專利名稱：：低丙烯酰胺食品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及在植物中，例如在這些植物的富含淀粉的貯藏器官中下調(diào)和上調(diào)基因的遺傳方法，以降低在這些器官的加工相關(guān)的加熱后積累的丙烯酰胺的水平。
背景技術(shù)：
：加熱含有游離天冬酰胺和還原糖的食品，會導(dǎo)致丙烯酰胺的生成。丙烯酰胺是在世界范圍內(nèi)用于合成聚丙烯酰胺的工業(yè)化學(xué)物質(zhì)。暴露于Neurotoxicology2001，22，34卜353)。在嚙齒動物中，高濃度丙烯酰胺(>2mg/kg體重)的毒理學(xué)作用包括神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、生殖力減弱和癌癥(Friedman,J.Agric.FoodChem.，2003，51,4504-4526)。還已知職業(yè)性暴露于高水平的丙烯酰胺會升高人類的神經(jīng)毒性的發(fā)病率(LoPachin,Neurotoxicology,2004，25，617-630),^f旦是沒有記載丙烯酰胺對人類生殖的影響或致癌作用。丙烯酰胺和它的氧化代謝物環(huán)氧丙酰胺會與血紅蛋白的氨基端纈氨酸反應(yīng)，形成加合物。加合物形成的程度是暴露水平的良好標(biāo)志物，且暗示著接近100iug的日攝入量(Tareke等人，J.Agric.FoodChem.,2002，50，4998-5006)。盡管最初認(rèn)為飲用水、化妝品和吸煙代表著丙烯酰胺背景暴露的唯一主要來源(Bergmark，Chem.Res.Toxicol,，1997，10，78-84)，最近的分析表明，油炸的和烘烤的淀粉食品的消耗，構(gòu)成約36%的丙烯酰胺攝入(Becker和Pearson,DietaryhabitsandnutrientintakeinSweden1997-98。Riksmaten1997-98,1999)。飲食丙烯酰胺主要源自熱誘導(dǎo)的游離氨基酸天冬酰胺的氨基和還原糖的羰基之間的反應(yīng)(Mottram等人，Nature,2002,419，448-449;Stadler等人，Nature,2002，419，449-450)。新鮮的馬鈴薯塊莖含有非常高水平的天冬酰胺，但是相對低濃度的還原糖葡萄糖和果糖。但是，在冷藏期間，通過表達(dá)冷誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化酶(該酶催化蔗糖向葡萄糖和果糖的轉(zhuǎn)化)，積累還原糖。以前嘗試限制丙烯酰胺在淀粉食品中的積累，沒有產(chǎn)生實(shí)用的且節(jié)省成本的應(yīng)用?，F(xiàn)有技術(shù)的第一種方法是基于調(diào)整加工參數(shù)，例如表面/體積比，溫度和油炸時間。盡管這些方法的應(yīng)用可能在減少丙烯酰胺的積累方面是部分有效的，但它會通過減輕顏色、改變形狀和改變口味和質(zhì)地，改變最終食品的感觀特征。這些改變是不希望的。笫二種方法是基于，在加熱前用天冬酰胺酶(EC3.5.1.1)或glurninase(EC3.4.1.2)溫育部分加工的食品(參見世界專利申請2004/030468A3和世界專利申請2004/026042Al)。該方法是昂貴的，僅能容易地應(yīng)用于可以與所述酶容易地混合的材料，例如面粉。第三種方法將天冬酰胺竟?fàn)巹├绺拾彼峒尤氩糠旨庸さ氖称分?關(guān)于馬鈴薯塊莖的世界專利申請2005/025330Al，關(guān)于烤制咖啡豆的美國專利申請2004/0081724Al,關(guān)于可可豆的世界專利申請2005/004620Al,關(guān)于基于玉米的食品的世界專利申請2005/004628Al)。該方法僅是部分有效的，需要高濃度的添加劑，且因為成本太高而難以廣泛應(yīng)用。第四種方法在加熱前將還原糖改變酶(包括醛糖還原酶)加入食品中(參見美國專利6989167)。該方法不是非常有效，且因為成本太高而難以廣泛應(yīng)用。第五種方法在加熱前給食品包被選自下述的試劑含有氨基酸的化合物，氨基酸鹽，氨基酸酰胺，氨基酸酯，和其混合物(參見世界專利申請2005/077203A3)。該方法僅是部分有效的，且因為成本太高而難以廣泛應(yīng)用。第六種方法是基于，選擇含有非常低水平的還原糖和天冬酰胺的種質(zhì)。這樣的種質(zhì)的可用性，使得將"低糖"和"低天冬酰胺"性狀漸滲到食品工業(yè)可廣泛使用的品種中成為可能。但是，尚未鑒定出低天冬酰胺作物植物。即使將來發(fā)現(xiàn)了這樣的種質(zhì)，將希望的性狀漸滲到商業(yè)化品種中也需要至少15-20年。第七種方法遺傳地修飾作物，以降低還原糖水平。該方法是基于下調(diào)參與淀粉降解的基因，例如馬鈴薯淀粉相關(guān)的Rl和磷酸化酶-L基因的表達(dá)(參見，例如，美國專利申請2003/0221213Al)。盡管是部分有效的，從修飾的作物加工的食品仍然含有對照產(chǎn)品的約三分之一的丙烯酰胺水平。因而，非常需要降低從淀粉作物得到的加工食品中的丙烯酰胺水平的方法。這樣的方法應(yīng)當(dāng)是節(jié)省成本的，不會降低食品的感觀特征。本發(fā)明提供了這樣的方法。
發(fā)明內(nèi)容在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種降低加工食品中的丙烯酰胺水平的新策略，所述加工食品通過加熱作物的淀粉組織來得到。獨(dú)特地，該策略采用基因工程的方法，使作物植物的淀粉組織中的天冬酰胺水平降低了至少50%。在一個實(shí)施方案中，通過降低天冬酰胺生物合成的水平和/或增加天冬酰胺代謝的水平，降低作物植物的淀粉組織中的天冬酰胺水平。任一種機(jī)理都可能需要下調(diào)或上調(diào)直接或間接參與每個天冬酰胺途徑的基因。在一個方面，參與天冬酰胺代謝的基因編碼天冬酰胺酶。在一個方面，參與天冬酰胺生物合成的基因編碼天冬酰胺合成酶。在另一個方面，間接參與天冬酰胺途徑的基因選自谷氨酰胺合成酶(GS)基因，硝酸還原酶(NR)基因，14-3-3基因，和己糖激酶(HXK)基因。在一個方面，通過降低參與天冬酰胺生物合成的至少一個基因的表達(dá)，降低天冬酰胺生物合成的水平。在一個方面，通過向植物中導(dǎo)入表達(dá)盒，降低參與天冬酰胺生物合成的基因的表達(dá)，所述表達(dá)盒從5，至3，包含，(i)啟動子，(ii)包含參與天冬酰胺代謝的至少一個基因的至少一個片段的序列的至少一個拷貝，和任選地，(iii)第二個啟動子或終止子，其中所述第一個和任選的第二個啟動子以趨同方向排列。在一個方面，用于降低參與天冬酰胺生物合成的基因的表達(dá)的表達(dá)盒含有參與天冬酰胺代謝的基因的至少一個片段的序列的2個拷貝。在一個方面，所述2個拷貝排列為(i)反向重復(fù)序列或(ii)直接重復(fù)序列。在一個方面，參與天冬酰胺生物合成的基因分離自馬鈴薯，野生馬鈴薯例如Solanumphureja，甘薯，山藥，咖啡樹，可可樹，小麥，玉米，燕麥，高梁，或大麥，且編碼天冬酰胺合成酶。在一個方面，所述天冬酰胺合成酶基因包含與SEQID:1所示序列的至少一個片段具有至少70°/同一性的序列。在另一個方面，所述天冬酰胺合成酶基因包含與SEQID:2所示序列的至少一個片段具有至少70%同一性的序列。在一個方面，通過向植物中導(dǎo)入表達(dá)盒，實(shí)現(xiàn)參與天冬酰胺代謝的基因的超量表達(dá)，所述表達(dá)盒從5，至3，包含，第一啟動子，參與天冬酰胺生物合成的基因，和終止子。在一個方面，參與天冬酰胺代謝的基因分離自馬鈴薯，野生馬鈴薯例如Solanumphureja，甘薯，薯蕷，咖啡樹，可可樹，小麥，玉米，燕麥，高梁，或大麥，且編碼天冬酰胺酶。在一個方面，所述天冬酰胺酶基因包含與SEQID:9，10，14，15,31，32,或33所示序列具有至少70°/同一性的序列。在另一個方面，所述天冬酰胺酶基因包含與SEQID:14所示序列具有至少70°/同一性的序列。在另一個方面，參與天冬酰胺生物合成的基因是谷氨酰胺合成酶或己糖激酶基因。在一個方面，所述啟動子是下述基因的啟動子(i)馬鈴薯顆粒結(jié)合的淀粉合酶基因，(ii)馬鈴薯ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因，(iii)馬鈴薯泛素-7基因，(iv)馬鈴薯塊莖特異蛋白(patatin)基因，(v)馬鈴薯類黃酮單加氧酶基因。在一個方面，馬鈴薯顆粒結(jié)合的淀粉合酶基因的啟動子與SEQIDN0:8的至少一部分具有至少70°/。同一性，馬鈴薯ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因的啟動子與SEQIDNO:7的至少一部分具有至少70%同一性，馬鈴薯泛素-7基因的啟動子與SEQIDNO:21的至少一部分具有至少70%同一性，馬鈴薯塊莖特異性蛋白基因的啟動子與SEQIDNO:22的至少一部分具有至少70%同一性，馬鈴薯類黃酮單加氧酶基因的啟動子與SEQIDNO:13的至少一部分具有至少70°/同一性。在另一個方面，所述啟動子是在用于食品加工的淀粉作物的塊莖、根或種子中表達(dá)的基因的啟動子。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了降低食品中丙烯酰胺水平的方法，所述食品通過加熱作物的組織并同時降低該組織中天冬酰胺和還原糖的水平來得到。在一個實(shí)施方案中，所述組織是作物或植物的淀粉組織。在一個方面，通過下述方式實(shí)現(xiàn)天冬酰胺和還原糖水平的同時降低(i)下調(diào)參與天冬酰胺生物合成的基因的表達(dá)，或超量表達(dá)參與天冬酰胺代謝的基因，和(ii)下調(diào)參與淀粉降解的至少一個基因的表達(dá)。在一個方面，通過向植物中導(dǎo)入表達(dá)盒，下調(diào)參與淀粉降解的基因的表達(dá)，所述表達(dá)盒從5，至3，包含，(i)啟動子，(ii)包含參與淀粉降解的基因的至少一個片段的序列的至少一個拷貝，和任選地，(iii)第二個啟動子或終止子，其中所述笫一個和任選的第二個啟動子以趨同方向排列。在一個方面，參與淀粉降解的基因選自(i)淀粉-相關(guān)的Rl基因，和(ii)淀粉-相關(guān)的磷酸化酶-L基因。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過同時降低組織中天冬酰胺和還原糖的水平，降低通過加熱作物的組織得到的食品中丙烯酰胺的水平并同時提高該食品的感官特征的方法。在一個實(shí)施方案中，所述組織是作物或植物的淀粉組織。在一個方面，通過采用"多基因耙向"構(gòu)建體，實(shí)現(xiàn)同時降低，所述"多基因靶向"構(gòu)建體包含第一表達(dá)盒和第二表達(dá)盒，所述第一表達(dá)盒包含(i)可操作地連接到啟動子上的天冬酰胺酶基因，或(ii)可操作地連接到啟動子上的天冬酰胺合成酶基因片段的至少一個拷貝，所述第二表達(dá)盒包含DNA區(qū)段的至少一個拷貝，所述DNA區(qū)段含有可操作地連接到啟動子上的Rl基因片段和磷酸化酶基因片段，其中所述第一和第二表達(dá)盒可以是相同的表達(dá)盒。在一個實(shí)施方案中，植物包含用"多基因靶向"構(gòu)建體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的至少一個細(xì)胞。在另一個實(shí)施方案中，所述植物是具有塊莖的。在另一個實(shí)施方案中，所述具有塊莖的植物是馬鈴薯植物。在另一個實(shí)施方案中，所述具有塊莖的植物含有穩(wěn)定摻入它的基因組中的盒。在另一個方面，本發(fā)明提供了從轉(zhuǎn)基因塊莖加工的產(chǎn)品，其中(a)轉(zhuǎn)基因塊莖的至少一個細(xì)胞包含"多基因靶向"構(gòu)建體，且(b)所述產(chǎn)品具有比從相同植物品種的非轉(zhuǎn)基因塊莖生產(chǎn)的等同產(chǎn)品更低的丙烯酰胺濃度。在另一個方面，本發(fā)明提供了從轉(zhuǎn)基因塊莖生產(chǎn)的產(chǎn)品，其中(a)轉(zhuǎn)基因塊莖的至少一個細(xì)胞包含"多基因靶向"構(gòu)建體，(b)所述產(chǎn)品具有比從相同物種的非轉(zhuǎn)基因塊莖生產(chǎn)的等同產(chǎn)品更低的丙烯酰胺濃度，且(c)所述產(chǎn)品還表現(xiàn)出比從相同物種的非轉(zhuǎn)基因塊莖生產(chǎn)的等同產(chǎn)品更低的非酶性褐變速率。在另一個方面，本發(fā)明提供了從轉(zhuǎn)基因塊莖生產(chǎn)的產(chǎn)品，其中(a)轉(zhuǎn)基因塊莖的至少一個細(xì)胞包含"多基因靶向，，構(gòu)建體，(b)所述產(chǎn)品具有比從相同物種的非轉(zhuǎn)基因塊莖生產(chǎn)的等同產(chǎn)品更低的丙烯酰胺濃度，且(c)所述產(chǎn)品還表現(xiàn)出比從相同品種的非轉(zhuǎn)基因塊莖生產(chǎn)的等同產(chǎn)品更低的非酶性褐變速率，且(d)所述產(chǎn)品還表現(xiàn)出比從相同品種的非轉(zhuǎn)基因塊莖生產(chǎn)的等同產(chǎn)品增強(qiáng)的感官特征。在一個實(shí)施方案中，所述可食用的植物產(chǎn)品具有比從沒有根據(jù)本發(fā)明的方法修飾的植物生產(chǎn)的等同產(chǎn)品改善的感官特征。在一個實(shí)施方案中，所述可食用的植物產(chǎn)品具有選自下述的至少一種改善的感官特征外觀，風(fēng)味，香氣，和質(zhì)地。在一個實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因塊莖是馬鈴薯。在另一個實(shí)施方案中，所述產(chǎn)品是炸薯條。在另一個實(shí)施方案中，所述產(chǎn)品是馬鈴薯片。在另一個實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因塊莖是馬鈴薯，且所述轉(zhuǎn)基因塊莖產(chǎn)品在4。C-12。C儲存約1-30周時，其葡萄糖水平比在與該轉(zhuǎn)基因塊莖相同儲存條件下儲存的相同物種的非轉(zhuǎn)基因塊莖的葡萄糖水平的50%還低。在一個實(shí)施方案中，所述植物選自馬鈴薯，玉米，咖啡，可可，和小麥。在另一個實(shí)施方案中，用選自下述的細(xì)菌抹轉(zhuǎn)化所述植物根癌農(nóng)桿菌，三葉草根瘤菌，豌豆根瘤菌，紫金牛葉桿菌，苜蓿中華根瘤菌和百脈才艮中'隄生才艮瘤菌(MesoRhizobiumloti)。在一個方面，本發(fā)明提供了分離的多核苷酸序列，其包含編碼多肽的核酸序列，所述多肽能降低植物中的天冬酰胺水平，并從而降低該植物的加工產(chǎn)品中的丙烯酰胺水平。在一個實(shí)施方案中，所述核酸序列與選自SEQIDN0:9，10，"，15，31,32，和33的序列或其變體或片段具有至少70%同一性，且所述核酸編碼具有天冬酰胺酶活性的多肽。在另一個實(shí)施方案中，所述變體與SEQIDNO:9，10，14,15，31，32，和33中的任一個序列的序列同一性大于或等于99%、98%、97%、96°/、95°/、94%、93%、92°/"91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82°/"81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、7"/"70%、69°/"68%、67%、66%、65%、64%、63%、62°/"61%，或60%。在另一個方面，提供了分離的多核苷酸序列，其包含編碼天冬酰胺酶的核酸序列，所述天冬酰胺酶能降低植物中的天冬酰胺水平，并從而降低該植物的加工產(chǎn)品中的丙烯酰胺水平。在另一個方面，本發(fā)明提供了具有降低的天冬酰胺酶表達(dá)水平的轉(zhuǎn)基因植物，其可以用于生產(chǎn)含有低丙烯酰胺含量的加工食品。在另一個方面，本發(fā)明提供了具有低丙烯酰胺含量的食品，其可以通過加工具有降低的天冬酰胺含量的轉(zhuǎn)基因塊莖得到?；诿绹称匪幤饭芾砭?jǐn)?shù)據(jù)(www.cfsan.fda.gov/一dms/acrydata.html),在大量快餐連鎖餐館中生產(chǎn)的典型炸薯條含有超過十億分之100份(ppb)的丙烯酰胺。這樣的典型炸薯條中丙烯酰胺的平均量是404ppb，通過消耗炸薯條平均每日攝入的丙烯酰胺水平是0.07微克/kg體重/天。