專利名稱：用于改變植物纖維素含量的多核苷酸、dna構(gòu)建體和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域以及通過(guò)將外源基因引入植物細(xì)胞中(優(yōu) 選引入其基因組中)來(lái)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成。更具體地，所述方法涉及通過(guò)引 入編碼活性蔗糖合酶的外源基因來(lái)改變植物細(xì)胞中的纖維素含量。
背景技術(shù)：
蔗糖合酶(EC2.4丄13)是催化蔗糖分解為UDP-葡萄糖和果糖的酶。 在植物中，蔗糖合酶可見(jiàn)于庫(kù)(sink)組織中，例如塊莖、種子、果實(shí)、 分生組織和木質(zhì)(wood)。貯藏組織中的后續(xù)反應(yīng)使用UDP-葡萄糖產(chǎn)生 淀粉；而在其它組織中，UDP-葡萄糖和果糖可累積起來(lái)，或者進(jìn)一步轉(zhuǎn)變 為其它化合物，如纖維素。已在植物中鑒定了多種蔗糖合酶的同工酶，其 中大多數(shù)通常顯示組織特異性表達(dá)模式。Huang等，5,Vwc/: 5,V^附.60:233-239 (1996) ; Chourey等，扁.G饑203:251-255 (1986)。特別地，若干蔗糖合酶同工酶主要或僅僅可見(jiàn)于通過(guò)大恥漠細(xì)胞 分裂和細(xì)胞壁沉積實(shí)現(xiàn)生物量生長(zhǎng)的組織中，例如發(fā)育中的次生木質(zhì)部和 才艮瘤。Rouhier & Usuda，CW/42:583-593 (2001) ; Komina 等,7V""fiV^s,V /. 129:1664-1673 (2002)。
植物在轉(zhuǎn)錄和翻譯后水平均對(duì)蔗糖合酶進(jìn)行調(diào)節(jié)，包括通過(guò)葡萄糖/ 果糖實(shí)現(xiàn)反饋抑制和磷酸化。已顯示玉米蔗糖合酶在Ser-15殘基處發(fā)生可 逆磷酸化，該殘M迄今研究的所有植物序列中都是保守的。Hardin等, /V"WiV^wW. 134: 1427-1438 (2004)。
在藍(lán)細(xì)菌(如魚腥藍(lán)細(xì)菌(^i^fle" sp.)中，蔗糖合酶似乎在稱為 異形胞的特化結(jié)構(gòu)中的固氮中發(fā)揮作用。Schilling & Ehrnsperger， Z TV^wr/orac/i 40c: 776-779 (1985 )。已經(jīng)提出，在這些生物中蔗糖合酶負(fù)責(zé)蔗糖合成，而在植物中其功能為蔗糖分解。Salerno &Curatti，7>emfciV"/^ 5W 8: 63-69 (2003 )。
纖維素是植物細(xì)胞壁的主要成分之一，它提供機(jī)械強(qiáng)度和剛性。通常， 烘干的木材含有30~50%纖維素和20~30%半纖維素(參閱Higuchi等， BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY OF WOOD, Springer Verlag (1997)),盡管當(dāng)樹(shù)木經(jīng)受環(huán)境變化時(shí)這些數(shù)字常常發(fā)生變化。 例如，承受壓縮應(yīng)力的木材通常表現(xiàn)出纖維素含量的顯著降低，而應(yīng)拉木 則含有較多的纖維素。Timmell， COMPRESSION WOOD IN GYMNOSPE函S， Springer Verlag (1986 )。
纖維素是通過(guò)一種或多種纖維素合酶合成的|3-1，4-連接的葡萄糖殘基 的多聚體，所述纖維素合酶在質(zhì)膜處稱為玫瑰狀復(fù)合體(rosette)的蛋白 質(zhì)復(fù)合物中催化UDP-葡萄糖單元組裝成纖維素微原纖維。Ddmer & Amor， i /fl", CW/7: 987-1000 (1995 )。在高等植物中，葡聚糖聚合度在初生和次 生細(xì)胞壁中不同，次生壁產(chǎn)生較高分子量的纖維素微原纖維。Brown等， 7y^i^iV"WSd: 1 : 149-156(1996)。應(yīng)拉木中的細(xì)胞壁也具有更高的纖維 素含量以及更高的聚合度和結(jié)晶度。認(rèn)為細(xì)胞壁聚合度中這些變化取決于 參與纖維素合成的纖維素合酶同工酶。Haigler & Blanton，尸roc. 7Vfl《/Jaw/.
t/X4 93: 12082-12085 (1996 )。
另 一方面，幾乎還不了解纖維素合酶復(fù)合體如何起作用以及這些蛋白 質(zhì)復(fù)合體能否偶聯(lián)纖維素合成與蔗糖分解，認(rèn)為所述蔑糖分解在所有植物 細(xì)胞中通過(guò)蔗糖合酶的作用提供用于纖維素合成的UDP-葡萄糖單元。 Delmer, j朋仏及ev./%s,V /. 7V虛她/. 5,》/. 50: 245-276 (1999 )。
Konishi等，尸/""f134: 1146-1152 (2004)報(bào)道了在25個(gè)獨(dú)立 的楊樹(shù)品系中it^達(dá)綠豆蔗糖合酶。雖然所有品系均在葉中表現(xiàn)出高水平 的蔗糖合酶，然而均^現(xiàn)出纖維素沉積的提高。其作者推測(cè)，該結(jié)果可 能與植物具有控制糖從來(lái)源轉(zhuǎn)運(yùn)到庫(kù)(特別是當(dāng)來(lái)源組織包含高水平的蔗 糖合酶時(shí))的調(diào)節(jié)機(jī)制有關(guān)?；蛘?，Konishi等推測(cè)，在他們的轉(zhuǎn)基因品 系中纖維素沉積未增加可能與^f吏用組成性啟動(dòng)子有關(guān)，該啟動(dòng)子可能導(dǎo)致 蔗糖在來(lái)源與庫(kù)之間的分配效率低。

發(fā)明內(nèi)容
一方面，本發(fā)明提供了包含非植物蔗糖合酶核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物，
量。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)用包含所述非植物蔗糖合酶核酸分子的表達(dá) 載體轉(zhuǎn)化植物來(lái)獲得轉(zhuǎn)基因植物，所述核酸分子在能在植物中發(fā)揮功能的
啟動(dòng)子控制之下。在另一實(shí)施方案中，所述核酸分子是U)包含SEQID NO:l或2的核苷酸序列；或者(b)缺失、替換、插入或添加了一個(gè)或多 個(gè)堿基的U)的核苷酸序列。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因植物具有提高的纖維素含量。在另一 實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因植物具有降低的木質(zhì)素含量。在一個(gè)實(shí)施方案中， 所述轉(zhuǎn)基因植物是雙子葉植物或單子葉植物。在另一實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn) 基因植物是棵子植物。在又一實(shí)施方案中，所述植物a本樹(shù)木。在又一 實(shí)施方案中，所i^^N"木是桉屬(五"cfl(v/^"s)、楊屬(i^/;"/"s)或柏> 屬(戶/""s)植物。在另一實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因植物選自葉、莖、花、 子房、果實(shí)、種子和愈傷組織。
另一方面，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)與非轉(zhuǎn)基因植物相比纖維素含量提 高的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括(i)用能在植物中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子控制之 下的非植物蔗糖合酶序列轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，(ii)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)的條件下 培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，以及(iii)選擇顯示纖維素含量提高的轉(zhuǎn)基因植 物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核香酸序列是廉糖合酶基因，其包括(a) 包含SEQIDNO:l或2的核苷酸序列；或者(b)缺失、替換、插入或添 加了一個(gè)或多個(gè)堿基的(a)的核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基 因植物是雙子葉植物或單子葉植物。在另一實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因植物 是棵子植物。
