yǎng)源；存在于培養(yǎng)基中的糖成分被使用的微生物代謝，得到有價(jià)值的有機(jī)產(chǎn)物。這樣制備的微生物代謝產(chǎn)物(即有機(jī)化合物)的范圍包括例如低分子量揮發(fā)性化合物如乙醇，非揮發(fā)性代謝物如氨基酸、維生素和類胡蘿卜素，以及多種其它物質(zhì)。根據(jù)多種過程的條件，這類通常已知的微生物發(fā)酵過程利用不同的碳原料。它們從經(jīng)由甜菜和甘蔗糖蜜的純凈蔗糖擴(kuò)展到已知的優(yōu)質(zhì)(high-test)糖蜜(轉(zhuǎn)化的甘蔗糖蜜)到來自淀粉水解產(chǎn)生的葡萄糖。另外，乙酸和乙醇作為協(xié)同底物被提及，其能夠以工業(yè)規(guī)模用于L-賴氨酸的生物技術(shù)生產(chǎn)(Pfefferle等,BiotechnologicalManufactureofLysine,AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,Vol.79(2003)，59-112)。根據(jù)上述的碳原料，建立了多種方法和步驟用于微生物代謝物的基于糖的發(fā)酵生產(chǎn)。以L-賴氨酸為例，關(guān)于菌林開發(fā)、方法開發(fā)和工業(yè)生產(chǎn)的方法例如由Pfefferle等(上述引文中)描述。用于微生物介導(dǎo)發(fā)酵生產(chǎn)微生物代謝產(chǎn)物的一種重要碳原料是淀粉。淀粉首先必須在前面的反應(yīng)步驟中被液化和糖化，然后其可以作為發(fā)酵中的碳原料被利用。為此，通常從天然淀粉原料如馬鈴薯、木薯、谷物(例如小麥、玉米、大麥、黑麥、黑小麥或稻)中以預(yù)純化的形式獲得淀粉，隨后將其用酶液化并糖化，隨后其用于實(shí)際發(fā)酵中來產(chǎn)生目的代謝產(chǎn)物。除了這類預(yù)純化的淀粉原料的用途以外，還描述了未預(yù)處理的淀粉原料用于制備碳原料的用途，所述碳原料用于發(fā)酵產(chǎn)生孩史生物代謝產(chǎn)物。通常，最初通過磨碎將淀粉原料粉碎。然后將碾磨產(chǎn)物(millbase)進(jìn)行液化和糖化。因?yàn)樵撃肽ギa(chǎn)物除淀粉外天然地含有一系列非淀粉組分，所述非淀粉組分可不利地影響發(fā)酵，所以通常在發(fā)酵前去除這些組分。去除可以在磨碎后直接進(jìn)行(WO02/077252;JP2001-072701;JP56-169594;CN1218111)、在液化后進(jìn)行(WO02/077252;CN1173541)或在糖化后進(jìn)行(CN1266102;Beukema等Productionoffermentationsyrupsbyenzymatichydrolysisofpotatoes;potatosaccharifkationtogiveculturemedium(ConferenceAbstract),Symp.Biotechnol.Res.Neth.(1983)，6;NL8302229)。然而，所有的變型涉及在發(fā)酵中使用基本純的淀粉水解產(chǎn)物。發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)化合物的最近方法尤其包括在發(fā)酵前純化淀粉原料，例如經(jīng)液化和糖化的淀粉溶液的純化(JP57159500);或提供旨在使得可能從可再生資源制備發(fā)酵培養(yǎng)基的方法(EP1205557)。相反，未加工的淀粉原料已知被大規(guī)模地用于發(fā)酵生產(chǎn)生物乙醇。此處淀粉原料(通常為完整的谷粒)首先進(jìn)行干磨，隨后使用酶將淀粉原料的淀粉組分水解。此處水解可以分批進(jìn)行(例如在攪拌容器中)或連續(xù)進(jìn)行(例如在蒸汽加壓鍋(jetcooker)中)。合適過程的描述可例如見于"TheAlcoholTextbook國(guó)Areferenceforthebeverage,fuelandindustrialalcoholindustries",Jaques等(Ed.)，NottinghamUniv.Press1995，ISBN1-8977676-735，Chapter2，pp.7to23,和McAloon等,"Determiningthecostofproducingethanolfromcornstarchandlignocellulosicfeedstocks",NREL/TP-580-28893,NationalRenewableEnergyLaboratory,October2000中。因?yàn)樵谏镆掖嫉陌l(fā)酵生產(chǎn)中，價(jià)值產(chǎn)物通過蒸餾獲得，所以使用來自干磨過程的非預(yù)純化形式的淀粉原料不構(gòu)成嚴(yán)重的問題。然而，當(dāng)使用干磨法用于生產(chǎn)其它微生物代謝產(chǎn)物時(shí)，通過糖溶液被引入發(fā)酵中的固體流是有問題的，因?yàn)槠洳粌H可對(duì)發(fā)酵具有例如關(guān)于氧轉(zhuǎn)移速率或使用的微生物的需氧量(在該語境中參閱Mersmann，A.等SelectionandDesignofAerobicBioreactors，Chem.Eng.Technol.13(1990)，357-370)的不良作用，而且也可以可觀地將隨后的加工復(fù)雜化。另外，作為引入固體的結(jié)果，甚至制備含淀粉的懸浮液時(shí)懸浮液的粘度可達(dá)到臨界值，因?yàn)槔绾卸嘤?0%重量玉米粉的懸浮液在水中不再是可均相混溶的(IndustrialEnzymology，第2版，T.Godfrey,S.West,1996)。這限制了傳統(tǒng)步驟中的葡萄糖濃度。就生物酒精的發(fā)酵生產(chǎn)而言這不再有關(guān)，因?yàn)楫a(chǎn)物對(duì)用于發(fā)酵的酵母的毒性導(dǎo)致在任何情況下不能以有意義的方式轉(zhuǎn)化更高的濃度。用低糖濃度補(bǔ)充含糖的發(fā)酵培養(yǎng)基原則上在除乙醇外的有機(jī)代謝產(chǎn)物的發(fā)酵生產(chǎn)中是不利的，因?yàn)樵摬襟E導(dǎo)致發(fā)酵液不成比例的稀釋，并因而導(dǎo)致可達(dá)到的目的產(chǎn)物最終濃度被降低，當(dāng)這些產(chǎn)物得自發(fā)酵培養(yǎng)基中時(shí)，這首先導(dǎo)致提高的成本和空間時(shí)間產(chǎn)率(space-timeyield)降低。這些考慮是重要的，特別是在淀粉水解產(chǎn)物旨在被部分地添加至較低體積的次級(jí)發(fā)酵中用于生產(chǎn)其它化學(xué)品的情況下，所述淀粉水解產(chǎn)物被生產(chǎn)用于大體積生物乙醇生產(chǎn)并傳統(tǒng)地具有按重量計(jì)最多約30%或33%的低糖或葡萄糖濃度。另一方面，發(fā)酵培養(yǎng)基中更高濃度的可代謝單糖可導(dǎo)致發(fā)酵或微生物生長(zhǎng)的抑制，或引起所使用的微生物的代謝改變。例如在大腸桿菌中，過分高的游離葡萄糖濃度導(dǎo)致形成有機(jī)酸(乙酸)，同時(shí)例如釀酒酵母(Saccharomycescerevisae)在該情況下轉(zhuǎn)化為發(fā)酵，盡管充氣的發(fā)酵罐中存在足夠的氧(crabtree效應(yīng))。因此，補(bǔ)充進(jìn)發(fā)酵中的含糖培養(yǎng)基中更高濃度的可代謝單糖可在補(bǔ)料階段對(duì)發(fā)酵具有有利的作用。在通過補(bǔ)料流向發(fā)酵中補(bǔ)充其它糖之前，在分批階段中(即發(fā)酵批次中微生物的生長(zhǎng)期期間)使用更高濃度的培養(yǎng)基也是有問題的，因?yàn)樵S多菌林需要按重量計(jì)低于6%的葡萄糖濃度用于它們的生長(zhǎng)。由于這些困難和限制，干磨法因?yàn)橐呀?jīng)被廣泛用于生產(chǎn)生物乙醇而至今保留在發(fā)酵生產(chǎn)除乙醇以外的微生物代謝產(chǎn)物中，但不具有特別的經(jīng)濟(jì)學(xué)重要性。迄今為止，僅描述了使用木薯作為淀粉原料，將干磨法概念和原則上與該方法有關(guān)而存在的優(yōu)點(diǎn)應(yīng)用于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)微生物代謝產(chǎn)物的嘗試。因此，JP2001/275693描述了用于發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸的一種方法，其中在干燥狀態(tài)下被磨碎的去皮木薯塊莖被用作淀粉原料。為了進(jìn)行該過程，必須將碾磨產(chǎn)物的顆粒尺寸調(diào)節(jié)至￡150nm。在用于該目的的過濾步驟中，在將獲得的淀粉液化/糖化和隨后發(fā)酵之前去除使用的一部分碾磨產(chǎn)物，所述部分包括不含淀粉的組分。在該過程中，獲得中等的糖濃度。類似的過程描述于JP2001/309751中，用于生產(chǎn)含氨基酸的飼料添加劑。用于發(fā)酵的液體培養(yǎng)基中提高的糖濃度可以通過使用下述碾磨產(chǎn)物來達(dá)成，所述碾磨產(chǎn)物主要包含淀粉原料的固體的、非淀粉的組分，用于通過申請(qǐng)7>司的WO2005/116228(PCT/EP2005/005728)中所述方法糖化。令人驚奇的是，顯示存在于淀粉原料中的固體的、非淀粉的組分不需要在發(fā)酵前被去除。所述過程可以在經(jīng)液化的淀粉原料的原位糖化期間進(jìn)行。4吏用在谷粒中選擇淀粉原料的一種類似方法描述于申請(qǐng)公司的PCT/EP2006/066057(較早的專利申請(qǐng)DE102005042541.0)中。提供用于發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)化合物的另一方法是本發(fā)明的一個(gè)目的，所述方法不要求之前去除存在于淀粉原料中的非淀粉固體組分，至少不要求完全去除。特別地，該方法應(yīng)當(dāng)要求相對(duì)不復(fù)雜的裝備并使得可能使用具有高糖濃度的培養(yǎng)基。另外，其特征在于容易操作所使用的培養(yǎng)基和它們?cè)诎l(fā)酵過程中沒有問題的用途。特別地，該過程將允許使用谷物作為淀粉原料。令人驚奇的是，我們發(fā)現(xiàn)用于產(chǎn)生有機(jī)化合物的發(fā)酵方法(盡管固有地引入大量固體)可以以有效的方式進(jìn)行，所述方式通過制備含糊精的培養(yǎng)基(l)并在發(fā)酵中使用該含糊精的培養(yǎng)基而不添加糖化酶，所述制備通過將淀粉原料碾磨和液化而之前不去除淀粉原料的所有非淀粉固體組分。因此本發(fā)明涉及通過發(fā)酵手段用于產(chǎn)生至少一種有機(jī)化合物的方法，所述化合物具有至少3個(gè)C原子或具有至少2個(gè)C原子和至少1個(gè)N原子，所述方法包括以下步驟al)碾磨淀粉原料從而獲得碾磨產(chǎn)物，所述碾磨產(chǎn)物包含淀粉原料的至少部分非淀粉固體組分；a2)將碾磨產(chǎn)物懸浮于水性液體中，并在至少一種淀粉液化酶的存在下將存在于水性液體中的碾磨產(chǎn)物液化，獲得水性的含糊精培養(yǎng)基(l)，該培養(yǎng)基包含淀粉原料的至少一部分非淀粉固體組分；和b)在發(fā)酵中使用水性含糊精培養(yǎng)基(l)用于培養(yǎng)微生物，所述微生物能夠過量產(chǎn)生有機(jī)化合物；以下述量添加將糊精水解為單糖的酶，所述量以4吏用的淀粉原料總重為基礎(chǔ)按重量計(jì)少于0.001%，或完全不添加。無論含糊精培養(yǎng)基(l)中使用的淀粉原料的固體非淀粉組分的含量，根據(jù)本發(fā)明的發(fā)酵方法可以以有效的方式進(jìn)行而不需要添加糖化酶。然而，可以添加不足以進(jìn)行完全糖化的'J、量糖化酶，所述用量以使用的淀粉原料的總重為基礎(chǔ)按重量計(jì)一般少于0.001%，特別少于0.0005%。作為使用糊精培養(yǎng)微生物的結(jié)果，可在發(fā)酵培養(yǎng)基(分批階段和補(bǔ)料階段二者中)中建立高濃度的可代謝糖而不導(dǎo)致不期望的次級(jí)反應(yīng)，從而避免發(fā)酵液的不期望的稀釋。另外，根據(jù)本發(fā)明的方法可在很大程度上避免在更高濃度的淀粉原料液化期間可能出現(xiàn)的粘度問題。此處和下文中，術(shù)語"含糊精培養(yǎng)基"和"含糊精液體"可互換使用。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解發(fā)酵中使用的微生物必須能夠代謝存在于水性含糊精培養(yǎng)基中的糊精，所述糊精不必須被額外添加的糖化酶水解為二糖和/或單糖。糊精可能優(yōu)選在被糖化酶水解之后被微生物代謝，所述糖化酶是菌林固有的，例如菌林所固有的葡糖淀粉酶。根據(jù)本發(fā)明的方法的特別有利的方面是在后一情況下，發(fā)酵期間的糖化速率(特別是葡萄糖的釋放)由微生物的需要自動(dòng)調(diào)節(jié)，首先由生物量數(shù)量、其次由菌林固有的糖化酶的表達(dá)水平調(diào)節(jié)。此處和下文中，術(shù)語"液化"表示淀粉水解降解為寡糖，特別是糊精。此處和下文中，術(shù)語"糖化"表示糊精水解為單糖，特別是水解為例如葡萄糖的單糖。因此，"糖化酶，，應(yīng)理解為表示將糊精水解為單糖的酶。此處和下文中，術(shù)語"糊精"應(yīng)理解為表示作為淀粉水解降解的結(jié)果獲得的寡糖，其通常由3到18個(gè)(特別是6到12個(gè))單糖單元(特別是葡萄糖單元)組成。術(shù)語"葡萄糖當(dāng)量含量"和"糖濃度"是指發(fā)酵可能使用的培養(yǎng)基中單糖、二糖和寡糖的總濃度。術(shù)語"葡萄糖當(dāng)量"也包括除葡萄糖外的可代謝糖或糖單元。此處和下文中，術(shù)語"過量產(chǎn)生，，用于表示微生物，以表征微生物以下述量產(chǎn)生一種或多種其代謝產(chǎn)物的特征，所述量超過了微生物繁殖所需的量，導(dǎo)致在發(fā)酵培養(yǎng)基中蓄積，所述蓄積能夠以細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)方式發(fā)生。適合用作本發(fā)明方法的淀粉原料的主要是干谷物或種子，其中干燥狀態(tài)下淀粉總計(jì)為按重量計(jì)至少40%，優(yōu)選按重量計(jì)至少50%。它們存在于目前大規(guī)模種植的許多谷類植物(例如玉米、小麥、燕麥、大麥、黑麥、黑小麥、稻)中和甜菜、馬鈴薯、木薯和多種高粱和黍(millet)物種，例如甜高粱(sorgo)和買羅高粱(milo)。淀粉原料優(yōu)選選自谷類，特別是玉米、黑麥、黑小麥和小麥仁。原則上，根據(jù)本發(fā)明的方法也可以用類似的淀粉原料進(jìn)行，所述淀粉原料例如多種含淀粉谷類或種子的混合物。為了制備含糊精的液體，將所述淀粉原料在步驟al)中碾磨，期間添加或不添加液體例如水，優(yōu)選不添加液體。也可能將干磨與隨后的濕磨步驟結(jié)合。通常用于干磨的設(shè)備為錘磨機(jī)(hammermill)、轉(zhuǎn)子磨(rotormill)或滾筒式磨(rollermill);適用于濕磨的是槳式混合機(jī)(paddlemixer)、攪拌式球磨機(jī)(agitatedballmill)、環(huán)流磨(circulationmill)、盤式磨(diskmill)、annularchambermill、振動(dòng)磨(oscillatorymill)或行星式磨(planetarymill)。原則上，其它磨也是合適的。濕磨法需要的液體量可以由技術(shù)人員在常規(guī)實(shí)驗(yàn)中確定。通常如下調(diào)節(jié)干物質(zhì)含量按重量計(jì)在從10%到20%的范圍內(nèi)。碾磨得到了適用于隨后方法步驟的顆粒尺寸。在本文語境中，已經(jīng)證明當(dāng)碾磨步驟(特別是干磨步驟)中、步驟al)中獲得的碾磨產(chǎn)物以按重量計(jì)從30%到100%、優(yōu)選按重量計(jì)從40%到95%、特別優(yōu)選按重量計(jì)50%到卯％的量含有下述粉末顆粒(即微粒組分)時(shí)是有利的，所述粉末顆粒具有從100jim到630fim范圍內(nèi)的顆粒尺寸。優(yōu)選獲得的碾磨產(chǎn)物按重量計(jì)包含50%的粉末顆粒，所述粉末顆粒具有大于100nm的顆粒尺寸。通常按重量計(jì)至少95%的磨碎的粉末顆粒具有少于2mm的顆粒尺寸。在本文上下文中，借助于使用振動(dòng)分析儀的篩選分析測(cè)量顆粒尺寸。通常，小的顆粒尺寸對(duì)于獲得高產(chǎn)物產(chǎn)率是有利的。然而，過分小的顆粒尺寸可導(dǎo)致問題，特別是當(dāng)碾磨產(chǎn)物在液化或加工期間被調(diào)成漿時(shí)(例如在發(fā)酵步驟后干燥固體時(shí))由凝塊形成/團(tuán)聚引起的問題。通常，粉末由出粉率(extractionrate)或粉末級(jí)別表征，它們彼此之間的關(guān)系是粉末級(jí)別特征隨著提高的出粉率而提高。出粉率對(duì)應(yīng)于以按重量計(jì)每100份使用的碾磨產(chǎn)物為基礎(chǔ)獲得的按重量計(jì)的粉末量。