結(jié)果，炸薯條代表著16%的丙烯酰胺總飲食攝入。烘箱烘烤的薯條和由商業(yè)處理機(jī)生產(chǎn)的馬鈴薯片中丙烯酰胺的平均量分別是698ppb和597ppb。因而，馬鈴薯-衍生的加工食品(包括炸薯條，烘箱烘烤的薯條，和馬鈴薯片)代表著38%的丙烯酰胺總飲食攝入。根據(jù)本發(fā)明，在從本發(fā)明的特定品種的轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)的塊莖得到的炸薯條、烤薯條或馬鈴薯片中存在的丙烯酰胺水平，比從相同品種的非轉(zhuǎn)基因植物得到的炸薯條、烤薯條或馬鈴薯片中的丙烯酰胺水平低超過2倍，3倍，4倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10倍，11倍，12倍，13倍，14倍，15倍，16倍，17倍，18倍，194咅，20倍，或超過20倍。以十億分之......份表示，從本發(fā)明的塊莖生產(chǎn)的炸薯條可以具有1-20ppb，20-40ppb，40-60ppb，60-80ppb，或80-100ppb的丙烯酰胺。以十億分之……份表示，從本發(fā)明的塊莖生產(chǎn)的烘箱烘烤的薯條、馬鈴薯片或薯餅(hashbrown)可以具有1-20ppb，20-40ppb，40-60ppb，60-80ppb，80-100ppb,100-120ppb，120-140ppb，140-160ppb,160-180ppb，或180-200ppb的丙烯酰胺。本發(fā)明不限于降低塊莖的油炸食品和馬鈴薯片產(chǎn)品中的丙烯酰胺水平?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明處理其它食物，以降低丙烯酰胺水平。早餐谷類中的丙烯酰胺水平可以從約50-250ppb降低至低于40ppb的水平，優(yōu)選降低至低于20ppb的水平。脆餅,如DareBretonThinWheatCrackers和WasaOriginalCrispbreadFiberRye中的丙烯酰胺水平可以/人約300-500ppb降低至低于100ppb的水平，優(yōu)選降低至低于50ppb的水平。巧克力，如Ghirardelli無^f唐可可或Hershey可可中的丙烯酰胺水平可以從約300-900ppb降低至低于200ppb的水平，優(yōu)選降低至低于50ppb的水平。餅干中的丙烯酰胺水平可以從約50-200ppb降低至低于40ppb的水平，優(yōu)選降低至低于20ppb的水平?？Х确壑械谋０匪娇梢詮募s175-350ppb降低至低于60ppb的水平，優(yōu)選降低至低于30ppb的水平。小麥面包中的丙烯酰胺水平可以從約50-150ppb降^氐至^f氐于30ppb的水平，優(yōu)選降低至低于15ppb的水平。應(yīng)當(dāng)理解，許多因素會影響最終的食品中的丙烯酰胺水平。這些因素包括作物、品種、生長條件、收獲的種子或塊莖的貯存條件、和加工變量，例如加熱穩(wěn)定、加熱時間、油炸使用的油的類型和暴露的表面。本發(fā)明所述方法的應(yīng)用，會使丙烯酰胺水平降低至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30°/。、至少約35%、至少約40%、至少約45°/、50%，至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或超過約90°/。。附圖簡述圖1:(A)pSIM1148，(B)pSIMl151，和(C)pSIM658的簡圖。LB=左T-DNA邊界，P:Agp=馬鈴薯Agp啟動子，2a=ast2基因片段的反義拷貝，la=astl基因片段的反義拷貝，lb=astl基因片段的有義拷貝，2b=ast2基因片段的有義拷貝，P:Gbss=馬鈴薯Gbss啟動子，T:nos=農(nóng)桿菌胭脂堿合酶基因的終止子，P:nos=農(nóng)桿菌胭脂堿合酶基因的啟動子，RB=右T-DNA邊界，P:Ubi7=馬鈴薯泛素-7基因的啟動子。圖2:RussetBoise構(gòu)建體。PF-啟動子片孚殳，GF=基因片,殳。優(yōu)選實(shí)施方案的詳述本發(fā)明提供了用于降低丙烯酰胺水平的多核苷酸序列和方法。本發(fā)明使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的術(shù)語和短語。如果沒有另外定義，此處使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。一般地，本文使用的命名，細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)和核酸化學(xué)中的實(shí)驗方法，和在此描述的雜交是本領(lǐng)域公知和常用的。對于重組核酸方法、多核苷酸合成、微生物培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、分析化學(xué)、有機(jī)合成化學(xué)、化學(xué)合成、化學(xué)分析和藥物制劑和遞送，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。一般地，根據(jù)廠家的說明進(jìn)行酶促反應(yīng)和純化和/或分離步驟。一般根據(jù)常規(guī)方法(MolecularCloning,ALaboratoryManual,3rd.edition,editedbySambrook&RusselColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,2001),進(jìn)行這些技術(shù)和操作。丙烯酰胺丙烯酰胺單體被認(rèn)為是有毒的，會直接影響神經(jīng)系統(tǒng)。它被視作致癌物。丙烯酰胺會容易地透過完整皮膚從水溶液吸附。分子式是C3H5NO;結(jié)構(gòu)CH2=CH-C0-NH2。農(nóng)桿菌或細(xì)菌轉(zhuǎn)化如本領(lǐng)域眾所周知的，用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌通常是根癌農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌的減毒(disarmed)和有毒的衍生物。在感染植林、外植體、細(xì)胞或原生質(zhì)體后，農(nóng)桿菌會將DNA區(qū)段從質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移至所述植物細(xì)胞核。所述載體通常含有位于T-DM或P-DNA的邊界之間的需要的多核苷酸。但是，可以使用能轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的任意細(xì)菌，例如，三葉草根瘤菌，豌豆根瘤菌，紫金牛葉桿菌，苜蓿中華根瘤菌和百脈根中慢生根瘤菌。被子植物具有包裹在子房中的種子的維管植物。被子植物是開花的種子植物，所述花生產(chǎn)果實(shí)。被子植物分為雙子葉和單子葉植物。天冬酰胺生物合成在植物中發(fā)生的生成天冬酰胺的酶催化的反應(yīng)。天冬酰胺代謝在植物中發(fā)生的將天冬酰胺轉(zhuǎn)化成其它化合物的酶催化的反應(yīng)。天冬酰胺酶在多種植物、動物和細(xì)菌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的天冬酰胺酶，是參與天冬酰胺代謝的酶。它會催化天冬酰胺的脫氨作用，產(chǎn)生天冬氨酸和銨離子，導(dǎo)致游離循環(huán)天冬酰胺的消耗。天冬酰胺合成酶該酶參與天冬酰胺生物合成，并催化從天冬氨酸合成天冬酰胺?？股乜剐约?xì)胞在有抗生素存在下存活的能力。本文使用的抗生素抗性源自抗生素抗性基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。細(xì)胞可以具有對任意抗生素的抗性。常用抗生素的實(shí)例包括卡那霉素和潮霉素。雙子葉植物胚具有2瓣種子或子葉的開花植物，分支葉脈，花瓣數(shù)是4或5的倍數(shù)。雙子葉植物的實(shí)例包括、但不限于，馬鈴薯，甜菜，綠花椰菜，木薯，甘薯，胡椒，猩猩木，菜豆，苜蓿，大豆，和聘梨。內(nèi)源的從待轉(zhuǎn)化的植物或植物物種的基因組分離的、或從與待轉(zhuǎn)化的植物物種在性別上相容或互交可孕的植物或物種分離的核酸、基因、多核苷酸、DNA、RNA、mRNA或cDNA分子，對于所述4直物物種是"天然的"，即天生的。表達(dá)盒多核苷酸，其從5，至3，包含，(a)第一個啟動子，(b)包含(i)基因或基因片段的至少一個拷貝或(ii)基因啟動子片段的至少一個拷貝的序列，和(c)以與第一個啟動子相反方向排列的終止子或第二個啟動子。外源的關(guān)于核酸"外源的"是指，該核酸來源于非植物生物體、或來源于與待轉(zhuǎn)化的植物不同物種的植物、或來源于與待轉(zhuǎn)化植物不是互交可孕的植物，不屬于目標(biāo)植物的物種。根據(jù)本發(fā)明，外源的DNA或RM代表天然地存在于真菌、細(xì)菌、病毒、哺乳動物、魚或鳥類的遺傳組成中，但不天然地存在于待轉(zhuǎn)化的植物中的核酸。因而，外源核酸是編碼核酸，例如，編碼不由^L轉(zhuǎn)化植物天然地產(chǎn)生的多肽。外源核酸不是必須編碼蛋白產(chǎn)物?；蚧蚴呛泻铣僧a(chǎn)物、多肽鏈或RNA分子所需的所有信息的DNA分子區(qū)段，其包含編碼序列和非編碼序列?；蛞部梢源矶鄠€序列，它們中的每一個可以獨(dú)立表達(dá)，或可以編碼表現(xiàn)出相同功能活性的輕樣丈不同的蛋白。例如，天冬酰胺合成酶1和2基因可以統(tǒng)一稱作一個基因。遺傳元件"遺傳元件"是任意離散的核苷酸序列，例如、但不限于，啟動子，基因，終止子，內(nèi)含子，增強(qiáng)子，間隔區(qū)，5，-非翻譯區(qū)，3，-非翻"if區(qū)，或重組酶識別位點(diǎn)。遺傳修飾通過應(yīng)用分子和細(xì)胞生物學(xué)方法，將DNA穩(wěn)定導(dǎo)入某些生物體的基因組中?？米又参锶绫疚氖褂玫?，指具有沒有子房的種子的種子植物?？米又参锏膶?shí)例包括針葉樹，蘇鐵科植物，銀杏，和麻黃。導(dǎo)入如本文使用的，是指通過包括感染、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法將核酸序列插入到細(xì)胞中。單子葉植物胚芽具有一個子葉或籽葉的開花植物，平行葉脈，花瓣數(shù)是3的倍數(shù)。單子葉植物的實(shí)例包括、但不限于，玉米，稻，燕麥，小麥，大麥，和高梁。天然的從待轉(zhuǎn)化的植物或植物物種的基因組分離的、或從與待轉(zhuǎn)化的植物物種在性別上相容或互交可孕的植物或物種分離的核酸、基因、多核苷酸、DNA、RNA、mRNA或cDNA分子，對于所述植物物種是"天然的"，即天生的。天然DNA:從待轉(zhuǎn)化的植物或植物物種的基因組分離的、或從與待酸、基因、多核苷酸、DM、RNA、mRNA或cDNA分子，對于所述植物物種是"天然的"，即天生的。換而言之，天然的遺傳元件代表植物育種明，天然核酸的任何變體也認(rèn)為是"天然的"。例如，天然DNA可以包含點(diǎn)突變，因為這樣的點(diǎn)突變會天然發(fā)生。通過采用限制位點(diǎn)，也可以連接2個不同的天然DNA,因為這樣的位點(diǎn)普遍存在于植物基因組中。天然核酸構(gòu)建體包含至少一個天然DNA的多核苷酸?？刹僮鞯剡B接以這樣的方式組合兩個或多個分子，從而使它們在植物細(xì)胞中以組合方式適當(dāng)?shù)仄鹱饔?。舉例來說，當(dāng)啟動子控制結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄時，啟動子可操作地連接到結(jié)構(gòu)基因。超量表達(dá)基因的表達(dá)水平高于在非轉(zhuǎn)基因植物中的水平。P-DNA:本發(fā)明的植物衍生的轉(zhuǎn)運(yùn)-DNA("P-DNA")邊界序列的核苷酸序列不同于任意已知細(xì)菌-衍生的T-DNA邊界序列，但是它的功能用于基本上相同的目的。也就是說，P-DNA可以用于將一個多核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)和整合到另一個多核苷酸中?？梢詫-DNA插入腫瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒，例如替代常規(guī)T-DNA的來自農(nóng)桿菌的Ti-質(zhì)粒，并維持在細(xì)菌株中，正如常規(guī)轉(zhuǎn)化質(zhì)粒一樣。可以操縱P-DNA,以便含有需要的多核苷酸，后者用于通過細(xì)菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化整合到植物基因組中。參見Rommens等人，WO2003/069980,US-2003-0221213，US-2004-0107455，和WO2005/004585:它們都在本文中引作參考。表型表型是植物的區(qū)別特征或特性，通過將一個或多個"需要的多核苷酸，，和/或篩選/選擇標(biāo)記整合到轉(zhuǎn)化的植物的至少一個植物細(xì)胞的基因組中，可以根據(jù)本發(fā)明改變表型。"需要的多核苷酸"和/或標(biāo)記可以賦予轉(zhuǎn)化的植物的表型的變化，這通過修飾轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或植物整體的許多遺傳、分子、生化、生理學(xué)、形態(tài)學(xué)或農(nóng)學(xué)特征或性質(zhì)中的任意一種來實(shí)現(xiàn)。因而，一個或多個穩(wěn)定整合的需要的多核苷酸在植物基因組中的表達(dá)，會在植物組織中產(chǎn)生降低的丙烯酰胺濃度的表型。植物組織"植物"是植物界許多光合的、真核的、多細(xì)胞生物體中的任一種，其特征性地生成胚、含有葉綠體且具有纖維素細(xì)胞壁?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明的方法處理植物的一部分即"植物組織"，以生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物。根據(jù)本發(fā)明可以轉(zhuǎn)化許多合適的植物組織，包括、但不限于，體細(xì)胞胚，花粉，葉，莖，愈傷組織，匍旬莖，微塊莖，和芽。因而，本發(fā)明預(yù)見到被子植物和棵子植物的轉(zhuǎn)化，所述植物例如小麥，玉米，稻谷，大麥，燕麥，甜菜，馬鈴薯，番茄，苜蓿，木薯，甘薯，和大豆。根據(jù)本發(fā)明，"植物組織"也包括植物細(xì)胞。植物細(xì)胞包括懸浮培養(yǎng)物、愈傷組織、胚、分生組織區(qū)、愈傷組織、葉、根、芽、配子體、孢子體、花粉、種子和微孢子。植物組織可以處于各種成熟階段，可以生長在液體或固體培養(yǎng)基中，或在土壤中或在罐的合適培養(yǎng)基中、溫室或田地中。植物組織也指這樣的植物、種子、后代、繁殖體的任意克隆，無論是有性還是無性產(chǎn)生的，和它們的后代，例如插條或種子。特別感興趣的是馬鈴薯，玉米，和小麥。植物轉(zhuǎn)化和細(xì)胞培養(yǎng)泛指遺傳修飾植物細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移到適合的植物培養(yǎng)基，用于維持、進(jìn)一步生長、和/或進(jìn)一步發(fā)育的過程。這樣的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。加工從下述物質(zhì)生產(chǎn)食品的過程(1)種子，例如，小麥、玉米、咖啡植物或可可樹的種子，(2)塊莖，例如，馬鈴薯塊莖，或(3)根，例如，甘薯和山藥的根，包含加熱至至少120°C。加工食品的實(shí)例包括面包、早餐谷類、餡餅、蛋糕、土司、餅干、小甜餅、比薩餅、椒鹽巻餅、玉米餅、炸薯條、烤薯條、馬鈴薯片、薯餅、烘烤的咖啡，和可可。后代本發(fā)明的"后代"，例如轉(zhuǎn)基因植物的后代，是由植物或轉(zhuǎn)基因植物生出的、產(chǎn)生的或衍生的后代。因而，"后代"植物，即"F1"代植物，是通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因植物的子代或后代。