另一方面，本發(fā)明提供分離的多核普酸序列，其包含編碼能提高植物 中蔗糖合酶及纖維素水平的多肽的核酸序列。


圖1展示說(shuō)明植物中由蔗糖合,化的反應(yīng)以及UDP-葡萄糖生成與
6纖維素生物合成途徑的偶聯(lián)。
圖2示意性展示本發(fā)明的植物表達(dá)質(zhì)粒載體pALELLYX-Susy，其包 含驅(qū)動(dòng)本發(fā)明蔗糖合酶核苷酸序列表達(dá)的形成層/木質(zhì)部偏好啟動(dòng)子。
圖3示意性展示本發(fā)明的植物表達(dá)質(zhì)粒載體pALELLYX-SusyN，其包 含驅(qū)動(dòng)來(lái)自魚腥藍(lán)細(xì)菌的天然蔗糖合酶核苷酸序列表達(dá)的形成層/木質(zhì)部 偏好啟動(dòng)子。
圖4示意性展示本發(fā)明的植物表達(dá)質(zhì)粒載體pALELLYX-Susycu，其 包含驅(qū)動(dòng)編碼魚腥藍(lán)細(xì)菌蔗糖合酶的經(jīng)密碼子使用適應(yīng)性改造的核普酸 序列表達(dá)的形成層/木質(zhì)部偏好啟動(dòng)子。
圖5顯示轉(zhuǎn)化了本發(fā)明植物表達(dá)質(zhì)粒載體pALELLYX-SusyN的若干轉(zhuǎn) 基因品系及各自對(duì)照非轉(zhuǎn)基因植物中的纖維素含量。星號(hào)指示統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著 更高的纖維素含量平均值(PO.Ol， t檢驗(yàn))。
圖6顯示轉(zhuǎn)化了本發(fā)明植物表達(dá)質(zhì)粒載體pALELLYX-Susycu的若干 轉(zhuǎn)基因品系及各自對(duì)照非轉(zhuǎn)基因植物中的纖維素含量。星號(hào)指示在統(tǒng)計(jì)學(xué) 上顯著更高的纖維素含量平均值(P<0.05， t枱r驗(yàn))。
圖7顯示轉(zhuǎn)化了本發(fā)明的植物表達(dá)質(zhì)粒載體pALELLYX-Susycu的Tl 轉(zhuǎn)基因植物三種基因型中的纖維素含量。星號(hào)指示在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著更高的 纖維素含量平均值(P<0.05， t檢驗(yàn))。
發(fā)明詳述
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)非植物蔗糖合酶(如可見(jiàn)于藍(lán)細(xì)菌中的酶)可能不受經(jīng) 遺傳改造以表達(dá)該酶的植物調(diào)節(jié)，其原因包括但不僅限于缺乏調(diào)節(jié)性磷酸 化作用或其它別構(gòu)位點(diǎn)(如通常可見(jiàn)于植物蔗糖合酶中的那些)。同樣， 本發(fā)明人設(shè)想芽1入這些宿主植物中的非植物蔗糖合酶可影響蔗糖合成，但 卻不會(huì)被宿主植物下調(diào)。因此，本發(fā)明人通過(guò)用編碼非植物蔗糖合酶的 DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化木本樹(shù)木和其它產(chǎn)生纖維素纖維的作物來(lái)實(shí)現(xiàn)了這一期 望。所述異源酶將提高葡萄糖向UDP-葡萄糖的轉(zhuǎn)換，接著UDP-葡萄糖用 作纖維素合成的建造塊。
因此，本發(fā)明涉及包含非植物蔗糖合酶編碼DNA序列和蔗糖合酶多
7肽的組合物。編碼本發(fā)明蔗糖合酶的核普酸序列的實(shí)例為SEQ ID NO: 1和2。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了通過(guò)控制蔗糖合酶的活性來(lái)改變植物組織中纖維素含量的方法，所述植物組織如木^子植物木質(zhì)部的纖維細(xì)胞、棵子植物木質(zhì)部的管胞細(xì)胞和棉籽的纖維細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的該方面，用非植物來(lái)源(優(yōu)選魚腥藍(lán)細(xì)菌)的蔗糖合酶編碼序列轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或完整植物，所述序列在被子植物的木質(zhì)纖維細(xì)胞、棵子植物的木質(zhì)管胞或棉籽的纖維細(xì)胞中表達(dá)時(shí)致使蔗糖向UDP-葡萄糖的轉(zhuǎn)換提高，引起用于纖維素生物合成的UDP-葡萄糖可用性提高。
除了提高纖維素的生物合成和沉積之外，本發(fā)明提供了用于同時(shí)降低木質(zhì)素沉積的方法。樹(shù)木中高濃度的木質(zhì)素為造紙工業(yè)帶來(lái)顯著的問(wèn)題，必須消耗可觀的資源才能將木質(zhì)素從纖維素纖維中分離。因此，期望通過(guò)遺傳工程來(lái)降低木^t物中的木質(zhì)素含量。Hu等，iVfl似^ 5!V^c/m0/o^v 17:808-812 (1999)發(fā)現(xiàn)抑制木質(zhì)素生物合成提高了纖維素沉積，這提示木質(zhì)素與纖維素生物合成之間負(fù)相關(guān)。因?yàn)楸景l(fā)明人已發(fā)現(xiàn)通it^達(dá)非植物蔗糖合酶來(lái)提高纖維素沉積的策略，所以也可能同時(shí)引起木質(zhì)素沉積的降低。
本文使用的所有技術(shù)術(shù)語(yǔ)均為普遍用于生物化學(xué)、分子生物學(xué)和農(nóng)業(yè)的術(shù)語(yǔ)，并且可為本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所理解。這些技術(shù)術(shù)語(yǔ)可見(jiàn)于以下文獻(xiàn)MOLECULAR CLONING: A LABORATORYMANUAL,第三版，1-3巻，Sambrook和Russd編輯，Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y" 2001; CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel等編輯,GreenePublishing Associates and Wiley-Interscience, New York, 1988 (定期更新)；SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY: A COMPENDIUMOF METHODS FROM CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY,第五版，1-2巻，Ausubel等編輯，John Wiley & Sons, Inc., 2002;GENOME ANALYSIS: A LABORATORY MANUAL, 1-2巻，Green等編輯,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harboi"， N. Y"1997。涉及植物生物學(xué)技術(shù)的方法在本文中有所描述，并且在以下著述中詳細(xì)描述METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY: ALABORATORY COURSE MANUAL, Maliga等編輯，Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1995。 4吏用PCR的多種技術(shù)描述于例如Innis等，PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS ANDAPPLICATIONS, Academic Press, San Diego, 19卯以及Dieffenbach和Dveksler， PCR PRIMER: A LABORATORY MANUAL,第二版，ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y" 2003?？衫靡阎夹g(shù)從已知序列得到PCR引物對(duì)，例如使用旨在用于該目的的計(jì)算^^呈序，例如Primer, 0.5版，1991， Whitehead Institute for BiomedicalResearch, Cambridge, MA。用于核酸化學(xué)合成的方法描述于例如Beaucage和Caruthers, T^m.22:1859-1862 (1981)以及Matteucci和Caruthers， / 爿附.C7^附.Soc. 103:3185 (1981)。