當(dāng)在碾磨過程中最初用進(jìn)一步的碾磨(即以提高的出粉率)獲得純凈的、超細(xì)的粉末(例如來自谷物仁內(nèi)部)時(shí)，粉末中的粗纖維和外殼含量提高，淀粉含量下降。因此出粉率也反映在已知的粉末級(jí)別中，其用作分級(jí)粉末(特別是谷粉)的特征，并以粉末的灰分含量(ashcontent)為基礎(chǔ)(已知為灰分標(biāo)尺(ashscale))。粉末級(jí)別或類型編號(hào)指出100g粉末固體焚燒后殘余的以mg計(jì)的灰分(礦物)量。在谷粉的情況下，更高的類型編號(hào)表示更高的出粉率，因?yàn)楣任锶实暮诵陌粗亓坑?jì)約0.4%的灰分，而外殼包含按重量計(jì)約5%的灰分。因此在更低出粉率的情況下，谷粉主要由粉碎的胚乳(即谷物仁中的淀粉含量)組成；在更高出粉率的情況下，谷粉也包含粉碎的、含蛋白質(zhì)的谷粒糊粉層；在粗粉的情況下，它們也包含胚(其含有蛋白質(zhì)并含有脂肪)和種殼(其含有粗纖維和灰分)的組分。就本發(fā)明的目的而言，原則上優(yōu)選具有高出粉率或高類型編號(hào)的粉末。如果使用谷類作為淀粉原料，優(yōu)選將完整的仁與它們的殼一起碾磨并進(jìn)一步加工，如果適當(dāng)?shù)脑捲陬A(yù)先機(jī)械去除胚和殼之后。根據(jù)本發(fā)明，使用的碾磨產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于出粉率包含至少一部分、優(yōu)選按重量計(jì)至少20%、尤其是按重量計(jì)至少50%、特別是按重量計(jì)至少卯％和非常特別是按重量計(jì)至少99%的存在于碾碎的谷物仁中的非淀粉固體組分。根據(jù)碾磨產(chǎn)物的淀粉組分(從而根據(jù)含糊精培養(yǎng)基(l)中可代謝糖的量)，碾磨產(chǎn)物中的非淀粉固體組分優(yōu)選總計(jì)為按重量計(jì)至少10%、尤其是按重量計(jì)至少15%、例如按重量計(jì)從15%到75%，特別是按重量計(jì)在從20%到60%的范圍內(nèi)。旨在用于步驟a2)中液化的碾磨產(chǎn)物根據(jù)本發(fā)明與水性液體(例如新鮮的水、例如來自隨后發(fā)酵的再循環(huán)過程的水)混合，或與這些液體的混合物混合。通常，這會(huì)產(chǎn)生水性懸浮液。通常，一定用量的淀粉原料或碾磨產(chǎn)物會(huì)與水性液體混合并在后者中液化，使得7K性含糊精液體(1)中存在按重量計(jì)占培養(yǎng)基(l)總重至少40%的葡萄糖當(dāng)量濃度。得到的培養(yǎng)基(l)中的干物質(zhì)含量按重量計(jì)通常占培養(yǎng)基(l)總重的至少50%。為了進(jìn)行本發(fā)明的方法，可以將用于懸浮固體碾磨產(chǎn)物的水性液體預(yù)熱至適度提高的溫度，例如在40。C到60。C的范圍內(nèi)。然而，優(yōu)選在室溫下使用液體。為了根據(jù)步驟a2)進(jìn)行碾磨產(chǎn)物淀粉部分的液化，已經(jīng)證明在開始液化之前僅將所有碾磨產(chǎn)物的一部分與水性液體混合并隨后在液化過程中將剩余的碾磨產(chǎn)物(連續(xù)或分批)添加至水性液體中是有利的。根據(jù)步驟a2)的碾磨產(chǎn)物的液化可以通過技術(shù)人員熟悉的慣常操作實(shí)現(xiàn)，例如通過已經(jīng)在開頭描述的"TheAlcoholTextbook-Areferenceforthebeverage,fuelandindustrialalcoholindustries"的第2章，第7到23頁中描述的方法。根據(jù)本發(fā)明，步驟a2)中的液化步驟在存在至少一種淀粉液化酶時(shí)進(jìn)行。為此，原則上可能使用所有的淀粉液化酶，尤其是a-淀粉酶(酶類別EC3.2.1.1),例如已經(jīng)得自地衣芽孢桿菌(Bacilluslichenformis)或Bacillusstaerothermophihis的a-淀粉酶，特別是就生物乙醇生產(chǎn)的目的用于液化通過干磨法獲得的材料的那些。適用于液化的a-淀粉酶也是可以商業(yè)獲得的，例如來自Novozymes的名稱Termamyl120LL型下的；或來自Genencor的名稱Spezyme下的a-淀粉酶。不同a-淀粉酶的組合也可以用于液化。這得到了水性液體，其包含來自碾磨產(chǎn)物的經(jīng)液化的淀粉部分，通常為具有3到18個(gè)、尤其是6到12個(gè)單糖單元的糊精，如果合適的話包含其它寡糖，如果合適的話小量的單糖和/或二糖(以單糖、二糖和寡糖的總量為基礎(chǔ)，一般按重量計(jì)<30%、通常按重量計(jì)<25%、按重量計(jì)<20%、尤其是按重量計(jì)<10%)和所使用的碾磨產(chǎn)物的非淀粉組分，尤其是用于液化的碾磨產(chǎn)物的固體非淀粉組分。淀粉液化酶和碾磨產(chǎn)物的量以下述方式有利地選擇膠凝過程中的粘度被足夠降低，使得可能通過例如攪拌將懸浮液有效混合。膠凝過程中反應(yīng)混合物的粘度優(yōu)選不大于20Pas，更優(yōu)選不大于15Pas,最優(yōu)選不大于8Pas。通常，使用裝備有M5測(cè)量系統(tǒng)和MVDIN設(shè)備的RotoViskoRV20型Haake粘度計(jì)，在50。C溫度和200s-1的剪切率下測(cè)量粘度。最初可向反應(yīng)容器中引入或者在步驟a2)期間添加a-淀粉酶(或使用的淀粉液化酶)。優(yōu)選在步驟a2)開始時(shí)添加步驟a2)中需要的一部分a-淀粉酶，或該部分可以最初被引入反應(yīng)器中。以使用的淀粉原料總量為基礎(chǔ)，a-淀粉酶的總量通常在按重量計(jì)0.002%到3.0%的范圍內(nèi)，優(yōu)選按重量計(jì)從0.01%到1.5%,特別優(yōu)選按重量計(jì)從0.02%到0.5%。液化可以在膠凝溫度之上或之下進(jìn)行。優(yōu)選步驟a2)中的液化至少部分在使用的淀粉的膠凝溫度或膠化溫度之上進(jìn)行(已知為煮過程)。所述淀粉所需的溫度是技術(shù)人員已知的(參閱已經(jīng)在開頭引用的"TheAlcoholTextbook-Areferenceforthebeverage,fuelandindustrialalcoholindustries"的第2章，第11頁)或可以由他通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定。通常，選擇的溫度在80。C和165。C之間、優(yōu)選90。C和15(TC之間的范圍內(nèi)，特別優(yōu)選在從100。C到140。C的范圍內(nèi)，所述溫度通常比膠凝溫度高至少5K、優(yōu)選至少10K并特別優(yōu)選至少20K，例如10到100K，尤其是20到80K。在這些溫度下，淀粉的顆粒結(jié)構(gòu)被破壞(凝膠)，使得后者的酶降解成為可月匕。對(duì)于最適有效的a-淀粉酶(或使用的淀粉液化酶)而言，步驟a2)優(yōu)選至少有一段時(shí)間在所述液化酶的最適pH下進(jìn)行，通常在弱酸范圍內(nèi)的pH下，優(yōu)選4.0和7.0之間、更優(yōu)選5.0到6.5之間，pH調(diào)節(jié)通常在步驟a2)之前或開始時(shí)進(jìn)行；優(yōu)選在液化過程期間檢查和適當(dāng)?shù)脑捲僬{(diào)節(jié)該pH。優(yōu)選使用稀無機(jī)酸如H2S04或H3P04或稀水性堿性氫氧化物溶液如NaOH或KOH調(diào)節(jié)pH。在步驟a2)中用于液化碾磨產(chǎn)物中淀粉部分的優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少部分的碾磨產(chǎn)物被連續(xù)或分批地添加進(jìn)水性液體中。優(yōu)選按重量計(jì)至少40%、尤其是按重量計(jì)至少50%、非常特別優(yōu)選按重量計(jì)至少55%是在液化過程的進(jìn)程期間向反應(yīng)器中添加的。通常添加的量不超過按重量計(jì)90%、尤其是按重量計(jì)85%、特別優(yōu)選按重量計(jì)80。/。。優(yōu)選在該過程的進(jìn)程中添加的碾磨產(chǎn)物部分是在液化階段期間主要的條件下被補(bǔ)充進(jìn)反應(yīng)器中的。該添加可以以若干部分分批(即按部分)進(jìn)行或者連續(xù)進(jìn)行，優(yōu)選所述部分在每種情況下總計(jì)占待液化的碾磨產(chǎn)物總量的按重量計(jì)不多于30%、特別優(yōu)選按重量計(jì)不多于20%、例如按重量計(jì)1%到30°/。、尤其是按重量計(jì)2%到20%。該實(shí)施方案的本質(zhì)方面是只有一些碾磨產(chǎn)物(優(yōu)選按重量計(jì)不多于60%、尤其按重量計(jì)不多于50%、特別優(yōu)選按重量計(jì)不多于45。/。的碾磨產(chǎn)物)在液化開始時(shí)存在于反應(yīng)器中，而碾磨產(chǎn)物的剩余部分在液化階段期間被添加。液化也可以連續(xù)進(jìn)行，例如在多步驟反應(yīng)級(jí)聯(lián)中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明方法的步驟a2)如下進(jìn)行總計(jì)占碾磨產(chǎn)物總量按重量計(jì)不多于60%、優(yōu)選按重量計(jì)不多于50%、特別優(yōu)選按重量計(jì)不多于45%、例如按重量計(jì)10%到60%、尤其是按重量計(jì)15%到50%、特別優(yōu)選按重量計(jì)20%到45%的部分最初被懸浮于水性液體中，并隨后進(jìn)行液化。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，存在至少一種a-淀粉酶時(shí)一些碾磨產(chǎn)物的不連續(xù)的或連續(xù)的添加(尤其是按部分的添加)如下進(jìn)行液體培養(yǎng)基的粘度不多于20Pas、優(yōu)選不多于15Pas、特別優(yōu)選不多于8Pas。為了幫助控制粘度，在高于存在于碾磨產(chǎn)物中的淀粉的膠化溫度之上的溫度下，添加已添加的碾磨產(chǎn)物總量的按重量計(jì)至少25%、優(yōu)選按重量計(jì)至少35%、特別優(yōu)選按重量計(jì)至少50%4皮證明是有利的。另外，還可通過按部分地添加至少一種淀粉液化酶(優(yōu)選a-淀粉酶)和/或至少一種糖化酶(優(yōu)選葡糖淀粉酶)自身來影響調(diào)控粘度。為了進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的方法，可能將用于懸浮固體碾磨產(chǎn)物的水性液體在適度提高的溫度下預(yù)熱，例如在從40。C到60。C的范圍內(nèi)。然而，優(yōu)選在室溫下使用液體。然后將至少一種淀粉液化酶(優(yōu)選a-淀粉酶)添加進(jìn)碾磨產(chǎn)物的懸浮液中。如果僅在液化階段添加一些碾磨產(chǎn)物，則僅在開始時(shí)添加一些a-淀粉酶(例如以步驟a2)中使用的所有a-淀粉酶為基礎(chǔ)按重量計(jì)10%到70%，尤其是按重量計(jì)20%到65%)是有利的。在該時(shí)間點(diǎn)添加的a-淀粉酶量取決于所述a-淀粉酶在所用的淀粉原料相關(guān)的反應(yīng)條件下的活性，并一般在以使用的淀粉原料總重為基礎(chǔ)按重量計(jì)從0.0004%到2.0%、優(yōu)選按重量計(jì)從0.001%到1.0%、特別優(yōu)選按重量計(jì)從0.02%到0.3%的范圍內(nèi)。或者，a-淀粉酶部分可以在制備懸浮液之前與使用的液體混合。使用的a-淀粉酶部分的量通常在開始加熱至用于液化的溫度之前被添加至懸浮液中，尤其是在室溫下或僅適度提高的溫度下，例如在加。C到30'C的范圍內(nèi)。然后加熱這樣制造的懸浮液，優(yōu)選加熱至高于使用的淀粉的膠凝溫度的溫度。通常，選擇在80。C和165。C之間、優(yōu)選90。C和150。C之間、特別優(yōu)選100。C和140。C之間范圍內(nèi)的溫度，該溫度通常優(yōu)選比膠凝溫度高至少5K、優(yōu)選至少10K、特別優(yōu)選至少20K、例如10到100K、尤其是20到80K。監(jiān)測(cè)粘度的同時(shí)，如果合適的話向含淀粉的懸浮液中逐漸添加更多的淀粉原料部分，例如在各情況下以使用的所有碾磨產(chǎn)物為基礎(chǔ)按重量計(jì)1%到30%、尤其是按重量計(jì)從2%到20%的部分。在該情況下優(yōu)選將液化步驟進(jìn)程中待添加的碾磨產(chǎn)物部分以至少2部分、優(yōu)選至少4部分、特別優(yōu)選至少6部分添加至反應(yīng)混合物中?；蛘呶从糜谥圃鞈腋∫旱哪肽ギa(chǎn)物部分可以在該實(shí)施方案的液化步驟期間連續(xù)添加。添加中應(yīng)當(dāng)有利地將溫度維持高于淀粉的膠凝溫度。達(dá)到期望的溫度后或適當(dāng)時(shí)所有粉末已經(jīng)被添加后，如果需要的話，通常將反應(yīng)混合物在高于淀粉膠凝溫度的溫度設(shè)置下維持一段時(shí)間，例如10到60分鐘或更久，即煮。然后，通常將反應(yīng)混合物冷卻至稍微更低的溫度，但是優(yōu)選高于膠凝溫度，例如70。C到90。C。之后如果適當(dāng)?shù)脑挘砑恿硪徊糠謅-淀粉酶，優(yōu)選最大的部分。在該情況下，取決于在所用的a-淀粉酶反應(yīng)條件下的活性，在該時(shí)間點(diǎn)添加的a-淀粉酶的量以使用的淀粉原料總量為基礎(chǔ)優(yōu)選按重量計(jì)從0.002%到2.0%、特別優(yōu)選按重量計(jì)從0.01%到1.0%、非常特別優(yōu)選按重量計(jì)從0.02%到0.4%。為了將淀粉完全降解為糊精，將反應(yīng)混合物維持在設(shè)定溫度下，或適當(dāng)時(shí)進(jìn)一步加熱，直到通過碘或適當(dāng)時(shí)通過檢測(cè)淀粉的另一測(cè)試的淀粉檢測(cè)是陰性的或至少基本上是陰性的。如果適當(dāng)?shù)脑?，這時(shí)可以向反應(yīng)混合物中添加一個(gè)或多個(gè)其它a-淀粉酶部分，例如以使用的淀粉原料總量為基礎(chǔ)按重量計(jì)從0.001%到0.5%、優(yōu)選按重量計(jì)從0.002%到0.2%的范圍內(nèi)?；蛘撸赡苋缦乱夯矸鄄糠?，首先通過引入蒸汽將包含碾磨產(chǎn)物的水性懸浮液加熱至高于存在于淀粉原料中的淀粉或碾磨產(chǎn)物的膠化溫度。通常懸浮液會(huì)被加熱至比所迷膠化溫度高至少10K、尤其是至少加K、例如10到100K、尤其是20到80K的溫度。尤其是將懸浮液加熱至從90°C到150。C的范圍內(nèi)、特別是從100。C到140。C的范圍內(nèi)。用于加熱懸浮液的蒸汽通常是具有至少105°C、尤其是至少110°C、例如110°C到210°C溫度的預(yù)熱蒸汽。該蒸汽優(yōu)選在超大氣壓(superatmosphericpressure)下被引入。因此，該蒸汽優(yōu)選具有至少1.5巴、例如1.5巴到16巴、尤其是2巴到12巴的壓強(qiáng)。通常如下將蒸汽引入懸浮液中優(yōu)選以高速度將蒸汽在超大氣壓下引入懸浮液中，優(yōu)選1到10或11巴、尤其是1.5到5巴的超大氣壓。引入蒸汽的結(jié)果是懸浮液被瞬間加熱至高于90。C的溫度，即高于膠化溫度的溫度。用蒸汽加熱優(yōu)選在裝有懸浮液的連續(xù)操作的設(shè)備中以特定的補(bǔ)料壓強(qiáng)連續(xù)進(jìn)行，所述補(bǔ)料壓強(qiáng)是由懸浮液粘度、補(bǔ)料速率和設(shè)備的幾何形狀引起的，并在懸浮液負(fù)荷區(qū)中通過可調(diào)節(jié)的噴嘴在提高的壓強(qiáng)下根據(jù)補(bǔ)料壓強(qiáng)補(bǔ)充熱蒸汽。在提高的壓強(qiáng)下補(bǔ)充蒸汽表示不僅加熱懸浮液，而且向體系中引入機(jī)械能，并且該機(jī)械能促進(jìn)碾磨產(chǎn)物顆粒的進(jìn)一步粉碎，導(dǎo)致特別均一的能量供應(yīng)，并從而導(dǎo)致碾磨產(chǎn)物中顆粒狀淀粉顆粒的特別均一的凝膠化。這些設(shè)備通常具有管狀的幾何形狀。優(yōu)選蒸汽沿管狀設(shè)備的縱軸補(bǔ)充。通常，懸浮液以至少45。的角度或以直角提供?？烧{(diào)節(jié)區(qū)域噴嘴通常具有圓錐形的幾何形狀，該圓錐在蒸汽的流動(dòng)方向逐漸變細(xì)。在該噴嘴中安置了針或安置于縱向可移動(dòng)桿上的水舌(nappe)。針或水舌與噴嘴的圓錐一起形成孔。通過縱向移動(dòng)針或桿，可以以簡(jiǎn)單的方式調(diào)節(jié)孔的大小并從而調(diào)節(jié)噴嘴口的橫斷面積，藉此可以以簡(jiǎn)單的方式控制提供蒸汽的速度。這些設(shè)備通常也裝備有混合管，在提供蒸汽后懸浮液被運(yùn)入其中并在該管中離開設(shè)備。該混合管通常沿著蒸汽提供方向并與補(bǔ)料垂直設(shè)置?；旌瞎芎蛧娮煲黄鹜ǔＰ纬煽?，懸浮液通過該孔運(yùn)輸。作為該孔的結(jié)果，在運(yùn)輸過程中額外的剪切力作用于懸浮液并從而提高對(duì)懸浮液的機(jī)械能供應(yīng)?；旌瞎芸梢砸钥煽v向移置的方式安置。