專利名稱:Dna模塊克隆載體質(zhì)粒和其應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及克隆載體質(zhì)粒領(lǐng)域,并涉及使用克隆載體質(zhì)粒構(gòu)建DNA構(gòu)建 物或轉(zhuǎn)基因。
背景技術(shù):
分子生物學(xué)的基礎(chǔ)是重組DNA技術(shù),在本文中將其小結(jié)為出于研究核酸 及其蛋白產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和功能而修飾和擴(kuò)增核酸。 -
單個(gè)基因、基因調(diào)控區(qū)、基因亞組和含有它們的整個(gè)染色體均由核苷酸的 雙鏈反向平行序列組成,核苷酸包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤和胞嘧啶,習(xí) 慣上分別用首字母A、 T、 G和C表示。這些DNA序列以及cDNA序列是衍 生自mRNA(信使RNA)分子的雙鏈DNA拷貝,可切割成單獨(dú)片段,分離和插 入載體如細(xì)菌質(zhì)粒中來研究基因產(chǎn)物。質(zhì)粒是染色體外的一段DNA,最初來 源于細(xì)菌,可進(jìn)行操作并再次引入宿主細(xì)菌中以便研究或產(chǎn)生基因產(chǎn)物。質(zhì)粒 的DNA與所有染色體DNA相似,即它同樣由A、 T、 G和C核苷酸組成,編 碼基因和基因調(diào)控區(qū),然而,質(zhì)粒是相對(duì)較小的分子,它由少于約30,000個(gè)堿 基對(duì)或30千堿基(kb)組成。此外,雙鏈質(zhì)粒的核苷酸堿基對(duì)形成連續(xù)的環(huán)形分 子,也使質(zhì)粒DNA區(qū)別于染色體DNA。
質(zhì)粒能促進(jìn)細(xì)菌生物體之間快速交換遺傳物質(zhì),使得細(xì)菌能夠快速適應(yīng)環(huán) 境改變,如溫度、食物供給或其它刺激。獲得的任何質(zhì)粒必須表達(dá)有助于宿主 存活的基因,否則該生物體將破壞或丟棄該質(zhì)粒,因?yàn)榫S持不必要的質(zhì)粒會(huì)浪
費(fèi)資源??寺〉募?xì)胞群含有相同遺傳物質(zhì),包括它可能攜帶的任何質(zhì)粒。將含
有DNA插入物的克隆載體質(zhì)粒用于這類克隆的宿主細(xì)胞群將擴(kuò)增可得的感興 趣DNA的量。然后分離并回收如此克隆的DNA,以便在建立DNA構(gòu)建物所 需的步驟中進(jìn)行后續(xù)操作。因此,應(yīng)理解,克隆的載體質(zhì)粒是研究基因功能的 有用工具,能夠快速產(chǎn)生大量感興趣的DNA插入物。
雖然質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)的一些元件是天然產(chǎn)生的,但其它一些元件可以是經(jīng)過工 程改造提高該質(zhì)粒作為DNA載體的有用性的元件。這些元件包括抗生素或化 學(xué)物質(zhì)抗性基因以及多克隆位點(diǎn)(MCS)等。這些元件各自在本發(fā)明、以及現(xiàn)有 技術(shù)中起到某種作用。各元件所起作用的描述將突出說明現(xiàn)有技術(shù)的局限,并 證明本發(fā)明的有用性。
可由宿主獲得的一類特別有用的質(zhì)粒攜帶基因是能產(chǎn)生抗生素抗性的基 因。在平常的重組DNA技術(shù)實(shí)踐中,抗生素抗性基因用作陽性或陰性選擇元 件,以便與其它質(zhì)粒相比,優(yōu)先增強(qiáng)所述質(zhì)粒的培養(yǎng)和擴(kuò)增。
為了被宿主細(xì)菌保持,質(zhì)粒一定也含有指導(dǎo)宿主復(fù)制該質(zhì)粒的序列段。稱 為復(fù)制起點(diǎn)(ORI)元件的序列能指導(dǎo)宿主利用其細(xì)胞酶產(chǎn)生質(zhì)粒拷貝。這類細(xì) 菌分裂時(shí),子細(xì)胞各自保持了這類質(zhì)粒的一個(gè)或多個(gè)拷貝。使某些大腸桿菌(五. co")菌株衍生化,以最大程度提高這種復(fù)制,使每個(gè)細(xì)菌產(chǎn)生高達(dá)300個(gè)拷貝。 以此方式,可提高所需質(zhì)粒的培育。
在任何克隆載體中另一種必需元件是插入感興趣遺傳物質(zhì)的位置。這是經(jīng) 工程改造進(jìn)入"野生型"質(zhì)粒,從而使該質(zhì)??捎米骺寺≥d體的合成元件。市售 克隆載體質(zhì)粒一般含有至少一個(gè)這種區(qū)域,稱為多克隆位點(diǎn)(MCS)。 MCS—般 含有可被一種或一系列限制性核酸內(nèi)切酶(下文稱為"限制性酶")切割的核苷酸 序列,各酶具有不同的核酸內(nèi)切酶限制性位點(diǎn)和切割模式。DNA分子中編碼 的這些核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)或核酸內(nèi)切酶限制性位點(diǎn)(下文稱為"限制性位點(diǎn)")一般 含有雙鏈回文序列。就一些限制性酶而言,少至4-6個(gè)核苷酸足以提供限制性 位點(diǎn),而一些限制性酶需要8個(gè)或更多個(gè)核苷酸的限制性位點(diǎn)。例如,酶EcoRl 能識(shí)別六核苷酸序列5'G-A-A-T-T-C3',其中5'表示通常稱作"上游"末端的分 子末端,類似地,3'表示"下游"末端。該限制性位點(diǎn)的互補(bǔ)鏈?zhǔn)瞧浞聪嗥叫墟?3'G-A-A-T-T-C-5'。因此,雙鏈限制性位點(diǎn)可存在于較大的雙鏈分子中,其中它表示為
5' G-A-A-T-T誦C 3' 3' C-T-T-A-A-G 5'
如同許多其它限制性酶那樣,EcoRl不在雙鏈對(duì)稱軸上準(zhǔn)確切割,而是在 7"所示核苷酸之間兩條DNA鏈上相距4個(gè)核苷酸的位置上切割 5' G/A-A-T-T-C 3' 3' C-T誦T-A-A/G 5'
以便切割該雙鏈DNA分子,在新形成的"末端"上得到的核苷酸構(gòu)型為 5' G3' 5A-A-T-T-C 3。
3' C-T-T-A-A5' 3G5'
這種交錯(cuò)切割產(chǎn)生5'末端突出的DNA片段。因?yàn)閴A基互相接近時(shí)自發(fā)形 成A-T和G-C對(duì),所以突出末端如上述末端被稱為粘性末端。這些末端中任 何一個(gè)均可與用同一限制性酶切割的其它互補(bǔ)末端形成氫鍵。由于含有特定限 制性位點(diǎn)的任何DNA與含有相同序列的任何其它DNA的切割方式相同,所 以這些切割末端互補(bǔ)。因此,用同一限制性酶切割的任何DNA分子的末端互 相"匹配",類似于拼圖相鄰部分的"匹配",并可通過酶將它們連接在一起。正 是這種特性能夠形成重組DNA分子,能夠?qū)⑼鈦鞤NA片段引入細(xì)菌質(zhì)粒, 或引入任何其它DNA分子。