限制酶消化、磷酸化、連接和轉(zhuǎn)化如Sambrook等，MOLECULARCLONING: A LABORATORY MANUAL,第二版(1989) , Cold SpringHarbor Laboratory Press所述進(jìn)行。除非另有說(shuō)明，用于培養(yǎng)和維持細(xì)菌細(xì)胞的所有試劑和材料均得自Aldrich Chemicals (Milwaukee, WI )、DIFCO Laboratories (Detroit, MI )、 Invitrogen ( Gaithersburg， MD )或Sigma Chemical Company ( St. Louis， MO )。
術(shù)語(yǔ)"編碼"指基因通過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)制向細(xì)胞提皿息的過(guò)程，在所述細(xì)胞中 一系列氨基酸可組裝成特定的M酸序列以產(chǎn)生活性酶。由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，DNA序列中的某些絲變化不改變蛋白質(zhì)的猛斷列。因此應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明涵蓋編碼蔗糖合酶的DNA序列中不顯著影響蔗糖合酶的功能特性的修飾。
在本說(shuō)明書中，"表達(dá)"指產(chǎn)生基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。"it^達(dá)"是指在轉(zhuǎn)基因生物中產(chǎn)生超過(guò)正?；蚍寝D(zhuǎn)化生物中所產(chǎn)生水平的基因產(chǎn)物。
非植物蔗糖合酶序列
已在若干非植物物種中鑒定出蔗糖合酶基因，例如藍(lán)細(xì)菌(魚腥藍(lán)細(xì)菌)、變形菌(歐洲亞硝化單胞菌(TV. e"w/7fl^！))、綠藻(小球藻(C. v"/g"n's)和斜生柵藻M//《w"s))和原生生物(眼蟲(￡. grac/to))。因此，本文中短語(yǔ)"非植物蔗糖合酶"指從賦予蔗糖合酶活性的非植物物種基因組分離的任何核酸、基因、多核普酸、DNA、 RNA、 mRNA或cDNA分 子。
適用于本發(fā)明的非植物蔗糖合酶可得自多種特征為存在蔗糖合酶基因 的生物，所述蔗糖合酶基因較少受到包含和表達(dá)該基因的宿主植物調(diào)節(jié)。 例如，植物的蔗糖合酶序列含有調(diào)節(jié)基因表達(dá)的磷酸化結(jié)構(gòu)域，而例如許 多藍(lán)細(xì)菌的蔗糖合酶序列缺乏磷酸化結(jié)構(gòu)域。與植物蔗糖合酶不同，相信 非植物蔗糖合酶在宿主植物中較少受到負(fù)反饋抑制。
就本發(fā)明目的而言，非植物蔗糖合酶基因優(yōu)選分離自藍(lán)細(xì)菌物種。更 優(yōu)選地，非植物蔗糖合酶基因分離自絲狀藍(lán)細(xì)菌和異形胞藍(lán)細(xì)菌。示例性 藍(lán)細(xì)菌物種為隱球藍(lán)細(xì)菌(々Afl"oc"，fl sp.)、 隱桿藍(lán)細(xì)菌(々A""o幼ece sp.)、管孢藍(lán)細(xì)菌(C7^扁ew》Aow sp.)、 色球藍(lán)細(xì)菌(Oiraocwa/s sp.)、 C7rnw^^c，/s sp.、 OwospAflrmi sp.、藍(lán)細(xì)菌(C戸"c^""m7/附sp.)、藍(lán) 菌(Q;fl加6/w附sp.)、藍(lán)絲菌(Qwi0幼ece sp.)、擬指球菌(D"c^;/oc0ccfl!psis sp.)、 粘球藍(lán)細(xì)菌(<7/<^c"/wfl sp.)、粘桿藍(lán)細(xì)菌(G7o 幼"e sp.)、 /(9/r"朋esA豐/幼Vi sp.、片菌(A/m'膽o/;^f/" sp.)、微嚢藍(lán)細(xì)菌(M/m^幼's1 sp.)、桿皮藻(及/^rf^fc歸sp.)、聚球藍(lán)細(xì)菌(iS"ecAoc0CCMs sp.)、集 胞藍(lán)細(xì)菌(iSjwcAo，ris sp. )、 rAmimsjwc/iococcws sp.、 魚腥藍(lán)細(xì)菌
(Jwa6ae朋sp.)、 項(xiàng)圏藍(lán)細(xì)菌(Jwfl6"e朋戸's sp.)、 藍(lán)束絲藍(lán)細(xì)菌
(々/ffl"/zo膨wow sp.)、管鏈藍(lán)細(xì)菌(爿1//艦>*" sp.)、藍(lán)螺菌(Qwios/wV" sp.)、擬柱抱藻(C^/zWmspmwo/wis sp.)、筒抱藍(lán)細(xì)菌(C^//"</mspmfii/w sp. )、 M y謂."sp.、節(jié)球藍(lán)細(xì)菌(A^/w/"nVi sp.)、念珠藍(lán)細(xì)菌(Ateoc sp.)、 尖頭藍(lán)細(xì)菌(及fl/ /r,V/iV /w/s sp. )、 7Hc/ro簡(jiǎn)us sp.、眉藍(lán)細(xì)菌(CVi/( 幼rix: sp.)、 膠糸'藍(lán)細(xì)菌 (G/oeofr/c/i/fl sp.)、 偽斗支藍(lán)細(xì)菌 (5"cj;to/ie附a sp.)、 5^towe挑a鄉(xiāng)sis1 sp.、 節(jié)螺藍(lán)細(xì)菌(爿WAms/wV" sp. )、 G^/en'"e附"sp.、 ^T(a/o附/c/wi柳"sp.、 鹽螺旋藻(Hfl/<w/ >M/iVifl sp. )、 JT"^ig"拜e"e sp.、 丄^pto(v"g6^fl sp.、湖生藍(lán)絲藻(L/附w0^w^c sp.)、鞘絲藍(lán)細(xì)菌(jL^wgi^fl sp.)、 微鞘藍(lán)細(xì)菌(MiVtwo/cws sp.)、顫藍(lán)細(xì)菌(6te7/"tonVi sp.)、席藍(lán)細(xì)菌
(i^0削認(rèn)n附sp. )、 P/flwAtW/if/cwVfes sp.、浮游藍(lán)絲藻(/V"fiA:to幼^: sp.)、 織線藻(iV"towewflsp.)、假魚腥藍(lán)細(xì)菌(i^e"^m"6"e/fflsp.)、裂須藍(lán)細(xì) 菌(5"由'zo幼A sp.)、螺41^細(xì)菌(sp.)、束藍(lán)細(xì)菌(sp.)、 束毛藍(lán)細(xì)菌(7V/cAoto附/畫sp. ) 、 T)^卵柳"sp.、 擬色球藍(lán)細(xì)菌
(Orwocw"V/iV /wis sp.)、皮果藍(lán)細(xì)菌(Dmw0ow7 fl sp.)、 小皮果藍(lán)細(xì)菌(Dmnoow*/^//" sp.)、 粘八疊球菌(J^mwim.聽(tīng)sp.)、 寬球藍(lán)細(xì)菌 (/Veiowfl/7s" sp.)、斯塔尼爾氏菌(5to/er/" sp.)、異球藍(lán)細(xì)菌(Xe朋coccws sp.)、原綠藍(lán)細(xì)菌(iVw/r/o#wi sp.)、原綠球藻(jP w似ww0cci/s sp.)、原 綠絲藍(lán)細(xì)菌(iVoc/i/wY^/w^: sp.)、蒴鏈藻(CVz/;^w/ni sp.)、擬綠膠藍(lán)細(xì)菌 (CMwy^Wo戸's sp.)、 飛氏藍(lán)細(xì)菌(/^/|^//" sp.)、 軟管藍(lán)細(xì)菌 (H"戸/柳》/r卵sp. )、 (Mfls/^c/flflto/wis sp.)、擬念珠藍(lán)細(xì)菌(iV。s/。c/ro/wis sp.)、真枝藍(lán)細(xì)菌(iS^o/i柳fl sp.)、聚線藻(X戸/7/rjwi柳fl sp. )、 C/柳otA:/" sp.、擬惠氏藍(lán)細(xì)菌(W^/e//fl>/>sis sp. )、 ^4c"，c/r/oWs sp.。
例如，根據(jù)本發(fā)明，分離自魚腥藍(lán)細(xì)菌的蔗糖合酶基因是非植物蔗糖 合酶，并可用于改變植物組織和/或器官的纖維素含量。優(yōu)選地，所述非植
ID NO: 1代表可見(jiàn)于魚腥藍(lán)細(xì)菌基因組DNA中的蔗糖合酶序列，其與編 碼蔗糖合酶蛋白的植物cDNA的同 一性低于55%。應(yīng)該注意，SEQ ID NO: 1缺乏N端附近的保守性磷酸化位點(diǎn)，該磷酸化位點(diǎn)是真核物種中蛋白質(zhì) 磷酸化所必需的。