轉(zhuǎn)基因植物的后代可以含有它的至少一個、一些或全部細(xì)胞基因組，通過本文所述的方法將需要的多核苷酸整合到親本轉(zhuǎn)基因植物的細(xì)胞中。因而，需要的多核苷酸由后代植物"傳遞"或"遺傳"。這樣在后代植物中遺傳的需要的多核苷酸可以停留在T-DNA或P-DNA構(gòu)建體內(nèi)，后者也可以由后代植物從它的親本遺傳。本文使用的術(shù)語"后代"也可以視作一組植物的子代或后代。啟動子啟動子意在指核酸，優(yōu)選結(jié)合RNA聚合酶和/或其它轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件的DNA。象任意的啟動子一樣，本發(fā)明的啟動子會促進(jìn)或控制DNA或RNA的轉(zhuǎn)錄，以從可操作地連接到啟動子上的核酸分子產(chǎn)生mRNA分子。如前所述，產(chǎn)生的RNA可以編碼蛋白或多肽，或可以編碼RNA干擾或反義分子。啟動子是核酸序列，它使與它相關(guān)的基因被轉(zhuǎn)錄。在原核生物中，啟動子通常由在基因上游-10和-35位置的2個短序列組成，也就是說，在轉(zhuǎn)錄方向上是在基因前面。在-IO位置的序列稱作普里布諾盒，通常由6個核苷酸TATAAT組成。普里布諾盒是原核生物開始轉(zhuǎn)錄所必需的。在-35位置的另一個序列通常由6個核苷酸TTGACA組成，它的存在會促進(jìn)轉(zhuǎn)錄速率。真核啟動子是更多樣的，因此更難以表征，但是存在某些基本特征。例如，真核啟動子通常位于它們最密切相關(guān)的基因的上游。啟動子可以具有距離它們的轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)數(shù)千堿基的調(diào)節(jié)元件，盡管轉(zhuǎn)錄復(fù)合物形成的某些三級結(jié)構(gòu)可以造成DNA的折疊，這會使這些調(diào)節(jié)元件更接近實(shí)際轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)。許多真核啟動子含有"TATA盒"序列，通常用核苷酸序列TATAAA指示。該元件會結(jié)合TATA結(jié)合蛋白，它輔助RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的形成。TATA盒通常位于轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)的50堿基內(nèi)。真核啟動子的特征也在于存在某些調(diào)節(jié)序列，它們結(jié)合參與形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的轉(zhuǎn)錄因子。一個實(shí)例是序列CACGTG指示的E-盒，它會結(jié)合基本的螺旋-環(huán)-螺旋家族中的轉(zhuǎn)錄因子。也存在高GC核苷酸含量的區(qū)域。因此，根據(jù)本發(fā)明，可以用于設(shè)計本發(fā)明的需要的多核苷酸的啟動子的部分序列或特定啟動子"片段"，例如天冬酰胺合成酶基因的啟動子，可以包含或不包含一個或多個這樣的元件或沒有這樣的元件。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的啟動子片段序列不是功能性的，且不含有TATA備JUL。本發(fā)明的構(gòu)建體的另一個特征是，它會通過2個相反啟動子，促進(jìn)與或不與終止子直接可操作地相連的多核苷酸的一個或多個拷貝的趨同轉(zhuǎn)錄。由于缺失終止信號，從第一個和第二個啟動子轉(zhuǎn)錄的RM分子集合的長度可以是不同的長度。偶然地，例如，轉(zhuǎn)錄機(jī)制可能繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，越過象征著需要的多核苷酸序列的"末端"的最后一個核苷酸。因此，在該特定排列中，轉(zhuǎn)錄終止可能通過下游序列的微弱的或非預(yù)期作用(例如，促進(jìn)發(fā)夾形成)來發(fā)生，或通過位于側(cè)接轉(zhuǎn)運(yùn)DNA整合位點(diǎn)的植物DNA中的非預(yù)期轉(zhuǎn)錄終止子的作用來發(fā)生。需要的多核苷酸可以以2個不同的方向連接至啟動子上。在一個方向，例如"有義"方向，得到的RNA轉(zhuǎn)錄物的至少5'-部分與至少一種耙轉(zhuǎn)錄物的至少一部分具有序列同一性。在指定為"反義"的另一個方向，預(yù)測轉(zhuǎn)錄物的至少5，-部分與至少一種耙轉(zhuǎn)錄物的反向互補(bǔ)序列的至少一部分相同或同源。植物啟動子是能啟動在植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄的啟動子，無論它的起源是否是植物細(xì)胞。示例性植物啟動子包括、但不限于，從包含要在植物細(xì)胞中表達(dá)的基因的植物、植物病毒和細(xì)菌(例如農(nóng)桿菌或根瘤菌)得到的啟動子。在發(fā)育控制下的啟動子的實(shí)例包括，優(yōu)先啟動在某些組織(例如木質(zhì)部，葉，根，或種子)中的轉(zhuǎn)錄的啟動子。這樣的啟動子稱作組織優(yōu)選的啟動子。僅啟動在某些組織中的轉(zhuǎn)錄的啟動子稱作組織特異性的啟動子。細(xì)胞類型特異性的啟動子主要驅(qū)動在一個或多個器官的某些細(xì)胞類型(例如，根或葉中的維管細(xì)胞)中的表達(dá)。誘導(dǎo)型或抑制型啟動子是在環(huán)境控制下的啟動子?？赡苡绊懻T導(dǎo)型啟動子的轉(zhuǎn)錄的環(huán)境條件的實(shí)例包括缺氧條件或光的存在。組織特異性的、組織優(yōu)選的、細(xì)胞類型特異性的和誘導(dǎo)型的啟動子構(gòu)成非組成型啟動子的類型。組成型啟動子是在大多數(shù)環(huán)境條件下和在大多數(shù)植物部分中有活性的啟動子。多核苷酸是核苷酸序列，其包含基因編碼序列或其片段(包含至少15個連續(xù)核苷酸，優(yōu)選至少30個連續(xù)核苷酸，和更優(yōu)選至少50個連續(xù)核苷酸)，啟動子，內(nèi)含子，增強(qiáng)子區(qū)域，聚腺苷酸化位點(diǎn)，翻譯起始位點(diǎn)，5'或3'非翻譯區(qū)，報道基因，選擇標(biāo)記等。多核苦酸可以包含單鏈或雙鏈DNA或RNA。多核苦酸可以包含修飾的堿基或修飾的主鏈。多核苦酸可以是基因組的、RNA轉(zhuǎn)錄物(例如mRNA)或加工過的核苷酸序列(例如cDM)。多核苷酸可以包含有義或反義方向的序列。分離的多核苷酸是并非處于它的天然狀態(tài)的多核苦酸序列，例如，該多核苷酸包含天然不存在的核苷酸序列，或該多核苷酸與它通常接近的核苷酸序列分離，或接近與它通常不接近的核普酸序列。種子"種子，，可以視作含有胚的成熟的植物胚珠，和植物的繁殖部分，作為塊莖或孢子。種子可以在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化之前在黑暗中溫育，例如，以促進(jìn)萌芽。種子也可以在溫育前滅菌，例如通過用漂白劑簡單處理。得到的幼苗然后可以暴露于目標(biāo)農(nóng)桿菌菌株。選擇/篩選標(biāo)記在植物或植物組織中表達(dá)時，可以將它們與不表達(dá)該基因的其它植物或植物組織區(qū)分開的基因。篩選操作可能需要測定由篩選標(biāo)記基因編碼的蛋白的表達(dá)。選擇標(biāo)記的實(shí)例包括編碼卡那霉素和遺傳霉素抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NptII)基因，編碼潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HptII)基因，或其他本領(lǐng)域已知的類似基因。感官特征專業(yè)訓(xùn)練的個體組可以評定食品的感官特征，例如外7見，風(fēng)味，香氣，和質(zhì)地。在實(shí)施例4中，描述了從R1和磷酰酶-L基因表達(dá)水平下調(diào)的塊莖得到的炸薯條的等級。從實(shí)施例5所述的塊莖得到的炸薯條也表現(xiàn)出增強(qiáng)的感官特征。因而，本發(fā)明預(yù)見到，提高從已經(jīng)根據(jù)本發(fā)明修飾的植物得到的植物產(chǎn)品的感官特征，以操縱它的天冬酰胺生物合成和代謝途徑。序列同一性在2個核酸或多肽序列的情況下，本文使用的"序列同一性"或"同一性"包括，當(dāng)進(jìn)行比對以得到指定區(qū)域上的最大相應(yīng)性時，2個序列中相同的殘基。當(dāng)序列同一性百分比用于指蛋白時，認(rèn)識到不相同的殘基位置的差別經(jīng)常在于保守氨基酸置換，其中將氨基酸殘基置換為具有類似化學(xué)性質(zhì)(例如電荷或疏水性)的其它氨基酸殘基，因此不會改變分子的功能性質(zhì)。當(dāng)序列的差異在于保守置換時，可以向上調(diào)節(jié)序列同一性百分比，以校正置換的保守性質(zhì)。差異在于這樣的保守置換的序列，被描述為具有"序列相似性"或"相似性"。進(jìn)行該調(diào)節(jié)的方法，是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。通常，這包含，將保守置換評定為部分的、而不是完全的錯配，從而增加序列同一性百分比。因而，例如，當(dāng)為相同的氨基酸給出l分、且為非保守置換給出o分時，為保守置換給出0至1之間的分?jǐn)?shù)。計算保守置換的評分，例如，根據(jù)Meyers和Miller的算法，ComputerApplic.Biol.Sci.,4:1117(1988)例如,在程序PC/基因(Intelligenetics，MountainView,California,USA)中實(shí)現(xiàn)。如本文使用的，序列同一性百分比是指通過在對比窗中對比2個最優(yōu)比對的序列而確定的值，其中多核苦酸序列在對比窗中的部分可以相對于用于2個序列的最優(yōu)比對的參照序列(它不包含添加或缺失)包含添加或缺失(即，空位)。如下計算百分比通過測定2個序列中存在相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置的數(shù)目，以確定匹配位置的數(shù)目，將匹配位置的數(shù)目除以對比窗中的位置總數(shù)，并將結(jié)果乘以100,以確定序列同一性百分比。"序列同一性，，具有本領(lǐng)域公知的含義，且可以使用公開的技術(shù)來計算。參見COMPUTATIONALMOLECULARBI0L0GY，Lesk,編(OxfordUniversityPress,1988)，BI0C0MPUTING:INFORMATICSANDGENOMEPROJECTS,Smith,編(AcademicPress,1993),COMPUTERANALYSISOFSEQUENCEDATA,PARTI，Griffin&Griffin，編.，(HumanaPress,1994):SEQUENCEANALYSISINMOLECULARBIOLOGY,VonHeinjeed.,AcademicPress(1987)，SEQUENCEANALYSISPRIMER,Gribskov&Devereux，編.(MacmillanStocktonPress,1991)，和Carillo&Lipton，SIAMJ.AppliedMath.48:1073(1988)。經(jīng)常用于測定2個序列之間的同一性或相似性的方法包括、但不限于在GUIDETOHUGECOMPUTERS,Bishop,ed.,(AcademicPress,1994)和上面Cari1lo&Lipton中公開的方法。測定同一性和相似性的方法可以編譯成計算機(jī)程序。測定2個序列之間的同一性和相似性的優(yōu)選計算機(jī)程序包括、但不限于GCG程序包(Devereux等人，NucleicAcidsResearch12:387(1984))，BLASTP，BLASTN,FASTA(Atschul等人，J.Mol.Biol.215:403(1990))，和FASTDB(Brutlag等人，Comp.App.Biosci,6:237(1990))。沉默基因或基因片段從啟動子向終止子的單向的和不受干擾的轉(zhuǎn)錄，可以觸發(fā)靶基因的轉(zhuǎn)錄后沉默。植物中轉(zhuǎn)錄后基因沉默的起始表達(dá)盒包含以反義(McCormick等人，美國專利6617"6;Shewmaker等人，美國專利5107065)或有義(vanderKrol等人，Plant細(xì)胞2:291-299,1990)方向位于轉(zhuǎn)錄起始和終止的調(diào)節(jié)序列之間的單個基因片段。在擬南芥中，依賴于RNA的RM聚合酶對得到的轉(zhuǎn)錄物的識別，會導(dǎo)致雙鏈(ds)RNA的生成。Dicer-樣(Dcl)蛋白例如Dcl4對該dsRNA的切割，會產(chǎn)生21個核普酸(nt)的小干擾RM(siRNA)。這些siRNA與包含Argonaute(Ago)家族成員在內(nèi)的蛋白絡(luò)合，生成RNA-誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)。RISC然后粑向同源RM,進(jìn)4亍核酸內(nèi)切。更有效的沉默構(gòu)建體含有有義和反義組分，生成折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA分子(Waterhouse等人，ProcNatlAcadSciUSA95:13959-13964,1998)。推斷反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)基因的表達(dá)生成的高dsRNA水平會促進(jìn)多個Dcl的活性。擬南芥中組合Dcl敲除的分析，支持了該理論，也將Dcl4鑒別為參與RNA切割的蛋白之一。基于常規(guī)有義、反義和雙鏈(ds)RNA的基因沉默構(gòu)建體的一種組分是轉(zhuǎn)錄終止子。WO2006/036739證實(shí)，當(dāng)基因片段位于2個方向相反且有功能活性的啟動子之間時，該調(diào)節(jié)元件變得退化。得到的趨同轉(zhuǎn)錄會觸發(fā)至少象單向"啟動子-至-終止子"轉(zhuǎn)錄一樣有效的基因沉默。除了短的各種大小且未聚腺苷酸化的RM以外，無終止子的盒生成罕見的更長的轉(zhuǎn)錄物，它到達(dá)側(cè)接啟動子中。用啟動子-衍生的序列替代基因片段，會進(jìn)一步增加基因沉默的程度。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，需要的多核苷酸包含靶基因啟動子的部分序列或與靶基因啟動子的一部分具有序列同一性的部分序列。因此，本發(fā)明的需要的多核苷酸含有感興趣的特定靶基因啟動子的特異性片l殳。需要的多核苷酸可以可操作地連接到一個或多個功能啟動子上。本發(fā)明考慮的不同構(gòu)建體包括，但不限于(1)構(gòu)建體，其中所述需要的多核苷酸包含一個或多個啟動子片段序列，且在兩端可操作地連接到功能性"驅(qū)動，，啟動子上。這2個功能性啟動子以趨同方向排列，以便轉(zhuǎn)錄需要的多核苷酸的每條鏈；(2)構(gòu)建體，其中所述需要的多核苷酸在它的5，-末端或它的3，-末端可操作地連接一個功能性啟動子，且所述需要的多核苷酸也在它的非啟動子末端可操作地連接功能性終止子序列；(3)構(gòu)建體，其中所述需要的多核苷酸在它的5，-末端或它的3，-末端可操作地連接一個功能性啟動子，但是其中所述需要的多核苷酸沒有可操作地連接終止子；或(4)盒，其中所述需要的多核苷酸包含一個或多個啟動子片段序列，但是沒有可操作地連接任意功能性啟動子或終止子。因此，本發(fā)明的構(gòu)建體可以包含2個或多個"驅(qū)動"啟動子，其側(cè)接一個或多個需要的多核苷酸或其側(cè)接需要的多核苷酸的拷貝，以便使需要的多核苷酸的2條鏈進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。也就是說，一個啟動子可以定向，以便啟動需要的多核苷酸的5，-末端的轉(zhuǎn)錄，而第二個啟動子可以可操作地定向，以便啟動相同的需要的多核普酸的3，-末端的轉(zhuǎn)錄。相反方向的啟動子可以側(cè)接需要的多核苷酸的多個拷貝。