建立重組DNA分子時(shí)考慮的另一普遍原理是用特定限制性酶切割分子中 出現(xiàn)的所有限制性位點(diǎn),而不只是感興趣位點(diǎn)。DNA分子越大,任意限制性 位點(diǎn)重復(fù)出現(xiàn)的可能性越高。假定任何限制性位點(diǎn)沿某DNA分子隨機(jī)分布, 平均每44(即256)個(gè)核苷酸出現(xiàn)一個(gè)四核苷酸位點(diǎn),而每46(即4096)個(gè)核苷酸 出現(xiàn)一個(gè)六核苷酸位點(diǎn),每48(即114,688)個(gè)核苷酸出現(xiàn)一個(gè)八核苷酸位點(diǎn)。因 此,不難理解,較短的限制性位點(diǎn)出現(xiàn)頻率較高,而較長的限制性位點(diǎn)較少出 現(xiàn)。準(zhǔn)備構(gòu)建轉(zhuǎn)基因或其它重組DNA分子時(shí),這是一個(gè)重要問題,因?yàn)檫@種 計(jì)劃常常需要將大小不同的幾段DNA組裝在一起。這些片段越大,希望使用 的位點(diǎn)在幾段DNA組件中出現(xiàn)的可能性越高,最樂觀的情況也會(huì)使得操作困 難。
在本文中將頻繁出現(xiàn)的限制性位點(diǎn)稱為常見限制性位點(diǎn),切割這些位點(diǎn)的
核酸內(nèi)切酶稱為常見限制性酶。關(guān)聯(lián)序列大于6個(gè)核苷酸的限制性酶稱為罕見 限制性酶,其關(guān)聯(lián)位點(diǎn)是罕見限制性位點(diǎn)。然而,有一些6bp的限制性位點(diǎn)的 出現(xiàn)頻率高于統(tǒng)計(jì)學(xué)預(yù)測(cè)值,這些位點(diǎn)和切割它們的核酸內(nèi)切酶也被稱作罕 見。因此,稱謂"罕見"和"常見"并不指任何具體限制性酶的相對(duì)豐度或可及性, 而是指在任何DNA分子或DNA分子的分離片段、或者任何基因或其DNA序 列中構(gòu)成其關(guān)聯(lián)限制性位點(diǎn)的核苷酸序列的出現(xiàn)頻率。
最近分離到第二類限制性酶,稱為尋靶(homing)核酸內(nèi)切酶(HE)酶。 HE酶具有大的、不對(duì)稱限制性位點(diǎn)(12-40個(gè)堿基對(duì))。HE限制性位點(diǎn)極罕見。 例如,稱為 I-Scel 的 HE 具有 18 bp 限制性位點(diǎn) (5'…TAGGGATAACAGGGTAAT…3'),預(yù)計(jì)在每7xl0"個(gè)堿基對(duì)的隨機(jī)序列中 僅出現(xiàn)一次。這種出現(xiàn)頻率等于在20個(gè)哺乳動(dòng)物大小的基因組中僅出現(xiàn)一個(gè) 位點(diǎn)。如果克隆載體質(zhì)粒的合適位置上含有HE位點(diǎn),HE位點(diǎn)的罕見特性將 大大提高遺傳工程技術(shù)人員切割最終轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物而不破壞轉(zhuǎn)基因的完整性的 可能性。
由于任何來源生物體的DNA分子均被其關(guān)聯(lián)限制性酶以相同方式切割, 所以可用限制性酶切割來自任何物種的外來DNA片段,插入用同一限制性酶 切割的細(xì)菌質(zhì)粒載體中,在合適的宿主細(xì)胞中擴(kuò)增。例如,可用稱為EcoRl 的限制性酶切割人基因中的兩個(gè)位置,可分離具有EcoRl末端的所需片段,在 通常稱為連接反應(yīng)物或連接混合物的體系中與也用EcoRl切割的質(zhì)?;旌?。在 連接混合物中適當(dāng)條件下, 一些分離的人基因片段將與質(zhì)粒分子的末端匹配起 來。這些新連接的末端可連接在一起,并用酶使該質(zhì)粒再環(huán)化,現(xiàn)在該質(zhì)粒就 含有新的DNA插入物。然后將連接混合物引入大腸桿菌或另一種合適的宿主 中,新工程改造的質(zhì)粒將隨著細(xì)菌分裂而擴(kuò)增。以此方式,可從細(xì)菌獲得并收 獲相對(duì)大量的人基因拷貝。然后,可根據(jù)研究、分析或產(chǎn)生基因產(chǎn)物蛋白的需 要進(jìn)一步操作這些基因拷貝。
重組DNA技術(shù)常常體現(xiàn)在產(chǎn)生所謂的"轉(zhuǎn)基因"。轉(zhuǎn)基因常包含衍生自一 種或多種供體生物并引入宿主生物的各種遺傳物質(zhì)。 一般地,用克隆載體作為 項(xiàng)目的起點(diǎn)或"主鏈"(backbone)來構(gòu)建轉(zhuǎn)基因,設(shè)計(jì)一系列復(fù)雜的克隆步驟 在該載體內(nèi)組裝最終產(chǎn)物。轉(zhuǎn)基因元件(含有核苷酸序列)包括但不限于l)調(diào)
節(jié)性啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子元件,2)表達(dá)成mRNA分子的基因,3)使mRNA信使 穩(wěn)定化的DNA元件,4)模擬哺乳動(dòng)物內(nèi)含子基因區(qū)域的核苷酸序列和5)mRNA 加工信號(hào),如加到天然產(chǎn)生的mRNA末端的聚A尾。在某些情況下,實(shí)驗(yàn)設(shè) 計(jì)可能需要加入定位信號(hào),以便將基因產(chǎn)物運(yùn)輸?shù)教囟ǖ膩喖?xì)胞位置。這些元 件各自是由供體基因組切下的較大DNA分子的片段,或者在某些情況下,是 在實(shí)驗(yàn)室中合成的。各片段與其它片段以精確順序和5'-3'取向組裝到克隆載體 質(zhì)粒中。
可以DNA片段的形式分離到任何基因的啟動(dòng)子,將其放入合成分子如質(zhì) 粒中,以便指導(dǎo)所需基因的表達(dá),假定可提供刺激感興趣啟動(dòng)子所需的必要條 件。例如,可分離胰島素基因的啟動(dòng)子序列,與報(bào)道基因一起放入克隆載體質(zhì) 粒中,用于研究在合適細(xì)胞類型中表達(dá)胰島素基因所需的條件?;蛘撸诳寺?載體質(zhì)粒中胰島素基因啟動(dòng)子可與任何感興趣基因的蛋白質(zhì)編碼序列連接在 一起,用于驅(qū)動(dòng)感興趣基因在表達(dá)胰島素的細(xì)胞中表達(dá),假定如此構(gòu)建的DNA 轉(zhuǎn)基因中存在所有必要元件。
在某些類型的轉(zhuǎn)基因中,報(bào)道基因是特別有用的組件。報(bào)道基因中包含的 編碼某蛋白的核苷酸序列在轉(zhuǎn)基因中與其連接的感興趣特定啟動(dòng)子的指導(dǎo)下 表達(dá),提供可測(cè)定到啟動(dòng)子活性的生化反應(yīng)。 一般相對(duì)于內(nèi)源性細(xì)胞蛋白質(zhì)的 背景,易于檢測(cè)或測(cè)定報(bào)道基因。常用的報(bào)道基因包括但不限于LacZ、綠色 熒光蛋白和熒光素酶以及其它報(bào)道基因,許多都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
內(nèi)含子是哺乳動(dòng)物基因中的非編碼區(qū),細(xì)菌基因組中未發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子,但它 是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中適當(dāng)形成mRNA所必需的區(qū)域。因此,用于哺乳動(dòng)物系統(tǒng) 的任何DNA構(gòu)建物都必須含有至少一個(gè)內(nèi)含子,可由任何哺乳動(dòng)物基因分離 內(nèi)含子,將它與合適的剪接信號(hào)一起插入DNA構(gòu)建物,所述剪接信號(hào)使哺乳 動(dòng)物細(xì)胞能夠切掉該內(nèi)含子并將其余的mRNA末端剪接在一起。