非植物蔗糖合酶序列可以作為經(jīng)密碼子優(yōu)化的序列從頭開(kāi)始合成。參 閱Young和Dong, 7Vwc/"V/J"Vfci^s 32: e59 (2004)。例如，SEQ ID NO: 2提供了編碼蔗糖合酶的DNA序列，其中將所有密碼子選擇成與植物中針 對(duì)每種氨基酸所使用的平均偏好密碼子相匹配。因此，SEQ ID NO: 2與編 碼蔗糖合酶蛋白的植物cDNA的同一性低于55%，但是所編碼的蛋白質(zhì)序 列與非密碼子優(yōu)化序列所編碼的蛋白質(zhì)序列相同，因此它也缺乏N端附近
的保守性磷酸化位點(diǎn)。
另外，合適的非植物蔗糖合酶序列類別包括由SEQ ID NO: 1或SEQ IDNO:2的變體組成的核酸分子，其缺失、替換、插入或添加了一個(gè)或多 個(gè)堿基，所述變體編碼具有蔗糖合酶活性的多肽。因此，"缺失、替換、 插入或添加了一個(gè)或多個(gè)堿基的磁基序列"仍保留生理活性，即便所編碼 的Jl&酸序列中替換、缺失、插入或添加了一個(gè)或多個(gè)氨基酸。具有這樣 的修飾并編碼蔗糖合酶同工酶的核苷酸序列包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。例如， 可以缺失多腺普酸尾或者5，或3，末端非翻譯區(qū)，并且可缺失堿基至佳JL 基酸缺失的程度。還可以替換堿基，只要不造成移碼即可。還可以"添加，， 堿基至添加氨基酸的程度。然而，任何這樣的修飾不得造成蔗糖合酶活性
菌基因組DNA，如SEQ ID NO: 1所示序列。SEQ的損失。例如，可以修飾本發(fā)明的DNA g序列以通過(guò)位點(diǎn)特異性誘變 而替換、缺失、插入或添加特定位點(diǎn)的氨基酸，從而獲得本文中經(jīng)修飾的 DNA。 Zoller & Smith, A^c/"c爿"V/及仏10: 6487-6500 (1982 )。
可以由適當(dāng)?shù)膅從頭開(kāi)始合成非植物蔗糖合酶序列，例如通過(guò)使用 本文公開(kāi)的適當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)序列為指導(dǎo)來(lái)產(chǎn)生DNA分子，該DNA分子盡管不 同于天然的DNA序列，但卻引起產(chǎn)生具有相同或相似M酸序列的蛋白 質(zhì)。這類合成DNA分子在向植物中引入編碼異源蛋白質(zhì)的DNA序列時(shí)有 用，該DNA序列反映不同的(非植物)密碼子^^用頻率，并且如果不加 以修飾地使用則可導(dǎo)致宿主植物翻譯效率低。例如，SEQ ID NO: 2中的 DNA序列就是這樣經(jīng)密碼子使用優(yōu)化的分子。
本發(fā)明還提供了包含核苷酸序列SEQ ID NO: 1和2的核酸分子，其 編碼活性蔗糖合酶，其中該酶具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 3的M酸序列， 并且其中本發(fā)明的蛋白質(zhì)包含不改變?cè)撜崽呛厦腹δ艿腗酸替換、添加 和缺失。SEQ ID NO.: 3與真核蛋白質(zhì)的序列同源性平均低于40%。
合適的調(diào)節(jié)元件
本發(fā)明提供了可以在轉(zhuǎn)化植物中引起纖維素含量改變的核酸分子。本 發(fā)明的一個(gè)重要方面是DNA構(gòu)建體的使用，其中蔗糖合酶編碼核苷^t
列與 一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)序列有效連接，所述調(diào)節(jié)序列驅(qū)動(dòng)蔗糖合酶編碼序列 在某些細(xì)胞類型、器官或組織中表達(dá)，從而改變轉(zhuǎn)化植物的纖維素含量， 而不對(duì)其正常發(fā)育或生理狀況產(chǎn)生不當(dāng)影響。
維管系統(tǒng)包括木質(zhì)部和韌皮組織，統(tǒng)稱為"維管組織"。維管系統(tǒng)特 異性啟動(dòng)子(如木質(zhì)部偏好啟動(dòng)子)可用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的核酸分子的表達(dá)， 特別是在維管組織(尤其A^質(zhì)部組織)中表達(dá)。因此，"木質(zhì)部偏好" 指本發(fā)明的核酸分子在木質(zhì)部中比在任何其它植物組織中活性更高。根據(jù) 本發(fā)明，所選擇的啟動(dòng)子應(yīng)當(dāng)引起非植物蔗糖合酶it^達(dá)，由此改變木質(zhì) 部的大小、改變宿主植物木質(zhì)部的化學(xué)組成或者二者兼有。
合適的啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于木質(zhì)部偏好的微管蛋白(TUB)基 因啟動(dòng)子、木質(zhì)部偏好的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白(LTP)基因啟動(dòng)子和木質(zhì)部偏好 的香豆酸-4-羥化酶(C4H)基因啟動(dòng)子。其它合適的木質(zhì)部偏好啟動(dòng)子公 開(kāi)于2005年3月28日提交的國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/BR2005/000041中，其通過(guò)參考并入本文。
本發(fā)明使用的另一些調(diào)節(jié)元件描述于以下"DNA構(gòu)建體"小標(biāo)題下。
用于遺傳改造的植物
本發(fā)明包括對(duì)植物(特別是樹(shù)木和產(chǎn)生纖維素纖維的作物如棉花)進(jìn) 行遺傳操作從而增強(qiáng)維管組織或種子的纖維細(xì)胞中蔗糖合酶的活性，這通 過(guò)引入非植物蔗糖合酶基因來(lái)實(shí)現(xiàn)，該基因優(yōu)選在木質(zhì)部偏好啟動(dòng)子控制 之下。結(jié)果為纖維素的合成和沉積增強(qiáng)。
在本說(shuō)明書中，"植物"指可進(jìn)行遺傳操作的任何含有纖維素的植物 材料，包括但不僅限于分化或未分化的植物細(xì)胞、原生質(zhì)體、完整植物、 植物組織或植物器官，或者植物的任何組分如葉、莖、根、芽、塊莖、果 實(shí)、才艮莖等。
可根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行改造的植物包括但不僅限于樹(shù)木，如桉屬物種 (白按(五.fl幼fl)、 a仿ews1、杏仁按(fl/fy^a/f'"fl)、 flfw "/7/r/<w'"、 6似7e戸"fl、 五.Afl,/fl^w/e"5is1 、 雙助按(五.6/c仍toto )、 葡萄按( 6tf^jo油s1)、 6rac%fl/ fni、褐斑按6fmwVmfl )、 ^v/鄉(xiāng),/s、 6racA:w"^、赤按(五.cfl附flto/e/fs/s )、cmicefl、大花序按(五.c/ocVma )、
聚果桉(￡ CW"y^YI)、異心葉桉(五. n/fl似)、耶桉(五.CW7fM似)、
cwricos"、 常按(五.c"6m )、 craflyf'"go/ms/s、 J51. c W/s//、 山按(五. fl^/r戸/;/^wifl )、 剝皮按ofeg/w/;to )、 瑞格楠木(￡" fife/c^她wsis1 )、 fe//oito、 紅按rf/vem'co/w )、五.必vemyi /,Vi、 闊葉按(￡ rf/v^s)、五. </o//c/roc f77fl、 t/"wflf固7、鄧恩按fifw朋//)、五.e/"to、 ^j幼fwwys1、
藍(lán)按(g/oAiz/ws )、￡" g/Wiz/ws 5i/6s/ . 6/ow似似、jE". gto6w/"s1 sw&sp. g/Mw/ws、 ^mgv/oaw7w1、大按(五.gmw^fc )、五.gnmWs x ww/ ^y//"、 g肌.(^/e/、 加利按(五.g簡(jiǎn)w")、/r"http:////、/wws^fl艦、五._/flc&5wi//、 /flW5^to簡(jiǎn)^ifm、
/",/si"msis、五./e ico>/7/r/o/fl、 白蘚葉按(五./eMa x盧w )、 /oc^w/、 /"msi,'、 直軒藍(lán)按(￡" 附ftiVsfew//)、 赤按/mwg/m她)、附^1aw7w1、 蜜味按(五.柳e〃iWom )、 附/cAae,/a"a 、 小帽按(五.附/c/ww")、 附,Vro幼ecfl、 附"e/,mVi腦、亮果按(￡ Wews1)、五.",Wa、斜葉按 o緒《im)、五.otosiy/wfl、濕地按(￡ oc"Vjfe/i似//51 )、 一/附a、卵葉按