移動(dòng)混合管是調(diào)節(jié)孔的尺寸從而調(diào)節(jié)設(shè)備壓差(pressuredrop)的簡(jiǎn)單途徑?，F(xiàn)有技術(shù)中這類設(shè)備已知稱作蒸汽加壓鍋，例如"TheAlcoholTextbook"第2章(上述引文中)的圖13中所示的設(shè)備是可商業(yè)獲得的，例如來自HydroThermalCorp.WaukeshaWI，USA的名稱HYDROHEATER⑧。當(dāng)反應(yīng)連續(xù)進(jìn)行時(shí)，用蒸汽處理的懸浮液通常隨后被轉(zhuǎn)移^A"反應(yīng)后區(qū)域，，(after-reactionzone)中以繼續(xù)淀粉組分的膠凝。通常，在反應(yīng)后區(qū)域中主要為超大氣壓(通常是在2到8巴范圍內(nèi)的絕對(duì)壓強(qiáng))。反應(yīng)后區(qū)域中的溫度通常在90。C到150。C的范圍內(nèi)。該反應(yīng)后區(qū)域中的滯留時(shí)間可以在1分鐘到4小時(shí)的范圍內(nèi)，取決于懸浮液的溫度。反應(yīng)后區(qū)域通常具有管狀或柱狀的幾何形狀。在一個(gè)實(shí)施方案中，反應(yīng)后區(qū)域具有垂直安置的柱的幾何形狀。此處懸浮液一旦離開蒸汽處理設(shè)^f更被施加于柱的上部區(qū)域，并在下部區(qū)域離開。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，反應(yīng)后區(qū)域具有管狀的幾何形狀。懸浮液離開反應(yīng)后區(qū)域后，壓強(qiáng)通常被釋放，并隨后進(jìn)行液化。壓強(qiáng)的釋放優(yōu)選以閃蒸的形式進(jìn)行，從而將懸浮液冷卻至(優(yōu)選)低于IOO'C、尤其是低于85。C的溫度。通常，然后在獨(dú)立的反應(yīng)容器中將被這樣崩解的淀粉液化。液化可以如上文所述進(jìn)行。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少一些或所有的、通常至少50%、尤其是至少80。/。或者所有的淀粉液化酶在蒸汽加熱過程之前被添加進(jìn)水性液體中的碾磨產(chǎn)物懸浮液中。如此，當(dāng)混合物被加熱至高于膠化溫度時(shí)，液化過程已經(jīng)發(fā)生。用蒸汽加熱和反應(yīng)后階段可以適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行。獨(dú)立的反應(yīng)容器中隨后的液化步驟可以省略。然而，會(huì)優(yōu)選進(jìn)行這類液化步驟來完成淀粉到糊精的降解。為了穩(wěn)定使用的酶，如果適當(dāng)?shù)脑捒梢岳缡褂肅aCl2將Ca"離子的濃度調(diào)節(jié)為酶特異的最佳值。合適的濃度值可以由技術(shù)人員在常規(guī)實(shí)驗(yàn)中確定。如果例如使用Termamyl作為a-淀粉酶，則將液體培養(yǎng)基中的Ca2+離子濃度調(diào)節(jié)至例如10到100ppm、優(yōu)選20到80ppm和特別優(yōu)選約30到70ppm是有利的，單位ppm是以重量為基礎(chǔ)的并表示g/1000kg。為了將淀粉完全降解為糊精，將反應(yīng)混合物保持在設(shè)定溫度下，直到通過碘或適當(dāng)時(shí)通過檢測(cè)淀粉的另一測(cè)試的淀粉檢測(cè)是陰性的或至少基本上是陰性的。如果適當(dāng)?shù)脑?，這時(shí)可以向反應(yīng)混合物中添加一個(gè)或多個(gè)其它a-淀粉酶部分，例如以使用的淀粉原料總量為基礎(chǔ)按重量計(jì)從0.001%到0.5%、優(yōu)選按重量計(jì)從0.002%到0.2%的范圍內(nèi)。因此，通常主要包含淀粉原料中所有或基本上所有組分的碾磨產(chǎn)物，料的非淀粉固體組分未被完全去除)，獲得的含糊精液體(l)也包含淀粉原料的一些或所有非淀粉固體組分。這隨后引起一定量的(例如來自谷類的)肌醇六磷酸的引入，所述量不應(yīng)被忽視。為了避免因而導(dǎo)致的抑制作用，在對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵步驟之前在步驟a2)中向培養(yǎng)基(l)中添加至少一種肌醇六磷酸酶是有利的。如果肌醇六磷酸酶對(duì)分別的高溫足夠穩(wěn)定，則其可以在液化之前、期間或之后添加。任何肌醇六磷酸酶都可以使用，只要它們的活性在各情況下不多于在反應(yīng)條件下受到可忽略的影響。使用的肌醇六磷酸酶優(yōu)選地具有>50°(:和優(yōu)選>60。C的熱穩(wěn)定性(T50)。肌醇六磷酸酶的量通常為從1到10000單位/kg淀粉原料，尤其1到4000單位/kg淀粉原料。在含糊精液體(l)的制備中也添加其它酶(例如支鏈淀粉酶、纖維素酶、半纖維素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶或蛋白酶)是有利的。這些酶的添加可對(duì)粘度具有積極作用，即降低粘度(例如通過切割長(zhǎng)鏈(也稱作較長(zhǎng)鏈)葡聚糖和/或(阿拉伯-)木聚糖)，并引起可代謝葡萄糖苷的釋放和(殘余的)淀粉的釋放。蛋白酶的使用具有類似的積極作用，另外可能釋方說發(fā)酵生長(zhǎng)因子作用的氨基酸。在步驟a2)獲得的含糊精的液體(l)通常具有按重量計(jì)至少20%((=200g/kg)、尤其是按重量計(jì)至少40%、特別是按重量計(jì)至少50%、通常在按重量計(jì)30%到75%范圍內(nèi)、優(yōu)選在按重量計(jì)40%到70%范圍內(nèi)、尤其是按重量計(jì)從50%到65%范圍內(nèi)的葡萄糖當(dāng)量濃度，所述濃度在各情況下以培養(yǎng)基(l)的總重為基礎(chǔ)。得到的液體(l)中的干物質(zhì)含量通常為按重量計(jì)至少25%、優(yōu)選按重量計(jì)至少40%、尤其是按重量計(jì)至少50%、特別是^J姿重量計(jì)至少60%,并通常不超過按重量計(jì)80%，所述含量在各濃度下以培養(yǎng)基(l)的總重為基礎(chǔ)。存在于得到的含糊精液體(l)中的葡萄糖當(dāng)量主要以單糖、尤其是糊精的形式存在。這些寡糖或糊精的主要組分通常是葡萄糖，培養(yǎng)基也可能包含小量的單糖和/或二糖和由其它單糖單元組成的寡糖單元。含糊精培養(yǎng)基(l)中的含糖組分(即單糖、二糖和寡糖)通常包含按重量計(jì)至少70%、通常按重量計(jì)至少75%、尤其是按重量計(jì)至少80%、特別是按重量計(jì)至少卯％的寡糖，尤其是糊精，即單糖和二糖總計(jì)按重量計(jì)少于30%、通常按重量計(jì)少于25%、尤其是按重量計(jì)少于20%、特別是按重量計(jì)少于10%。以葡萄糖當(dāng)量的總量為基礎(chǔ)，以游離或結(jié)合方式存在的葡萄糖通?？傆?jì)為按重量計(jì)50%到99%、尤其是按重量計(jì)75%到97%、特別是按重量計(jì)80%到95%范圍內(nèi)的培養(yǎng)基(1)的葡萄糖當(dāng)量。在步驟a2)中已經(jīng)荻得的水性含糊精液體(l)根據(jù)本發(fā)明被用于步驟b)中用于期望的有機(jī)化合物的發(fā)酵生產(chǎn)。為此，將含糊精的液體(1)補(bǔ)充*酵中，在那里其用于培養(yǎng)發(fā)酵中使用的微生物。所述有機(jī)化合物作為揮發(fā)性的或非揮發(fā)性微生物代謝產(chǎn)物在此處獲得。通常，根據(jù)步驟b)直接在發(fā)酵中使用得到的水性含糊精液體(l)而不使用獨(dú)立的糖化罐。通常，含糊精的液體(l)會(huì)在補(bǔ)充進(jìn)發(fā)酵中之前被冷卻至發(fā)酵溫度，通常在32。C到37。C的范圍內(nèi)。發(fā)酵前如果適當(dāng)?shù)脑捒梢詫⑺缘暮后w(l)滅菌，微生物通常被熱方法或化學(xué)方法破壞。例如，為此目的將水性含糊精液體(l)加熱至通常高于80。C的溫度。細(xì)胞的破壞或裂解可在發(fā)酵前直接發(fā)生。為此，對(duì)所有的含糊精液體(l)進(jìn)行裂解步驟或破壞步驟。這可通過熱、機(jī)械或化學(xué)手段進(jìn)行。然而，就根據(jù)本發(fā)明的方法的目的而言，尚未證明在發(fā)酵前進(jìn)行本文所述的滅菌步驟是必需的；相反，已經(jīng)證明不進(jìn)行這類滅菌步驟是有利的。因此，本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案涉及一種方法，其中在步驟a2)中獲得的培養(yǎng)基(l)被直接補(bǔ)充進(jìn)發(fā)酵中，即在先前滅菌之前。在發(fā)酵期間，糊精的代謝根據(jù)本發(fā)明主要在不添加糖化酶時(shí)發(fā)生。此處，糊精可能在被菌林固有的糖化酶(例如菌抹固有的葡糖淀粉酶)水解之后被」微生物代謝。被液化的淀粉組分可能被糖化，所述糖化與糖的代謝(尤其是微生物對(duì)單糖葡萄糖的代謝)是并行的。因此在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于發(fā)酵的微生物選自表達(dá)或產(chǎn)生將糊精水解為單糖的酶的微生物，特別是產(chǎn)生或表達(dá)葡糖淀粉酶的微生物。這類微生物是技術(shù)人員已知的并可通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定，例如通過篩選方法、例如通過篩選葡糖淀粉酶、例如通過將微生物在搖瓶測(cè)試中培養(yǎng)然后測(cè)定葡糖淀粉酶的酶活性、或通過引物/探針的幫助使用實(shí)施例章節(jié)中描述的篩選方法來篩選，和在酶數(shù)據(jù)庫中通過數(shù)據(jù)庫研究員根據(jù)實(shí)施例章節(jié)中描述的方法來篩選，所述數(shù)據(jù)庫例如誦BrendaSchomburgI.，ChangA.，HofmannO.，EbelingC.，EhrentreichF.，SchomburgD.BRENDA:aresourceforenzymedataandmetabolicinformation.TrendsBiochemSci.2002Jan;27(l):54畫6.，-Swissprot[BoeckmannB.，BairochA.，ApweilerR.，BlatterM.畫C.，EstreicherA.，GasteigerE.，MartinM.J.，MichoudK.，O'DonovanC.,PhanI.，PilboutS.，SchneiderM.77re,ZS^-尸及Or戸te/"Atkw/喊由ms卿/e艦"f7V皿ALi"請(qǐng)JNucleicAcidsRes.31:365-370(2003)1，-ERGO-WIT[OverbeekR，LarsenN，WalunasT，D'SouzaM，PuschG，SelkovEJr，LioliosK,JoukovV，KaznadzeyD，AndersonI，BhattacharyyaA，BurdH，GardnerW，HankeP，KapatralV，MikhailovaN，VasievaO，OstermanA，VonsteinV，F(xiàn)onsteinM，IvanovaN，KyrpidesN.TheERGO(TM)genomeanalysisanddiscoverysystem.NucleicAcidsRes2003Jan1;31(1):164-71;OverbeekR，LarsenN，PuschGD，D'SouzaM,SelkovEJr，KyrpidesN，F(xiàn)onsteinM，MaltsevN，SelkovE.WIT:integratedsystemforhigh-throughputgenomesequenceanalysisandmetabolicreconstruction.NucleicAcidsResearch,2000;Vol.28，No.l:123-125，-CAZY[Coutinho,P.M.&Henrissat,B.(1999)Carbohydrate-ActiveEnzymesserveratURL:http:〃afmb.ciirs-mrs.fr/CAZY/;Coutinho,P.M.&Henrissat,B.(1999)Carbohydrate-activeenzymes:anintegrateddatabaseapproach.In"RecentAdvancesinCarbohydrateBioengineering",H.J.Gilbert,G.Davies，B.HenrissatandB.Svenssoneds.，TheRoyalSocietyofChemistry,Cambridge,pp.3-12and曙PIR[CathyH.Wu，Lai-SuL.Yeh，HongzhanHuang,LeslieArminski，JorgeCastro-Alvear,YongxingChen,Zhang-ZhiHu,RobertS.Ledley,PanagiotisKourtesis,BarisE.Suzek，C.R.Vinayaka，JianZhang，andWinonaC.Barker.TheProteinInformationResource.NucleicAcidsResearch,31:345-347，2003.具有葡糖淀粉酶的合適微生物的實(shí)例為根瘤土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)、Arxulaadeninivorans、棉阿舒嚢霉(Ashbyagossypii)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、亮白曲霉(^45尸^///"5cafK/i'cf"s)、臭曲霉(/4spw7/附/o幼V/"51)、煙曲窖(y45/w7/附/"附/ga似s)、Aspergilluskawachi、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、海藻曲霉(^57^《///附//^"/".51)、Aspergillussaitoi、Aspergillusshirousami、土曲霉(As/7ew7/"s,m^"力、Atheliarolfsii、環(huán)狀芽孢桿菌0Bfl"7/附"Vrw/ff附)、嗜熱月旨肪芽孢桿菌(5a"7/附他flro^簡(jiǎn)o/7緒fis)、甜衷(Be似VM/gc/s)、大豆根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)、Burkholderiacenocepacia、Burkholderiafungomm、類鼻疽4白克氏菌(Burkholderiapseudomalld)、白假絲酵母(Candidaalbicans)、南極洲假絲酵母(C"m/iV/"^wtor"Zcfl)、光滑假絲酵母(C""力V/flg/a6mto)、Candidatsukubaensis、新月柄桿菌(Caulobactercrescentus)、Cephalosporiumcharticola、CephalosporiumeichhorniaeCeratocystisparadoxa、Chaetomiumthermophilum、Chlorobiumtepidum、紫色色桿菌(Chromobacteriumviolaceum)、Cladosporiumresinae、梭狀芽孢桿菌屬(Clostridiumsp.)、Clostridiumthermocellum、Clostridiumthermosaccharolyticum、Coniophoraputeana、Corticiumrolfsii、谷氛酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)、新型隱球酵母科(Cryptococcusneoformans)、Debaryomyceshansenii、Debaryomycesoccidentalis、構(gòu)巢棵孢殼(Emericellanidulans)、內(nèi)孑包霉屬(Endomycessp.)、Endomycopsisfibuligera、jF"sflr/M/wvewewfl^w附、死海鹽軒菌(Haloarculamarismortui)、Hormoconisresinae、Humicolagrisea、柔毛腐質(zhì)霉(好"附/co/a/做wgZwofl)、Hypocrealixii、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)、Lentinulaedodes、Lipomyceskononenkoae、Magnaporthegrisea、Mesorhizobiumloti、詹氏曱烷暖球菌(Methanocaldococcusjannaschii)、詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)、海沼甲烷球菌(Methanococcusmaripaludis)、噬乙酸甲烷八疊球菌(Methanosarcinaacetivorans)、巴氏甲烷八疊球菌(Methanosarcinabarkeri)、梅氏甲烷八疊球菌(Methanosarcinamazei)、Monascusrubiginosus、紅曲霉屬(Monascussp.)