mRNA穩(wěn)定化元件是保護(hù)一些mRNA不降解的結(jié)合蛋白所識(shí)別的DNA 序列。包含mRNA穩(wěn)定化元件常常能提高該mRNA在一些哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型 中的基因表達(dá)水平,因此可用于一些DNA構(gòu)建物或轉(zhuǎn)基因。可以從天然產(chǎn)生 的DNA或RNA分離mRNA穩(wěn)定化元件,或者通過合成方法產(chǎn)生包含在DNA 構(gòu)建物中的穩(wěn)定化元件。
定位信號(hào)是編碼感興趣蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞路徑的蛋白信號(hào)的DNA序列。例 如,核定位信號(hào)能將蛋白質(zhì)導(dǎo)向細(xì)胞核;質(zhì)膜定位信號(hào)將其導(dǎo)向質(zhì)膜等。因此, 可將定位信號(hào)摻入DNA構(gòu)建物中,以其蛋白質(zhì)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到所需的亞細(xì)胞位置 中。
DNA構(gòu)建物中可編碼標(biāo)簽序列,以便使蛋白質(zhì)產(chǎn)物具有獨(dú)特的附連區(qū)域。 這種獨(dú)特區(qū)域用作可將其與內(nèi)源性對(duì)應(yīng)物區(qū)別開來的蛋白質(zhì)標(biāo)簽?;蛘撸?用作可通過本領(lǐng)域熟知的各種技術(shù)檢測(cè)的標(biāo)志物,這些技術(shù)包括但不限于 RT-PCR、免疫組化或原位雜交。
用復(fù)雜的轉(zhuǎn)基因,或者用含有特別大的DNA區(qū)域的轉(zhuǎn)基因,會(huì)使這些 DNA片段中存在多個(gè)限制性位點(diǎn)的概率增加?;叵肫鹈?096 bp (46)出現(xiàn)一個(gè) 編碼任何一個(gè)六核苷酸位點(diǎn)的限制性位點(diǎn)。如果啟動(dòng)子序列是3000 bp,準(zhǔn)備 將1500 bp的感興趣基因組裝到3000 bp的克隆載體中,那么6個(gè)或更少核苷 酸的許多位點(diǎn)將無法使用的可能性相當(dāng)大,因?yàn)槿魏慰捎玫奈稽c(diǎn)必須僅出現(xiàn)在 這些片段的兩個(gè)片段中。而且,該位點(diǎn)必須出現(xiàn)在待組裝的合適分子的合適區(qū) 域中。此外,大多數(shù)克隆計(jì)劃需要加入其它DNA元件,從而增加了生長分子 的復(fù)雜性和不合適地重復(fù)任何具體位點(diǎn)的概率。由于任何限制性酶將切割DNA 分子中所有它的限制性位點(diǎn),因此,如果某限制性酶位點(diǎn)重復(fù)出現(xiàn),所有不合 適的位點(diǎn)將與所需位點(diǎn)一起被切割,這會(huì)破壞該分子的完整性。因此,必須仔 細(xì)設(shè)計(jì)各個(gè)克隆步驟,以便不會(huì)因?yàn)橐延糜趽饺肭耙辉南拗菩悦傅那懈疃?破壞生長分子。最后,當(dāng)研究人員希望將完整的轉(zhuǎn)基因引入哺乳動(dòng)物生物體時(shí), 常常必須在轉(zhuǎn)基因至少一端的獨(dú)特限制性位點(diǎn)將完全組裝的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物線 性化,因此需要不存在于此構(gòu)建物其它地方的另一種獨(dú)特位點(diǎn)。由于大多數(shù) DNA構(gòu)建物是根據(jù)單個(gè)目的設(shè)計(jì)的,所以對(duì)將來可能需要作出的修改考慮很 少,進(jìn)一步增加了將來實(shí)驗(yàn)改變的難度。
傳統(tǒng)上,由于幾種原因,轉(zhuǎn)基因設(shè)計(jì)和構(gòu)建消耗了大量時(shí)間和精力,這些 原因包括
1.可獲得產(chǎn)生各種末端的多種限制性酶和HE酶;但大多數(shù)這些酶互不 相容。許多限制性酶如EcoRl能產(chǎn)生具有突出的5'粘性末端或"尾"的DNA片 段;其它限制性斷如Pstl)能產(chǎn)生具有3'突出尾的片段,另外一些酶(如Ball)
在對(duì)稱軸上切割,產(chǎn)生鈍端片段。 一些酶與用其它限制性酶和/或HE酶切割形 成的末端兼容,但大多數(shù)有用的酶不兼容。在設(shè)計(jì)DNA構(gòu)建物的過程中,必 須仔細(xì)考慮采用各種DNA片段分離方法產(chǎn)生的末端。
2. 必須首先從其來源基因組分離組裝DNA構(gòu)建物或轉(zhuǎn)基因所需的DNA 片段,將其放入質(zhì)??寺≥d體,擴(kuò)增獲得有用量??刹捎迷S多市售或單獨(dú)改變 的克隆載體進(jìn)行該步驟。大多數(shù)不同的市售克隆載體質(zhì)粒是各自獨(dú)立開發(fā)的, 因此含有不同序列和感興趣的基因DNA片段或遺傳元件的限制性位點(diǎn)。因此, 必須單獨(dú)修飾基因,以使其適應(yīng)各種載體,滿足給定實(shí)驗(yàn)類型的需要。常常需 要根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)改變進(jìn)一步同一 DNA片段,或?qū)⑵淇寺〉狡渌M合中形成新 的DNA構(gòu)建物或轉(zhuǎn)基因。由于各DNA構(gòu)建物或轉(zhuǎn)基因是根據(jù)具體應(yīng)用定制 的,沒有考慮或了解它下一步將如何使用,所以常常必須根據(jù)后續(xù)應(yīng)用進(jìn)行" 回復(fù)改動(dòng)(retro-fitted)"。
3. 此外,任何給定的基因或遺傳元件的DNA序列不同,可含有使其與 目前可用載體不相容、從而使操作復(fù)雜化的內(nèi)部限制性位點(diǎn)。將幾種DNA片 段組裝成單個(gè)DNA構(gòu)建物或轉(zhuǎn)基因時(shí),尤其如此。
雖然可使用限制性酶操作遺傳物質(zhì),但已知可通過從頭合成、重組工程和 /或PCR終止子突出端克隆來產(chǎn)生MCS或其它轉(zhuǎn)基因組件。合成轉(zhuǎn)基因組件的 一種這類方法包括Jarrell等在美國專利6,358,712中所述的方法。雖然Jarrell 公開了將轉(zhuǎn)基因元件"焊接(welding)"在一起的方法,但現(xiàn)有技術(shù)沒有說明一 旦組裝后,"脫焊"和再組裝這些元件的方法或工具。