13( vfl似)、戸c/r"/^/,"、 雪桉(五./7fl""y wfl)、粗皮按(￡. /;e//&fl)、五. /7群/ /"" 、 / Wo/"r^s、 /H7w/flr/s、 /m》抓Y"、闊葉按(五./;/"妙/^//")、 多花按(￡ /w/拜w幼ewms )、 暢葉按(￡. /w戸/wefl )、 pm'5siVwm 、五. /we"flfog/06w/"s、五./ M/cAe//"、 澳洲尤加利(五.ra力Vi似)、md/fl似si/^s/7. mdiVz似、王按(jE"j"腦"sO、五.r/s^o"i7'、 ra6^tswi/Z、 /Wnvy;" 河紅 按(￡ f 6zV/fl)、 rw6/g/"os"、柳葉按(JE1. sfl/^m)、 Sfl/挑0加/;/ito/fl、
scfl;paf7'fl、銀頂白錯(cuò)按(五.5^6w')、五.spfl幼w/","、 stoen'、 E stoafe/、 jE". te聽(tīng)^s、 te""/ra挑/s1、 細(xì)葉按(_￡". feWVw"/s )、 te加gwifl、 澳大 利亞紅檀(五.)、五.ft'"rf"/,V^、 tor《wfl似、w挑Am、尾葉桉(五. wra尸/y;〃fl )、 vei7i/c仍fl、 多枝按(v/zmTm/Zs )、 w"/iflfe0、 韋塔按(￡. wtorens/s )、柳7//$//、五.柳7/^//5 65/7./ /"》濯&、￡. sn6s/7. w/船//、
五.mwrfmin///);楊屬物種(銀白楊(/ a/6fl)、銀白楊x大齒楊(/ a/6fljc i grawrfzVfeMtoto)、 4艮白楊x歐洲山楊(P fl仿fl jc i ,w附w/fl)、 E a歷fl jc 加附w/tf vfl/: g/fl </"/<wfl、 fl仿fl jc7 ^附M/wVafes、 小葉楊A(yù)"/wwmy^m )、
flfe/to/flfes、緣毛楊(i "7/"to )、美洲黑楊(P ^fe/^wVtes )、胡楊(i en/ /riYift'ctf )、 歐美楊e"m附w'cfl"" )、 i A:&flAfl附/eww's、 大葉楊/fl 》cw/7fl )、 苦
楊(i /"WJ7》//fl )、遼楊(E
訓(xùn)6s/;. ^y'cA0aif/7fl、黑楊w/gni )、 i s/e6o認(rèn)i'jcgrawWfifewtoto、甜楊 si/av^ /ews1 )、川楊(iR Mec/i fl/i/c")、毛白楊(i to附ewtowi )、歐洲山楊(
^"g附m/fl )、 ( ^^附M/a JC ^e附M/ozVfes )、 4以歐$州山楊()、椅
楊(i 兩7s卵//)、加楊(jR cfl腦dmsis )、 溪楊(戸朋awms/s)); 針葉樹(shù) 如火炬松(/Vmm51 toeda )、濕Afe^K朽"ms e,/!V 加'/ )、西黃樹(shù)i^7iMS1 /;o/iflferas")、 扭葉松(/V聽(tīng)s )和輻射松(iV聰s rar/i'a^i);花旗松(尸5^MrfW訓(xùn)gfl
廳即'^w'/);加拿大鐵杉(rsi/^i c"/mfifew5/s1);美洲云杉(g/做c"); 紅杉(北美紅杉(iS^""/"棚戸v/m^));冷杉如4M^ (^^鵬"M/s) 和香月旨冷杉(J6/es6flr/ra附m);以及雪木〉如北美喬柏(7%">/7//aito)和 黃扁柏(C^flffm^pan、 ziotf汰她腦's)。
本文還包括產(chǎn)生纖維的植物。示例性作物為棉(C 仍skp/m附s/;/;.)、亞 麻Msi'她'柳7im附)、異抹尊麻(C/rft.cfl )、嘩酒花(及m附"/ms
/"/m/"s)、歐椴樹(shù)(小葉椴(77//fl )、Z
/7/fl0^^F〃"s))、鷹爪豆(X/wiW/m附7wwcew附)、苧麻(丑0e/1挑enV1 w/vefl )、 構(gòu)樹(shù)(5raMswmei^f/ifl/y;ny^fl )、新西蘭麻(te/mjc )、 夾竹杉匕(^4/wqvww附c"MM"6,Vfi/附)、秀尾屬物種(道氏豸尾(/ flfo"g/flwVwifl )、 / /fiflcn w》/^w和/ /win/"')、馬矛J筋(Jsc/ep/" spec/es)、菠蘿、香蔑等。 還考慮了飼料作物，如苜蓿、黑麥草屬、羊茅屬和三葉草。
在本說(shuō)明書中，"轉(zhuǎn)基因植物"是指引入了 DNA序列的植物，所述 DNA序列包括但不限于宿主植物基因組中通常不存在的基因、通常不轉(zhuǎn)錄 為RNA或翻譯為蛋白質(zhì)("表達(dá)")的DNA序列或者期望引入未轉(zhuǎn)化植 物的任何其他基因或DNA序列，例如通常可存在于未轉(zhuǎn)化植物中但期望 對(duì)其進(jìn)行遺傳^tit或改變其表達(dá)的基因。"轉(zhuǎn)基因植物"類別包括原代轉(zhuǎn) 化體和鐠系中包括轉(zhuǎn)化體的植物，這通過(guò)例如標(biāo)準(zhǔn)基因滲入或另一育種方 法來(lái)實(shí)現(xiàn)。
預(yù)期在某些情形中，將通過(guò)穩(wěn)定引入轉(zhuǎn)基因使本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物的基 因組增加。然而，在另一些情形中，所引入的基因?qū)⑻鎿Q內(nèi)源序列。根據(jù) 本發(fā)明，在這一點(diǎn)上優(yōu)選的基因?yàn)榉侵参镎崽呛厦窪NA序列，尤其是從 藍(lán)細(xì)菌物種魚腥藍(lán)細(xì)菌獲得的序列。
DNA構(gòu)建體
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，將非植物蔗糖合酶序列引入適用于植物轉(zhuǎn)化 的DNA構(gòu)建體中。如上所述，這樣的DNA構(gòu)建體可用于改變植物中蔗糖 合酶基因的表達(dá)。
因此，提供了包含非植物蔗糖合酶序列的DNA構(gòu)建體，所述序列處 于在植物中起作用的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的控制之下，從而該構(gòu)建體可在宿主植物 細(xì)胞中產(chǎn)生RNA。優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)錄起始區(qū)是維管或木質(zhì)部偏好啟動(dòng)子(例 如任何上述啟動(dòng)子)的一部分。 重組DNA構(gòu)建體可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)產(chǎn)生。例如，用于轉(zhuǎn)錄的DNA序列
^錄的DNA序列還可通過(guò)退火和連接合成寡聚核^酸或者通it^聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)中使用合成寡聚核普酸以在每個(gè)末端產(chǎn)生適當(dāng)?shù)南拗泼?切位點(diǎn)來(lái)產(chǎn)生。然后，將所述DNA序列克隆進(jìn)包含上游啟動(dòng)子和下游終 止子序列的載體中。
本發(fā)明的表達(dá)載體還可包含終止序列，其位于本發(fā)明核酸分子的下游，從而終止mRNA轉(zhuǎn)錄并添加多聚A序列。這樣的終止子的實(shí)例為花椰菜 花葉病毒(CaMV) 35S終止子和胭脂堿合酶基因(Tnos)終止子。表達(dá) 載體還可包含增強(qiáng)子、起始密碼子、剪接信號(hào)序列和靶向序列。
本發(fā)明的表達(dá)載體還可包^i^擇標(biāo)記，通過(guò)該選擇標(biāo)記可在培養(yǎng)物中 鑒定轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。所述標(biāo)記可以與異源核酸分子(即與啟動(dòng)子有效連接 的基因)相連。本文使用的術(shù)語(yǔ)"標(biāo)記"是指編碼某種性狀或表型的基因， 該性狀或表型允許選擇或篩選包含該標(biāo)記的植物或植物細(xì)胞。通常，標(biāo)記 基因?qū)⒕幋a抗生素或除草劑抗性。這允許從未轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中選擇轉(zhuǎn) 化細(xì)胞。
合適的選擇標(biāo)記的實(shí)例包括腺苷脫氨酶、二氫葉酸還原酶、潮霉素-B-磷酸轉(zhuǎn)移酶、胸苷激酶、黃嘌呤-鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶、草甘膦和草銨 膦抗性以及^J4I苷3'-0-磷酸轉(zhuǎn)移酶(卡那霉素、新霉素和G418抗性)。 這些標(biāo)記包括對(duì)G418、潮霉素、博來(lái)霉素、卡那霉素和慶大霉素的抗性。 所述構(gòu)建體還可包含選擇標(biāo)記基因必w，該基因賦予對(duì)除草劑膦絲菌素類 似物(如草銨膦)的抗性。Thompson等,五MBO乂 9: 2519-2523 (1987)。 還已知其它合適的選擇標(biāo)記。