因此，"拷貝數(shù)"可以變化，使得構(gòu)建體可以包含需要的多核苷酸的2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100或超過100個拷貝，或其間的任意整數(shù)，其可以側(cè)接定向的'驅(qū)動，啟動子，以便誘導(dǎo)趨同轉(zhuǎn)錄。如果2個盒都不包含終止子序列，則這樣的構(gòu)建體由于趨同轉(zhuǎn)錄排列，可以生成不同長度的RNA轉(zhuǎn)錄物。因此，在該情況下，可能存在部分或完全轉(zhuǎn)錄的RNA轉(zhuǎn)錄物的亞群，所述RNA轉(zhuǎn)錄物包含從各個盒轉(zhuǎn)錄的需要的多核苷酸的部分或全長序列?；蛘撸跊]有功能性終止子的情況下，轉(zhuǎn)錄機(jī)制可以前進(jìn)超過需要的多核香酸末端，以生成比需要的多核苷酸的長度更長的轉(zhuǎn)錄物。因此，在包含需要的多核苷酸的2個拷貝的構(gòu)建體中，其中一個多核苷酸可以是彼此以方向互補(bǔ)方向定向或不是如此，且其中多核苷酸可操作地連接到啟動子上以誘導(dǎo)趨同轉(zhuǎn)錄，且在構(gòu)建體中沒有功能性終止子，從一個需要的多核苷酸啟動的轉(zhuǎn)錄機(jī)制可以繼續(xù)轉(zhuǎn)錄需要的多核苷酸的其它拷貝，反之亦然。需要的多核苷酸的多個拷貝可以以不同的排列定向在構(gòu)建體中存在需要的多核苷酸的2個拷貝的情況下，這些拷貝可以是例如以相同方向定向、；波此相反的方向，或4皮此反向互補(bǔ)的方向。在一個需要的多核苷酸與另一個多核苷酸以方向互補(bǔ)方向進(jìn)行定向的排列中，可以生成RNA轉(zhuǎn)錄物，其不僅包含第一多核苷酸的"有義"序列，而且包含來自第二多核苷酸的"反義"序列。如果第一和第二多核苦酸包含相同的或基本上相同的DNA序列，則單個RNA轉(zhuǎn)錄物可以包含彼此互補(bǔ)的2個區(qū)域，且它們因此可以退火。因此，這樣轉(zhuǎn)錄的單個RNA轉(zhuǎn)錄物可以形成部分或完全的發(fā)夾雙鏈體結(jié)構(gòu)。另一方面，如果生成這樣一個長轉(zhuǎn)錄物的2個拷貝，一個來自一個啟動子，則將存在2個RNA分子，其中的每個具有彼此序列互補(bǔ)的區(qū)域。因此，第一個RM轉(zhuǎn)錄物的"有義，，區(qū)域可以退火于第二個RNA轉(zhuǎn)錄物的"反義，，區(qū)域，反之亦然。因此，在該排列中，可以形成另一個RNA雙鏈體，其由2個分開的RNA轉(zhuǎn)錄物組成，這不同于形成自單個自互補(bǔ)的RNA轉(zhuǎn)錄物的發(fā)夾雙鏈體?；蛘?，需要的多核苷酸的2個拷貝可以是相同的方向，以便在轉(zhuǎn)錄連讀的情況下，從一個啟動子生成的長MA轉(zhuǎn)錄物可以包含，例如，需要的多核苷酸的第一個拷貝的有義序列，和需要的多核苷酸的第二個拷貝的有義序列。因此，從另一個趨同方向的啟動子生成的RNA轉(zhuǎn)錄物可以包含需要的多核苷酸的第二個拷貝的有義序列，和第一多核苷酸的反義序列。因此，可能兩個RNA轉(zhuǎn)錄物都不含有精確互補(bǔ)的區(qū)域，因此，可能兩個RNA轉(zhuǎn)錄物都不折疊到自身上，生成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。另一方面，2個單獨(dú)的RNA轉(zhuǎn)錄物可以彼此雜交和退火，形成RM雙鏈體。因此，在一個方面，本發(fā)明提供了構(gòu)建體，其缺少終止子或缺少前面有自我剪接核酶編碼DNA區(qū)域的終止子，但是其包含可操作地連接到需要的多核苷酸上的笫一個啟動子。組織用于生產(chǎn)食品的植物的任意部分。組織可以是馬鈴薯塊莖，甘薯根,或玉米植物種子。轉(zhuǎn)錄終止子本發(fā)明的表達(dá)載體一般在轉(zhuǎn)錄起始調(diào)節(jié)區(qū)的相反末端具有轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。可以選擇轉(zhuǎn)錄終止區(qū)，用來穩(wěn)定mRNA以增加表達(dá)和/或用于將聚腺苷酸尾部添加到基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。當(dāng)3個肽鏈終止密碼子中的任一個進(jìn)入核糖體上的位點(diǎn)時，新生多肽的翻譯會發(fā)生終止。翻譯終止密碼子是UAA，UAG，和UGA。在本發(fā)明中，轉(zhuǎn)錄終止子源自基因，或更優(yōu)選地，源自不代表基因、但是代表基因間DM的序列。例如，可以使用來自馬鈴薯泛素基因的終止子序列，且描述在SEQIDNO:5中。轉(zhuǎn)運(yùn)DNA(T-DNA):轉(zhuǎn)運(yùn)DNA是由T-DNA邊界或P-DM邊界描繪的DNA區(qū)段，分別建立T-DNA或P-DNA。T-DNA是一種遺傳元件，眾所周知它是能將包含在它的邊界內(nèi)的核苷酸序列整合到另一個基因組中的元件。在這方面，T-DNA通常側(cè)接2個"邊界"序列。本發(fā)明的需要的多核苷酸和選擇標(biāo)記可以位于T-DNA的左邊界樣序列和右邊界樣序列之間。包含在T-DNA內(nèi)的需要的多核苷酸和選擇標(biāo)記可以可操作地連接許多不同的、植物特異性的(即，天然的)或外源的核酸，如促進(jìn)它的表達(dá)的啟動子和終止子調(diào)節(jié)元件，所述表達(dá)即由需要的多核苷酸或選擇標(biāo)記編碼的DM序列的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化將核酸穩(wěn)定地插入植物細(xì)胞的基因組中的過程。轉(zhuǎn)化可以在天然的或人工的條件下利用本領(lǐng)域公知的各種方法來進(jìn)行。轉(zhuǎn)化可以依靠任何已知的方法，來將核酸序列插入到原核或真核宿主細(xì)胞中，包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方案如'精制轉(zhuǎn)化，或'精確育種，、病毒感染、噬菌體頸須(whishkers)、電穿孔、顯微注射、聚乙二醇處理、熱激、脂轉(zhuǎn)染和粒子轟擊。轉(zhuǎn)基因植物本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物是包含至少一個其中已經(jīng)穩(wěn)定整合了外源核酸的細(xì)胞基因組的植物。根據(jù)本發(fā)明，轉(zhuǎn)基因植物是包含僅一個遺傳修飾的細(xì)胞和細(xì)胞基因組的植物，或包含一些遺傳修飾的細(xì)胞的植物，或其中所有細(xì)胞都被遺傳修飾的植物。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可以是僅在該植物的某些部分中表達(dá)需要的多核苷酸(即，外源核酸)的植物。因而，轉(zhuǎn)基因植物可以僅在它的結(jié)構(gòu)的某些部分中含有遺傳修飾的細(xì)胞。變體本文使用的"變體"被理解為是指與標(biāo)準(zhǔn)的或給定的特定基因或蛋白的核苷酸或氨基酸序列有區(qū)別的核苷酸或氨基酸序列。術(shù)語"異構(gòu)體""同種型"和"類似物"也是指核苷酸或氨基酸序列的"變體"形式。通過添加、去除或取代一個或多個氨基酸而改變的氨基酸序列，或在核苦酸序列中的變化，可被認(rèn)為是"變體"序列。變體可具有"保守性，，變化，其中被取代的氨基酸具有類似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)，例如，用異亮氨酸替換亮氨酸。變體也可具有"非保守性"變化，例如用色氨酸替換甘氨酸。類似的較小的變異也可包括氨基酸缺失或插入，或二者。利用本領(lǐng)域公知的計算機(jī)程序，例如VectorNTISuite(InforMax,MD)軟件，可以獲得在確定哪些氨基酸殘基可以被取代、插入或缺失方面的指導(dǎo)。"變體"也可以指"改組基因"，例如在Maxygen的專利中所述的那些。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不限于在此描述的特定方法、方案、載體和試劑等，這些都可以變化。還需要理解的是，本文使用的專有名詞僅用于描迷特定實(shí)施方式的目的，不意在限制本發(fā)明的范圍。必須指出，本文使用的和在附隨的權(quán)利要求中，單數(shù)形式"一個"、"一種"和"該"包括復(fù)數(shù)的引用，除非上下文中另有明顯的指示。因而，例如，提及"一個基因，，是指一個或多個基因，包括本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其等同方案等。實(shí)際上，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用在此描述的方法來在植物宿主系統(tǒng)中表達(dá)任何天然的基因(目前或后來知道的)。多核苷酸序列本發(fā)明涉及分離的核酸分子，其包含具有選自下述任意多核苷酸序列的序列的多核苷酸SEQIDN0:1，2，3,4，9，10,14，15，23，24，或25。本發(fā)明也提供了SEQIDNO:1，2，3，4,9，10，14,15，23,24，或25的多核苷酸序列的功能性片段。本發(fā)明還提供了與SEQIDN0:1,2,3，4,9，10，14，15，23,24，或25中的任意多核苷酸序列互補(bǔ)的核酸或其片段，以及核酸，其包含至少15個連續(xù)堿基，且與SEQIDN0:1，2，3,4,9，10,14，15，23，24,或25中的任意多核苷酸序列雜交。"分離的"核酸分子是指已經(jīng)從它的天然環(huán)境取出的核酸分子，即DNA或RNA。例如，包含在DNA構(gòu)建體中的重組DNA分子被認(rèn)為出于本發(fā)明的目的而分離。分離的DNA分子的其它實(shí)例包括維持在異源宿主細(xì)胞中的重組DNA分子或在溶液中的(部分地或基本上)純化的DNA分子。分離的RNA分子包括本發(fā)明的DNA分子的體外RNA轉(zhuǎn)錄物。根據(jù)本發(fā)明的分離的核酸分子還包括合成生產(chǎn)的這樣的分子。本發(fā)明的核酸分子可以是MA的形式，例如mRM，或DNA的形式，包括，例如，通過克隆或合成生產(chǎn)的cDNA和基因組DNA。DNA或RNA可以是雙鏈的或單鏈的。單鏈DNA可以是編碼鏈，也稱作有義鏈，或它可以是非編碼鏈，也稱作反義鏈。除非另有說明，通過使用自動化DM測序儀(例如來自AppliedBiosystems,Inc的373型)測定本文DNA分子的序列，確定所有核苷酸序列。因此，如本領(lǐng)域已知的，對于通過該自動化方案測定的任意DNA序列，本文測定的任意核普酸序列可以含有一些錯誤。自動化測定的核苷酸序列通常與測序的DNA分子的實(shí)際核苷酸序列具有至少約95%同一性，更通常至少約96%-至少約99.9%同一性。通過其它方案，包括本領(lǐng)域眾所周知的手工DNA測序方法，可以更津f確地測定實(shí)際序列。也如本領(lǐng)域已知的，測定的核苷酸序列相對于實(shí)際序列的單個插入或缺失，會造成核苷酸序列翻譯中的移碼，使得由測定的核苷酸序列編碼的預(yù)測氨基酸序列從這樣的插入或缺失點(diǎn)開始，可能完全不同于由測序的DNA分子實(shí)際編碼的氨基酸序列。本文所述的每個"核苷酸序列"都表示為脫氧核糖核苷酸(縮寫為A，G，C和T)的序列。但是，核酸分子或多核苷酸的"核苷酸序列"是指，對于DNA分子或多核苷酸而言，是脫氧核糖核苷酸序列，對于RNA分子或多核苷酸而言，是核糖核苷酸(A，G，C和U)的對應(yīng)序列，其中在指定的脫氧核普酸序列中的每個胸苷脫氧核苷酸(T)被替換為核糖核苷酸尿苷(U)。本發(fā)明也涉及本文所述分離的核酸分子的片段。優(yōu)選地，DNA片段的長度包含至少15個核苷酸，更優(yōu)選至少20個核苷酸，更優(yōu)選至少30個核苷酸，它們可用作診斷探針和引物。當(dāng)然，最高達(dá)本發(fā)明核酸分子的整個長度的更大核酸片段也可以根據(jù)常規(guī)雜交技術(shù)在診斷上用作探針，或用作通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增靶序列的引物，如例如在MolecularCloning,ALaboratoryManual,第3版，Sambrook&Russel.編，(2001),ColdSpringHarborLaboratoryPress中所述，它的整個公開內(nèi)容在本文中引作參考。長度是至少20個核苷酸的片段是指，例如，包括20或更多個來自SEQIDNO:1，2，17，20，21的核苷酸序列的連續(xù)堿基的片段。使用技術(shù)人員熟知的DNA合成的常規(guī)方法，可以產(chǎn)生含有在SEQIDNO:1，2，17,20，21中列出的核苷酸序列的核酸。例如，限制內(nèi)切核酸酶切割或聲處理剪切，可以容易地用于產(chǎn)生不同大小的片段?；蛘?，根據(jù)已知的技術(shù)，可以合成地制備本發(fā)明的DNA片段。在另一個方面，本發(fā)明提供了分離的核酸分子，其包含可在嚴(yán)格雜交條件下與上述本發(fā)明的核酸分子的多核苷酸的一部分雜交的多核苷酸。與多核苷酸的"一部分"雜交的多核苷酸是指，與參照多核苷酸的至少約15個核苷酸、更優(yōu)選至少約20個核苷酸、更優(yōu)選至少約30個核苷酸、甚至更優(yōu)選超過30個核苷酸雜交的多核苷酸(DNA或RNA)。這些與參照片段雜交的片段可以用作診斷探針和引物。本文使用的探針定義為，SEQIDNO:1-230所述核酸序列之一的至少約100個連續(xù)堿基。為了本發(fā)明的目的，當(dāng)在6XSSC、0.5%SDS、5XDenhardt溶液和100jug非特異性載體DNA的雜交溶液中形成雙鏈復(fù)合物時，2個序列雜交。參見Ausubel等人，2.9部分，增補(bǔ)27(1994)。序列可以在"中等嚴(yán)格性，，雜交，所述"中等嚴(yán)格性"定義為60°C的溫度，在6XSSC、0.5%SDS、5XDenhardt溶液和100jLig非特異性載體DNA的雜交溶液中。對于"高嚴(yán)格性"雜交，溫度升高至68°C。在中等嚴(yán)格性雜交反應(yīng)后，在室溫在2XSSC+0.05%SDS的溶液中洗滌核苷酸5次，隨后在60°C用0.IXSSC+0.1%SDS洗滌1h。對于高嚴(yán)格性，洗滌溫度升高至68°C。為了本發(fā)明的目的，雜交的核苷酸是使用1ng具有10，000cptn/ng比放射性的放射標(biāo)記的探針檢測的核普酸，其中雜交的核苷酸在70°C曝光于X-線膠片不超過72小時后可以清楚地看到。本發(fā)明涉及這樣的核酸分子，其與SEQIDNO:1，2，17，20，21所述的核酸序列具有至少60%、65%、70°/。、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97°/。、98%、99%或100%同一性。但是，優(yōu)選的是與SEQIDNO:1，2，17，20，21中的任一個所述的核酸序列具有至少95%、96°/。、97%、98%、99%或100%同一性的核酸分子。2個核酸序列之間的差異可以發(fā)生在參照核苷酸序列的5'或3'末端位置，或這些末端位置之間的任意位置，單個地散布在參照序列的核苷酸中或參照序列的一個或多個連續(xù)基團(tuán)中。作為實(shí)踐物質(zhì)，任意特定核酸分子與參照核苷酸序列是否具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性是指，使用本領(lǐng)域眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)算法，在2個分子之間對比，且可以使用可公開得到的計算機(jī)程序例如BLASTN算法來常規(guī)地測定。參見Altschul等人，NucleicAcidsRes.25:3389-3402(1997)。序列分析為對比目的而比對序列的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。