、魯毛霉(Af"cor尸owx,Vz""51)、牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)、麻風(fēng)分枝桿菌(Mycobacteriumleprae)、海分枝軒菌(Mycobacteriummarinum)、結(jié)核分枝扦菌(Mycobacteriumtuberculosis)、漆斑菌屬(Myrotheciumsp.)、粗糙脈孑包菌(7Vewms/;oiYicms仰)、Nostocpunctiforme、稻(。/^flsflriva)、多變擬青霉(Paecilomycesvariotii)、Penaeusjaponicus、產(chǎn)黃青霉(戶e"/"7,/"wc/^5^e聽附)、草酸青霉(/^肌."7//"附a^/icM附)、Picrophilustorridus、焚光假單胞菌(尸se"t/麵o""s/7"0,esce"s)、惡臭假單胞菌(i^e"f/麵o"flwpnrirfa)、丁香假單胞菌(jRsemfe附0wass戸'wg—、Ralstoniaeutropha、Ralstoniametallidurans、Ranajaponica、處i根瘤菌(i/ri'^to附/egM附lVffWWW挑)、fife/e附""、爪哇才艮霉(7/f/^/7"SytfVflfW/CMS)、雪白才艮審(及/t/zo^附mVe附)、稻才艮審(及A/zo/7"st/j^ie)、才艮審屬(Rhizopussp.)、紅球菌屬(Rhodococcussp.)、Rhodopseudomonaspalustris、紅紅蟲累菌(Rhodospirillumrubrum)、酉良酒酵母(iS"cc/^ro附y(tǒng)cescefev/wVie)、泮唐4b酵母(5"acc/iaro考cescte她c附)、Saccharomycopsisfibuligera、Saccharomycopsisfibuligera、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、許旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)、Shewanellaoneidensis、Sphingomonasaromaticivorans、天藍(lán)色鏈霉菌(5^e/;to考(^coe//o/or)、酸熱硫化葉菌(Sulfolobusacidocaldarius)、硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobussolfataricus)、Talaromycesemersonii、Termitomycesclypeatus、普通高溫放線菌(Thermoactinomycesvulgaris)、Thermoanaerobactertengcongensis、熱解糖熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticum)、Thermoascuscrustaceus、Thermomyceslanuginosus、附著熱變形菌(Thermoproteustenax)、T^,e/謂.tfterm^r/s、里氏木霉(Trichodermareesei)和Trichosporonadeninovorans。如果發(fā)酵中使用的微生物表達(dá)菌林內(nèi)在的葡糖淀粉酶，則發(fā)酵培養(yǎng)基的pH可以被調(diào)節(jié)為葡糖淀粉酶最適活性范圍內(nèi)的值，例如調(diào)節(jié)為3.5和6.0之間范圍內(nèi)的值。pH通常被調(diào)節(jié)為發(fā)酵的最適值，其可能在上述范圍之外，例如在從6.0到8.0的范圍內(nèi)。這可以是完全有利于發(fā)酵的，盡管大量葡糖淀粉酶的活性在該pH范圍內(nèi)被限制或者導(dǎo)致發(fā)酵條件需要被調(diào)節(jié)，所述發(fā)酵條件尤其要適應(yīng)所述的微生物。發(fā)酵最適的pH范圍可以由技術(shù)人員通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定。為了獲得通過培養(yǎng)基(l)引入發(fā)酵培養(yǎng)基中的糊精的高轉(zhuǎn)化程度，通常要將發(fā)酵培養(yǎng)基在經(jīng)調(diào)節(jié)的溫度下保持超過一段時(shí)間，例如2到72小時(shí)，或適當(dāng)?shù)脑捀L(zhǎng)，例如2到96小時(shí)，尤其是5到48小時(shí)。通過水解糊精獲得的單糖(尤其是葡萄糖)通常被微生物非常迅速地代謝，從而通常不能檢測(cè)到高的單糖或葡萄糖濃度。發(fā)酵可以以技術(shù)人員已知的常規(guī)方式進(jìn)行。為此，各期望的微生物通常會(huì)在通過本文所述方法獲得的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。發(fā)酵過程可以作為分批操作或作為補(bǔ)料分批(fed-batch)操作(包括帶有中間體收獲的補(bǔ)料分批)進(jìn)行，優(yōu)選補(bǔ)料分批操作。例如，如果適當(dāng)?shù)脑捲谟盟♂尯吞砑映Ｒ?guī)培養(yǎng)基組分(例如緩沖液，營(yíng)養(yǎng)鹽，氮原料如硫酸銨、尿素等，包含氨基酸的復(fù)雜營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基組分如酵母提取物、蛋白胨、CSL等)之后，可以將已經(jīng)通過本發(fā)明的方法獲得的培養(yǎng)基(l)，如果適當(dāng)?shù)脑捙c常規(guī)的糖原料(即可代謝的單、二和/或寡糖或包含可代謝的單、二和/或寡糖的培養(yǎng)基)一起，用期望的微生物接種，所述微生物可以在發(fā)酵條件下繁殖，直到所述的微生物濃度達(dá)到了發(fā)酵所期望的穩(wěn)定態(tài)。此處存在于發(fā)酵培養(yǎng)基中的糊精被代謝并形成期望的代謝產(chǎn)物(也已知為分批操作或分批階段(batchphase))。進(jìn)行補(bǔ)料分批操作時(shí)，在分批階段后，例如總糖濃度降低至特定水平以下時(shí)，將培養(yǎng)基(l)連續(xù)或分批添加至發(fā)酵培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明的方法的一個(gè)典型的實(shí)施方案是補(bǔ)料分批操作，其包括以下步驟bl)在水性發(fā)酵培養(yǎng)基(2)中培養(yǎng)能夠過量產(chǎn)生有機(jī)化合物的微生物；和b2)如果適當(dāng)?shù)脑捲谙惹耙驯惶腔?，將含糊精的培養(yǎng)基(l)(如果適當(dāng)?shù)脑捙c常規(guī)的糖原料一起)添加進(jìn)發(fā)酵培養(yǎng)基(2)中，其中存在于培養(yǎng)基(1)中的糊精由過量產(chǎn)生有機(jī)化合物的微生物代謝。在步驟bl)中，例如傳統(tǒng)的含糖培養(yǎng)基(通常為葡萄糖溶液)，或根據(jù)本發(fā)明的液體培養(yǎng)基(l)，或(l)與常規(guī)糖原料的混合物可首先通過用水性液體(尤其是水)稀釋達(dá)到合適的糖濃度，并添加常規(guī)用于發(fā)酵目的的培養(yǎng)基成分，例如緩沖液、營(yíng)養(yǎng)鹽、氮原料(如疏酸銨、尿素等)、包含氨基酸的復(fù)雜營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基組分(如酵母提取物、蛋白胨、CSL等)。此處糖和液體用量之間的比例通常會(huì)優(yōu)選以下述方式選擇發(fā)酵培養(yǎng)基(2)中的總單糖濃度按重量計(jì)少于6%，例如在從按重量計(jì)^0到5%的范圍內(nèi)，所述濃度^皮計(jì)算為葡萄糖當(dāng)量并以發(fā)酵培養(yǎng)基(2)的總重為基礎(chǔ)。由此制備的含糖分批培養(yǎng)基用所期望的微生物接種，并且所述微生物在分批培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基(2))中在發(fā)酵條件下繁殖直到微生物濃度達(dá)到發(fā)酵所期望的穩(wěn)定狀態(tài)。在該過程中，發(fā)酵培養(yǎng)基(2)提供的糖被代謝并形成所期望的代謝產(chǎn)物。在隨后的4卜料分批階段，通過向發(fā)酵培養(yǎng)基(2)中添加含糊精的培養(yǎng)基(l)來維持發(fā)酵過程，并且由微生物過量產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物在發(fā)酵液中蓄積，蓄積可能以細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外形式發(fā)生。添加的培養(yǎng)基(l)對(duì)提供的含有微生物的分批培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基(2))的體積比例通常在從約1:10到10:1的范圍內(nèi)，例如在從1:5到5:1的范圍內(nèi)，尤其是在從1:1到5:1的范圍內(nèi)。發(fā)酵培養(yǎng)基(2)中的糖濃度可以被控制，尤其是通過培養(yǎng)基(l)的補(bǔ)料速率控制。通常，以下述方式調(diào)節(jié)補(bǔ)料速率總糖濃度(即寡糖和單糖的總計(jì))不會(huì)超過按重量計(jì)30。/。、尤其是按重量計(jì)20%的值。發(fā)酵液中的單糖濃度優(yōu)選按重量計(jì)從>0%到按重量計(jì)約5%的范圍內(nèi)，尤其是按重量計(jì)不多于3%。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟bl)中的發(fā)酵培養(yǎng)基(2)(此處即分批培養(yǎng)基)主要含有含糊精的培養(yǎng)基(l)、能夠過量產(chǎn)生有機(jī)化合物的微生物、培養(yǎng)基組分和適當(dāng)時(shí)用于稀釋的水，所述培養(yǎng)基組分為例如緩沖液、營(yíng)養(yǎng)鹽、氮原料(如硫酸銨、尿素等)、包含氨基酸的復(fù)雜營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基組分(如酵母提取物、蛋白胨、CSL等)。為此，如果適當(dāng)?shù)脑拺?yīng)將含糊精的培養(yǎng)基(l)稀釋至期望的糊精含量，例如按重量計(jì)從15%到30%的范圍內(nèi)，并直接用于制備發(fā)酵培養(yǎng)基(l)(分批培養(yǎng)基)，所述含量被計(jì)算為葡萄糖當(dāng)量并以含糊精的培養(yǎng)基(1)的總重為基^出。根據(jù)步驟b2)用于維持發(fā)酵的含糊精的培養(yǎng)基的糊精含量通常較高，例如在上述范圍內(nèi)，以便最小化發(fā)酵培養(yǎng)基(2)的稀釋度。優(yōu)選進(jìn)行下述操作，其中制備了具有較高糊精含量的含糊精培養(yǎng)基(1)，例如具有按重量計(jì)至少30%、特別是按重量計(jì)至少40%、非常特別按重量計(jì)至少50%的含量，所述含量被計(jì)算為葡萄糖當(dāng)量并以含糊精培養(yǎng)基(l)的總重為基礎(chǔ)。然后首先將該培養(yǎng)基(l)在用水稀釋后如步驟bl)所述用于制備分批培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基(2)),其次如步驟b2)所述用于添加至發(fā)酵培養(yǎng)基(2)中。使用含糊精培養(yǎng)基(l)可能通過發(fā)酵的手段產(chǎn)生揮發(fā)性的和非揮發(fā)性(尤其是非揮發(fā)性)、具有至少3個(gè)C原子或具有至少2個(gè)C原子和至少1個(gè)N原子的微生物代謝物。在該上下文中，非揮發(fā)性產(chǎn)物被理解為表示不進(jìn)行分解時(shí)不能通過蒸餾從發(fā)酵液中回收的化合物。通常，這些化合物具有高于水沸點(diǎn)的沸點(diǎn)，在大氣壓下通常高于150°C，尤其高于200°C。通常，它們是在標(biāo)準(zhǔn)條件(298K，101.3kPa)下處于固態(tài)的化合物。然而，也可能在用于產(chǎn)生不揮發(fā)微生物代謝產(chǎn)物的發(fā)酵中使用水性含糊精培養(yǎng)基(l)，所迷代謝產(chǎn)物在大氣壓下具有低于水沸點(diǎn)的熔點(diǎn)和/或油性稠度(oilyconsistency)。術(shù)語非揮發(fā)性微生物代謝物尤其包括有機(jī)的單、二和三羧酸，其優(yōu)選地具有3到10個(gè)碳原子，并且適當(dāng)時(shí)附著有一個(gè)或多個(gè)(例如l、2、3或4個(gè))羥基，例如酒石酸、衣康酸、琥珀酸、丙酸、乳酸、3-羥基丙酸、延胡索酸、馬來酸、2，5-呋喃二羧酸、戊二酸、乙酰丙酸、葡糖酸、烏頭酸和二氨基庚二酸、檸檬酸；產(chǎn)蛋白質(zhì)的的和不產(chǎn)蛋白質(zhì)的氨基酸，例如賴氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、色氨酸和蘇氨酸；嘌呤和嘧啶堿基；核苷和核苷酸，例如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和腺苷-5，-單磷酸(AMP);脂類；優(yōu)選具有10到22個(gè)碳原子的飽和和不飽和的脂肪酸，例如y-亞麻酸、二高-y-亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸；優(yōu)選具有3到8個(gè)碳原子的二元醇，例如丙二醇和丁二醇；具有3個(gè)或更多(例如3、4、5或6個(gè))OH基團(tuán)的多元(也稱作高價(jià))醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇和阿拉伯糖醇；具有至少4個(gè)碳原子(例如4到22個(gè)碳原子)的長(zhǎng)鏈(也稱作較長(zhǎng)鏈)醇，例如丁醇；糖類，例如透明質(zhì)酸和海藻糖；芳香族化合物，例如芳香族胺、香草醛和餃藍(lán)；維生素和維生素原，例如抗壞血酸、維生素B6、維生素Bu和核黃素，輔因子和已知的營(yíng)養(yǎng)藥；蛋白質(zhì)如酶，例如淀粉酶，果膠酶，酸性、雜合或中性的纖維素酶，酯酶如脂肪酶，胰腺酶，蛋白酶，木聚糖酶和氧化還原酶如漆酶、過氧化氫酶和過氧化物酶，葡聚糖酶，肌醇六磷酸酶；類胡蘿卜素，例如番茄紅素、P-胡蘿卜素、蝦青素、玉米黃素和角黃素；優(yōu)選具有3到10個(gè)碳原子和適當(dāng)時(shí)1個(gè)或多個(gè)羥基基團(tuán)的酮，例如丙酮和3-羥基丁酮；內(nèi)酯，例如Y-丁內(nèi)酯、環(huán)糊精、生物聚合物例如聚羥基乙酸酯、聚酯例如聚交酯、多糖、聚類異戊二烯、聚酰胺；和上述化合物的前體和^f汙生物。適合用作不揮發(fā)微生物代謝產(chǎn)物的其它化合物由Gutcho描述于ChemicalsbyFermentation,NoyesDataCorporation(1973)，ISBN:0818805086中。術(shù)語"輔因子"包含正常酶活性發(fā)生所需的非蛋白質(zhì)的化合物。這些化合物可以是有機(jī)的或無機(jī)的；優(yōu)選本發(fā)明的輔因子分子是有機(jī)的。這類分子的實(shí)例是NAD和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP);這些輔因子的前體是煙酸。術(shù)語"營(yíng)養(yǎng)藥，，包含促進(jìn)植物和動(dòng)物、尤其是人健康的食品添加劑。這類分子的實(shí)例是維生素、抗氧化劑和某些脂類，例如多不飽合脂肪酸。產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物尤其選自酶、氨基酸、維生素、二糖、具有3到10個(gè)C原子的脂肪族單羧酸和二羧酸、具有3到10個(gè)C原子的脂肪族羥基羧酸、具有3到10個(gè)C原子的酮、具有4到10個(gè)C原子的鏈烷醇和具有3到10個(gè)、尤其是3到8個(gè)C原子的鏈烷二醇(alkanediol)。技術(shù)人員明白這樣發(fā)酵產(chǎn)生的化合物在各情況下以使用的微生物產(chǎn)生的對(duì)映異構(gòu)體形式獲得(如果存在不同的對(duì)映異構(gòu)體的話)。因此，例如在氨基酸的情況下通常獲得各自的L-對(duì)映異構(gòu)體。發(fā)酵中使用的微生物以本身已知的方式取決于所述微生物代謝產(chǎn)物，如下文所詳細(xì)描述的。它們可以是天然來源或經(jīng)遺傳修飾的。合適的微生物和發(fā)酵方法的實(shí)例為下文表A中給出的那些表A:<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，被產(chǎn)生的有機(jī)化合物選自任選地連接有羥基并具有3到10個(gè)碳原子的單羧酸、二羧酸和三羧酸、產(chǎn)蛋白質(zhì)的和不產(chǎn)蛋白質(zhì)的氨基酸、嘌呤堿基、嗜淀堿基；核苷、核苷酸、脂類；飽和和不飽和的脂肪酸；具有4到10個(gè)碳原子的二元醇、具有3個(gè)或更多羥基的多元醇、具有至少4個(gè)碳原子的長(zhǎng)鏈醇、糖類、芳香族化合物、維生素、維生素原、輔因子、營(yíng)養(yǎng)藥、蛋白質(zhì)、類胡蘿卜素、具有3到10個(gè)碳原子的酮、內(nèi)酯、生物聚合物和環(huán)糊精。