因此,提供以準(zhǔn)確順序和5'-3'取向?qū)⑥D(zhuǎn)基因各組件與其它組件一起克隆到 克隆載體質(zhì)粒中的方法是有利的。還需要使得使用者能夠?qū)⒃S多DNA片段快 速組裝到一個(gè)分子中的系統(tǒng),盡管在這些DNA片段的末端及其各自的內(nèi)部發(fā) 現(xiàn)限制性位點(diǎn)的冗余。提供快速改變所選DNA片段的末端,以向其中添加限 制性位點(diǎn)的簡(jiǎn)單方式也是有用的。包含單對(duì)或相反對(duì)的HE限制性位點(diǎn)會(huì)提高 具有獨(dú)特克隆位點(diǎn)的可能性。也易于取代或去除一個(gè)或多個(gè)片段的系統(tǒng)會(huì)增加 目前使用者無法獲得的多樣性水平。因此,能夠?qū)NA片段插入或移出側(cè)接 于克隆載體中固定的罕見限制性位點(diǎn)的"盒"區(qū)的"模塊"系統(tǒng)特別有用,受到重 組DNA技術(shù)領(lǐng)域的歡迎。
因此,本發(fā)明一方面提供了采用克隆載體質(zhì)粒快速組裝DNA構(gòu)建物或轉(zhuǎn) 基因的方法。另一方面是依次將DNA片段,也稱為"插入物"或"模塊"如啟動(dòng)子、 表達(dá)(Expression)和3'調(diào)控核苷酸序列,摻入克隆載體質(zhì)粒中。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供了一種通過提供在含有稱為基因樞(genepivot)的專用??奎c(diǎn) 的模塊克隆載體內(nèi)提供主鏈,產(chǎn)生用于合成遺傳結(jié)構(gòu)域模塊、PE3轉(zhuǎn)基因和其 它復(fù)雜DNA構(gòu)建物的模塊克隆載體的結(jié)構(gòu)和方法。
本發(fā)明涉及一種由DNA克隆載體組成的結(jié)構(gòu)域模塊??枯d體,所述載體 包含將感興趣遺傳物質(zhì)亞克隆到多克隆(MC)模塊中的MC模塊,該MC模塊 包含a)第一基因樞(GP),其含有可通過操作限定MC模塊5'部分的至少兩個(gè) 恒定的罕見限制性位點(diǎn);b)含有包括多個(gè)限制性位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)(MCS)的核 酸序列,以便為將感興趣遺傳物質(zhì)克隆到MC模塊中提供克隆位點(diǎn),所述限制 性位點(diǎn)選自常見的、在結(jié)構(gòu)域模塊停靠載體中獨(dú)特的(unique)限制性位點(diǎn); 和c)第二基因樞,其含有可通過操作限定MC模塊3'部分的至少兩個(gè)恒定的罕 見限制性位點(diǎn)。
本發(fā)明也涉及一種由DNA克隆載體組成的結(jié)構(gòu)域模塊載體,其包含的結(jié) 構(gòu)域模塊包括a)第一基因樞,其含有可通過操作限定結(jié)構(gòu)域模塊5'部分的至 少兩個(gè)恒定的罕見限制性位點(diǎn);b)感興趣遺傳模塊,它由含有感興趣遺傳物質(zhì) 的核酸序列組成;和c)第二基因樞,其含有可通過操作限定結(jié)構(gòu)域模塊3'部分 的至少兩個(gè)恒定的罕見限制性位點(diǎn)。
本發(fā)明也涉及一種由DNA克隆載體組成的PE3??枯d體,其包含含有至 少一個(gè)克隆模塊的PE3克隆模塊,經(jīng)構(gòu)建該模塊可用于將至少第一結(jié)構(gòu)域模塊 克隆到PE3克隆模塊中,所述PE3克隆模塊包含a)第一基因樞,其含有克隆 后可通過操作限定至少第一結(jié)構(gòu)域模塊5'部分的至少兩個(gè)恒定的罕見限制性 位點(diǎn);b)由含有填充片段的第一核酸序列組成的填充模塊,克隆后被第一結(jié)構(gòu) 域模塊取代;和c)第二基因樞,其含有克隆后可通過操作限定至少第一結(jié)構(gòu)域 模塊3'部分的至少兩個(gè)恒定的罕見限制性位點(diǎn)。
本發(fā)明也涉及由DNA克隆載體組成的PE3停靠載體,其包含含有多個(gè)克隆模塊的PE3克隆模塊,經(jīng)構(gòu)建該模塊可用于將多個(gè)結(jié)構(gòu)域模塊克隆到PE3 克隆模塊中,所述PE3克隆模塊包含a)第一基因樞,其含有克隆后可通過操 作限定第一結(jié)構(gòu)域模塊5'部分的至少兩個(gè)恒定的罕見限制性位點(diǎn);b)由含有填 充片段的第一核酸序列組成的第一填充模塊,克隆后被第一結(jié)構(gòu)域模塊取代; c)第二基因樞,其含有克隆后可通過操作限定第一結(jié)構(gòu)域模塊3'部分和第二結(jié) 構(gòu)域模塊5'部分之間的共有連接的至少兩個(gè)恒定的罕見限制性位點(diǎn);d)由含有 填充片段的第二核酸序列組成的第二填充模塊,克隆后被第二結(jié)構(gòu)域模塊取 代;e)第三基因樞,其含有克隆后可通過操作限定第二結(jié)構(gòu)域模塊3,部分和第 三結(jié)構(gòu)域模塊5'部分之間的共有連接的至少兩個(gè)恒定的罕見限制性位點(diǎn);f)由 含有填充片段的第三核酸序列組成的第三填充模塊,克隆后被第三結(jié)構(gòu)域模塊 取代;和g)第四基因樞,其含有克隆后可通過操作限定第三結(jié)構(gòu)域模塊3'部分 的至少兩個(gè)恒定的罕見限制性位點(diǎn)。
本發(fā)明還涉及由DNA克隆載體組成的PE3多克隆(MC)??枯d體,其包含 經(jīng)構(gòu)建能將至少三結(jié)構(gòu)域模塊克隆到PE3克隆模塊中的PE3克隆模塊,所述 PE3克隆模塊包含a)第一基因樞,其含有克隆后可通過操作限定第一結(jié)構(gòu)域
模塊5'部分的至少兩個(gè)恒定的罕見限制性位點(diǎn);b)第一核酸序列;C)第二基因
樞,其含有克隆后可通過操作限定第一結(jié)構(gòu)域模塊3'部分和第二結(jié)構(gòu)域模塊5' 部分之間的共有連接的至少兩個(gè)恒定的罕見限制性位點(diǎn);d)第二核酸序列;e) 第三基因樞,其含有克隆后可通過操作限定第二結(jié)構(gòu)域模塊3'部分和第三結(jié)構(gòu)
域模塊5'部分之間的共有連接的至少兩個(gè)恒定的罕見限制性位點(diǎn);f)第三核酸
序列;和g)第四基因樞,其含有克隆后可通過操作限定第三結(jié)構(gòu)域模塊3'部分 的共有連接的至少兩個(gè)恒定的罕見限制性位點(diǎn);其中所述第一、第二和第三核 酸序列中至少一種是含有多克隆位點(diǎn)(MCS)的多克隆模塊,以便為將感興趣遺 傳物質(zhì)克隆到多克隆模塊中提供克隆位點(diǎn),其余核酸序列是填充片段序列,所 述多克隆位點(diǎn)含有多個(gè)限制性位點(diǎn),這些限制性位點(diǎn)選自常見的、在PE3???載體中獨(dú)特的限制性位點(diǎn)。
本發(fā)明還涉及由DNA克隆載體組成的PE3載體,其包含含有啟動(dòng)子模塊、 表達(dá)模塊和3'調(diào)控模塊的PE3模塊,所述PE3模塊包含a)第一基因樞,其含 有可通過操作限定啟動(dòng)子模塊5'部分的至少兩個(gè)恒定的罕見限制性位點(diǎn);b)啟
動(dòng)子模塊;c)第二基因樞,其含有可通過操作限定啟動(dòng)子模塊3'部分和表達(dá)模 塊5'部分之間的共有連接的至少兩個(gè)恒定的罕見限制性位點(diǎn);d)表達(dá)模塊;e) 第三基因樞,其含有可通過操作限定表達(dá)模塊3'部分和3'調(diào)控模塊5'部分之間 的共有連接的至少兩個(gè)恒定的罕見限制性位點(diǎn);f)3'調(diào)控模塊;和g)第四基因 樞,其含有可通過操作限定3'調(diào)控模塊3'部分的至少兩個(gè)恒定的罕見限制性位 點(diǎn)。