通過下述算法可以為3十比目的而進(jìn)4亍序歹Q的最優(yōu)比只于Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法;Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比只于算法；Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444(1988)的相似性檢索方法；這些算法的計算機(jī)化執(zhí)行,包括,但不卩艮于Intel1igenetics，MountainView,California的PC/基因程序中的CLUSTAL;WisconsinGenetics軟件包，GeneticsComputerGroup(GCG),575ScienceDr.,Madison,Wisconsin,USA中的GAP，BESTFIT，BLAST、FASTA和TFASTA;所述CLUSTAL程序詳細(xì)記載在Higgins和Sharp,基因73:237244(1988);Higgins和Sharp,CABI0S5:151153(1989);Corpet，等人，NucleicAcidsResearch16:1088H0(1988);H訓(xùn)g，等人，ComputerApplicationsintheBiosciences8:155-65(1992)，和Pearson,等人，MethodsinMolecularBiology24:307-331(1994)。可以用于數(shù)據(jù)庫相似性檢索的BLAST程序家族包括針對核苷酸數(shù)據(jù)庫序列的核苷酸查詢序列的BLASTN;針對蛋白數(shù)據(jù)庫序列的核苷酸查詢序列的BLASTX;針對蛋白數(shù)據(jù)庫序列的蛋白查詢序列的BLASTP;針對核苷酸數(shù)據(jù)庫序列的蛋白查詢序列的TBLASTN;和針對核苷酸數(shù)據(jù)庫序列的才亥苦酸查詢序歹寸的TBLASTX。參見，CurrentProtocolsinMolecularBiology,Chapter19，Ausubel，等人，Eds.，GreenePublishing和Wiley-Interscience，NewYork(1995);Altschul等人，J.Mol.Biol.，215:403-410(1990);和，Altschul等人，NucleicAcidsRes.25:3389-3402(1997)。用于進(jìn)行BLAST分析的軟件可公開得到，例如，通過國家生物技術(shù)信息中心(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)。該算法包含，首先識另'J高評分序列對(HSP),這通過識別查詢序列中的長度W的短字來實(shí)現(xiàn)，當(dāng)與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的字比對時，其匹配或滿足一些正值的閾值評分T。T稱作鄰域字評分闊值。這些起始鄰域字命中作為啟動檢索的種子，所述檢索會發(fā)現(xiàn)含有它們的更長的HSP。所述字命中然后沿著每個序列向兩個方向延伸，遠(yuǎn)至可以增加累積比對評分。如下計算累積評分對于核苷酸序列，使用參數(shù)M(—對匹配殘基的獎勵分；總是>O)和N(錯配殘基的罰分；總是<0)。對于氨基酸序列，使用評分矩陣來計算累積評分。在下述情況時，停止每個方向的字命中延伸累積比對評分從它的最大達(dá)到值下降X;累積評分達(dá)到0或以下，這歸因于一個或多個負(fù)評分的殘基比對的積累；或達(dá)到任一個序列的末端。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定了比對的靈敏度和速度。BLASTN程序(對于核苷酸序列)使用的缺省值是，字長(W)為ll,期望值(E)為IO，截止值為100，M=5，N--4，和2條鏈的對比。對于氨基酸序列，BLASTP程序使用的缺省值是，字長(W)為3,期望值(E)為10，BL0S麗62評分矩陣(參見Henikoff&Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915)。除了計算序列同一性百分比以外，BLAST算法也進(jìn)行2個序列之間的相似性的統(tǒng)計分才斤(參見，例如，Karlin&Altschul,Proc.Nat，1,Acad.Sci.USA90:5873-5877(1993))。BLAST算法提供的相似性的一種度量是最小總概率(P(N))，它指示著2個核苷酸或氨基酸序列之間隨機(jī)發(fā)生匹配的概率。使用CLUSTAL比對方法(Higgins和Sharp(1989)CABIOS.5:151153),利用缺省參數(shù)(GAPPENALTY=10，GAPLENGTHPENALTY=10),可以進(jìn)行序列的多種比對。使用CLUSTAL方法的逐對比對的缺省參數(shù)是KTUPLE1，GAPPENALTY=3，WIND0W-5和DIAGONALSSAVED=5。下述運(yùn)行參數(shù)優(yōu)選地用于使用BLASTN測定比對和相似性，這導(dǎo)致多核苷酸序列的E值和百分比同一性Unix運(yùn)行命令blastall-pblastn-dembldb-e10-GO-EO-r1-v30-b30-iqueryseq-oresults;參數(shù)是-p程序名[字符串];-d數(shù)據(jù)庫[字符串];-e期望值(E)[實(shí)數(shù)];-G打開間隙的成本(零調(diào)用缺省行為)[整數(shù)];-E延伸空位的成本(零調(diào)用缺省行為)[整數(shù)];-r核苷酸匹配的獎勵(僅blastn)[整數(shù)];-v—行描述的數(shù)目(V)[整數(shù)];-b顯示的比對的數(shù)目(B)[整數(shù)];-i查詢文件[文件輸入];和-oBLAST報告輸出文件[文件輸出]任選的。由BLASTN、FASTA、BLASTP或類似算法生成的查詢序列對一個或多個數(shù)據(jù)庫序列的"命中"，會比對和識別序列的類似部分。命中按照相似性程度和序列重疊的長度的順序來排列。數(shù)據(jù)庫序列的命中通常代表在查詢序列的僅一部分序列長度上的重疊。BLASTN,FASTA和BLASTP算法也生成比對的"期望"值。期望值(E)指示著當(dāng)檢索某些大小的數(shù)據(jù)庫時，可以"期望"隨機(jī)看到的對某些數(shù)目的連續(xù)序列的命中數(shù)目。期望值用作確定對數(shù)據(jù)庫(例如優(yōu)選的EMBL數(shù)據(jù)庫)的命中是否指示真實(shí)相似性的顯著性閾值。例如，指定給多核普酸命中的0.1E值被解釋為是指，在EMBL數(shù)據(jù)庫大小的數(shù)據(jù)庫中，可能期望到看到在比對的序列部分的0.1匹配，僅僅隨機(jī)地具有類似評分。通過該標(biāo)準(zhǔn)，多核苷酸序列的比對的和匹配的部分則具有90%的概率是相同的。對于在比對的和匹配的部分具有0.01或更小的E值的序列，使用BLASTN或FASTA算法在EMBL數(shù)據(jù)庫中隨機(jī)發(fā)現(xiàn)匹配的概率是1°/?；蚋?。根據(jù)一個實(shí)施方案，"變體"多核苦酸，參考本發(fā)明的每個多核苷酸，優(yōu)選地包含具有與本發(fā)明的每個多核苷酸相同數(shù)目或比其更少的核酸、并且與本發(fā)明的多核苦酸比較時，生成0.01或更小的E值。也就是說，變體多核苷酸是具有至少99%概率與本發(fā)明多核苷酸相同的任意序列，使用設(shè)定為上述參數(shù)的BLASTN、FASTA或BLASTP算法測得具有0.01或更小的E值。或者，本發(fā)明的變體多核苷酸會在嚴(yán)格條件下與SEQIDNO:1,2，3，4，9，10，14，15，23，24,或25所述的多核苷酸序列或這些序列的互補(bǔ)序列、反向序列或反向互補(bǔ)序列雜交。本發(fā)明也包括不同于公開的序列的多核苷酸，但是作為遺傳密碼簡并的結(jié)果，其編碼與本發(fā)明的多核苷酸編碼的多肽相同的多肽。因而，作為保守取代的結(jié)果，本發(fā)明預(yù)見到且包括，包含不同于SEQIDNO:1，2,3,4，9，10，14,15，23，24，或25所述的多核苷酸序列或它們的互補(bǔ)序列、反向序列或反向互補(bǔ)序列的序列的多核苷酸。另外，作為缺失和/或插入總計小于10%總序列長度的結(jié)果，本發(fā)明也預(yù)見到且包括，包含不同于SEQIDNO:1，2，3，4，9，10，14，15,23,24，或25所述的多核苦酸序列或它們的互補(bǔ)序列、反向互補(bǔ)序列或反向序列的序列的多核苷酸。除了與本發(fā)明的多核苷酸序列具有指定的百分比同一性以外，變體多核苷酸優(yōu)選地具有與本發(fā)明的多核苷酸共有的其它結(jié)構(gòu)和/或功能特征。除了它們的一級結(jié)構(gòu)與本發(fā)明的多核苷酸具有高度的相似性以外，與本發(fā)明的多核苷酸具有指定程度的同一性或能與本發(fā)明的多核苷酸雜交的多核苷酸，優(yōu)選地具有至少一種下述特征(i)它們含有讀碼框或部分讀碼框，其編碼基本上具有與本發(fā)明的多核苷酸編碼的多肽相同的功能性質(zhì)的多肽；或(n)它們具有共同的結(jié)構(gòu)域。元件和DNA序列的來源本文所述的任意或所有元件和DM序列可以是一個或多個植物基因組內(nèi)源的。因此，在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方案中，為最終的轉(zhuǎn)運(yùn)盒選擇的所有元件和DNA序列都是待轉(zhuǎn)化的植物的基因組內(nèi)源的或天然的。例如，所有序列可以來自馬鈴薯基因組?；蛘?，一個或多個元件或DNA序列可以是與待轉(zhuǎn)化的植物物種不同的植物基因組內(nèi)源的，但是其可以在任意情況下在宿主植物細(xì)胞中起作用。這樣的植物包括馬鈴薯，番茄，和苜蓿植物。本發(fā)明也包括使用一個或多個來自與待轉(zhuǎn)化的植物互交可孕的植物的遺傳元件。在這點(diǎn)上，本發(fā)明的"植物"包括、但不限于，馬鈴薯，番茄，鱘梨，苜蓿，甜菜，木薯，甘薯，大豆，豌豆，菜豆，玉米，小麥，稻，大麥，和高梁。因而，植物可以是單子葉植物或雙子葉植物。"植物"和"植物材料"也包括植物細(xì)胞，種子，植物后代，繁殖體，無論是有性還是無性產(chǎn)生的，和它們中的任一種的子代，例如插條或種子。"植物材料"可以是指植物細(xì)胞，細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物，愈傷組織，胚，分生組織區(qū)域，愈傷組織，葉，根，芽，配子體，孢子體，花粉，種子，正在發(fā)芽的幼苗，和孩￡孢子。植物可以處于各種成熟階,殳，可以生長在液體或固體培養(yǎng)物中，或罐中的土壤或合適的培養(yǎng)基中、溫室或田地中。導(dǎo)入植物中的先導(dǎo)序列、尾隨序列或基因序列的表達(dá)可以是暫時的或永久的。在這方面，本發(fā)明的植物衍生的轉(zhuǎn)運(yùn)-DNA("P-DM")邊界序列的核苷酸序列不同于任意已知細(xì)菌-衍生的T-DNA邊界序列，但是它的功能用于基本上相同的目的。也就是說，P-DNA可以用于將一個多核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)和整合到另一個多核苷酸中?？梢詫-DNA插入腫瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒，例如替代常規(guī)T-DNA的來自農(nóng)桿菌的Ti-質(zhì)粒，并維持在細(xì)菌林中，正如常規(guī)轉(zhuǎn)化質(zhì)粒一樣?？梢圆倏vP-DNA，以便含有需要的多核苷酸，后者用于通過細(xì)菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化摻入植物基因組中。參見Rommens等人WO2003/069980,US-2003-0221213，US-2004-0107455，和WO2005/004585:它們都在本文中引作參考。因而，P-DNA邊界序列與來自農(nóng)桿菌物種(例如根癌農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌)的已知T-DM邊界序列相差1,2，3，4，5,6，7，8，9，10，11,12，13,14，15,16,17,18,19，20，或更多個核苷酸。P-DNA邊界序列的核苷酸序列與農(nóng)桿菌T-DNA邊界序列的相似性不大于99%、98%、97°/"96°/。、95°/。、94%、93°/。、92°/"91%、90°/"89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、8"/"80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、70%、69%、68%、67%、66%、65%、64%、63%、62%、6"/"60%、59%、58%、57%、56%、55°/"54%、53%、52%、51%或50%。開發(fā)了鑒別和分離來自植物(尤其是馬鈴薯和小麥)的轉(zhuǎn)運(yùn)DM的方法，和使用在本文中引作參考的US-2004-0107455中所述的邊界基序共有序列。在這方面，本發(fā)明的植物衍生的DNA、例如任一種本文公開的序列、切割位點(diǎn)、區(qū)域或元件是功能性的，如果它能促進(jìn)它所連接的多核苷酸向另一個核酸分子(例如植物染色體)中的轉(zhuǎn)運(yùn)和整合，轉(zhuǎn)化頻率是約99%、約98%、約97%、約96%、約95%、約94%、約93%、約92%、約91%、約90%、約89°/。、約88%、約87%、約86%、約85%、約84%、約83%、約82%、約81%、約80%、約79%、約78%、約77%、約76%、約75%、約74%、約73°/。、約72%、約71%、約70%、約69%、約68%、約67%、約66%、約65%、約64%、約63%、約62%、約61%、約60°/。、約59%、約58%、約57%、約56%、約55%、約54%、約53%、約52%、約51%、約50%、約49%、約48°/。、約47%、約46%、約45%、約44%、約43%、約42%、約41%、約40°/。、約39%、約38%、約37%、約36%、約35%、約34%、約33%、約32%、約31%、約30%、約29%、約28%、約27%、約26%、約25%、約24%、約23%、約22%、約21%、約20%、約15°/。，或約5%或至少約l°/。?？梢孕揎椈蛲蛔?nèi)我环N這樣的轉(zhuǎn)化相關(guān)的序列和元件，以改變轉(zhuǎn)化效率?？梢詫⑵渌嗪塑账嵝蛄刑砑拥奖景l(fā)明的轉(zhuǎn)化序列上。例如，可以修飾它以具有5，-和3，-多克隆位點(diǎn)或其它限制位點(diǎn)。例如，可以修飾本文公開的切割位點(diǎn)的序列，以增加來自附隨載體的主鏈DNA不整合到植物基因組中的概率。可以將任意的需要的多核苷酸插入本文所述的任意切割或邊界序列之間。例如，需要的多核苷酸可以是植物物種天然的野生型或修飾的基因，或它可以是來自非植物基因組的基因。例如，當(dāng)轉(zhuǎn)化馬鈴薯植物時，可以制備包含可操作地連接到目標(biāo)馬鈴薯基因或其片段上的馬鈴薯特異性啟動子和馬鈴薯特異性終止子的表達(dá)盒。表達(dá)盒可以含有其它馬鈴薯遺傳元件，例如與基因的5，-末端符合讀碼框地融合的信號肽序列，和馬鈴薯轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子。本發(fā)明不限于這樣的排列，可以構(gòu)建轉(zhuǎn)化盒，使得需要的多核苷酸盡管可操作地連接到啟動子上，但不會可操作地連接到終止子序列上。當(dāng)從植物鑒定和分離轉(zhuǎn)化-相關(guān)的序列或元件(例如本文所述的那些)時，且如果該序列或元件隨后用于轉(zhuǎn)化相同物種的植物，該序列或元件可以描述為所述植物基因組"天然的"。因而，"天然的"遺傳元件是指天然存在于、源自或?qū)儆诖D(zhuǎn)化植物的基因組的核酸。以相同的脈絡(luò)，術(shù)語"內(nèi)源"也可以用于鑒別植物"天然的"特定核酸，例如，DNA或RNA,或蛋白。內(nèi)源是指起源自該生物體的元件。因而，從待轉(zhuǎn)化的植物或植物物種的基因組分離的、或從的核酸、基因、多核苷酸、DNA、RNA、mMA或cDNA分子，對于所述植物物種是"天然的"，即天生的。換而言之，天然的遺傳元件代表植物育種者可用于通過經(jīng)典植物培育來改良植物的所有遺傳物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，天然核酸的任意變體也視作"天然的"。