本發(fā)明第一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案涉及可以根據(jù)本發(fā)明獲得的含糖液體培養(yǎng)基用于發(fā)酵產(chǎn)生酶的用途，所述酶是例如肌醇六磷酸酶、木聚糖酶或葡本發(fā)明第二個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案涉及可以根據(jù)本發(fā)明獲得的含糖液體培養(yǎng)基用于發(fā)酵產(chǎn)生氨基酸的用途，所述氨基酸是如賴氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸和谷氨酸。本發(fā)明另一優(yōu)選的實(shí)施方案涉及可以根據(jù)本發(fā)明獲得的含糖液體培養(yǎng)基用于發(fā)酵產(chǎn)生維生素的用途，所述維生素是如泛酸和核黃素，及其前體和衍生物。本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案涉及下述物質(zhì)的發(fā)酵生產(chǎn)-具有3到10個(gè)碳原子的單、二和三羧酸，尤其脂肪族單、二和三羧酸，例如丙酸、延胡索酸、琥珀酸、衣康酸、檸檬酸和二甲基丙二酸；國(guó)具有3到10個(gè)C原子的脂肪族羥基羧酸，例如乳酸和3-羥基丙酸；-如上所述的長(zhǎng)鏈鏈烷醇，尤其是具有4到10個(gè)C原子的鏈烷醇，例如丁醇；畫如上所述的二元醇，尤其是具有3到10個(gè)、尤其是3到8個(gè)C原子的鏈烷二醇，例如丙二醇；-如上所述的酮，尤其是具有3到IO個(gè)C原子的酮，例如丙酮；和-如上所述的糖類，尤其是二糖，如海藻糖。在另一特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，由微生物在發(fā)酵中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物是聚羥鏈烷酸，例如聚-3-羥基丁酸和與其它有機(jī)羥基羧酸的共聚多酯，所述其它有機(jī)羥基羧酸例如3-羥基戊酸、4-羥基丁酸和描述于Stdnbtichel(上文所述)中的其它有機(jī)羥基羧酸，包括例如長(zhǎng)鏈(也稱作較長(zhǎng)鏈)的羥基羧酸，如3-羥基辛酸、3-羥基癸酸和3-羥基十四烷酸及其混合物。為了進(jìn)行發(fā)酵，可以使用已經(jīng)例如在S.Y.Lee，PlasticBacteriaProgressandprospectsforpolyhydroxyalkanoateproductioninbacteria,Tibtech,Vol.14，(1996)，pp.431-438中描述用于其它碳原料的類似條件和步驟。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可用于發(fā)酵的微生物因此選自天然或重組的微生物，所述微生物過量產(chǎn)生至少一種以下的代謝產(chǎn)物-酶，例如肌醇六磷酸酶、木聚糖酶或葡聚糖酶，尤其是肌醇六磷酸酶；-氨基酸，例如賴氨酸、蘇氨酸或甲硫氨酸，尤其是賴氨酸和甲硫氨酸；-維生素，例如泛酸和核黃素；和它們的前體和/或^f汙生物；_二糖，如海藻糖；-具有3到io個(gè)碳原子的脂肪族單、二和三羧酸，例如丙酸、延胡索酸、琥珀酸、衣康酸、檸檬酸和二曱基丙二酸；-聚羥鏈烷酸，例如聚-3-羥基丁酸和3-羥基丁酸的共聚多酯；-具有3到10個(gè)C原子的脂肪族羥基羧酸，例如乳酸和3-羥基丙酸；-具有3到IO個(gè)C原子的酮，例如丙酮；-具有4到10個(gè)C原子的鏈烷醇，例如丁醇；和-具有3到8個(gè)C原子的鏈烷二醇，例如丙二醇。合適的微生物通常選自棒桿菌屬(Corynebacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、阿舒嚢霉屬(Ashbya)、埃希氏菌屬(Escherichia)、曲霉屬(Aspergillus)、產(chǎn)械菌屬(Alcaligenes)、放線桿菌屬(Actinobacillus)、厭氧螺菌屬(Anaerobiospirillum)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、丙酸桿菌屬(Propionibacterium)、根霉屬(Rhizopus)和梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium),尤其是選自谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、棉阿舒嚢霉(Ashbyagossypii)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、黑曲霉(Aspergillusniger)或廣泛產(chǎn)械菌(Alcaligeneslatus)、Anaerobiospirillumsucciniproducens、Actinobacillussuccinogenes、德氏乳才干菌(Lactobacillusdelbriickii)、Lactobacillusleichmannii、阿^立伯糖丙酸桿菌(Propionibacteriumarabinosum)、Propionibacteriumschermanii、費(fèi)氏丙酸軒菌(Propionibacteriumfreudenreichii)、丙酸梭菌(Clostridiumpropionkum)、蚊酸乙酸梭菌(Clostridiumformicoaceticum)、醋酪酸梭狀芽孢桿菌、少根才艮霉(Rhizopusarrhizus)和米根霉(Rhizopusoryzae)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，發(fā)酵中使用的微生物是棒桿菌屬的菌林，尤其是谷氨酸棒桿菌的菌林。過量產(chǎn)生氨基酸，特別是賴氨酸、甲硫氨酸或谷氨酸的尤其是棒桿菌屬的菌林，特別是谷氨酸棒桿菌的菌林。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，發(fā)酵中使用的微生物是埃希氏菌屬，尤其是大腸桿菌。其尤其是過量產(chǎn)生氨基酸(特別是賴氨酸、甲硫氨酸或蘇氨酸)的埃希氏菌屬菌林，特別是大腸桿菌。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，由微生物在發(fā)酵中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物是賴氨酸。為了進(jìn)行發(fā)酵，可以使用已經(jīng)針對(duì)其它碳原料描述的類似條件和步驟，例如在上文所述的Pfefferle等和US3,708,395中所描述。原則上，連續(xù)和不連續(xù)(分批或補(bǔ)料分批)的操作模式都是合適的，優(yōu)選補(bǔ)料分批的操作模式。在另一特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，由微生物在發(fā)酵中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物是曱硫氨酸。為了進(jìn)行發(fā)酵，可使用針對(duì)其它碳原料描述的類似條件和步驟，例如WO03/087386和WO03/100072中所述。在另一特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，由微生物在發(fā)酵中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物是泛酸。為了進(jìn)行發(fā)酵，可使用例如WO01/021772中針對(duì)其它碳原料描述的類似條件和步驟。在另一特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，由微生物在發(fā)酵中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物是核黃素。為了進(jìn)行發(fā)酵，可使用例如WO01/011052、DE19840709、WO98/29539、EP1186664和Fujioka,K.:Newbiotechnologyforriboflavin(vitaminB2)andcharacterofthisriboflavin.FragranceJournal(2003)，31(3)，44-48中針對(duì)其它碳原料描述的類似條件和步驟。在另一特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，由微生物在發(fā)酵中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物是延胡索酸。為了進(jìn)行發(fā)酵，可使用例如Rhodesetal，ProductionofFumaricAcidin20-LFermentors，AppliedMicrobiology,1962，10(1)，9-15中針對(duì)其它碳原料描述的類似條件和步驟。在另一特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，由微生物在發(fā)酵中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物是琥珀酸。為了進(jìn)行發(fā)酵，可使用例如Int.J.Syst.Bacteriol.26,498—504(1976);EP249773(1987)，Lemme&Datta;US5504004(1996)，Guettler，Jain&Soni;Arch.Microbiol.167,332—342(1997);GuettlerMV，RumlerD,JainMK.，Actinobacillussuccinogenessp.nov.，anovelsuccinic-acid-producingstrainfromthebovinerumen.IntJSystBacteriol.1999Jan;49Pt1:207-16;US5,723,322，US5,573,931、US5,521,075、WO99/06532、US5，869，301或US5,770,435中針對(duì)其它碳原料描述的類似條件和步驟。在另一特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，由微生物在發(fā)酵中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物是肌醇六砩酸酶。為了進(jìn)行發(fā)酵，可〗吏用例如WO98/55599中針對(duì)其它碳原料描述的類似條件和步驟。發(fā)酵產(chǎn)生發(fā)酵液，所述發(fā)酵液除了所期望的微生物代謝產(chǎn)物外，主要含有發(fā)酵中產(chǎn)生的生物量、液化的淀粉溶液的未代謝的組分，和尤其是淀粉原料的非淀粉固體組分，例如纖維和未利用的糖，以及未利用的緩沖液和營(yíng)養(yǎng)鹽。在本申請(qǐng)中，該液體培養(yǎng)基也稱作發(fā)酵液，術(shù)語發(fā)酵液也包含添加的含糊精培養(yǎng)基(l)，其中存在的糖僅進(jìn)行部分或不完全的發(fā)酵轉(zhuǎn)化，即其中發(fā)生可利用的糖(例如單糖和二糖)的部分或不完全的微生物代謝。在分離或耗盡微生物代謝產(chǎn)物之前或去除發(fā)酵液的揮發(fā)性組分之前，如果適當(dāng)?shù)卦捯陨鲜龇绞竭M(jìn)^f亍滅菌步驟。本發(fā)明的特定實(shí)施方案(I)涉及方法，該方法中至少一種微生物代謝產(chǎn)物被從發(fā)酵液中耗盡或分離。隨后去除發(fā)酵液的大部分揮發(fā)性組分，得到固體或半固體蛋白質(zhì)組合物。進(jìn)行這類耗盡的更詳細(xì)描述，以及獲得的蛋白質(zhì)組合物的更纖細(xì)描述是本申請(qǐng)公司的WO2005/116228(PCT/EP2005/005728)的主題，其涉及進(jìn)一步的細(xì)節(jié)。從發(fā)酵液中分離或耗盡代謝產(chǎn)物通常以下述方式進(jìn)行至少一種代謝產(chǎn)物被從發(fā)酵液中耗盡或分離，使得發(fā)酵液中該代謝產(chǎn)物的含量維持在按重量計(jì)不多于20%、尤其是按重量計(jì)不多于10%、特別是按重量計(jì)不多于5%、非常特別地按重量計(jì)不多于2.5%,每種情況下以剩余的發(fā)酵液總重為基礎(chǔ)。精細(xì)化學(xué)品(即微生物代謝物)可以在一個(gè)或多個(gè)步驟中從發(fā)酵液中被分離或耗盡。該上下文中的一個(gè)關(guān)鍵步驟是從發(fā)酵液中去除固體組分。這可以在分離價(jià)值產(chǎn)物之前或之后進(jìn)行。本領(lǐng)域常規(guī)使用的方法(其也包括用于粗清潔和精純化價(jià)值產(chǎn)物的步驟和用于配制的步驟)是已知用于分離價(jià)值產(chǎn)物和用于去除固體的，即固液相分離(例如描述于Belter,P.A，Bioseparations:DownstreamProcessingforBiotechnology,JohnWiley&Sons(1988)，和Ullmann，sEncyclopediaofIndustrialChemistry,笫五版CD-ROM上，Wiley-VCH)。為了分離價(jià)值產(chǎn)物，隨后可有利地進(jìn)行一個(gè)步驟，其中首先例如借助于離心或過濾將固體組分從發(fā)酵液中去除，隨后例如通過結(jié)晶、沉淀、吸附或蒸餾將價(jià)值產(chǎn)物從液相中分離。或者，價(jià)值產(chǎn)物也可以通過例如使用層析方法或萃取方法從發(fā)酵液中直接分離。必須提到的層析方法尤其是離子交換層析，其中價(jià)值產(chǎn)物可以在層析柱上選擇性地被分離。在該情況下，例如通過傾析、蒸發(fā)和/或干燥有利地從剩余的發(fā)酵液中去除固體。在揮發(fā)性或油性化合物的情況下，通常必須在加工期間、尤其在干燥期間監(jiān)測(cè)最大溫度。也可以通過將其配制在吸附劑上的假固體形式中有利地制備這些化合物。適用于該目的的吸附劑詳細(xì)地描述于例如本申請(qǐng)公司的WO2005/116228(PCT/EP2005/005728)中。可以有利地以這種方式制備的化合物的實(shí)例為，亞麻酸、二高-Y亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸，以及丙酸、乳酸、丙二醇、丁醇和丙酮。就本發(fā)明的目的而言，假固體制劑中的這些化合物也被理解為固體形式的非揮發(fā)性微生物代謝產(chǎn)物。另一特定實(shí)施方案(II)涉及一種方法，其中發(fā)酵液的揮發(fā)性組分基本被去除，而之前不分離或耗盡非揮發(fā)性微生物代謝產(chǎn)物，并且如果適當(dāng)?shù)脑挘安蝗コ腆w組分，得到非揮發(fā)性微生物代謝產(chǎn)物的固體制劑。進(jìn)行這類方法的更詳細(xì)的描述可見于本申請(qǐng)公司的PCT/EP2006/066057(較早專利申請(qǐng)為DE102005042541.0)。"基本上，，表示一旦揮發(fā)性組分被去除，固體或至少半固體的殘余物如果適當(dāng)?shù)脑捒梢酝ㄟ^添加固體被轉(zhuǎn)化為固體產(chǎn)物。通常，這表示揮發(fā)性組分的去除低至按重量計(jì)不多于30%、通常按重量計(jì)不多于20%、尤其是按重量計(jì)不多于15。/。的殘余水分含量。通常，發(fā)酵液的揮發(fā)性組分會(huì)有利地從發(fā)酵液中去除，低至按重量計(jì)0.2%到30%、優(yōu)選按重量計(jì)1%到20%、特別優(yōu)選按重量計(jì)2%到15%、非常特別優(yōu)選按重量計(jì)5%到15%范圍內(nèi)的殘余水分含量，其以干燥后測(cè)定的固體組分的總重為基礎(chǔ)。可以通過才支術(shù)人員熟悉的常規(guī)方法測(cè)定殘余的水分含量，例如借助于熱重量分析法(Hemminger等，MethodenderthermischenAnalyse[Methodsofthermalanalysis],SpringerVerlag，Berlin,Heidelberg,1989)。以固體形式從發(fā)酵液中獲得不揮發(fā)代謝產(chǎn)物可以在一個(gè)、兩個(gè)或更多步驟中，尤其是在一步或兩步的操作中達(dá)成。通常，用于以固體形式獲得代謝產(chǎn)物的至少一個(gè)步驟，尤其是最終步驟應(yīng)包括干燥步驟。在一步操作中，發(fā)酵液的揮發(fā)性組分會(huì)^L去除，如果適當(dāng)?shù)脑捲谇懊猿醪饺コ?，直到達(dá)到期望的殘余水分含量。在兩步或多步操作中，應(yīng)首先例如通過過濾(微量過濾、超濾)濃縮發(fā)酵液，或通過蒸發(fā)一部分揮發(fā)性組分熱濃縮發(fā)酵液。在該步驟中被去除的揮發(fā)性組分的量通?？