還可包括細(xì)菌或病毒起點(diǎn)的復(fù)制序列，以使載體可以克隆進(jìn)細(xì)菌或噬 菌體宿主中。優(yōu)選地，使用寬宿主范圍的原核復(fù)制起點(diǎn)。還可以包括用于 細(xì)菌的選擇標(biāo)記，以允許選擇帶有期望構(gòu)建體的細(xì)菌細(xì)胞。合適的原核選 擇標(biāo)記還包括對(duì)抗生素(如卡那霉素或四環(huán)素)的抗性。
如本領(lǐng)域所知，載體中還可以存在編碼其它功能的其他DNA序列。 例如，當(dāng)宿主為農(nóng)桿菌屬時(shí)，可包含T-DNA序列，以便于隨后轉(zhuǎn)移并整 合到植物染色體中。
植物轉(zhuǎn)化
使用適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化技術(shù)，本發(fā)明的構(gòu)建體可用于轉(zhuǎn)化任何植物細(xì)胞。單
進(jìn)行轉(zhuǎn)化。例如，參閱Klein等，fi,W"/i"o/(^v 4: 583畫5卯(1993 ); Bechtold 等，C.及.Jaw/. 戶"Ws 316:1194-1199 (1993 ) ; Bent爭(zhēng),Mo/. 204:383-396 (1986) ; Paszowski等，￡MB0 / 3: 2717-2722 (1984 ) ; Sagi 爭(zhēng),iV朋《CW/~ 13: 262-266 (1994 )。
16可使用農(nóng)桿菌屬物種如根癌農(nóng)桿菌(A似附e/"c/e"s)和毛根農(nóng)桿菌(A W^og^iM )，例如參照Nagel等，Mim^,W61: 325 (1990 )。簡(jiǎn)言之， 可通過(guò)如電穿孔用植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，然后通過(guò)例如熟知的葉盤法 將所述農(nóng)桿菌引入植物細(xì)胞中。用于實(shí)現(xiàn)此目的的其它方法包括但不僅限 于電穿孔、微粒槍轟擊、磷酸鉀沉淀和聚乙二醇融合、轉(zhuǎn)移至萌發(fā)的花粉 粒中、直接轉(zhuǎn)化(Lorz等,Mo/. G^iC 199: 179-182 (1985))以及本領(lǐng)域 已知的其它方法。如果^f吏用選擇標(biāo)記(如卡那霉素抗性)，則更易于確定 哪些細(xì)胞已成功轉(zhuǎn)化。
已知上述農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法可用于轉(zhuǎn)化雙子葉植物。另外，de la Pena 等，7Va似M 325: 274-276 (1987),等，240: 204-207 (1988) 和Shimamato等，A^i似m 328: 274-276 (1989 )已使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化谷類單子 葉植物，上述文獻(xiàn)均通過(guò)參考并入本文中。還參閱Bechtold，等，CJ . Jcm/. S"i^in's 316 (1994)，其顯示了真空滲入用于農(nóng)桿菌所介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的用途。
可測(cè)量特定細(xì)胞中蛋白質(zhì)、多肽或核酸分子的存在從而確定例如細(xì)胞 是否已成功轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。進(jìn)行這些測(cè)定的方法是公知的，本文無(wú)需贅述。
定量纖維素和木質(zhì)素含量
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物的特征在于纖維素含量提高以及優(yōu)選的木質(zhì)素含 量降低。在遺傳^tit植物中纖維素含量的提高優(yōu)選通過(guò)提高發(fā)生纖維素沉 積的植物組織中的蔗糖合酶活性來(lái)實(shí)現(xiàn)。在描述本發(fā)明的植物時(shí)，"纖維 素含量的提高"是指與野生型植物中的纖維素量相比，植物中纖維素量的 定量提高。纖維素的定量提高可通過(guò)若干方法測(cè)定，例如基于莖磨木(stem milled wood)中多糖酸水解后的總糖進(jìn)行的定量。Chiang和Sarkanen, ,rf5W. 7k^"" 17: 217-226 (1983 ); Davis, / C&附.rec/i朋/" 18: 235-252 (1988 )。
本發(fā)明^it植物中的纖維素含量可以提高到野生型植物纖維素含量的 約105%至約200%的水平，優(yōu)選約110%至約175%，更優(yōu)選約115%至 約150%。本發(fā)明植物的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案的纖維素含量為野生型纖 維素含量的約120%至約140%。
由于纖維素生物合成的提高可降低木質(zhì)素含量，因此本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因 植物可具有提高的纖維素含量和降低的木質(zhì)素含量。參閱Hu等，A^"^丑iV^cA朋/. 17: 808-812 (1999 )。因此，在本說(shuō)明書中，短語(yǔ)"減少的木質(zhì) 素含量"和"降低的木質(zhì)素含量"是指與野生型植物中木質(zhì)素的量相比，植 物中木質(zhì)素量的定量降低?？赏ㄟ^(guò)幾種方法測(cè)定木質(zhì)素的定量降低，例如 Klason木質(zhì)素測(cè)定(Kirk等，M^/^rf /"五"矽附o/. 161: 87-101 (1988 )) 或木質(zhì)素的乙酰溴測(cè)定(Iiyama等，『卯dSd r"A/fo/. 22: 271-280( 1988))。
本發(fā)明的改造植物中的木質(zhì)素含量可降低至野生型植物中木質(zhì)素含量 的約5%至約卯％的水平，優(yōu)選約10%至約75%，更優(yōu)選約15%至約65%。 本發(fā)明植物的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案的木質(zhì)素含量為野生型木質(zhì)素含量 的約20%至約60%。
下iL艮示了獲得藍(lán)細(xì)菌蔗糖合酶基因以及通過(guò)農(nóng)桿菌引入粑基因以產(chǎn) 生植物轉(zhuǎn)化體的方法的具體實(shí)例。它們旨在進(jìn)行示例，而非限制本發(fā)明。
實(shí)施例1.分離來(lái)自魚腥藍(lán)細(xì)菌PCC 7120的蔗糖合酶DNA序列
(a) 基因組DNA制備物
在恒定的冷熒光下在BG-ll培養(yǎng)基中培養(yǎng)魚腥藍(lán)細(xì)菌PCC 7120 (ATCC)(輕柔攪動(dòng)) 一周或直至培養(yǎng)基顯示為綠色。沉淀藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞， 并在95t:下用1% Triton X-100、 10mM Tris pH 8.0、 lmMEDTApH8.0 處理30分鐘。用CHCl3萃取裂解液兩次，將得到的上清液用作后續(xù)PCR 反應(yīng)的模板基因組DNA來(lái)源。
(b) 引物設(shè)計(jì)
已測(cè)定了來(lái)自多變魚腥藍(lán)細(xì)菌(』""6"e腳vflnViW//s) ATCC 29413蔗 糖合酶基因的DNA序列，并以登記號(hào)AJ292758保存于GenBank。基于 該序列，合成DNA寡聚體作為PCR的引物，包括編碼所述蔗糖合酶的主 ORF的第一個(gè)密碼子ATG周圍或終止密碼子周圍的區(qū)域。
設(shè)計(jì)引物以擴(kuò)增蔗糖合酶ORF的完整編碼區(qū)，即從ATG至翻譯終止 密碼子。所述引物的序列如下Susy—S3長(zhǎng)度 27 SEQ ID NO:4
Suay—as3長(zhǎng)度 33 ID KTO:5
(c) PCR擴(kuò)增