本發(fā)明也提供,PE3??枯d體、PE3載體和PE3多克隆(MC)??枯d體中 任一種可包含由PE3載體釋放PE3模塊以插入多基因停靠載體的部件 (means), 一般包含啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)域、表達(dá)結(jié)構(gòu)域和側(cè)接于基因樞的3'調(diào)控結(jié) 構(gòu)域模塊。釋放和插入所述PE3克隆模塊的一種部件包括位于PE3??枯d體 或PE3 MC停靠載體中的一對(duì)尋耙核酸內(nèi)切酶(HE),其側(cè)接含有PE3克隆模塊 的核酸序列。將啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)域、表達(dá)結(jié)構(gòu)域和3'調(diào)控結(jié)構(gòu)域插入或克隆入PE3 克隆模塊后,該對(duì)HE提供了剪切PE3載體上的PE3模塊、以插入多基因載體 內(nèi)相容性??课恢弥械囊环N部件,所述相容性??课恢靡话阌赏粚?duì)HE確定。 雖然任何尋靶核酸內(nèi)切酶均可用于所述第一位置(剪切的PE3模塊的5'端)或第 二位置(剪切的PE3模塊的3'端),但優(yōu)選的HE對(duì)由所述第一位置上的I-Ceu I 和所述第二位置上反向的ISce-I組成。在PE3??枯d體或PE3 MC??枯d體的 其它實(shí)施方式中,可采用不同的剪切和插入部件代替HE。這類不同的剪切和 插入部件可包含一對(duì)一種或多種恒定的罕見限制性位點(diǎn),包含不同于基因樞中 罕見限制性位點(diǎn)的一對(duì)罕見限制性位點(diǎn),或側(cè)接的基因樞(GP1和GP4)本身。 插入部件采用了重組工程方法,下面進(jìn)行討論。
本發(fā)明提供了構(gòu)建PE3模塊載體的方法,所述方法包括以下步驟a)提供 含有PE3克隆模塊的PE3克隆載體,所述PE3克隆模塊依次含有含有至少 兩個(gè)恒定的罕見限制性位點(diǎn)的第一基因樞、由含有填充片段的核酸序列組成的 至少第一填充模塊、和第二基因樞;b)提供至少第一結(jié)構(gòu)域模塊載體,其依次 含有第一基因樞,由含有感興趣遺傳物質(zhì)的核酸序列組成的感興趣遺傳模塊; 和第二基因樞;c)提供所述第一基因樞的罕見限制性位點(diǎn)之一的第一關(guān)聯(lián)限制 性酶和所述第二基因樞的罕見限制性位點(diǎn)之一的第二關(guān)聯(lián)限制性酶;d)采用 所述第一和第二關(guān)聯(lián)限制性酶從所述第一結(jié)構(gòu)域模塊載體切下和分離感興趣
遺傳模塊;e)采用所述第一和第二關(guān)聯(lián)限制性酶從PE3克隆載體的PE3克隆模 塊上切下第一填充模塊;和f)將感興趣的遺傳模塊連接到PE3克隆模塊中。該 方法也可采用第三基因樞和關(guān)聯(lián)限制性酶將感興趣的第二遺傳模塊剪切和連 接到PE3克隆模塊中,從而將感興趣的第二遺傳模塊插入PE3中。相似地, 可采用第三基因樞和關(guān)聯(lián)限制性酶將感興趣的第二遺傳模塊剪切和連接到PE3 克隆模塊中,從而將感興趣的第三遺傳模塊插入PE3中。該方法能夠?qū)⒏信d趣 的遺傳模塊依次安置到PE3克隆載體中。 一般地,所述感興趣的第一、第二和 第三遺傳模塊分別對(duì)應(yīng)于啟動(dòng)子模塊、表達(dá)模塊和3'調(diào)控模塊。
本發(fā)明的另一實(shí)施方式是制備轉(zhuǎn)基因的方法,其包括以下步驟提供包含 主鏈的克隆載體質(zhì)粒,該主鏈至少含有第一、第二、第三和第四??奎c(diǎn),所述 停靠點(diǎn)以5'-3'方向依次安置,各自具有可通過操作被限制性酶切割的至少一個(gè) 恒定的罕見限制性位點(diǎn);用對(duì)應(yīng)于第一??奎c(diǎn)的至少一個(gè)恒定的罕見限制性位 點(diǎn)的第一限制性酶切割第一??奎c(diǎn),產(chǎn)生3,端露出的切割的第一停靠點(diǎn);用對(duì) 應(yīng)于第二??奎c(diǎn)的至少一個(gè)恒定的罕見限制性位點(diǎn)的第二限制性酶切割第二 ??奎c(diǎn),產(chǎn)生5'端露出的切割的第二停靠點(diǎn);提供含有5'端、感興趣核苷酸序 列和3'端的第一插入物,其中所述第一插入物的5'端與切割的第一??奎c(diǎn)露出 的3'端相容,所述第一插入物的3'端與切割的第二??奎c(diǎn)露出的5'端相容,將 所述第一插入物和切割的克隆載體質(zhì)粒放入合適的反應(yīng)混合物中,以便使所述 第一插入物連接和自身定向到第一??奎c(diǎn)和第二停靠點(diǎn)之間的主鏈內(nèi),重新組 裝所述主鏈。
在此實(shí)施方式中,然后,可用第二限制性酶切割第二??奎c(diǎn),產(chǎn)生3'端露 出的切割的第二??奎c(diǎn),可采用對(duì)應(yīng)于第三??奎c(diǎn)的至少一個(gè)恒定的罕見限制 性位點(diǎn)的第三限制性酶切割第三??奎c(diǎn),產(chǎn)生5'端露出的切割的第三??奎c(diǎn), 然后是以下步驟提供含有5'端、感興趣核苷酸序列和3'端的第二插入物,其 中所述第二插入物的5'端與切割的第二??奎c(diǎn)露出的3'端相容,所述第二種插 入物的3'端與切割的第三??奎c(diǎn)露出的5'端相容,將所述第二插入物和切割的 克隆載體質(zhì)粒放入合適的反應(yīng)混合物中,以便使所述第二插入物連接和自身定 向到第二??奎c(diǎn)和第三??奎c(diǎn)之間的主鏈內(nèi),重新組裝所述主鏈。
另外,這種實(shí)施方式可包括以下后續(xù)步驟用第三限制性酶切割第三???br>
點(diǎn)上的主鏈,產(chǎn)生3,端露出的切割的第三??奎c(diǎn),用對(duì)應(yīng)于第四??奎c(diǎn)的至少
一個(gè)恒定的罕見限制性位點(diǎn)的第四限制性酶切割第四停靠點(diǎn),產(chǎn)生5,端露出的 切割的第四??奎c(diǎn),提供含有5,端、感興趣核苷酸序列和3'端的第三插入物, 其中所述第三插入物的5'端與切割的第三??奎c(diǎn)露出的3'端相容,所述第三插 入物的3'端與切割的第四??奎c(diǎn)露出的5'端相容,將第三插入物和切割的克隆 載體質(zhì)粒放入合適的反應(yīng)混合物中,以便使所述第三插入物連接和自身定向到 第四??奎c(diǎn)和第二??奎c(diǎn)之間的主鏈內(nèi),重新組裝所述主鏈。