傆?jì)為按重量計(jì)10%到80%、尤其是按重量計(jì)20%到70%，所述量以發(fā)酵液的揮發(fā)性組分的總重為基礎(chǔ)。在一個(gè)或多個(gè)步驟隨后的中，發(fā)酵液的殘余的揮發(fā)性組分被去除，直到達(dá)到期望的殘余水分含量。根據(jù)該實(shí)施方案(II)，揮發(fā)性組分基本上被從液體培養(yǎng)基中去除，不事先耗盡或事實(shí)上分離價(jià)值產(chǎn)物。因此，當(dāng)去除發(fā)酵液的揮發(fā)性組分時(shí)，非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物基本上不與液體培養(yǎng)基的揮發(fā)性組分一起被去除，而是與來自發(fā)酵液的至少一部分、通常大部分和尤其是所有的其它固體組分一起保留在得到的殘余物中。然而，因此可能在去除發(fā)酵液的揮發(fā)性組分時(shí)與其一起去除一定量(優(yōu)選小量)的期望的非揮發(fā)性微生物代謝產(chǎn)物，通常按重量計(jì)不多于20%、例如按重量計(jì)0.1%到20%，優(yōu)選不多于10%、尤其按重量計(jì)不多于5V。、特別優(yōu)選按重量計(jì)不多于2.5%、非常特別優(yōu)選按重量計(jì)不多于1%,所述用量以代謝產(chǎn)物的總干重為基礎(chǔ)。在非常特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，期望的不揮發(fā)微生物代謝產(chǎn)物作為混合物中的固體，維持為按重量計(jì)至少90%、尤其是按重量計(jì)至少95%、特別是按重量計(jì)至少99%、非常特別是按重量計(jì)約100%，每種情況以代謝產(chǎn)物總干重為基礎(chǔ)，所述混合物是與去除揮發(fā)性組分后獲得的發(fā)酵培養(yǎng)基的固體組分部分的混合物，或者是與發(fā)酵培養(yǎng)基的所有固體組分的混合物。如果期望的話，可以在去除揮發(fā)性組分前，例如借助于離心或過濾將一部分非淀粉固體組分從發(fā)酵液中分離，所述部分例如為按重量計(jì)5%到80%，尤其是按重量計(jì)30%到70%。如果適當(dāng)?shù)脑拺?yīng)進(jìn)行這類初步分離，從而去除粗固體顆粒，所述顆粒不包含或僅包含小量的非揮發(fā)性微生物代謝產(chǎn)物。該初步過濾可以使用技術(shù)人員已知的常規(guī)方法進(jìn)行，例如使用粗篩、網(wǎng)、穿孔板(perforatedsheet)等。如果適當(dāng)?shù)脑?，也可以在離心力分離器中分離粗固體顆粒。此處使用的儀器如傾析器、離心機(jī)、sedicanters和分離器也是技術(shù)人員已知的。以此種方式獲得固體或半固體的(例如糊狀的)殘余物，所述殘余物包含非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物和淀粉原料的非揮發(fā)性、通常是固體的、非淀粉的組分或其至少一大部分，通常按重量計(jì)至少90%或所有的固體非淀粉組分。與發(fā)酵的固體組分一起存在的干的代謝產(chǎn)物的特性可以通過添加配制輔料(如載體和包衣材料、粘合劑和其它添加劑)，以本身已知的方式，特別是根據(jù)多種參數(shù)配制，所述參數(shù)如活性物質(zhì)含量、顆粒尺寸、顆粒形狀、成塵趨勢(shì)、吸濕性、穩(wěn)定性尤其是儲(chǔ)存穩(wěn)定性、顏色、氣味、流動(dòng)行為、團(tuán)聚趨勢(shì)、靜電荷、對(duì)光和溫度的敏感性、機(jī)械穩(wěn)定性和再分散性。常規(guī)使用的配制輔料包括例如粘合劑、載體材料、成粉/流動(dòng)佐劑，另外有色素、殺生物劑、分敉劑、消泡劑、粘度調(diào)節(jié)劑、酸、堿、抗氧化劑、酶穩(wěn)定劑、酶抑制劑、吸附劑、脂肪、脂肪酸、油或這些的混合物。這類配方輔料有利地作為干燥助劑使用，尤其是使用例如噴霧干燥、流化床干燥和冷凍干燥的配制和干燥方法時(shí)。進(jìn)一步的細(xì)節(jié)可見于PCT/EP2006/066057(較早申請(qǐng)DE102005042541.0)。上述添加劑和適當(dāng)時(shí)其它添加劑(如包衣材料)的用量可顯著變化，取決于所述代謝產(chǎn)物的特定要求和使用的添加劑的特征，并可以例如在按重量計(jì)0.1%到80%的范圍內(nèi)，尤其是按重量計(jì)從1%到30%的范圍內(nèi)，各情況下以完成配制形式的產(chǎn)物或物質(zhì)混合物的總重為！^出。配制輔料的添加可以在加工發(fā)酵液(也稱作產(chǎn)物配制或固體設(shè)計(jì))之前、期間或之后進(jìn)行，尤其是在干燥期間進(jìn)行。在加工發(fā)酵液或代謝產(chǎn)物之前添加配制輔料可以是有利的，尤其是對(duì)促進(jìn)要加工的物質(zhì)或產(chǎn)物的可加工性是有利的。配制輔料可以添加至固體形式獲得的代謝產(chǎn)物中，或添加至含有代謝產(chǎn)物的溶液或懸浮液中，例如在發(fā)酵完成后直接添加進(jìn)發(fā)酵液中或在加工期間和最后的干燥步驟之前添加進(jìn)獲得的溶液或懸浮液中。因此，例如輔料可以與微生物代謝產(chǎn)物的懸浮液混合；這類懸浮液也可以例如通過噴霧或混合應(yīng)用于載體材料。在干燥期間添加配制輔料可以是重要的，例如當(dāng)包含代謝產(chǎn)物的溶液或懸浮液被噴霧時(shí)。配制輔料的添加尤其是在干燥后進(jìn)行，例如當(dāng)對(duì)干燥的顆粒應(yīng)用包衣/包衣層時(shí)。也可以在干燥后和任選的包衣步驟后對(duì)產(chǎn)物應(yīng)用其它輔料。從發(fā)酵液中去除揮發(fā)性組分以本身已知的方式、通過用于將固相從液相中分離的常規(guī)方法進(jìn)行，所述方法包括過濾方法和蒸發(fā)液相的揮發(fā)性組分的方法。這類方法(其也可以包含用于粗清潔價(jià)值產(chǎn)物的步驟和配制步驟)描述于例如Belter,P.A，Bioseparations:DownstreamProcessingforBiotechnology,JohnWiley&Sons(1988)和Ullmann，sEncyclopediaofIndustrialChemistry,5thed.onCD-ROM,Wiley-VCH中。發(fā)酵結(jié)束后產(chǎn)物配制或加工的范圍內(nèi)可以使用的、技術(shù)人員已知的方法、儀器、輔料和一般或特定的實(shí)施方案進(jìn)一步描述于EP1038527、EP0648076、EP835613、EP0219276、EP0394022、EP0547422、EP1088486、WO98/55599、EP0758018和WO92/12645中。在該實(shí)施方案(II)的一個(gè)變型中，非揮發(fā)性微生物代謝產(chǎn)物如果以溶解的形式存在于液相中，將例如通過結(jié)晶或沉淀從液相中轉(zhuǎn)化進(jìn)入固相中。此后，非揮發(fā)性固體組分(包括代謝產(chǎn)物)例如借助于離心、傾析或過濾被分離。油性代謝產(chǎn)物也可以以類似的方式被分離，所述油性發(fā)酵產(chǎn)物通過添加吸附劑(例如二氧化硅、硅膠、壤土、粘土和活性炭)被轉(zhuǎn)化成為固體形式。在該實(shí)施方案(II)的第二個(gè)變型中，揮發(fā)性組分通過蒸發(fā)被去除。蒸發(fā)可以以本身已知的方式進(jìn)行。用于蒸發(fā)禪發(fā)性組分的合適方法的實(shí)例是噴霧干燥、流化床干燥或流化床團(tuán)聚、冷凍干燥、氣流干燥器(pneumaticdriers)和接觸干燥器，以及擠壓干燥。也可以進(jìn)行上述方法與形狀賦予方法(shape畫impartingmethod,例如擠壓、造粒(pelleting)或成球(prilling))的組合。在這些最后提到的方法中，優(yōu)選部分或主要地使用含預(yù)干燥的代謝產(chǎn)物的物質(zhì)混合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，發(fā)酵液的揮發(fā)性組分的去除包括噴霧干燥方法或流化床干燥方法，包括流化床顆粒化。為此，如果適當(dāng)?shù)脑捲诔醪椒蛛x以去除粗固體顆粒(其僅包含小量的不揮發(fā)微生物代謝產(chǎn)物，如果有的話)后，將發(fā)酵液補(bǔ)料進(jìn)一個(gè)或多個(gè)噴霧千燥或流化床干燥裝置中。固體負(fù)荷的發(fā)酵液的運(yùn)輸或補(bǔ)料方便地借助于常規(guī)運(yùn)輸設(shè)備進(jìn)行，所述設(shè)備用于含固體的液體，例如泵，如偏心螺旋泵(例如來自于DelascoPCM)或高壓泵(例如來自于LEWAHerbertOttGmbH)。使用本發(fā)明的含糖液體培養(yǎng)基的發(fā)酵也可以以如下方式進(jìn)行(i)將以總重為基礎(chǔ)按重量計(jì)不多于50%、例如按重量計(jì)在5%到45%范圍內(nèi)的一部分從在步驟a2)中獲得的含糊精培養(yǎng)基(l)(其包含淀粉原料的非淀粉固體組分)中去除，并將剩余部分提供給用于產(chǎn)生第一種代謝產(chǎn)物(A)的發(fā)酵，例如固體形式的不揮發(fā)代謝產(chǎn)物(A)或揮發(fā)性代謝產(chǎn)物(A);和(ii)如果適當(dāng)?shù)脑?，在先前去除了淀粉原料的所有或一些非淀粉固體組分之后，將該部分提供給用于產(chǎn)生第二種代謝產(chǎn)物(B)的發(fā)酵，所述第二種代謝產(chǎn)物與代謝產(chǎn)物(A)相同或不同。如果(ii)的非淀粉固體組分被分離，則含糖液體培養(yǎng)基剩余部分的固體含量總計(jì)為優(yōu)選按重量計(jì)不多于50%、尤其是按重量計(jì)不多于30%、特別優(yōu)選按重量計(jì)不多于10%、非常特別優(yōu)選按重量計(jì)不多于5%。在這類情況下，尤其優(yōu)選在用于產(chǎn)生第二種代謝產(chǎn)物(B)的發(fā)酵之前分離所有的固體。該步驟使得可能在(ii)的獨(dú)立發(fā)酵中使用下述微生物，所述微生物的某些最小需要(例如關(guān)于輸氧率)必須被滿足。用于(ii)的獨(dú)立發(fā)酵中的合適微生物是例如芽孢桿菌物種，優(yōu)選枯草芽孢桿菌。由這類微生物在獨(dú)立發(fā)酵中產(chǎn)生的化合物尤其選自維生素、輔因子和營(yíng)養(yǎng)藥、嘌呤和嘧-定堿基、核苷和核苷酸、脂類、飽和和不飽和的脂肪酸、芳香族化合物、蛋白質(zhì)、類胡蘿卜素，特別是選自維生素、輔因子和營(yíng)養(yǎng)藥、蛋白質(zhì)和類胡蘿卜素，非常特別選自核黃素和泛酸4丐。該步驟的優(yōu)選的實(shí)施方案涉及在兩個(gè)獨(dú)立的發(fā)酵中平行產(chǎn)生相同的代謝產(chǎn)物(A)和(B)。這是有利的，尤其是相同的代謝產(chǎn)物的不同應(yīng)用具有不同的純度要求時(shí)。因此，使用含固體的發(fā)酵液產(chǎn)生第一種代謝產(chǎn)物(A),例如要用作飼料添加劑的氨基酸(例如賴氨酸、曱硫氨酸、蘇氨酸或谷氨酸)；而使用(ii)的固體被耗盡的發(fā)酵液產(chǎn)生相同的第二種代謝產(chǎn)物(B)，例如要用作食物添加劑的相同氨基酸。由于非淀粉固體組分的完全或部分去除，加工代謝產(chǎn)物時(shí)純化的復(fù)雜性可以被降低，所述代謝產(chǎn)物的應(yīng)用領(lǐng)域具有更高的純度要求，例如作為食品添加劑。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，該步驟可以例如如下進(jìn)行。用于產(chǎn)生代謝產(chǎn)物A(例如氨基酸如賴氨酸、曱硫氨酸、谷氨酸或蘇氨酸)或檸檬酸或乙醇優(yōu)選的大體積發(fā)酵例如才艮據(jù)WO2005/116228(PCT/EP2005/005728)或PCT/EP2006/066057(較早專利申請(qǐng)DE102005042541.0)、或根據(jù)已知的生物乙醇發(fā)酵生產(chǎn)方法實(shí)現(xiàn)。根據(jù)i)，去除在步驟a2)中獲得的一些培養(yǎng)基(1)。根據(jù)i);波去除的部分可以通過常規(guī)方法根據(jù)ii)完全或部分沒有固體，所述常規(guī)方法例如離心或過濾，取決于發(fā)酵產(chǎn)生B的需要。以此種方式獲得的培養(yǎng)基(l)根據(jù)ii)被提供給用于產(chǎn)生代謝產(chǎn)物B的發(fā)酵中，所述培養(yǎng)基(l)全部或部分地沒有固體。根據(jù)i)分離的固體流被有利地返回大體積發(fā)酵的培養(yǎng)基(l)的流中。如果在大體積發(fā)酵中產(chǎn)生的微生物代謝產(chǎn)物(A)是乙醇，則根據(jù)步驟ii)制備的培養(yǎng)基(l)具有乙醇(生物乙醇)的發(fā)酵產(chǎn)生中常規(guī)的寡糖濃度，例如按重量計(jì)從20%到33%的范圍內(nèi)。另外，根據(jù)步驟ii)去除固體取決于發(fā)酵生產(chǎn)所述代謝產(chǎn)物B所需要的。在上述步驟的優(yōu)選的實(shí)施方案中，由微生物在發(fā)酵中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物B是核黃素。為了進(jìn)行發(fā)酵，可以使用例如WO01/011052、DE19840709、WO98/29539、EP1186664和Fujioka，K.:Newbiotechnologyforriboflavin(vitaminB2)andcharacterofthisriboflavin.FragranceJournal(2003)，31(3)，44-48中針對(duì)其他碳原料描述的類似條件和步驟。為了進(jìn)行該方法的變型，如上所述進(jìn)行優(yōu)選的大體積發(fā)酵用于產(chǎn)生代謝產(chǎn)物A，例如氨基酸如賴氨酸、甲硫氨酸或谷氨酸，或檸檬酸或乙醇。根據(jù)i)，在步驟a2)中獲得的培養(yǎng)基(l)的一些通過常規(guī)方法被去除并根據(jù)ii)被完全或部分地沒有固體，所述常規(guī)方法例如為離心或過濾。從中獲得的幾乎完全或部分地沒有固體的培養(yǎng)基(l)根據(jù)ii)被提供給用于產(chǎn)生代謝產(chǎn)物B的發(fā)酵中，所述代謝產(chǎn)物B在本情況下為核黃素。根據(jù)ii)分離的固體流被有利地返回大體積發(fā)酵的培養(yǎng)基(l)的流中。如此產(chǎn)生的含核黃素的發(fā)酵液可以例如通過DE4037441、EP464582、在細(xì)胞量裂解之后，將以結(jié)晶形式存在的核黃素被分離，優(yōu)選通過傾析分離。分離固體的其他途徑(例如過濾)也是可能的。此后優(yōu)選借助于噴霧干燥器和流化床干燥器干燥核黃素?；蛘撸梢酝ㄟ^例如EP1048668和EP730034中描述的類似條件和步驟加工根據(jù)ii)產(chǎn)生的含核黃素的發(fā)酵混合物。巴氏消毒后，離心發(fā)酵液并用無機(jī)酸處理剩余的含固體級(jí)分。通過離心將形成的核黃素從水性酸性培養(yǎng)基中去除、洗滌，如果適當(dāng)?shù)脑掚S后干燥。在該步驟的另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，由微生物在發(fā)酵中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物B為泛酸。為了進(jìn)行發(fā)酵，可以使用例如WO01/021772中針對(duì)其他碳原料描述的類似條件和步驟。為了進(jìn)行該步驟變型，可以隨后進(jìn)行如上針對(duì)核黃素所述的步驟。將已經(jīng)根據(jù)i)進(jìn)行初步純化并優(yōu)選基本不含固體的培養(yǎng)基(l)提供給用于產(chǎn)生泛酸的根據(jù)ii)的發(fā)酵中。此處，與含固體的液體培養(yǎng)基相比粘度被降低的事實(shí)是尤其有利的。獨(dú)立的固體流優(yōu)選被返回大體積發(fā)酵的含糖液體培養(yǎng)基(l)的流中。才艮據(jù)ii)產(chǎn)生的含泛酸發(fā)酵液可以通過例如EP1050219和WO01/83799中針對(duì)其他碳原料描述的類似條件和步驟加工。當(dāng)所有的發(fā)酵液^L巴氏消毒后，例如通過離心或過濾分離剩余的固體。在該固體分離中得到的澄清流出液4皮部分蒸發(fā)，如果適當(dāng)?shù)脑捰寐然}處理并干燥，尤其是噴霧干燥。已經(jīng)被分離的固體可以與平行的大體積發(fā)酵方法范圍內(nèi)各自期望的微生物代謝產(chǎn)物(A)—起獲得。干燥和/或配制后，可以向產(chǎn)物制劑或蛋白質(zhì)組合物中添加完整的或碾碎的谷物仁，優(yōu)選玉米、小麥、大麥、粟、黑小麥和/或黑麥。以下的實(shí)施例旨在闡述本發(fā)明的各方面，但是不應(yīng)以任何方式被理解為限制。實(shí)施例I.碾磨淀粉原料如下產(chǎn)生本文下文中使用的碾磨產(chǎn)物。使用轉(zhuǎn)子磨將完整的玉米仁充分磨碎。使用不同的打漿機(jī)、碾磨途徑或篩選元件，得到三種不同的精細(xì)程度。