使用(a)中獲得的基因組DNA樣品作為模板，使用(b)中設(shè)計(jì)的 引物進(jìn)行PCR。 PCR步驟包括94。C 1分鐘、50°C 1分鐘和72。C 2分鐘的 40個(gè)循環(huán)，之后是72'C 7分鐘的另外的延伸步驟。在1.0%瓊脂糖上通過(guò) 凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，然后對(duì)電泳皿進(jìn)行溴化乙錠染色并利用UV 透照儀檢測(cè)擴(kuò)增條帶。發(fā)汪所檢測(cè)的擴(kuò)增條帶，并用刀片從瓊脂糖皿中 切下。將皿條轉(zhuǎn)移至1.5mL微型離心管，使用GFXPCR回收和^_條 帶純化試劑盒(Amersham)分離并純化DNA片段。將回收的DNA片段 亞克隆進(jìn)pGEM-T克隆載體(Promega)，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，然后用 于以通常的方式制備質(zhì)粒DNA，然后使用BigDye化學(xué)物質(zhì)(Applied Biosystems )通過(guò)雙脫氧法(Messing,五u矽腳/. 101: 20-78 (1983))進(jìn)行測(cè)序，從而得到本文以SEQ ID NO. 1公開(kāi)的DNA序列用于 本發(fā)明的用途。
實(shí)施例2.合成修飾的經(jīng)密碼子使用適應(yīng)性改造的蔗糖合酶DNA序列
根據(jù)Young & Dong, M/c/. JciV/i " 32: e59 (2004 )描述的方法進(jìn)行 基因合成。簡(jiǎn)言之，合成覆蓋最終DNA序列完整長(zhǎng)度的50元寡聚核苷酸， 以使相鄰的引物顯示10bp長(zhǎng)的重疊。為了合成編碼魚腥藍(lán)細(xì)菌蔗糖合酶 的蔗糖合酶基因，設(shè)計(jì)了 62種引物，其包括序列兩端的寡聚核普酸，以將 Ndel和Xbal位點(diǎn)插入最終的PCR產(chǎn)物。在第一輪PCR中，將引物分別 混入引物延伸反應(yīng)物中，以使每個(gè)反應(yīng)物中包含4種相鄰的引物，包括前 一反應(yīng)中的兩種相鄰引物。在第二步中，合并各為8個(gè)延伸反應(yīng)物的四組， 并進(jìn)行另一引物延伸反應(yīng)，之后使用側(cè)翼引物進(jìn)行第三次PCR Jl應(yīng)，以 擴(kuò)增跨越整個(gè)合成DNA序列的4種~ 800bp的DNA片段。這4種片段通 過(guò)重疊PCR在第四步擴(kuò)增中連接，所述擴(kuò)增還用于在DNA分子的兩個(gè)末 端均包含Ndel和Xbal位點(diǎn)。實(shí)施例3.制備轉(zhuǎn)基因煙草屬(iV/cWflitfl)植物
將上述實(shí)施例1和2中獲得的蔗糖合酶基因引入植物宿主以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基 因煙草屬植物。
(a) 制備構(gòu)建體并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
可通過(guò)以下步驟制備表ii^建體用適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈钌鲜鰧?shí)施例1 和2中獲得的蔗糖合酶基因以包含全部開(kāi)ii讀碼框，以及將所iL^因插入 帶有合適啟動(dòng)子的植物轉(zhuǎn)化載體pALELLYX-Susy (圖2)。例如，將實(shí) 施例1中獲得的魚腥藍(lán)細(xì)菌蔗糖合酶基因克隆進(jìn)上i^達(dá)載體中來(lái)自美洲 黑楊微管蛋白基因(TUB)木質(zhì)部偏好啟動(dòng)子下游，如2005年3月28日 提交的國(guó)際申請(qǐng)PCT/BR2005/000041所述(圖3 )。或者，將實(shí)施例2中 獲得的經(jīng)密碼子使用適應(yīng)性改造的魚腥藍(lán)細(xì)菌蔗糖合酶基因克隆進(jìn)上述 表達(dá)載體中來(lái)自上述美洲黑楊微管蛋白基因(TUB)木質(zhì)部偏好啟動(dòng)子的 下游(圖4)。在大腸桿菌中擴(kuò)增得到的表達(dá)構(gòu)建體，然后通過(guò)凍融法 (7V"c/e/c爿"Wi " 12， 8711( 1984 ))轉(zhuǎn)化進(jìn)根癌農(nóng)桿菌LBA4404菌林中。
(b) 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的侵染煙草(7VfV^/朋fl6^iA"附,Viwfl)轉(zhuǎn)化
使用DNA構(gòu)建體，用Horsch等，Science 227:1229 (1985 )的葉盤法 轉(zhuǎn)化煙草屬物種，所述構(gòu)建體包含(a)中獲得的魚腥藍(lán)細(xì)菌天然蔗糖合酶 基因或者經(jīng)密碼子使用適應(yīng)性改造的合成蔗糖合酶基因，它們均與木質(zhì)部 偏好基因的TUB啟動(dòng)子有效連接。在含有100 mg/1 BASTA除草劑和500 mg/L羧千青霉素(Sigma )的Murashige和Skoog培養(yǎng)基(Sigma, St. Louis, MO )上選擇轉(zhuǎn)化體。使轉(zhuǎn)化煙草的幼芽在Murashige和Skoog培養(yǎng)基上 生根，1^被移至土壤中在溫室中培養(yǎng)。
(c) 外源基因插入宿主植物基因組的PCR!Hi
可使用PCR來(lái)驗(yàn)證基因構(gòu)建體整合進(jìn)轉(zhuǎn)基因植物的基因組中。合成了 兩種構(gòu)建體特異性引物，并將其用于從煙草轉(zhuǎn)化體的基因組DNA中PCR 擴(kuò)增相應(yīng)的構(gòu)建體。對(duì)于包含楊屬木質(zhì)部偏好微管蛋白基因啟動(dòng)子控制下 的魚腥藍(lán)細(xì)菌蔗糖合酶ORF的構(gòu)建體，合成了兩種特異性引物
20Susy—seq3 長(zhǎng)度20 SEQ ID NO. : S
CAAGfA^TTGCAAGAACGTTG
Susy—as3 長(zhǎng)度33 SEQ ID NO: 5
TCAGATCTTACCGaTATTTATGCTGTTCTAATA
對(duì)于包含楊屬木質(zhì)部偏好微管蛋白基因啟動(dòng)子控制下的經(jīng)密碼子使用 適應(yīng)性改造的修飾合成魚腥藍(lán)細(xì)菌蔗糖合酶基因的構(gòu)建體，合成了兩種特
異性引物
SUSY—CU—RTl 長(zhǎng)度 28 SEQ ID NO. t 7
CTAGGCTCOATAGGATCAAGAACCTCAC
STJSY—CU—RT2 長(zhǎng)度 28 SEQ H) NO.: 8
GATAGCCTTCTCAOA(3AT鵬T(3TTC:CA(3
PCR反應(yīng)混合物在50 總體積中包含100 ng轉(zhuǎn)化植物基因組DNA 和0.2 每種引物、100 每種脫氧核糖核普三磷酸、lxPCR緩沖液以 及2.5個(gè)單位AmpliTaq DNA聚合酶(Applied Biosystems )。循環(huán)參數(shù)如 下94'C 1分鐘、50。C 1分鐘和72。C 3分鐘的40個(gè)循環(huán)，72。C延伸5分 鐘。在1%瓊脂糖凝膠上對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳。
(d)測(cè)定轉(zhuǎn)基因植物中轉(zhuǎn)基因的表達(dá)7jc平
使用半定量RT-PCR檢測(cè)魚腥藍(lán)細(xì)菌蔗糖合酶轉(zhuǎn)錄物在轉(zhuǎn)基因植物莖 組織中的積累。使用描述于Aldrich和Cullis,戶/"W Mo/, fi/o/.及e/wW. 11:128-141 (1993)的CTAB法，從3月齡的轉(zhuǎn)基因煙草屬Tl植物的莖 切出物中分離總RNA。
4吏用Superscript II RNase H-RT (Invitrogen， USA)，由500 ng總 RNA合成cDNA。將上述引物與針對(duì)編碼甘油f 3-磷酸脫氫酶(GAPDH) 組成性基因的引物一起使用，GAPDH作為內(nèi)對(duì)照，以對(duì)每個(gè)樣品中使用 的總RNA量進(jìn)行歸一化。用12.5倍稀釋的第一鏈cDNA在如下條件下進(jìn) 4亍PCR: 94。C3分鐘，以及94。C1分4中、52 ~ 60°C 45秒和72。C 1分鐘的 27個(gè)循環(huán)，以及72。C30秒。
21實(shí)施例4.轉(zhuǎn)基因植物的組織化學(xué)分析
筒言之，將轉(zhuǎn)基因煙草和對(duì)照植物的莖切片，并在4%多聚曱醛中固 定24小時(shí)。然后，用切片機(jī)(Leica RM2255)將固定組織進(jìn)行切片，隨 后用星藍(lán)(astra blue) /番紅染色。在Leica DM1L倒置顯微鏡下使用亮視 野照明和暗視野照明來(lái)觀察組織學(xué)染色的切片。
實(shí)施例5.在維管組織中過(guò)表達(dá)蔗糖合酶的轉(zhuǎn)基因植物中纖維素含量的提 高