本發(fā)明另一實(shí)施方式是制備用于合成轉(zhuǎn)基因或其它復(fù)雜DNA構(gòu)建物的模 塊克隆載體質(zhì)粒的方法,所述方法包括以下步驟提供含有主鏈的克隆載體質(zhì) 粒,所述主鏈至少含有第一和第二??奎c(diǎn),所述??奎c(diǎn)各自具有可通過操作被 限制性酶切割的至少一個(gè)恒定的罕見限制性位點(diǎn);采用對(duì)應(yīng)于第一??奎c(diǎn)的至 少一個(gè)恒定的罕見限制性位點(diǎn)的第一限制性酶切割第一??奎c(diǎn),產(chǎn)生3'端露出 的切割的第一停靠點(diǎn)和5'端露出的切割的主鏈;提供含有5'端、感興趣核苷酸 序列和3'端的第一插入物,其中所述第一插入物的5'端與切割的第一??奎c(diǎn)露 出的3'端相容,所述第一插入物的3'端可通過操作(與切割主鏈露出的5'端結(jié) 合時(shí))形成具有可通過操作被第三限制性酶切割的至少一個(gè)恒定的罕見限制性 位點(diǎn)的第三停靠點(diǎn),將所述第一插入物和切割的克隆載體質(zhì)粒放入合適的反應(yīng) 混合物中,以便使所述第一插入物連接和自身定向到第一停靠點(diǎn)和第三??奎c(diǎn) 之間、第二停靠點(diǎn)上游的主鏈內(nèi),重新組裝所述主鏈,然后用第三限制性酶切 割第三停靠點(diǎn),產(chǎn)生3,端露出的切割的第三停靠點(diǎn)和5,端露出的切割的主鏈; 提供含有5,端、感興趣核苷酸序列和3,端的第二插入物,其中所述第二插入物 的5,端與切割的第三??奎c(diǎn)露出的3,端相容,第二插入物的3,端可通過操作(與 切割主鏈露出的5'端結(jié)合時(shí))形成包含可通過操作被第四限制性酶切割的至少 一個(gè)恒定的罕見限制性位點(diǎn)的第四??奎c(diǎn),將所述第二插入物和切割的克隆載 體質(zhì)粒放入合適的反應(yīng)混合物中,以便使所述第二插入物連接和自身定向到第 三??奎c(diǎn)和第四??奎c(diǎn)之間、第二??奎c(diǎn)上游的主鏈內(nèi),重新組裝所述主鏈, 然后用第四限制性酶切割第四停靠點(diǎn),產(chǎn)生3'端露出的切割的第四??奎c(diǎn),用 對(duì)應(yīng)于第二停靠點(diǎn)的至少一個(gè)恒定的罕見限制性位點(diǎn)的第二限制性酶切割第 二??奎c(diǎn),產(chǎn)生5'端露出的切割的第二??奎c(diǎn),提供含有5'端、感興趣核苷酸
序列和3'端的第三插入物,其中所述第三插入物的5'端與切割的第四停靠點(diǎn)露 出的3'端相容,所述第三插入物的3'端與切割的第二停靠點(diǎn)露出的5'端相容, 將第三插入物和切割的克隆載體質(zhì)粒放入合適的反應(yīng)混合物中,以便使所述第 三插入物連接和自身定向到第四停靠點(diǎn)和第二??奎c(diǎn)之間的主鏈內(nèi),重新組裝 所述主鏈。
可以參照以下附圖和詳述更全面地了解本發(fā)明的其它特性和優(yōu)點(diǎn)。
附圖簡(jiǎn)要說明
納入本說明書并構(gòu)成本說明書一部分的
了本發(fā)明的實(shí)施方式,附 圖與上面給出的發(fā)明概述和下面給出的詳述一起解釋了本發(fā)明的原理。
圖1是含有在遺傳模塊中克隆的多克隆位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)域模塊停靠載體的示 意圖。
圖2是含有在結(jié)構(gòu)域模塊中克隆的結(jié)構(gòu)域克隆模塊的PE3停靠載體的示 意圖。
圖3是含有在遺傳模塊中克隆的多克隆位點(diǎn)的PE3多克隆??枯d體的另 一種實(shí)施方式的示意圖。
圖4是含有在PE3載體中克隆的部件的多基因載體的示意圖。 圖5是本發(fā)明模塊構(gòu)思的另一種示意圖。 圖6是??抠|(zhì)粒圖。
圖7是說明可包含在??抠|(zhì)粒MCS中的限制性酶位點(diǎn)的例子的直線限制 性位點(diǎn)圖。
圖8是多基因(或原始)??抠|(zhì)粒圖。
圖9是說明可包含在多基因??抠|(zhì)粒MCS中的限制性酶位點(diǎn)的例子的直 線限制性位點(diǎn)圖。
圖IO是穿梭載體P("SVP")質(zhì)粒圖。
圖11是說明可包含在穿梭載體PMCS中的限制性酶位點(diǎn)的例子的直線限 制性位點(diǎn)圖。
圖12是穿梭載體E("SVE")質(zhì)粒圖。
圖13是說明可包含在穿梭載體EMCS中的限制性酶位點(diǎn)的例子的直線限
制性位點(diǎn)圖。
圖14是穿梭載體3'("SV3")圖。
圖15是說明可包含在穿梭載體3'MCS中的限制性酶位點(diǎn)的例子的直線限 制性位點(diǎn)圖。
圖16是按照本發(fā)明制備并與PE3模塊一起使用的多基因??枯d體的示意圖。
圖17是采用基因樞提供含有PE3模塊的多基因載體以將PE3模塊插入多 基因??枯d體中的示意圖。
圖18是采用多基因載體中的多克隆位點(diǎn)將PE3模塊插入多基因停靠載體 的示意圖。
圖19是采用多基因載體中的BstX-l限制性位點(diǎn)將PE3模塊插入多基因停 靠載體的示意圖。
圖20是采用多基因載體中的尋靶核酸內(nèi)切酶將PE3模塊插入多基因???載體的示意圖。
圖21是采用PE3載體和多基因載體之間的重組工程化將PE3模塊插入多 基因??枯d體中的示意圖。
序列表簡(jiǎn)述
納入本說明書并構(gòu)成本說明書一部分的所附序列表說明了本發(fā)明的實(shí)施 方式,該序列表與上面給出的發(fā)明概述和下面給出的詳述一起解釋了本發(fā)明的 原理。
SEQ:ID 01是PE3??抠|(zhì)粒MCS的核苷酸序列的例子。 SEQ:ID 02是PE3??抠|(zhì)粒的核苷酸序列的例子。 SEQ:ID 03是原始??抠|(zhì)粒MCS的核苷酸序列的例子。 SEQ:ID 04是原始??抠|(zhì)粒的核苷酸序列的例子。 SEQ:ID 05是穿梭載體P質(zhì)粒MCS的核苷酸序列的例子。 SEQ:ID 06是穿梭載體P質(zhì)粒的核苷酸序列的例子。 SEQ:ID 07是穿梭載體E質(zhì)粒MCS的核苷酸序列的例子。 SEQ:ID 08是穿梭載體E質(zhì)粒的核苷酸序列的例子。
SEQ:ID 09是穿梭載體3質(zhì)粒MCS的核苷酸序列的例子。 SEQ:ID 10是穿梭載體3質(zhì)粒的核苷酸序列的例子。
用于描述本發(fā)明的術(shù)語定義
出于本發(fā)明目的,以下術(shù)語定義如下
"染色質(zhì)修飾結(jié)構(gòu)域"(CMD)指與維持和/或改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)有關(guān)的各種蛋
白質(zhì)相互作用的核苷酸序列。
"克隆"指將DNA分子連接到質(zhì)粒中和將其轉(zhuǎn)移到合適宿主細(xì)胞中以便在 宿主增殖過程中復(fù)制的過程。
術(shù)語"克隆載體"指至少含有復(fù)制起點(diǎn)、陽性選擇攜帶該載體的宿主細(xì)胞的 部件如抗生素抗性基因、和多克隆位點(diǎn)的環(huán)形DNA分子??寺≥d體可由質(zhì)粒、 粘粒、人工染色體(BAC、 PAC、 YAC和其它)或病毒載體主鏈組成。
"關(guān)聯(lián)序列"指限制性酶結(jié)合和切割DNA分子或基因所需的最小核苷酸鏈。
"常見"指在基因組內(nèi)出現(xiàn)頻率相對(duì)較高的任何限制性位點(diǎn)。 "相容"指可與用相同限制性酶切割或通過其它方法產(chǎn)生的其它互補(bǔ)性末
端形成氫鍵的DNA鏈的5'或3'末端或端。由于含有限制性酶的特異性限制性 位點(diǎn)的DNA與含有相同序列的任何其它DNA的切割方式相同,所以這些切 割末端互補(bǔ),從而相容。因此,用同一限制性酶切割的任何DNA分子的末端 互相"匹配",類似于拼圖相鄰部分的"匹配",并可通過酶將它們連接在一起。 結(jié)合在一起時(shí),相容性末端將形成特定限制性酶的限制性位點(diǎn)。