在這方面，"天然"核酸也可以分離自植物或其性別相容的物種，并經(jīng)修飾或突變，使得得到的變體的核苷酸序列與從植物分離的未修飾的天然核酸的相似性大于或等于99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、8"/"80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、70%、69%、68%、67%、66%、65%、64%、63%、62%、61%,或60%。天然核酸變體的核苷酸序列的相似性也可以小于約60%、小于約55%或小于約50%。從植物分離的"天然"核酸也可以編碼從該核酸轉(zhuǎn)錄和翻譯的天然存在的蛋白產(chǎn)物的變體。因而，天然核酸可以編碼這樣的蛋白，它與在分離核酸的植物中表達(dá)的未修飾的天然蛋白的氨基酸序列的相似性大于或等于99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85°/"84%、83%、82%、81%、80°/"79%、78%、77%、76°/。、75%、74%、73%、72%、71%、70°/"69%、68%、67%、66°/"65%、64%、63%、62%、61%,或60%。啟動子本發(fā)明的多核苷酸可以用于特異性地指導(dǎo)多肽或蛋白在植物組織中的表達(dá)。本發(fā)明的核酸也可以用于特異性地指導(dǎo)反義RNA或參與RNA干擾(RNAi)的RNA例如小干擾RM(siRNA)在植物組織中的表達(dá)，其可以用于抑制或完全阻斷靶基因的表達(dá)。如本文使用的，"編碼產(chǎn)物"是指可操作地連接到啟動子上的核酸的最終產(chǎn)物。例如，蛋白或多肽是編碼產(chǎn)物，以及反義RNA或siRNA,它是編碼反義RNA的核酸的最終產(chǎn)物。編碼產(chǎn)物也可以是未翻譯的mRNA。術(shù)語多肽和蛋白在本文中可互換地使用。如本文所使用的，啟動子是指核酸，優(yōu)選結(jié)合RNA聚合酶和/或其它轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件的DNA。象任意的啟動子一樣，本發(fā)明的啟動子會促進(jìn)或控制DNA或RNA的轉(zhuǎn)錄，以從可4喿作地連接到啟動子上的核酸分子產(chǎn)生mRNA分子。RNA可以編碼蛋白或多肽，或可以編碼RNA干擾或反義分子。如本文使用的，"可操作地連接到"是指DNA的化學(xué)融合、連接或合成，使得啟動子-核酸序列組合以適合將所述核酸序列轉(zhuǎn)錄成RNA區(qū)段的方向形成。本發(fā)明的啟動子也可以含有得到的mRNA轉(zhuǎn)錄物的一些或所有5'非翻譯區(qū)(5'UTR)。另一方面，本發(fā)明的啟動子不一定需要具有任何5'UTR。本文使用的啟動子也可以包括調(diào)節(jié)元件。相反地，調(diào)節(jié)元件也可以與啟動子分開。調(diào)節(jié)元件會將許多重要特征賦予給啟動子區(qū)域。有些元件會結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，后者增強(qiáng)可操作地連接的核酸的轉(zhuǎn)錄速率。其它元件會結(jié)合抑制轉(zhuǎn)錄活性的阻抑物。轉(zhuǎn)錄因子對啟動子活性的影響，可能決定啟動子活性是高還是低，即所述啟動子是"強(qiáng)"還是"弱"。在另一個實(shí)施方案中，組成型啟動子可以用于表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸序列。在另一個實(shí)施方案中，許多誘導(dǎo)型植物基因啟動子可以用于表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸序列。誘導(dǎo)型啟動子會調(diào)節(jié)反應(yīng)于環(huán)境、激素或化學(xué)信號的基因表達(dá)。激素誘導(dǎo)型啟動子的實(shí)例包括植物生長素誘導(dǎo)型啟動子(Ba畫nn等人,PlantCell11:323-334(1999))，細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)型啟動子(Guevara-GarciaPlantMol.Biol,38:743-753(1998))，和赤霉素反應(yīng)性性啟動子(Shi等人，PlantMol.Biol,38:1053-1060(1998))。另外，反應(yīng)于熱、光、創(chuàng)傷、病原體抗性和化學(xué)物質(zhì)(例如茉莉酮酸曱酯或水楊酸)的啟動子，可以用于表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸序列。在一個實(shí)施方案中，所述啟動子是顆粒結(jié)合的淀粉合酶啟動子，馬鈴薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因啟動子，或類黃酮3'-單加氧酶基因啟動子。在另一個實(shí)施方案中，所述啟動子是種子特異性啟動子。本發(fā)明也包括不同于公開的序列的多核苷酸，但是作為遺傳密碼簡并的結(jié)果，其編碼與本發(fā)明的多核苷酸編碼的多肽相同的多肽。因而，作為保守取代的結(jié)果，本發(fā)明預(yù)見到且包括，包含不同于SEQIDNO:1，2，3,4，9，10,14，15，23，24，或25所述的多核苷酸序列或它們的互補(bǔ)序列、反向序列或反向互補(bǔ)序列的序列的多核苷酸。另外，作為缺失和/或插入總計小于10%總序列長度的結(jié)果，本發(fā)明也預(yù)見到且包括，包含不同于SEQIDNO:1，2，3，4,9，10，14，15,23，24,或25所述的多核苷酸序列或它們的互補(bǔ)序列、反向互補(bǔ)序列或反向序列的序列的多核普酸。除了與本發(fā)明的多核苷酸序列具有指定的百分比同一性以外，變體多核苷酸優(yōu)選地具有與本發(fā)明的多核苷酸共有的其它結(jié)構(gòu)和/或功能特征。除了它們的一級結(jié)構(gòu)與本發(fā)明的多核苷酸具有高度的相似性以外，與本發(fā)明的多核苷酸具有指定程度的同一性或能與本發(fā)明的多核苷酸雜交的多核苷酸，優(yōu)選地具有至少一種下述特征(i)它們含有讀碼框或部分讀碼框，其編碼基本上具有與本發(fā)明的多核苷酸編碼的多肽相同的功能性質(zhì)的多肽；或(ii)它們具有共同的結(jié)構(gòu)域。元件和DNA序列的來源本文所述的任意或所有元件和DNA序列可以是一個或多個植物基因組內(nèi)源的。因此，在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方案中，為最終的轉(zhuǎn)運(yùn)盒選擇的所有元件和DNA序列都是待轉(zhuǎn)化的植物的基因組內(nèi)源的或天然的。例如，所有序列可以來自馬鈴薯基因組?；蛘?，一個或多個元件或DNA在任i情況;在宿主植物細(xì)胞中起:用。這』的植物括馬鈴薯，^癡，和苜蓿植物。本發(fā)明也包括使用一個或多個來自與待轉(zhuǎn)化的植物互交可孕的植物的遺傳元件。在這點(diǎn)上，本發(fā)明的"植物"包括、但不限于，馬鈴薯，番茄，鱘梨，苜蓿，甜菜，木薯，甘薯，大豆，豌豆，菜豆，玉米，小麥，稻，大麥，和高梁。因而，植物可以是單子葉植物或雙子葉植物。"植物"和"植物材料，，也包括植物細(xì)胞，種子，植物后代，繁殖體，無論是有性還是無性產(chǎn)生的，和它們中的任一種的子代，例如插條或種子。"植物材料"可以是指植物細(xì)胞，細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物，愈傷組織，胚，分生組織區(qū)域，愈傷組織，葉，根，芽，配子體，孢子體，花粉，種子，正在發(fā)芽的幼苗，和微孢子。植物可以處于各種成熟階段，可以生長在液體或固體培養(yǎng)物中，或罐中的土壤或合適的培養(yǎng)基中、溫室或田地中。導(dǎo)入植物中的先導(dǎo)序列、尾隨序列或基因序列的表達(dá)可以是暫時的或永久的。核酸構(gòu)建體本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的分離的核酸分子和多肽序列的構(gòu)建體。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的DNA構(gòu)建體是源自農(nóng)桿菌的Ti-質(zhì)粒。在開發(fā)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體中，構(gòu)建體或其片段的各種組分通常插入方便的克隆載體中，例如，能在細(xì)菌宿主如大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒。存在許多已經(jīng)在文獻(xiàn)中描述的載體，其中的許多是可商業(yè)得到的。每次克隆后，可以分離含有需要的插入片段的克隆載體，并進(jìn)行其它操作，例如限制消化，插入新的片段或核香酸，連接，缺失，突變，切除，等，以改變需要的序列的組分。完成構(gòu)建體后，然后可以根據(jù)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的方式，將它轉(zhuǎn)移至用于其它操作的適當(dāng)載體中。本發(fā)明的重組DNA分子通常包括選擇標(biāo)記，以便可以從未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中鑒定和選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。這樣的標(biāo)記的實(shí)例包括、但不限于，新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(nptll)基因(Potrykus等人，Mol.Gen.基因t.199:183-188(1985)),它賦予卡那霉素抗性。使用適當(dāng)?shù)目股乩缈敲顾鼗騁418,可以選擇表達(dá)叩tll基因的細(xì)胞。其它常用的選擇標(biāo)記包括bar基因，它賦予雙丙氨磷抗性；突變的EPSP合酶基因(Hinchee等人，Bio/Tech加logy6:915-922(1988))，它賦予草甘膦抗性；和突變的乙酰乳酸合酶基因(ALS)，它賦予咪唑啉酮或^黃酰脲抗性(歐洲專利申請154,204，1985)。另外，載體可以包括特定宿主細(xì)胞的復(fù)制起點(diǎn)(復(fù)制子)。各種原核復(fù)制子是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，并起指導(dǎo)重組分子在原核宿主細(xì)胞中的自主復(fù)制和維持的作用。本發(fā)明也提供了包含本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。如本文使用的，宿主細(xì)胞指最終在其中表達(dá)編碼產(chǎn)物的細(xì)胞。因此，宿主細(xì)胞可以是單個細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物或作為生物體的一部分的細(xì)胞。宿主細(xì)胞也可以是胚、胚乳、精子或卵細(xì)胞，或受精卵的一部分。因此，本發(fā)明也提供了植物或植物細(xì)胞，其包含本發(fā)明的DM構(gòu)建體。優(yōu)選地，所述植物是被子植物或棵子植物。本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體可以用于轉(zhuǎn)化許多植物，包括單子葉植物(例如小麥，草地草，玉米，稻，燕麥，小麥，大麥，高梁，蘭花，鳶尾，百合，洋蔥，香蕉，甘蔗，和棕櫚)，雙子葉植物(例如，擬南芥，馬鈴薯，煙草，番茄，鱷梨，胡椒，甜菜，綠花椰菜，木薯，甘薯，棉花，猩猩木，豆類，苜蓿，大豆，豌豆，菜豆，黃瓜，葡萄，蕓苔，胡蘿卜，草莓，萵苣，橡樹，楓樹，胡桃，玫瑰，薄荷，南瓜，雛菊，和仙人掌，橡樹，桉樹，楓樹)，和棵子植物(例如，蘇格蘭松；參見A濯en，F(xiàn)innishForestRes.Papers,Vol.595，1996)，白云杉(Ellis等人，Biotechnology11:84-89，1993)，和落葉松(Huang等人，InVitroCell27:201-207,1991)。植物轉(zhuǎn)化和再生通過本領(lǐng)域已知的將重組序列導(dǎo)入耙宿主細(xì)胞中的標(biāo)準(zhǔn)操作，可以將本發(fā)明的多核苷酸和多肽導(dǎo)入宿主植物細(xì)胞中。這些操作包括、但不限于，轉(zhuǎn)染，感染，轉(zhuǎn)化，天然攝入，電穿孔，生物射彈和農(nóng)桿菌。將外源基因?qū)胫参镏械姆椒ㄊ潜绢I(lǐng)域已知的，且可以用于將本發(fā)明的構(gòu)建體插入植物宿主中，包括，生物和物理植物轉(zhuǎn)化方法。參見，例如，Miki等人，1993，"ProcedureforIntroducingForeignDNAintoPlants",見MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology,Glick和Thompson,編.，CRCPress,Inc.，BocaRaton,第67-88頁。選擇的方法可以隨宿主植物而變化，包括化學(xué)轉(zhuǎn)染方法例如磷酸釣，微生物介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移例如農(nóng)桿菌(Horsch等人，Science227:1229-31，1985)電穿孔，顯微注射，和生物射彈。優(yōu)選的轉(zhuǎn)化方法包括精確育種(參見美國專利申請2003/0221213Al，2004/0107455Al，和2005/0229267Al)和精制轉(zhuǎn)化(參見美國專利申請2005/0034188Al)。因此，本發(fā)明也提供了植物或植物細(xì)胞，其包含本發(fā)明的多核香酸或多肽。在一個實(shí)施方案中，所述植物是被子植物或棵子植物。超出植物的普通含義，術(shù)語"植物"也意在指植物的果實(shí)、種子、花、球花等。本發(fā)明的植物可以是直接轉(zhuǎn)染的，這是指將載體直接導(dǎo)入植物中，例如通過農(nóng)桿菌，或所述植物可以是轉(zhuǎn)染的植物的后代。后代也可以通過轉(zhuǎn)染的植物的無性繁殖來得到。第二代或后代植物可以通過或不通過有性生殖(即受精)來生成。此外，所述植物可以是配子體(單倍體階段)或孢子體(二倍體階段)。在這點(diǎn)上，本發(fā)明考慮用一個或多個遺傳上源自植物的轉(zhuǎn)化元件轉(zhuǎn)化植物。本發(fā)明考慮轉(zhuǎn)化的"全天然"方案，由此僅植物的天然轉(zhuǎn)化元件通過轉(zhuǎn)化最終整合到目標(biāo)植物中。在這方面，本發(fā)明包括僅用植物物種天然的遺傳轉(zhuǎn)化元件轉(zhuǎn)化特定植物物種。天然方案也可以指，特定轉(zhuǎn)化元件分離自同一待轉(zhuǎn)化的植物、同一植物物種或與待轉(zhuǎn)化的植物在性別上互交可孕的植物。另一方面，所述待轉(zhuǎn)化的植物可以用轉(zhuǎn)化盒轉(zhuǎn)化，所述轉(zhuǎn)化盒含有一個或多個源自不同物種植物的遺傳元件和序列?？赡芟Ｍ褂美缜懈钗稽c(diǎn)，它在用于轉(zhuǎn)化番茄或胡椒植物的轉(zhuǎn)化盒或質(zhì)粒中是馬鈴薯基因組天然的。但是，本發(fā)明不限于，天然的或全天然的方案。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化盒或質(zhì)粒也可以包含來自其它生物體的序列和元件，例如來自細(xì)菌物種。下面的實(shí)施例作為本發(fā)明的特定的和優(yōu)選的實(shí)施方案的代表來予以解，、可以作2許多變化和;奮改，、同時:然I本發(fā)明的精神和范圍:。^實(shí)施例實(shí)施例1天冬酰胺合成酶基因的下調(diào)的表達(dá)本實(shí)施例證實(shí)，參與作物淀粉組織中天冬酰胺生物合成的基因的下調(diào)的表達(dá)，會降低這些淀粉組織中天冬酰胺的量，從而降低加熱這些淀粉組織得到的食品中丙烯酰胺的量。