收集5個(gè)煙草屬轉(zhuǎn)基因事件與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参锏闹鞲刹L(fēng)干兩周， 所述轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)化了包含木質(zhì)部偏好美洲黑楊微管蛋白啟動(dòng)子控制下 的天然魚腥藍(lán)細(xì)菌蔗糖合酶基因的構(gòu)建體。將干燥的莖切碎并使用30目孔 篩在刀式粉碎機(jī)中粉碎。然后，對(duì)莖的粉末樣品進(jìn)行化學(xué)分析，以測(cè)定纖 維素和木質(zhì)素的含量。簡(jiǎn)言之，基于干木中這些多糖酸水解之后的總糖來(lái)
測(cè)定纖維素和半纖維素含量。將木粉末在45'C真空干燥并用H2S04水解。 在高pH陰離子交換層析后，基于7JC解產(chǎn)物的組成來(lái)定量葡聚糖和其它多
糖(半纖維素)。Chiang & Sarkanen，『卯rf5W. Tfec/^o/. 17: 217-226( 1983 ); Davis, J.CA亂Tk"/^/. 18: 235-252 (1988 )。
兩個(gè)轉(zhuǎn)基因事件(已知其根據(jù)實(shí)施例3中詳述的方案表達(dá)轉(zhuǎn)基因)顯 示統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的纖維素含量提高(圖5)。與對(duì)照植物中的48.6%相比， 轉(zhuǎn)基因事件25顯示54%的纖維素，表明纖維素含量顯著提高11%( PO.01 ， t檢驗(yàn))。與對(duì)照植物中的48.6%相比，轉(zhuǎn)基因事件53顯示52%的纖維素， 表明纖維素含量提高7% (圖5; P<0.01， t檢驗(yàn))。另外，如Klason重量 法所測(cè)定的，轉(zhuǎn)基因品系25顯示木質(zhì)素含量的明顯下降(19.15%,與對(duì) 照植物的23.3%相比；P<0.01， t檢驗(yàn))。
用構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的11個(gè)T0轉(zhuǎn)基因事件中的5個(gè)顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的纖維 素含量提高，所述構(gòu)建體包含修飾的經(jīng)密碼子使用適應(yīng)性^it的魚腥藍(lán)細(xì) 菌蔗糖合酶基因。與對(duì)照植物的平均值相比，轉(zhuǎn)基因事件BI092-51A、 BI092-11C、 BI092-13B、 BI092-29B和BI092-16A顯示纖維素含量顯著 提高(P0.05， t檢驗(yàn))(圖6)。例如，與對(duì)照非轉(zhuǎn)基因植物中的51.7% 相比，轉(zhuǎn)基因事件81092-5"顯示55.28%的纖維素，表明纖維素含量顯 著增加約7%。生長(zhǎng)至成熟后，將來(lái)自經(jīng)密碼子使用適應(yīng)性改造的蔗糖合酶基因的TO 事件自交以產(chǎn)生Tl品系。與純合隱性植物相比，純合子顯性的植物顯示 纖維素含量顯著提高7% (P<0.05, t檢驗(yàn))(圖7)。
權(quán)利要求
1.包含非植物蔗糖合酶核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物與缺乏所述分子的非轉(zhuǎn)基因植物相比具有改變的纖維素含量。
2. 權(quán)利要求l的轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物通過(guò)用包含所述非 植物蔗糖合酶核酸分子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物而獲得，所述核酸分子在能 在植物中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子的控制之下。
3. 權(quán)利要求l的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述核酸分子是(a) 包含SEQIDNo: 1或2的核苷酸序列；或者(b) 缺失、替換、插入或添加了一個(gè)或多個(gè)堿基的(a)的核苷鉼列。
4. 權(quán)利要求l的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物具有提高的纖維素含量。
5. 權(quán)利要求l的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物具有降低的木質(zhì)素含量。
6. 權(quán)利要求l的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是雙子葉植物。
7. 權(quán)利要求l的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是單子葉植物。
8. 權(quán)利要求l的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是棵子植物。
9. 權(quán)利要求l的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是木本樹(shù)木。
10. 權(quán)利要求9的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述木本樹(shù)木是桉屬植物。
11. 權(quán)利要求9的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述木本樹(shù)木是楊屬植物。
12. 權(quán)利要求9的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述木本樹(shù)木是松屬植物。
13. 權(quán)利要求l的轉(zhuǎn)基因植物的一部分，其選自葉、莖、花、子房、 果實(shí)、種子和愈傷組織。
14. 用于產(chǎn)生與非轉(zhuǎn)基因植物相比纖維素含量提高的轉(zhuǎn)基因植物的方 法，包括(i)用非植物蔗糖合酶序列轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，所述序列在能在植物 中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子的控制之下，(ii)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)所 述轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，以及(iii)選擇顯示纖維素含量提高的轉(zhuǎn)基因植物。
15. 權(quán)利要求14的方法，其中所述核苷酸序列是包含以下的蔗糖 合酶基因(a )包含SEQ ID No: 1或2的核苷酸序列；或者(b)缺失、替換、插入或添加了一個(gè)或多個(gè)堿基的(a)的核苷,列。
16. 權(quán)利要求15的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因植物是雙子葉植物。
17. 權(quán)利要求15的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因植物是單子葉植物。
18. 權(quán)利要求15的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因植物是棵子植物。
19. 分離的多核苷酸序列，其包含編碼多肽的核酸序列，所述多肽 能提高植物中蔗糖合酶及纖維素的水平。
全文摘要
公開(kāi)了用于改變植物組織中纖維素含量的多核苷酸、DNA構(gòu)建體和方法。用編碼活性魚腥藍(lán)細(xì)菌蔗糖合酶基因或大豆根瘤蔗糖合酶基因的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物，所述基因在形成層/木質(zhì)部偏好啟動(dòng)子控制下過(guò)表達(dá)時(shí)引起纖維素含量提高。包含魚腥藍(lán)細(xì)菌或大豆根瘤蔗糖合酶基因的植物轉(zhuǎn)化體顯示出纖維素含量的提高，認(rèn)為該性狀可改進(jìn)用于在制漿和造紙過(guò)程中提取纖維素的木本樹(shù)木。
文檔編號(hào)C12N15/63GK101495637SQ200680043560
公開(kāi)日2009年7月29日 申請(qǐng)日期2006年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月21日
發(fā)明者保羅·阿魯達(dá), 法比奧·帕佩斯 申請(qǐng)人:阿萊利克斯股份公司