借助于實(shí)驗(yàn)室振動(dòng)篩(振動(dòng)分析儀RetschVibrotronicVE1型，篩分時(shí)間5分鐘，振幅1.5mm)對(duì)碾磨產(chǎn)物進(jìn)行的篩選分析得到表l中所列的結(jié)果。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>II.淀粉的酶促液化和淀粉糖化II.l.糖化步驟中沒有肌醇六磷II.la)淀粉的酶促液化將320g干磨的玉米粉(T71/03)懸浮于480g水中并與310g氯化鈉通過連續(xù)攪拌混合。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中持續(xù)攪拌。用112804將？11調(diào)節(jié)至6.5并將混合物加熱至35。C后，添加2.4gL型Termamyl120L(NovozymesA/S)。在40分鐘的進(jìn)程中，將反應(yīng)混合物加熱至86.5。C的溫度，如果適當(dāng)?shù)脑捰肗aOH將pH再調(diào)節(jié)至先前的設(shè)定值。在30分鐘內(nèi)，再添加400g干磨的玉米粉(T71/03)，期間將溫度提高到91。C。將反應(yīng)混合物在該溫度保持約100分鐘。隨后再添加2.4g的Termamyl120L并將溫度維持約100分鐘。使用碘-淀粉反應(yīng)在實(shí)驗(yàn)期間監(jiān)測(cè)液化的進(jìn)程。最終將溫度提高到IO(TC并將反應(yīng)混合物煮沸20分鐘。在該時(shí)間點(diǎn)中，不再能夠檢測(cè)到淀粉。將反應(yīng)器冷卻至35'C。II.3用于淀粉的酶促液化的其它方案11.3a)玉米粉向反應(yīng)容器中引入360g去離子水。向醪液中添加1.54ml的CaCl2儲(chǔ)存液(IOOgCaCl2x2EbO/l)至約70ppmCa2+的終濃度。向水中緩慢加入240g玉米粉，持續(xù)攪拌。用按重量計(jì)50。/。強(qiáng)度的NaOH水溶液將pH調(diào)節(jié)至6.5后，加入4.0加1(=按重量計(jì)2%酶/干物質(zhì))的L型Termamyl120L(NovozymesA/S)。然后將醪液(mash)快速加熱至85°C。在該過程中，持續(xù)監(jiān)測(cè)并在適當(dāng)時(shí)調(diào)節(jié)pH。達(dá)到最終溫度后，添加更多粉，最初添加50g粉。另外，向醪液中添加0.13ml的CaCh儲(chǔ)存液，從而將Ca"濃度維持在70卯m。添加中將溫度保持在恒定85。C。允許經(jīng)過至少10分鐘以確保在另一部分(50g粉和0.13ml的CaCl2儲(chǔ)存液)之前完全反應(yīng)。添加兩部分后，添加1.67mlTermamyl;之后再添加兩部分(每次50g粉和0.13ml的CaCl2儲(chǔ)存液)。獲得按重量計(jì)55%的干物質(zhì)含量。添加后將溫度提高到100°C，并將醪液煮沸10分鐘。取樣并冷卻至室溫。用去離子水稀釋樣品(約1:10)后，加入一滴濃魯戈碘溶液(每升5g碘和10g碘化鉀的混合物)。濃藍(lán)色指出存在殘余的淀粉；當(dāng)所有的淀粉都被水解時(shí)觀察到棕色。當(dāng)測(cè)試指出存在一部分殘余的淀粉時(shí)，將溫度再次降低至85。C并保持恒定。再添加1.67ml的Termamyl直到碘-淀粉反應(yīng)呈陰性。IL3b)黑麥粉(包括用纖維素酶/半纖維素酶預(yù)處理)向反應(yīng)容器中引入360g去離子水。向水中緩慢加入155g黑麥粉，持續(xù)攪拌。將溫度維持在恒定50°C。用按重量計(jì)50%強(qiáng)度的NaOH水溶液將pH調(diào)節(jié)至5.5后，加入3.21ml(=按重量計(jì)2.5%酶/干物質(zhì))的ViscozymeL(NovozymesA/S)。30分鐘后再添加粉，最初添加55g粉。再過30分鐘后，再添加50g粉；30分鐘后，再添加40g粉。最后的添加后30分鐘，可以開始液化。添加1.7ml的CaCl2儲(chǔ)存液(100gCaCl2x2H20/1)。用按重量計(jì)50%的NaOH水溶液將pH調(diào)節(jié)至6.5后，加入5.0ml(=按重量計(jì)2%酶/干物質(zhì))的L型Termamyl120L(NovozymesA/S)。然后將醪液快速加熱至85°C。在該過程中，持續(xù)監(jiān)測(cè)并在適當(dāng)時(shí)調(diào)節(jié)pH。達(dá)到最終溫度后，添加更多粉，最初添加60g粉。另外，向醪液中添加0.13ml的CaCh儲(chǔ)存液，從而將Ca"濃度維持在70ppm。添加中將溫度保持在恒定85°C。允許經(jīng)過至少10分鐘以確保在另一部分(40g粉和0.1ml的CaCl2儲(chǔ)存液)之前完全反應(yīng)。添加1.1ml的Termamyl;隨后再添加一部分(40g粉和0.1ml的CaCh儲(chǔ)存液)。達(dá)到按重量計(jì)55%的千物質(zhì)含量。添加后將溫度提高到100°C，并將醪液煮沸10分鐘。取樣并冷卻至室溫。用去離子水稀釋樣品(約1:10)后，加入一滴濃魯戈溶液(每升5g不典和10g碘化鉀的混合物)。濃藍(lán)色指出存在殘余的淀粉；當(dāng)所有的淀粉都4皮水解時(shí)觀察到棕色。當(dāng)測(cè)試指出存在一部分殘余的淀粉時(shí)，將溫度再次降低至85。C并保持恒定。再添加1.1ml的Termamyl直到碘-淀粉反應(yīng)呈陰性。IL3c)小麥粉(包括用木聚糖酶預(yù)處理)向反應(yīng)容器中引入360g去離子水。將水加熱至55'C并使用按重量計(jì)50%強(qiáng)度的NaOH水溶液將pH調(diào)節(jié)至6.0。溫度和pH都調(diào)節(jié)好后，加入加入3.21ml(=按重量計(jì)2.5%酶/干物質(zhì))的Shearzyme500L(NovozymesA/S)。向溶液中緩慢添加155g小麥粉，持續(xù)攪拌。保持溫度和pH恒定。30分鐘后再添加粉，最初添加55g粉。再過30分鐘后，再添加50g粉；30分鐘后，再添力。40g粉。最后的添加后30分鐘，可以開始液化。如IL3b中所述進(jìn)行液化。III.菌株ATCC13032lysC"^在以下的一些實(shí)施例中，使用在WO05/059144中以名稱ATCC13032lysC"""描述的經(jīng)修飾的谷氨酸棒狀桿菌菌抹。IV:鑒定表達(dá)/產(chǎn)生葡糖淀粉酶的菌抹IVa)在基因數(shù)據(jù)庫中篩選對(duì)產(chǎn)葡糖淀粉酶的菌林的搜索1.葡糖淀粉酶(l，4-a-D-葡聚糖葡萄糖苷酶)歸類為以下的EC號(hào)EC3.2.1.3[1。2.在以下數(shù)據(jù)庫中用查詢EC3.2.1.3進(jìn)行搜索Brenda、Swissprot、ERGO-WIT、CAZY和PIR，在各情況下得到具有EC3.2.1.3的蛋白質(zhì)列表。3.將各自的結(jié)果列表組合，針對(duì)分類學(xué)的古生菌(Archaea)界、細(xì)菌界和真菌界過濾命中并通過物種名分類。4.滿足第3段過濾標(biāo)準(zhǔn)并且在第2段提到的至少一個(gè)數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)葡糖淀粉酶條目的物種是非?？赡墚a(chǎn)生葡糖淀粉酶的。特別地，它們是以下物種根瘤土壤軒菌(Agrobacteriumtumefaciens)、Arxulaadeninivorans、棉阿舒嚢霉(Ashbyagossypii)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、亮白曲霉(v4印w7/"scaw力V/附)、臭曲霉(y45pgrgf7/"s1/o"!V/附)、煙曲霉(^45pcg///Msi/"附/g她力、Aspergilluskawachi、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、海藻曲霉(ASjperg///"^/力owV/s)、Aspergillussaitoi、Aspergillusshirousami、土曲霉(Aspew7/"sfe/re附)、Atheliarolfsii、環(huán)狀芽孢桿菌(5ac"/附c,Vr"/flfls)、嗜熱月旨肪芽孢桿菌(必""7/附他flro幼c附o一//—、VM,gfl,/s1)、大豆根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)、Burkholderiacenocepacia、Burkholderiafungorum、類鼻疽伯克氏菌(Burkholderiapseudomallei)、白假絲酵母(Candidaalbicans)、南極洲假絲酵母(C""力V/"爿/itor"/c")、光滑假絲酵母g/tf6rflto)、Candidatsukubaensis、新月柄軒菌(Caulobactercrescentus)、Cephalosporiumcharticola、CephalosporiumeichhorniaeCeratocystisparadoxa、Chaetomiumthermophilum、Chlorobiumtepidum、紫色色桿菌(Chromobacteriumviolaceum)、Cladosporiumresinae、梭狀芽抱軒菌屬(Clostridiumsp.)、Clostridiumthermocellum、Clostridiumthermosaceharoiytieum、Coniophoraputeana、Corticiumrolfsii、谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)、新型隱球酵母科(Cryptococcusneoformans)、Debaryomyceshansenii、Debaryomycesoccidentalis、構(gòu)巢棵孢殼(Emericellanidulans)、內(nèi)孑包霉屬(Endomycessp.)、Endomycopsisfibuligera、F"5w/"附vewe/m似附、死海鹽軒菌(Haloarculamarismortui)、Hormoconisresinae、Humicolagrisea、柔毛腐質(zhì)霉(/T"附/o/a/aw"g/"a^)、Hypocrealixii、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)、Lentinulaedodes、Lipomyceskononenkoae、Magnaporthegrisea、Mesorhizobiumloti、詹氏甲坑暖球菌(Methanocaldococcusjannaschii)、詹氏曱烷球菌(Methanococcusjannaschii)、海沼甲烷球菌(Methanococcusmaripaludis)、嗟乙酸甲烷八疊球菌(Methanosarcinaacetivorans)、巴氏甲烷/V疊J求菌(Methanosarcinabarkeri)、梅氏甲烷/^疊J求菌(Methanosarcinamazei)、Monascusrubiginosus、紅曲霉屬(Monascussp.)、魯毛霉(M"co,rowxiVm"s)、牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)、麻風(fēng)分枝桿菌(Mycobacteriumleprae)、海分枝桿菌(Mycobacteriummarinum)、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)、漆斑菌屬(Myrotheciumsp.)、粗糙脈孑包菌(A^wros/wfYimmfl)、Nostocpunctiforme、稻((7i^""/va)、多變擬青霉(Paecilomycesvariotii)、Penaeusjaponicus、產(chǎn)黃青霉(尸《"/"7//"#11c/r，f^iM附)、草酸青霉(/^"/"7//"附oxflr"CM附)、Picrophilustorridus、焚光假單胞菌(尸S^"flfo卿"flS/ZMOr度e附)、惡臭假單胞菌(尸5^"flfe卿"OS戸ftV/")、丁香假單胞菌(jRyemto附wiflss"戸Vigfle)、Ralstoniaeutropha、Ralstoniametallidurans、Ranajaponica、威i根瘤菌(i&V6/M附/egM/m>Kwwww)、及/r/^p附flfe/e附tf/"、爪哇才艮霉(i/^o/;Msyflmw/c附)、雪白才艮審(iA/zo/"sm'vew51)、稻才艮霍(/A&o^"s0fjzae)、才艮霍屬(Rhizopussp.)、紅球菌屬(Rhodococcussp.)、Rhodopseudomonaspalustris、紅紅蟲累菌(Rhodospirillumrubrum)、酉良酒酵母(iS^a^fl^Yw^ce51"rev/57"e)、糖4匕酵母(5Vicc/rffro附y(tǒng)cftsd/fls她'c附)、Saccharomycopsisfibuligera、Saccharomycopsisfibuligera、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、許旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)、Shewanellaoneidensis、Sphingomonasaromaticivorans、天藍(lán)色鏈霉菌(5"fr印似附y(tǒng)cescoe//co/o/*)、酸熱硫化葉菌(Sulfolobusacidocaldarius)、硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobussolfataricus)、Talaromycesemersonii、Termitomycesclypeatus、普通高溫放線菌(Thermoactinomycesvulgaris)、Thermoanaerobactertengcongensis、熱解糖熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticum)、Thermoascuscrustaceus、Thermomyceslanuginosus、附著熱變形菌(Thermoproteustenax)、7te/"WfftefreWr/s、里氏木霉(Trichodermareesei)和Trichosporonadeninovorans。IVb)借助于搖瓶測(cè)試和隨后的酶活性測(cè)定篩選在搖瓶測(cè)試中研究了多種微生物的葡糖淀粉酶活性。適用于該目的的培養(yǎng)基是適用于生物生長(zhǎng)并導(dǎo)致葡糖淀粉酶表達(dá)的任何常規(guī)培養(yǎng)基。合適的培養(yǎng)基可以商業(yè)獲得或可以依據(jù)公開的方案(例如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中所述)制備。例如具有不同鏈長(zhǎng)度的葡萄糖寡聚物的混合物可以作為確定培養(yǎng)基中的單一碳原料使用。因?yàn)樵诎l(fā)酵條件下不發(fā)生寡糖的熱水解，所以只有具有葡糖淀粉酶和/或麥芽糖酶活性的菌林能夠在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。合適底物的實(shí)例為Maldex150(AmylumGroup)。篩選在多種發(fā)酵條件(pH,溫度)下進(jìn)行。為了區(qū)分葡糖淀粉酶和麥芽糖酶活性，在實(shí)驗(yàn)前例如使用HPLC分析混合物的S^t組成。因此，例如Maldexl50具有以下組成(見表2):表2:Maldex150(AmylumGroup)的組成<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>含有麥芽糖和葡萄糖的對(duì)照培養(yǎng)基根據(jù)該分析制造。然后可以將寡糖培養(yǎng)基中超出對(duì)照值的生長(zhǎng)和賴氨酸產(chǎn)生明確地歸因于葡糖淀粉酶活性?？梢杂米骱Y選的碳源的麥芽糖糊精混合物的替代物為純的麥芽四糖、麥芽五糖等。培養(yǎng)停止后，將生物量離心并過濾上清液。在葡糖淀粉酶活性測(cè)定中使用澄清的上清液(CHEN等，J.Gen.Appl.Microbiol.,51，175-181(2005))。為此，為該目的使用0.2ml50mM乙^/乙酸鈉緩沖液(pH5.0)和0.5%可溶淀粉和0.2ml上清液的反應(yīng)混合物。在60°C10分鐘的反應(yīng)時(shí)間后通過在100。C煮沸10分鐘停止反應(yīng)。釋放的葡萄糖的量借助于葡萄糖氧化酶/過氧化物酶方法(Bergmayer和Bernt,1974)測(cè)定。在該上下文中，一個(gè)單位的葡糖淀粉酶活性;故定義為在主要的反應(yīng)條件下每分鐘從可溶淀粉中釋放1pmol葡萄糖的酶量。IVc)借助于引物/探針進(jìn)行篩選用于測(cè)試要用于研究葡糖淀粉酶編碼序列的生物的備選方法是借助于引物或^笨針篩選，所述引物或探針對(duì)這些序列特異。i)從已知的葡糖淀粉酶基因的保守區(qū)開始，從多種生物構(gòu)建用于鑒定和克隆DNA序列的探針，所迷DNA序列編碼具有葡糖淀粉酶活性的多肽。