在SEQIDNO:1中顯示了馬鈴薯天冬酰胺合成酶-1(Astl)基因的序列。在SEQIDNO:2中顯示了馬鈴薯天冬酰胺合成酶-2(Ast2)基因的部分序列。連接SEQIDNO:3和4所示的這些基因的片段，以建立SEQIDN0:5。作為反向重復(fù)序列并被SEQIDNO:6所示的間隔區(qū)隔開，將得到的DNA區(qū)段的2個拷貝插入ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(Agp)和顆粒結(jié)合的淀粉合酶(Gbss)基因(分別是SEQIDNO:7和8)的趨同定向的啟動子之間。將得到的沉默構(gòu)建體插入已經(jīng)含有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(nptll)選擇標(biāo)記基因的表達(dá)盒的T-DNA邊界之間。如下將命名為pSIMl148的含有該T-DM的二元載體(圖1A)導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404。在有1jug載體DNA存在下，在水上溫育感受態(tài)LB4404細(xì)胞(50|uL)5min,在液氮中冷凍約15s，在37。C溫育5min。力口入1mL的培養(yǎng)液后，在28。C培養(yǎng)細(xì)胞3h,鋪板到含有鏈霉素(IOOmg/L)和卡那霉素(100mg/L)的培養(yǎng)液/瓊脂上。然后從單個LBA"04菌落的過夜培養(yǎng)物分離載體DNA,并通過限制分析進(jìn)行檢查，以證實(shí)完整質(zhì)粒DNA的存在。通過使10倍稀釋的過夜生長的農(nóng)桿菌培養(yǎng)物生長5-6小時，在2，800RPM沉淀15分鐘，用添加了蔗糖(3%,pH5.7)的MS液體培養(yǎng)基(Phytotechnology)洗滌，重新懸浮在相同培養(yǎng)基中直到OD國nm為0.2?；旌现匦聭腋〉募?xì)胞，用于感染馬鈴薯品種"RangerRusset"的0.4-0.6mm結(jié)間區(qū)l殳。感染的莖在含6g/L瓊脂的共培養(yǎng)培養(yǎng)基(1/10MS鹽，3%蔗糖，pH5.7)上在Percival生長室(16小時光照)中25。C培養(yǎng)2天，隨后轉(zhuǎn)移到含特美汀(150mg/L)和卡那霉素(100mg/L)的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(CIM，添加了3%蔗糖3、2.5mg/L玉米素核苷、0.1mg/L萘乙酸和6g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基)上。在CIM上培養(yǎng)1個月后，將外植體轉(zhuǎn)移至含有特美汀和卡那霉素(分別是150和100mg/L)的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(SIM，添加了3%蔗糖、2.5mg/L玉米素核苷、0.3mg/L赤霉酸GA3和6g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基)，直到發(fā)芽。將在再生期末期發(fā)出的芽轉(zhuǎn)移至含有3%蔗糖、6g/L瓊脂和特美汀(150mg/L)的MS培養(yǎng)基。將轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)移至土壤，置于溫室中。3個月后，收獲塊莖，根據(jù)OfficialMethodsofAnalysisofAOACINTERNATIONAL(2002)，第17版，AOACINTERNATIONAL,Gaithersburg，MD，USAOfficialMethod982,30,分析天冬酰胺水平。該分析i正實(shí)，26林pSIM1148植物中的17林僅含有對照植物中存在的約25%-50%的天冬酰胺(表1)。將來自一些低天冬酰胺植物的塊莖切片，漂白，平常油煎(par-fried),并精制油煎，生產(chǎn)炸薯條。將這些炸薯條在液氮中粉碎成細(xì)粉，在干水上運(yùn)送到Covance實(shí)纟全室。在Covance,通過進(jìn)行液相色譜/質(zhì)譜/質(zhì)譜(LC/MS/MS)(美國食品和藥品管理局，植物以及乳制品和飲料的食品安全中心和應(yīng)用營養(yǎng)辦公室，"食品中丙烯酰胺的檢測和定量"，2002),測定丙烯酰胺水平。表2證實(shí)，來自低天冬酰胺pSIM48植物的薯條積累的丙烯酰胺少于在對照薯條中生成的丙烯酰胺的約1/3。作為使用Agp和Gbss啟動子作為調(diào)節(jié)元件的一個替代方案，也可以使用2個Gbss啟動子。將含有反向重復(fù)序列的構(gòu)建體導(dǎo)入T-DNA邊界之間，以生成二元載體pSIM1151，所述反向重復(fù)序列包含插入2個Gbss啟動子之間的Astl和Ast2基因片段(圖1B)。該載體用于以與關(guān)于pSIM1148所述類似的方式生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯系。此外，Ast基因-衍生的序列可以插入啟動子和終止子之間。對于任意的Ast基因，可能存在具有高度序列相似性的其它序列?？梢允褂眠@樣的同源序列來生產(chǎn)沉默構(gòu)建體。例如，番茄Ast基因的片段可以用于沉默馬鈴薯中的同源Ast基因。鑒定植物衍生的Ast基因之后，為該基因的PCR-擴(kuò)增設(shè)計基因特異性的引物。根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將PCR擴(kuò)增的天冬酰胺酶基因克隆進(jìn)克隆載體中?？梢酝ㄟ^檢索數(shù)據(jù)庫來識別Ast基因，或從植物DNA分離。來自馬鈴薯以外的作物的Ast基因的一個實(shí)例是SEQIDNO:34和35所示的來自小麥的Ast基因。同時沉默小麥谷粒中的這些基因，可以降低面粉中的天冬酰胺水平，從而降低例如面包、餅干、小甜餅或薄脆餅中的丙烯酰胺水平。除了使用Ast基因片段來生產(chǎn)沉默構(gòu)建體以外，也可以使用從Ast基因的啟動子得到的片段。通過使用反向PCR等方法，可以分離這樣的啟動子，然后可以將特定150-600個堿基對的啟動子片段的2個拷貝作為反向重復(fù)序列插入啟動子和終止子之間，或2個趨同方向的啟動子之間(參見Rommens等人，世界專利申請2006/036739A2，它在本文中引作參考)。實(shí)施例2天冬酰胺酶基因的超量表達(dá)本實(shí)施例證實(shí)，參與作物淀粉組織中天冬酰胺代謝的基因的超量表達(dá)，會降低這些淀粉組織中天冬酰胺的量，從而降低加熱這些淀粉組織得到的食物中丙烯酰胺的量。在SEQIDNO:9中顯示了來自馬鈴薯品種RangerRusset的馬鈴薯天冬酰胺酶(Asgl)基因的序列。分別在SEQIDNO:lO和ll中顯示了對應(yīng)的讀碼框和預(yù)測的氨基酸序列。含有插入在Agp啟動子和Ubi3終止子之間的Asgl基因的二元載體(SEQIDNO:12)命名為pSIM658(圖1C)。通過應(yīng)用定量實(shí)時反轉(zhuǎn)錄酶PCR,測定塊莖中Asgl基因的表達(dá)水平。表3證實(shí)，25株pSIM658植物中的18株的塊莖超量表達(dá)Asgl基因約2至20倍。這些塊莖用于生產(chǎn)炸薯條。化學(xué)分析證實(shí)，2個轉(zhuǎn)基因系的炸薯條含有降低水平的丙烯酰胺(表4)。也可以使用其它塊莖特異性啟動子來驅(qū)動Asgl基因的表達(dá)。質(zhì)粒pSIM757含有可操作地連接到Asgl基因上的Gbss啟動子。用該質(zhì)粒的轉(zhuǎn)運(yùn)DNA轉(zhuǎn)化馬鈴薯，會生成卡那霉素抗性的、超量表達(dá)Asgl基因的植物?？梢杂糜隍?qū)動馬鈴薯塊莖中的天冬酰胺酶表達(dá)的其它啟動子，可以選自馬鈴薯塊莖特異性蛋白啟動子，冷誘導(dǎo)型啟動子，和類黃酮化合物-3'-單加氧酶(Fmo)啟動子。一個Fmo啟動子如SEQIDNO:13所示。該啟動子在半成熟的和成熟的塊莖中是有活性的，但是在小塊莖中是無活性的。除了使用Asgl以外，也可以采用其它天冬酰胺酶基因。SEQIDNO:14顯示了替代性馬鈴薯天冬酰胺酶Asg2基因的cDNA序列。天冬酰胺酶基因的其它實(shí)例包括大腸桿菌(登記號Z1051m;SEQIDNO:31)、農(nóng)桿菌(登記號Atu3044;SEQIDNO:32)、大麥(登記號AF308474;SEQIDNO:33)的天冬酰胺酶基因，和編碼具有基序pfam01112.12的蛋白的任意基因(Marchler—Bauer等人，NucleicAcidsRes33，D192—6，2005)。在SEQIDNO:15中顯示了小麥的天冬酰胺酶基因的序列。在SEQIDNO:16中描述了預(yù)測的氨基酸序列。對于任意的天冬酰胺酶基因，可能存在具有高度序列相似性的其它天冬酰胺酶序列。例如，通過檢索數(shù)據(jù)庫，例如由NCBI維護(hù)的那些，可以鑒別植物衍生的天冬酰胺酶基因。鑒別植物衍生的天冬酰胺酶基因之后，為天冬酰胺酶基因的PCR-擴(kuò)增設(shè)計基因特異性的引物。根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將PCR擴(kuò)增的天冬酰胺酶基因克隆進(jìn)克隆載體中。將天冬酰胺酶可操作地連接到種子特異性的啟動子上，例如SEQIDNO:17所述的小麥嘌呤二氬。引哚(puroindoline)基因啟動子。使用生產(chǎn)低天冬酰胺小麥的常規(guī)轉(zhuǎn)化方法，導(dǎo)入包含得到的表達(dá)盒的轉(zhuǎn)運(yùn)DNA。從小麥種子得到的面粉會在加熱過程中積累更少的丙烯酰胺。實(shí)施例3谷氨酰胺合成酶的超量表達(dá)谷氨酰胺合成酶基因的超量表達(dá)會導(dǎo)致降低水平的天冬酰胺?？梢詫⒕幋a具有谷氨酰胺合成酶活性的蛋白的任意序列可操作地連接到在目標(biāo)植物器官(例如馬鈴薯塊莖)中表達(dá)的啟動子上。馬鈴薯含有3個相關(guān)的谷氨酰胺合成酶基因，如SEQIDNO.:28-30所示。包含每個這樣的基因的一個片段的MA區(qū)段可以用于有效地下調(diào)谷氨酰胺合成酶活性。為此目的，可以將該區(qū)段的至少一個拷貝插入2個趨同啟動子之間，或啟動子和終止子之間。使用任意的轉(zhuǎn)化方法，可以將得到的表達(dá)盒導(dǎo)入目標(biāo)植物。然后可以選擇生產(chǎn)低天冬酰胺植物器官的轉(zhuǎn)基因植物。這些植物器官的熱加工會提供含有比從對應(yīng)器官得到的產(chǎn)品更低的丙烯酰胺的產(chǎn)物。例如，加工過的轉(zhuǎn)基因塊莖會產(chǎn)生這樣的炸薯條，其含有比從未轉(zhuǎn)化的塊莖得到的炸薯條更低的丙烯酰胺水平。Harrison和合作者(PlantPhysiology133:252-262，2003)已經(jīng)描述了谷氨酰胺合成酶超量表達(dá)對天冬酰胺水平的影響。但是，這些作者沒有預(yù)見到降低的天冬酰胺水平對強(qiáng)烈減少的熱誘導(dǎo)的丙烯酰胺積累的影響。類似地，可以下調(diào)顯示出硝酸還原酶活性的內(nèi)源基因的表達(dá)。為此目的，可以表達(dá)該基因的一部分或硝酸還原酶基因的啟動子的至少一個拷貝。可以篩選轉(zhuǎn)基因植物的硝酸還原酶基因表達(dá)水平，然后可以篩選表現(xiàn)出降低水平的系的降低的天冬酰胺水平。也可以沉默己糖激酶基因并增加天冬氨酸水平，同時降低天冬酰胺水平。以前已經(jīng)描述了硝酸還原酶和己糖激酶基因的超量表達(dá)與增加的天冬酰胺水平之間的關(guān)聯(lián)(Roland等人，A廳RevPlantBiol57:675-709,2006;Szopa,BiochemSocTrans30:405-410，2002)。但是，作者沒有預(yù)見到最終降低食物中的丙烯酰胺水平的相應(yīng)方案。的表達(dá)「修飾植物中的天冬酰i水平4i它i略f我們的i果暗示i,、任一種這樣的方法都可以用于生產(chǎn)低丙烯酰胺食物。實(shí)施例4同時下調(diào)淀粉降解和天冬酰胺生物合成基因的表達(dá)本實(shí)施例證實(shí)，同時下調(diào)分別參與作物淀粉組織的淀粉降解和天冬酰胺生物合成基因的表達(dá)，可以降低加熱這些淀粉組織得到的食物中的丙烯酰胺積累。分2步制備轉(zhuǎn)基因植物，其生產(chǎn)具有低水平的還原糖和天冬酰胺的塊莖。首先，用二元載體pSIM371的P-DNA轉(zhuǎn)化植物。該P(yáng)-DNA含有包含PPO(SEQIDNO:18)、Rl(SEQIDNO:19)和phL(SEQIDNO:20)基因的片段的多核苷酸的2個拷貝，其作為反向重復(fù)序列插入Gbss啟動子和Ubi3終止子之間。使用攜帶pSIM371和LifeSupport載體pSIM368的農(nóng)桿菌抹(它含有插入在T-DNA邊界之間的nptll和codA基因的表達(dá)盒)來感染21，900個馬鈴薯莖外植體。2天共培養(yǎng)階段后，將感染的外植體暴露于卡那霉素5天，以選擇瞬時叩tll基因表達(dá)。為了預(yù)防含有穩(wěn)定整合的T-DNA的細(xì)胞的增殖，隨后將外植體轉(zhuǎn)移至含有5-氟胞嘧啶(5FC)的培養(yǎng)基中。codA基因產(chǎn)物會將該化合物轉(zhuǎn)化成無毒的5-氟尿嘧啶(5FU)(Perera等人，1993)。對雙重選擇后存活的共3,822個芽進(jìn)行基因型分析，分析P-DNA的存在和來自T-DNA或質(zhì)粒主鏈的任意外源DNA的缺失。該分析鑒定出256個能生根的全天然DNA(基因內(nèi)的)芽，種入土壤中，在生長室中生長6周。為了篩選PP0活性，將兒茶酚溶液移液到收獲的約2-cM小塊莖的切口表面上。在溫室中培養(yǎng)在兒茶酚誘導(dǎo)的塊莖褐變中抑制的48個系3個月，以生產(chǎn)半成熟的塊莖，用于生化分析剩余的PP0活性水平。該分析證實(shí)，PPO基因沉默構(gòu)建體的應(yīng)用使PPO活性降低了約90%。隨后繁殖48個基因內(nèi)系和未轉(zhuǎn)化的RangerRusset和RussetBurbank對照植物，并在愛達(dá)荷州阿柏丁(Idaho,Aberdeen)的田地中生長。在冷藏3和6個月后，分析所有基因內(nèi)系和對照系的成熟塊莖的葡萄糖水平。大多數(shù)系(43)表現(xiàn)出比已經(jīng)沉默了僅一個淀粉相關(guān)基因的對照系更大的冷誘導(dǎo)的甜化減少(約60%)。源自植物371-28和371-38的沉默塊莖的炸薯條含有的神經(jīng)毒素丙烯酰胺少于在對照油炸食品中積累的1/3(表4)?？梢缘臏p少在預(yù)料之中，因為丙烯酰胺主要源自熱誘導(dǎo)的還原糖羰基和天冬酰胺之間的反應(yīng)(Mottram等人，2002;Stadler等人，2002)。由8位專業(yè)訓(xùn)練的個體組評價改良的炸薯條的感官特征。源自修飾的RangerRusset塊莖的炸菩條表3見出比來自RangerRusset或RussetBurbank的炸薯條更好的視覺外觀。此外，基因內(nèi)的炸薯條表現(xiàn)出明顯更好的總香氣，這可以通過位于鼻腔頂部的嗅覺上皮感知。對于已經(jīng)在4°C儲存10周的塊莖，觀察到了類似的趨勢。實(shí)際上，冷藏的基因內(nèi)系371-28，30，38，和68仍然滿足或超過了新鮮的未轉(zhuǎn)化的品種的感官特征。用pSIM1148再次轉(zhuǎn)化一種低糖馬鈴薯系。與來自原始pSIM1148植物的炸薯條相比，來自卡那霉素抗性的雙重轉(zhuǎn)化體的炸薯條通常表現(xiàn)出進(jìn)一步降低的丙烯酰胺水平。因而，該雙重轉(zhuǎn)化體會生成可以用于得到炸薯條的塊莖，所述食品(i)含有降低水平的丙烯酰胺，且(ii)表現(xiàn)出增強(qiáng)的感官特征。實(shí)施例5降低馬鈴薯塊莖中的天冬酰胺水平和冷誘導(dǎo)的甜化的全天然DNA轉(zhuǎn)化方法本實(shí)施例描述了使用全天然DNA轉(zhuǎn)化方法來降低馬鈴薯塊莖中的天冬酰胺水平和冷誘導(dǎo)的甜化。從這些塊莖得到的加工食品含有降低水平的丙烯酰胺。用于轉(zhuǎn)化的含有插入馬鈴薯-衍生的邊界區(qū)域之間的2個表達(dá)盒的轉(zhuǎn)運(yùn)DM如SEQIDNO:23所示(圖2)。