"從頭合成"指通過連接代表全部所需DNA分子的亞序列的互補(bǔ)單鏈DNA 分子相容性突出端,合成任何長度的雙鏈DNA分子的過程。
"DNA構(gòu)建物"指在克隆載體質(zhì)粒內(nèi)連續(xù)進(jìn)行克隆步驟合成的DNA分子, 它常常用于在任何合適細(xì)胞宿主如培養(yǎng)細(xì)胞中體外指導(dǎo)基因表達(dá),或在轉(zhuǎn)基因 小鼠體內(nèi)指導(dǎo)基因表達(dá)。用于制備這類小鼠的轉(zhuǎn)基因也可稱為DNA構(gòu)建物, 尤其是在設(shè)計(jì)和合成轉(zhuǎn)基因的階段。
"DNA片段"指任何分離的DNA分子,包括但不限于蛋白質(zhì)編碼序列、報(bào) 道基因、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、內(nèi)含子、外顯子、聚A尾、多克隆位點(diǎn)、核定位信 號(hào)或mRNA穩(wěn)定化信號(hào)、或者任何其它天然產(chǎn)生或合成的DNA分子?;蛘?, DNA片段可以完全是由合成來源在體外產(chǎn)生的。而且,DNA片段可包含天然 產(chǎn)生和/或合成的分離片段的任何組合。
"??抠|(zhì)粒"指專門用于本發(fā)明,將DNA片段組裝到DNA構(gòu)建物中的克 隆載體質(zhì)粒。
"核酸內(nèi)切酶",在本文中也常常稱為"限制性酶",指能結(jié)合DNA分子編 碼的限制性位點(diǎn)并且在該序列內(nèi)部或附近的準(zhǔn)確位置上切割該DNA分子的一 類催化分子的成員。
術(shù)語"核酸內(nèi)切酶限制性位點(diǎn)"或"限制性位點(diǎn)"(以及"關(guān)聯(lián)序列",見上)指限 制性酶結(jié)合和切割DNA分子或基因所需的最小核苷酸鏈。
"增強(qiáng)子區(qū)"指對(duì)于靶基因的表達(dá)不是必需的,但在合適條件下能提高基因 表達(dá)水平的核苷酸序列。
"基因表達(dá)宿主選擇基因"(GEH-S)指可賦予宿主生物體某特征的遺傳元 件,該特征可通過光學(xué)感受器、PCR擴(kuò)增、生化實(shí)驗(yàn)或細(xì)胞/生物體存活實(shí)驗(yàn)(用 合適的抗生素或化學(xué)物質(zhì)處理時(shí)使細(xì)胞或生物體有抗性或受毒害)進(jìn)行選擇、 跟蹤或檢測(cè)。
術(shù)語"基因啟動(dòng)子"或"啟動(dòng)子"(P)可互換使用,指表達(dá)基因所需的核苷酸序列。
術(shù)語"插入物"和"模塊"基本上可互換,僅有的微細(xì)差別是將"插入物"插入 載體中, 一旦插入后,常常稱為"模塊"。然后,可去除載體中的模塊。另外, 術(shù)語"插入物"常常用于分離的模塊,用作插入模塊受體載體的插入物。
"內(nèi)含子"指兩個(gè)蛋白質(zhì)編碼區(qū)或外顯子之間存在的基因的非蛋白質(zhì)編碼 區(qū)核苷酸序列。
"定位信號(hào)"(LOC)指編碼感興趣蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞途徑的信號(hào)的核苷酸序列。
"多克隆位點(diǎn)"(MCS)指含有將DNA片段克隆到克隆載體質(zhì)粒中的至少一 個(gè)獨(dú)特的限制性位點(diǎn),更一般地含有一組獨(dú)特的限制性位點(diǎn)的核苷酸序列。
術(shù)語"mRNA穩(wěn)定化元件"指通過結(jié)合認(rèn)為能保護(hù)一些mRNA不降解的蛋 白質(zhì)而識(shí)別的DNA序列。
提到一組限制性位點(diǎn)時(shí),術(shù)語"通過操作限定"指用一種關(guān)聯(lián)限制性酶切割 該組中任何一種限制性位點(diǎn)時(shí),突出端殘基代表該組限制性位點(diǎn)下游核苷酸序 列的5'部分。
術(shù)語"復(fù)制起點(diǎn)"(ORI)指指導(dǎo)質(zhì)粒在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制或倍增的核苷酸序列。
"PCR終止子突出端克隆技術(shù)"指用聚合酶鏈反應(yīng)與單鏈DNA引物擴(kuò)增遺 傳模塊的方法,所述單鏈DNA引物含有受保護(hù)的5'突出端核苷酸,可用作與 互補(bǔ)DNA突出端的連接位點(diǎn)。
"聚A尾"指通常存在于信使RNA(mRNA)分子末端的腺嘌呤(A)核苷酸序 列。將聚A尾信號(hào)摻入DNA構(gòu)建物或轉(zhuǎn)基因的3'端能促進(jìn)感興趣基因的表達(dá)。
"引物位點(diǎn)"指為了啟動(dòng)DNA測(cè)序、PCR擴(kuò)增和/或RNA轉(zhuǎn)錄,單鏈DNA 寡核苷酸可與其退火連接的用作DNA模板的核苷酸序列。
術(shù)語"pUC19"是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的質(zhì)??寺≥d體,可參見NCBI Genbank數(shù)據(jù)庫的登錄號(hào)弁L09137。
"隨機(jī)核苷酸序列"指不與編碼指定為同一分子組件的其它元件的序列相 重復(fù)的核苷酸序列的任意組合。隨機(jī)序列所需的核苷酸數(shù)目取決于側(cè)接該隨機(jī) 序列的限制性酶的要求。大多數(shù)核酸內(nèi)切酶至少需要2-4個(gè)額外的隨機(jī)序列, 以便使DNA結(jié)合穩(wěn)定化。隨機(jī)序列的數(shù)量優(yōu)選為3(對(duì)應(yīng)于組成密碼子的核苷 酸數(shù)目)的倍數(shù)。因此,隨機(jī)序列的最小數(shù)目優(yōu)選為6,然而,可采用更少或更 多的核苷酸。
"罕見"指在基因組內(nèi)出現(xiàn)頻率相對(duì)較低的限制性位點(diǎn)。
"重組臂"指能促進(jìn)轉(zhuǎn)基因DNA和基因組DNA之間同源重組的核苷酸序 列。成功的重組需要存在能夠通過同源重組摻入宿主基因組中的、側(cè)接于轉(zhuǎn)基 因DNA某區(qū)域的左重組臂(LRA)和右重組臂(RRA)。
"重組工程"指聯(lián)合采用隨機(jī)或位點(diǎn)選擇性重組酶和DNA序列的過程,重 組酶可作用于所述DNA序列將一部分遺傳物質(zhì)由一個(gè)DNA分子運(yùn)輸?shù)搅硪?個(gè)不同DNA分子。
"報(bào)道基因"指編碼可用于監(jiān)測(cè)感興趣具體啟動(dòng)子的活性的蛋白質(zhì)的核苷 酸序列。
"限制性核酸內(nèi)切酶"或"限制性酶"指能結(jié)合DNA關(guān)聯(lián)序列并且在該序列 內(nèi)部的準(zhǔn)確位置上切割該DNA分子的一類催化分子的成員。
"穿梭載體"指本發(fā)明所用的一種專門的克隆載體質(zhì)粒,用于制備能夠修飾 DNA片段末端的中間體分子。