這類探4f尤其適用于與期望生物的基因組DNA或cDNA雜交，隨后通過標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行DNA印跡，從而鑒定所期望的基因。技術(shù)人員會(huì)尤其在來自BoehringerMannheimGmbH(Mannheim,Germany,1993)的教科書"TheDIGSystemUsersGuideforFilterHybridization"和Liebl等(InternationalJournalofSystematicBacteriology(1991)41:255-260)中發(fā)現(xiàn)用于通過雜交鑒定DNA序列的教導(dǎo)。ii)從已知葡糖淀粉酶基因的保守區(qū)開始，合成PCR引物。這些引物用于與待研究生物的DNA的PCR反應(yīng)中。如果存在引物的合適的結(jié)合位點(diǎn)(即葡糖淀粉酶編碼基因)，則相應(yīng)擴(kuò)增的寡核苷酸可以借助于隨后進(jìn)行的凝膠電泳被鑒定。技術(shù)人員尤其會(huì)在Gait:Oligonucleotidesythesis:apracticalapproach(IRLPress,Oxford,UK,1984)的教科書和Newton和Graham:PCR(SpektmmAkademischerVerlag，Heidelberg,Germany,1994)中發(fā)現(xiàn)借助于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增DNA序列的教導(dǎo)。實(shí)施例1在使用谷氨酸棒狀桿菌的搖瓶實(shí)驗(yàn)中使用液化的玉米粉水解產(chǎn)物。I)液化向反應(yīng)容器中引入360g去離子水。向水中緩慢加入240g玉米粉，持續(xù)攪拌。用50%強(qiáng)度的NaOH水溶液將pH調(diào)節(jié)至5.8后，加入4.0ml(=按重量計(jì)2%酶/干物質(zhì))的LiquozymeSC(來自NovozymesA/S)。然后將醪液(mash)快速加熱至85。C。在該過程中，持續(xù)監(jiān)測(cè)并在適當(dāng)時(shí)調(diào)節(jié)pH。達(dá)到最終溫度后，添加更多粉，最初添加50g粉。添加中將溫度保持在恒定85。C。允許經(jīng)過至少10分鐘以確保在添加另一部分(50g)粉之前完全反應(yīng)。添加兩部分后，添力。1.67mlLiquozyme;之后再添加兩部分(每部分50g)粉。獲得按重量計(jì)55%的干物質(zhì)含量。添加后將溫度提高到100°C，并將醪液煮沸10分鐘。取樣并冷卻至室溫。用去離子水稀釋樣品(約1:10)后，加入一滴濃魯戈溶液(每升5g碘和10g碘化鉀的混合物)。濃藍(lán)色指出存在殘余的淀粉；當(dāng)所有的淀粉都被水解時(shí)觀察到棕色。當(dāng)測(cè)試的混合物對(duì)淀粉是陰性的時(shí)候，將其趁熱裝入無菌的容器中，并在冷卻后儲(chǔ)存在4。C。II)用谷氨酸棒桿菌發(fā)酵菌林使用具有反饋去調(diào)節(jié)的天冬氨酸激酶的經(jīng)修飾的野生型ATCC13032lysCfbr。接種物的制備將細(xì)胞在無菌的CM+CaAc瓊脂(組成見表3;121。C20分鐘)上劃線，然后在30。C培育過夜。之后，將細(xì)胞從平板上刮下并重懸于鹽水中。用下述量的細(xì)胞懸浮液接種裝有兩個(gè)擋板的250-ml-錐形瓶中25ml的培養(yǎng)基(見表4)，所述用量使得610nm處的光密度OD610值達(dá)到0.5。表3:CM+CaAc瓊脂平板的組成<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>燒瓶培養(yǎng)基的組成在表4中顯示。實(shí)驗(yàn)以一式三份進(jìn)行。表4:燒瓶培養(yǎng)基<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>*用稀的NaOH水溶液調(diào)節(jié)接種后，將燒瓶在濕潤(rùn)的搖床中搖動(dòng)(200rpm)下在30。C培育3天。發(fā)酵結(jié)束后，通過HPLC測(cè)定賴氨酸含量。用Agilent1100系列LC系統(tǒng)進(jìn)行HPLC分析。借助于高壓液相層析在Agilent1100系列LC系統(tǒng)HPLC上測(cè)定氨基酸濃度。用鄰苯二醛柱前衍生允許定量形成的氨基酸；使用AgilentHypersilAA柱分離"tj^酸混合物。結(jié)果列于表5中。表5:賴氨酸產(chǎn)量(均值)<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>實(shí)施例2在使用黑曲霉的搖瓶實(shí)驗(yàn)中使用液化的玉米粉水解產(chǎn)物。I)液化如實(shí)施例1中I)下所述進(jìn)行液化。II)用黑曲霉發(fā)酵菌林與W098/46772詳述的NP505-7制備類似地制備了黑曲霉肌醇六磷酸酶生產(chǎn)菌抹，所述菌林帶有處于glaA啟動(dòng)子調(diào)控下的來自Aspergillusficuum的6個(gè)拷貝的phyA基因。使用具有3個(gè)經(jīng)修飾的glaA擴(kuò)增子(與ISO505類似)但未整合phyA表達(dá)盒的菌抹作為對(duì)照。接種物的制備將每個(gè)裝備有一個(gè)擋板的100-ml-錐形瓶中的20ml預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基(見表6)用100pl水凍的培養(yǎng)物接種，并在34。C下在潮濕的搖床中搖動(dòng)(170rpm)下培育24小時(shí)。表6:預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基的組成組分濃度葡萄糖30.0g/1來自酪蛋白的蛋白胨10.0g/1酵母提取物5.0g/1KH2P041.0g/1MgS04x7H200.5g/1ZnCl230mg/1CaCl220mg/1MnS04x1H209mg/1FeS04x7H203mg/1吐溫803.0g/1青霉素50000IU/1鏈霉素50mg/1pH*5.5*用稀>5克酸調(diào)節(jié)將每個(gè)裝有一個(gè)擋板的250-ml錐形瓶中的50ml主要培養(yǎng)基(見表7)用5ml預(yù)培養(yǎng)物接種。發(fā)酵液的制備燒瓶培養(yǎng)基的組成在表7中顯示。對(duì)每個(gè)樣品建立兩個(gè)燒瓶。表7:燒瓶培養(yǎng)基玉米粉水解產(chǎn)物200g/1來自酪蛋白的蛋白胨25.0g/1<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>*將用稀硫酸調(diào)節(jié)接種后，將燒瓶在34。C濕潤(rùn)的搖床中搖動(dòng)(170rpm)下培養(yǎng)6天。發(fā)酵結(jié)束后，在250mM乙1乙酸鈉/吐溫20(按重量計(jì)0.1%),pH5.5緩沖液中使用肌醇六磷酸作為底物在合適的肌醇六磷酸酶活性水平(標(biāo)準(zhǔn)0.6U/ml)測(cè)定肌醇六磷酸酶活性。該測(cè)定被標(biāo)準(zhǔn)化以用于微量滴定板(MTP)。將IOJul的酶溶液與140fil的6.49mM肌醇六磷酸酶溶液在250mM的乙酸鈉緩沖液，pH5.5(肌醇六磷酸肌醇六磷酸的十二鈉鹽)中混合。在37。C溫育一小時(shí)后，通過添加等體積(150^1)的三氯乙酸終止反應(yīng)。將該混合物的一個(gè)等分試樣(20jil)轉(zhuǎn)移進(jìn)280jil的溶液中，所述溶液包含0.32NH2S04、按重量計(jì)0.27%的鉬酸銨和按重量計(jì)1.08%的抗壞血酸。隨后在50。C溫育25分鐘。在820nm處測(cè)量藍(lán)色溶液的吸光度。結(jié)果列于表8中。表8:發(fā)酵停止后的肌醇六磷酸酶活性<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>權(quán)利要求1.借助發(fā)酵產(chǎn)生至少一種有機(jī)化合物的方法，所述有機(jī)化合物具有至少3個(gè)C原子或具有至少2個(gè)C原子和至少1個(gè)N原子，所述方法包括以下步驟al)碾磨淀粉原料，從而獲得碾磨產(chǎn)物，所述碾磨產(chǎn)物包含淀粉原料的至少部分非淀粉固體組分；a2)將碾磨產(chǎn)物懸浮于水性液體中，并在至少一種淀粉液化酶的存在下將存在于水性液體中的碾磨產(chǎn)物液化，獲得水性的含糊精培養(yǎng)基(l)，該培養(yǎng)基包含淀粉原料的至少一部分非淀粉固體組分；和b)在發(fā)酵中使用水性含糊精培養(yǎng)基(l)培養(yǎng)微生物，所述微生物能夠過量產(chǎn)生所述有機(jī)化合物；以下述量添加將糊精水解為單糖的酶，所述量以使用的淀粉原料總重量為基礎(chǔ)按重量計(jì)少于0.001%，或完全不添加所述酶。2.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中將碾磨產(chǎn)物在水性液體中的懸浮液加熱至高于淀粉原料中存在的淀粉的膠化溫度的溫度。3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中加熱在淀粉液化酶存在下進(jìn)行。4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中在液化步驟期間將至少一部分碾磨產(chǎn)物連續(xù)或分批地添加進(jìn)水性液體中。5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中以下述量將碾磨產(chǎn)物懸浮于水性液體中并在其中液化，所述量使得得到的水性含糊精培養(yǎng)基(l)具有以培養(yǎng)基(l)的總重量為基礎(chǔ)按重量計(jì)至少50%的干物質(zhì)含量。6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中以下述量將碾磨產(chǎn)物懸浮于水性液體中并在其中液化，所述量使得得到的水性含糊精培養(yǎng)基(l)具有以培養(yǎng)基(l)的總重量為基礎(chǔ)按重量計(jì)至少40%的葡萄糖當(dāng)量濃度。7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中微生物選自產(chǎn)生將糊精水解為單糖的酶的微生物。8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，所述方法還包括以下步驟bl)在水性發(fā)酵培養(yǎng)基(2)中培養(yǎng)能夠過量產(chǎn)生所述有機(jī)化合物的微生物；和b2)將含糊精的培養(yǎng)基(1)添加進(jìn)發(fā)酵培養(yǎng)基(2)中，其中存在于培養(yǎng)基(1)中的糊精由過量產(chǎn)生所述有機(jī)化合物的孩l生物代謝。9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中步驟bl)中的發(fā)酵培養(yǎng)基(2)基本上包含培養(yǎng)基(l)、能夠過量產(chǎn)生所述有機(jī)化合物的微生物、常規(guī)培養(yǎng)基組分和適當(dāng)時(shí)，用于稀釋的水。10.根據(jù)權(quán)利要求8或9的方法，其中在步驟bl)中，下述量的培養(yǎng)基(l)用于補(bǔ)足發(fā)酵培養(yǎng)基(2),所述量使得發(fā)酵培養(yǎng)基(2)中的總糖濃度在按重量計(jì)從6%到30%的范圍內(nèi)，所述濃度被計(jì)算為葡萄糖當(dāng)量并以發(fā)酵培養(yǎng)基(2)的總重量為基礎(chǔ)計(jì)算。11.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中將谷物仁用作步驟al)中的淀粉原料。12.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中碾磨產(chǎn)物包含按重量計(jì)至少20%的淀粉原料所有非淀粉固體組分。13.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中淀粉液化酶為a-淀粉酶。14.根據(jù)前迷權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所產(chǎn)生的有機(jī)化合物選自任選地連接有羥基并具有3到10個(gè)碳原子的單羧酸、二羧酸和三羧酸、產(chǎn)蛋白質(zhì)的和不產(chǎn)蛋白質(zhì)的氨基酸、嘌呤堿基、嘧咬堿基；核苷、核苷酸、脂類；飽和和不飽和的脂肪酸；具有4到10個(gè)碳原子的二元醇、具有3個(gè)或更多羥基的多元醇、具有至少4個(gè)碳原子的長(zhǎng)鏈醇、糖類、芳香族化合物、維生素、維生素原、輔因子、營(yíng)養(yǎng)藥、蛋白質(zhì)、類胡蘿卜素、具有3到10個(gè)碳原子的酮、內(nèi)酯、生物聚合物和環(huán)糊精。15.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中用于發(fā)酵的微生物選自過量產(chǎn)生至少一種以下代謝產(chǎn)物的天然或重組的微生物酶、氨基酸、維生素、二糖、具有3到10個(gè)碳原子的脂肪族單、二和三羧酸、具有3到10個(gè)碳原子的脂肪族羥基羧酸、具有3到10個(gè)C原子的酮、具有4到10個(gè)C原子的鏈烷醇、具有3到8個(gè)C原子的鏈烷二醇和聚羥鏈烷酸。16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述微生物選自過量產(chǎn)生一種或多種氨基酸的微生物。17.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述微生物選自過量產(chǎn)生一種或多種具有3到10個(gè)C原子的脂肪族單、二和三羧酸的微生物。18.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述微生物選自過量產(chǎn)生一種或多種酶的微生物。19.根據(jù)權(quán)利要求15或18的方法，其中所述微生物選自過量產(chǎn)生肌醇六磷酸酶的微生物。20.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述^:生物選自棒桿菌屬(Corynebacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、阿舒嚢霉屬(Ashbya)、埃希氏菌屬(Escherichia)、曲霉屬(Aspergillus),產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)、放線桿菌屬(Actinobacillus)、厭氧螺菌屬(AnaerobiospiriHum)、專'L桿菌屬(Lactobacillus)、丙酸桿菌屬(Propionibacterium)、梭狀芽孢桿菌屬21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中微生物選自棒桿菌屬的菌林。22.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中至少一種微生物代謝產(chǎn)物被耗盡或從發(fā)酵液中分離，并且發(fā)酵液的揮發(fā)性組分隨后被基本去除，獲得固體或半固體的蛋白質(zhì)組合物。23.根據(jù)權(quán)利要求l到21中任一項(xiàng)的方法，其中發(fā)酵液的至少一些揮發(fā)性組分被去除，不事先分離或耗盡非揮發(fā)性的微生物代謝產(chǎn)物，并且如果適當(dāng)?shù)脑挘皇孪热コ腆w組分，獲得非揮發(fā)性的微生物代謝產(chǎn)物的固體制劑。全文摘要借助于發(fā)酵用于產(chǎn)生至少一種有機(jī)化合物的方法，所述有機(jī)化合物具有至少3個(gè)C原子或具有至少2個(gè)C原子和至少1個(gè)N原子，所述方法包括以下步驟a1)碾磨淀粉原料，從而獲得碾磨產(chǎn)物，所述碾磨產(chǎn)物包含淀粉原料的至少部分非淀粉固體組分；a2)將碾磨產(chǎn)物懸浮于水性液體中，并在至少一種淀粉液化酶的存在下將存在于水性液體中的碾磨產(chǎn)物液化，獲得水性的含糊精培養(yǎng)基(1)，該培養(yǎng)基包含淀粉原料的至少一部分非淀粉固體組分；和b)在發(fā)酵中使用水性含糊精培養(yǎng)基(1)培養(yǎng)微生物，所述微生物能夠過量產(chǎn)生所述有機(jī)化合物；以下述量添加將糊精水解為單糖的酶，所述量以使用的淀粉原料總重為基礎(chǔ)按重量計(jì)少于0.001％，或完全不添加所述酶。文檔編號(hào)C12P13/14GK101313075SQ200680043887公開日2008年11月26日申請(qǐng)日期2006年11月27日優(yōu)先權(quán)日2005年11月28日發(fā)明者M(jìn)·博伊,S·弗里爾申請(qǐng)人:巴斯夫歐洲公司