第一表達(dá)盒包含含有Ppo(SEQIDNO:24)、PhL(SEQIDNO:25)和R1(SEQIDNO:26)基因的啟動子片段的DNA區(qū)段的2個拷貝，其作為反向重復(fù)序列插入Agp基因的功能活性啟動子和泛素-3基因的終止子之間。第二表達(dá)盒包含含有Astl、Ast2和Ppo(SEQIDNO:27)基因的片段的DNA區(qū)段的2個拷貝，其作為反向重復(fù)序列插入Gbss基因的2個功能活性的和趨同方向的啟動子之間。將含有轉(zhuǎn)運(yùn)DM和農(nóng)桿菌異戊烯基轉(zhuǎn)移酶(ipt)基因的表達(dá)盒的質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404，使用無標(biāo)記的轉(zhuǎn)化方法(參見CraigRichael，"generationofmarker-freeandbackbone-freetransgenicplantsusingasinglebinaryapproach,臨時專利申i青60/765,177，它在本文中引作參考)，將得到的菌抹用于轉(zhuǎn)化馬鈴薯品種，例如RangerRusset和Atlantic。使沒有表現(xiàn)出細(xì)胞因子表型(特征是矮化的生長和不能生根)的轉(zhuǎn)化過的植物生成塊莖。有些系的塊莖會表現(xiàn)出低水平的Ppo酶活性，這可以通過將0.5mL的50mM兒茶酚移液到新鮮切口的塊莖表面上來測試。通過在50mM3-(N-嗎啉代)丙石黃酸緩沖液pH6.5(5mL)中混合粉末狀的塊莖(1g)，可以更精確地測定Ppo酶活性的水平。沉淀固體級分后，可以隨時間測定OD410的變化。通過在約4。C溫育塊莖，進(jìn)一步測試含有小于25。/。Ppo酶活性的塊莖的系。至少1個月后，可以測定葡萄糖水平，例如，通過使用葡萄糖氧化酶/過氧化物酶試劑(Megazyme，Ireland)?？梢苑治霰憩F(xiàn)出〉75°/。降低的ppo活性水平和>50°/。降低的冷謙導(dǎo)的甜化的塊莖的系的游離天冬酰胺水平。如果游離天冬酰胺水平降低了約>50%，可以加工塊莖，并分析丙烯酰胺水平。確實(shí)含有低天冬酰胺水平以及低Ppo和低的冷誘導(dǎo)的甜化的轉(zhuǎn)化系，可以考慮用于批量擴(kuò)大和商業(yè)生產(chǎn)。源自優(yōu)選系的塊莖的炸薯條含有更少的還原糖，因而可能減少漂白時間和保持原始的馬鈴薯味道。此外，由于缺少糖末端和黑點(diǎn)挫傷，增強(qiáng)了它們的視覺吸引力。炸薯條也具有更好的香氣，并積累降低水平的丙烯酰胺，這可以通過用于評價炸薯條的感官特征的感官組來測定。實(shí)施例6TILLING通過突變，也可以下調(diào)參與天冬酰胺(例如天冬酰胺合成酶)的生物合成的基因的表達(dá)。實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)的一種方法稱作'粑向誘導(dǎo)的基因組中的局部損傷，(TILLING)。該方法組合了曱磺酸乙酯(EMS)-誘導(dǎo)的誘變的效率和變性高效液相色譜(DHPLC)的能力，以通過異源雙鏈體分析檢測堿基對變化。該方法會產(chǎn)生寬范圍的突變等位基因，是快速且可自動化的，適用于可以化學(xué)誘變的任意生物體。在基本的TILLING方法中，通過EMS處理來誘變種子。使得到的Ml植物自受精，將M2代個體用于制備進(jìn)行突變篩選的DNA樣品，同時將它們的種子存貨。合并DNA樣品。在微量滴定板上排列各樣品組，進(jìn)行基因特異性的PCR(McCallum等人，NatBiotechnol18:455-457)。TILLING有多種替4<方案。例如，可以^使用不同類型的i秀變劑，例如快速中子或二環(huán)氧丁烷(DEB)。所有這些方法可以連接到反向遺傳學(xué)平臺，以篩選和分離預(yù)選擇的基因的突變體。這些方法已經(jīng)詳細(xì)描述在，例如，Wang等人，F(xiàn)loriculture,OrnamentalandPlantBiotechnology,VolumeI，2006，GlobalScienceBooks。此外，可以簡單地篩選可得到的種質(zhì)的低天冬酰胺表型。因而，分子植物培育、突變培育和系選擇都會提供可以得到'低天冬酰胺，品種的方法。實(shí)施例7降低天冬酰胺水平通過改進(jìn)種植者的操作，也可以降低天冬酰胺水平。例如，碳可以4中制天冬醜胺合成酵基因(KochKE.Carbohydrate—modulatedgeneexpressioninplants.AnnuRevPlantPhysiolPlantMolBiol47:509-540，1996)。通過降4氐土i裏中的氮/石危比，也可以減少天冬酰胺積累。相對較低的氮水平會導(dǎo)致富含N的化合物的濃度的降低和含S代謝物(例如半胱氨酸，谷胱甘肽，和S-腺苷酰甲硫氨酸)的增加。因而，含有相對高C、高S和低N的土壤可以用于生產(chǎn)具有相對低天冬酰胺的食口口。表表1.3個月齡的溫室生長的馬鈴薯系的塊莖中的天冬酰胺水平<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>表2.從3個月齡的溫室生長的馬鈴薯系的塊莖得到的炸薯條中的丙烯酰胺水平。根據(jù)美國食品和藥品管理局，植物以及乳制品和飲料的食品安全中心和應(yīng)用營養(yǎng)辦公室，"食品中丙烯酰胺的檢測和定量，，(2002)，測定丙烯酰胺水平。<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>表3.通過定量實(shí)時RT-PCR測得的6周齡生長室生長的馬鈴薯系的馬鈴薯塊莖中天冬酰胺酶-1基因的表達(dá)水平<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>表4.從3個月齡溫室生長的馬鈴薯系的塊莖得到的炸薯條中的丙烯酰胺水平<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>權(quán)利要求1.一種降低熱加工的植物產(chǎn)品中的丙烯酰胺含量的方法，其包含降低用于生產(chǎn)該產(chǎn)品的植物中的天冬酰胺水平。2.權(quán)利要求l的方法，其中降低天冬酰胺水平的步驟包含在植物中表達(dá)第一多核苷酸，其中所述多核苷酸包含至少一個下述成分的完整或部分序列(i)參與天冬酰胺生物合成的基因或基因的啟動子，和(b)參與天冬酰胺代謝的基因。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述第一多核苷酸包含下述成分的至少一個(a)來自選自(i)天冬酰胺合成酶基因、(ii)硝酸還原酶基因、和(iii)己糖激酶基因的基因或所述基因的啟動子的完整或部分有義和/或反義序列，其中完整或部分序列的表達(dá)下調(diào)該基因的內(nèi)源拷貝的mRNA水平，和(b)選自(i)天冬酰胺酶基因和(ii)谷氨酰胺合成酶基因的基因的完整或部分序列，其中超量表達(dá)所述序列，以上調(diào)該基因的總mRNA水平。4.權(quán)利要求3的方法，其中所述第一多核苷酸包含天冬酰胺合成酶基因的至少一部分，且包含與SEQIDN0:l或2所述序列的至少一部分具有至少70%同一性的序列。5.權(quán)利要求3的方法，其中所述第一多核苷酸包含功能上有活性的天冬酰胺酶基因，且包含與SEQIDN0:9、14或31-33所述序列具有至少70%同一性的序列。6.權(quán)利要求2的方法，其中所述第一多核苷酸可操作地連接到至少一個組織特異性植物啟動子上。7.權(quán)利要求6的方法，其中所述啟動子是塊莖特異性或種子特異性啟動子。8.權(quán)利要求7的方法，其中所述啟動子與馬鈴薯顆粒結(jié)合的淀粉合酶啟動子、馬鈴薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因啟動子、馬鈴薯塊莖特異性蛋白啟動子、馬鈴薯類黃酮3'-單加氧酶基因啟動子、或小麥嘌呤吲咮基因啟動子的至少一部分具有至少70°/同一性。9.權(quán)利要求8的方法，其中所述馬鈴薯顆粒結(jié)合的淀粉合酶啟動子包含SEQIDNO:8所述序列的至少一部分。10.權(quán)利要求8的方法，其中所述馬鈴薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因啟動子包含SEQIDN0:7所述序列的至少一部分。11.權(quán)利要求8的方法，其中所述馬鈴薯塊莖特異性蛋白基因啟動子包含SEQIDNO:22所述序列的至少一部分。12.權(quán)利要求8的方法，其中所述類黃酮單加氧酶基因啟動子包含在SEQIDN0:13所述序列上游的序列的至少一部分。13.權(quán)利要求3的方法，其中所述第一多核苷酸包含天冬酰胺生物合成基因的有義和/或反義片段的至少一個拷貝，且被表達(dá)，以下調(diào)用于生產(chǎn)熱加工食品的植物組織中的總天冬酰胺合成酶mRNA水平。14.權(quán)利要求13的方法，其中所述第一多核苷酸在它的5，-末端可操作地連接到到啟動子上，且在它的3'-末端可操作地連接到啟動子上。15.權(quán)利要求2的方法，還包含表達(dá)第二多核苷酸，所述多核苷酸包含下述成分的至少一個(i)選自R1基因和磷酸化酶L基因的基因的至少一個拷貝，其是有義和/或反義方向。16.權(quán)利要求15的方法，其中所述第一和第二多核苷酸位于轉(zhuǎn)運(yùn)DNA內(nèi)，且包含與SEQIDN0:23所示序列具有至少70°/同一性的序列。17.權(quán)利要求1的方法，其中所述植物是具有塊莖的植物。18.從轉(zhuǎn)基因植物的組織得到的熱加工產(chǎn)品，所述組織包含第一多核普酸，所述多核普酸包含參與天冬酰胺生物合成或天冬酰胺代謝的基因的完整或部分序列，其中所述產(chǎn)品具有比從其它方面相同的非轉(zhuǎn)基因植物的對應(yīng)組織制備的熱加工產(chǎn)品更低的丙烯酰胺濃度。19.權(quán)利要求18的熱加工產(chǎn)品，其中從轉(zhuǎn)基因植物制備的產(chǎn)品具有比從野生型塊莖制備的等同產(chǎn)品改進(jìn)的感官特征。20.權(quán)利要求18的熱加工產(chǎn)品，其中所述轉(zhuǎn)基因植物是具有塊莖的植物。21.權(quán)利要求20的熱加工產(chǎn)品，其中具有塊莖的植物的產(chǎn)品是炸薯條、馬鈴薯片、炸薯片、馬鈴薯或烤馬鈴薯。22.權(quán)利要求18的熱加工產(chǎn)品，其中轉(zhuǎn)基因植物的細(xì)胞還包含第二多核苷酸，所述多核苷酸包含下述成分的至少一個(i)與Rl基因或基因片段相對應(yīng)的有義和/或反義序列，和(ii)與磷酸化酶L基因或基因片段相對應(yīng)的有義和/或反義序列。23.4又利要求18的熱加工產(chǎn)品，其中所述產(chǎn)品的丙烯酰胺濃度比非轉(zhuǎn)基因植物的熱加工產(chǎn)品中的丙烯酰胺濃度低至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%。24.—種植物，其在基因組中包含第一多核苷酸，所述多核苷酸包含參與天冬酰胺生物合成或天冬酰胺代謝的基因的完整或部分序列。25.權(quán)利要求24的植物，其中所述植物是具有塊莖的。26.權(quán)利要求25的植物，其中具有塊莖的植物是馬鈴薯植物。27.權(quán)利要求24的植物，還在基因組中包含第二多核苷酸，所述多核苷酸包含下述成分的至少一個(i)與Rl基因或基因片段相對應(yīng)的有義和/或反義序列，和(ii)與磷酸化酶L基因或基因片段相對應(yīng)的有義和/或反義序列。28.分離的多核苷酸序列，其包含編碼能降低植物中的丙烯酰胺水平的多肽的核酸序列。29.權(quán)利要求28的分離的多核苷酸，其中所述核酸序列選自SEQIDN0:1、2、9、10、14、15和28-35，或其變體、片,殳、互補(bǔ)序列或反向互補(bǔ)序列，且所述核酸編碼具有天冬酰胺酶活性的多肽。30.權(quán)利要求29的分離的多核苷酸，其中所述變體的序列與SEQID冊1、2、17、20、21中的任一個序列具有大于或等于99%、98°/、97°/。、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80°/。、79%、78%、77°/"76%、75%、74%、73°/"72%、7"/"70%、69°/"68°/。、67%、66%、65%、64%、63%、62°/。、61%或60%的序列同一性。31.從具有降低的天冬酰胺的植物組織生產(chǎn)可食用植物產(chǎn)品的方法，其包含(1)增加所述植物組織中的天冬酰胺酶水平，或(2)降低所述植物組織中的天冬酰胺合成酶水平。32.權(quán)利要求31的方法，其中增加植物細(xì)胞中的天冬酰胺酶水平的步驟包含在該細(xì)胞中表達(dá)天冬酰胺酶基因。33.權(quán)利要求31的方法，其中降低植物細(xì)胞中的天冬酰胺合成酶水平的步驟包含在該植物細(xì)胞中表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸包含(i)Rl基因、(ii)磷酸化酶L基因和(iii)天冬酰胺合成酶基因的至少一個片段，其是有義和/或反義方向。34.權(quán)利要求31的方法，其中所述可食用植物產(chǎn)品是塊莖、炸薯條、馬鈴薯片、炸薯片、烤馬鈴薯或脫水的馬鈴薯。35.權(quán)利要求31的方法，其中與天冬酰胺酶水平?jīng)]有增加或天冬酰胺合成酶水平?jīng)]有降低的植物產(chǎn)品中的丙烯酰胺水平相比，所述可食用植物產(chǎn)品在被加熱后具有更低的丙烯酰胺水平。36.生產(chǎn)具有低水平的丙烯酰胺的可食用植物產(chǎn)品的方法，其包含(i)下調(diào)天冬酰胺生物合成基因的表達(dá)和/或上調(diào)參與天冬酰胺代謝基因的基因的表達(dá)，和(ii)下調(diào)植物組織中(a)Rl基因和(b)磷酸化酶L基因中的至少一個基因的表達(dá)或活性，所述植物組織產(chǎn)生用于制備產(chǎn)品的植物、種子或果實(shí)。37.權(quán)利要求36的方法，其中下調(diào)R1基因、磷酸化酶L基因和天冬酰胺生物合成基因的步驟包含在植物細(xì)胞中以有義和/或反義方向表達(dá)(i)Rl基因、(ii)磷酸化酶L基因和(iii)天冬酰胺合成酶基因的至少一個片段。38.權(quán)利要求36的方法，其中所述可食用植物產(chǎn)品是塊莖、炸薯條、馬鈴薯片、炸薯片或烤馬鈴薯。39.權(quán)利要求36的方法，其中與非轉(zhuǎn)基因植物的植物產(chǎn)品中的丙烯酰胺水平相比，所述可食用植物產(chǎn)品在被加熱后具有更低的丙烯酰胺水平。40.生產(chǎn)可食用轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品的方法，所述產(chǎn)品在被加熱后具有比來自非轉(zhuǎn)基因植物的等同加熱產(chǎn)品的丙烯酰胺水平更低的丙烯酰胺水的基因的表達(dá)水平，'降低4i因植物中4天名:酰胺水平5'^、41.權(quán)利要求40的方法，其中通過以有義和/或反義方向表達(dá)來自天冬酰胺合成酶基因、硝酸還原酶基因或己糖激酶基因的完整或部分序列的至少一個拷貝，降低天冬酰胺水平。42.權(quán)利要求41的方法，其中通過在植物中表達(dá)來自天冬酰胺酶基因或谷氨酰胺合成酶基因的完整或功能上有活性的部分序列，降低天冬酰胺水平。43.在馬鈴薯塊莖中超量表達(dá)基因的方法，該方法是通過將該基因可操作地連接到與SEQIDNO:13所示序列的至少一部分具有至少70%同一性的序列上。44.權(quán)利要求1的方法，其中降低植物淀粉組織中的天冬酰胺水平。45.權(quán)利要求36的方法，其中所述可食用植物產(chǎn)品具有與未修飾的等同產(chǎn)品相比改善的感官特征。46.權(quán)利要求45的方法，其中所述可食用植物產(chǎn)品具有選自下述的至少一種改善的感官特征外觀、風(fēng)味、香氣和質(zhì)地。全文摘要本發(fā)明提供了從植物分離的多核苷酸和多肽序列，降低植物中游離天冬酰胺水平的方法，生產(chǎn)含有降低水平的丙烯酰胺的熱加工食品的方法，和通過這些方法得到的植物和食物。文檔編號C12N15/82GK101313070SQ200680043287公開日2008年11月26日申請日期2006年9月19日優(yōu)先權(quán)日2005年9月20日發(fā)明者C·羅門斯申請人:J.R.西姆普羅特公司