"標(biāo)簽序列"(TAG)指編碼能夠檢測(cè)、或者在一些情況下能與任何內(nèi)源性對(duì) 應(yīng)物區(qū)別開的獨(dú)特蛋白質(zhì)區(qū)域的核苷酸序列。
"非翻譯區(qū)"(UTR)指包含mRNA分子的非蛋白質(zhì)編碼區(qū)的核苷酸序列。這 些非翻譯區(qū)可位于mRNA分子的5'端(5' UTR)或3'端(3' UTR)。
"獨(dú)特"指不存在于特定DNA分子內(nèi)任何其它位置的任何限制性核酸內(nèi)切 酶或HE位點(diǎn)。
發(fā)明詳述
本發(fā)明提供了通過提供其中含有模塊克隆或??奎c(diǎn)的主鏈,產(chǎn)生用于合成 PE3轉(zhuǎn)基因或其它復(fù)雜DNA構(gòu)建物的多基因??枯d體的結(jié)構(gòu)和方法,所述多 基因??枯d體一般是質(zhì)粒載體,也稱為模塊克隆載體??赏ㄟ^本發(fā)明,采用經(jīng) 優(yōu)化減少頻繁需要的操作量的克隆載體將各種DNA片段組裝到從頭DNA構(gòu) 建物或轉(zhuǎn)基因中。PE3轉(zhuǎn)基因載體在本文中稱為PE3??枯d體或??抠|(zhì)粒,一 般含有以直線方式排列的至少一個(gè)多克隆位點(diǎn)(MCS)和多組罕見限制性位點(diǎn)和 /或獨(dú)特的尋靶核酸內(nèi)切酶("HE")位點(diǎn)。這種排列確定了模塊結(jié)構(gòu),使得使用者 能夠?qū)⒔Y(jié)構(gòu)域模塊作為插入物置入PE3轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物中,而不破壞已經(jīng)在以前 的克隆步驟中摻入停靠質(zhì)粒的DNA元件的完整性。
雖然本發(fā)明公開并列舉了用于將遺傳結(jié)構(gòu)域模塊構(gòu)建到PE3轉(zhuǎn)基因模塊 中的模塊載體和方法以及用于插入多基因載體,即質(zhì)粒克隆載體的PE3轉(zhuǎn)基因 模塊,但也可采用相似方法在較大的染色體外DNA分子如粘粒或人工染色體, 包括細(xì)菌人工染色體(BAC)中構(gòu)建遺傳結(jié)構(gòu)域模塊和PE3轉(zhuǎn)基因模塊。由于可 摻入質(zhì)粒克隆載體的遺傳元件的種類很多,所以只需很少操作或者無需進(jìn)一步 操作就可將最終PE3轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到各種宿主生物體中。
本發(fā)明提供了各??奎c(diǎn)(基因樞)和各結(jié)構(gòu)域模塊或插入物的5'和3'端均與 另一??奎c(diǎn)或插入物的相應(yīng)端相容(的實(shí)施方式)。例如,如果第一??奎c(diǎn)含有
恒定的罕見限制性酶如SgrAl的限制性位點(diǎn),隨后切割該??奎c(diǎn),那么準(zhǔn)備插 入切割的第一??奎c(diǎn)3'端的第一插入物將含有相容性5,端,以當(dāng)插入物與第一 ??奎c(diǎn)組合時(shí)產(chǎn)生SgrAl的限制性位點(diǎn)。質(zhì)粒內(nèi)的第二??奎c(diǎn)可以(例如)含有 恒定的限制性酶如Swal的限制性位點(diǎn)。任何第二插入物的3'端都將具有相容 性核苷酸序列,以便與切割的第二??奎c(diǎn)切割的5'端組合,產(chǎn)生SwaI的限制 性位點(diǎn)。另外,為了適當(dāng)?shù)夭迦肽K克隆載體質(zhì)粒和隨后在同一點(diǎn)上去除,第 一插入物的3,端和第二插入物的5'端必須含有相容性末端,以產(chǎn)生第三種恒定 的罕見限制性酶,如Pacl或Sail的第三限制性位點(diǎn)。
本發(fā)明結(jié)構(gòu)域模塊??枯d體在本文中也稱為"穿梭載體",它能在結(jié)構(gòu)域模 塊中穿梭到PE3??枯d體中,其包含具有常見限制性位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn),該位 點(diǎn)側(cè)接于至少一個(gè)罕見限制性位點(diǎn),任選地側(cè)接于HE位點(diǎn)。設(shè)計(jì)穿梭載體, 以便將DNA片段克隆到罕見限制性位點(diǎn)之間的常見限制性位點(diǎn)中。隨后可通 過在罕見限制性(或HE)位點(diǎn)上切割而釋放該克隆的片段,用同樣的罕見限制性 位點(diǎn)和/或HE位點(diǎn)或穿梭載體中存在的位點(diǎn)將其摻入PE3??枯d體中。
因此,與常規(guī)克隆載體不同的是,MCS的設(shè)計(jì)允許采用含有一組罕見限 制性位點(diǎn)的確定的基因樞將結(jié)構(gòu)域模塊("盒"或DNA片段模塊)插入PE3???載體(停靠質(zhì)粒)的模塊區(qū)。同樣,可采用相同的罕見限制性酶和/或HE酶容易 地去除各模塊,并用任何其它感興趣的DNA片段取代。這種特征使得使用者 能夠迅速而容易地改變實(shí)驗(yàn)計(jì)劃的方向,而不必重建整個(gè)DNA構(gòu)建物。因此, 本發(fā)明的結(jié)構(gòu)域模塊和PE3克隆載體使得使用者能夠?qū)NA片段克隆到中間 性結(jié)構(gòu)域模塊載體中(利用常規(guī)的限制性位點(diǎn),產(chǎn)生盒-接受模塊),然后通 過罕見限制性位點(diǎn)將模塊片段轉(zhuǎn)移到最終構(gòu)建物中所需的模塊部位。而且,將 來能用其它盒模塊取代PE3停靠質(zhì)粒中的各個(gè)模塊,從而改變?cè)摲肿?。以下?述指出了與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明的獨(dú)特之處。
各??奎c(diǎn)(由基因樞確定)代表優(yōu)選有至少兩個(gè)固定的恒定的罕見限制性 位點(diǎn)的區(qū)域,更優(yōu)選有至少三個(gè)恒定的罕見限制性位點(diǎn)的固定群,最優(yōu)選有不 多于4個(gè)恒定的罕見限制性位點(diǎn)的固定群。各??奎c(diǎn)的具體限制性位點(diǎn)由其關(guān) 聯(lián)限制性酶切割。這會(huì)產(chǎn)生所需的5'或3'端,與含有所選核苷酸序列,如啟動(dòng) 子、表達(dá)或調(diào)控核苷酸序列的預(yù)構(gòu)建插入物之一的互補(bǔ)性5'或3'端相容。各自
的5'和3'端與感興趣的切割??奎c(diǎn)相容的至少兩種插入物可與切割的克隆載體
質(zhì)粒一起加入合適的反應(yīng)混合物中,在合適的熱力學(xué)環(huán)境下,插入物可同時(shí)(即 在一個(gè)步驟中)整合到克隆載體質(zhì)粒中。在這次單獨(dú)的加入和連接反應(yīng)中,再 次形成??奎c(diǎn),克隆載體質(zhì)粒變成模塊,因?yàn)榭梢杂煤线m的限制性酶再次切割 ??奎c(diǎn)和兩個(gè)模塊之間的連接。隨后可去除該模塊,將新模塊放入其位置。 雖然可能在側(cè)接模塊的樞點(diǎn)上采用單個(gè)限制性位點(diǎn),但明顯可能的是,單
個(gè)"罕見"限制性位點(diǎn)在所述特定DNA分子中出現(xiàn)頻率很高。想到限制性酶位
點(diǎn)頻率是4"的函數(shù),如上所述。例如,克隆載體質(zhì)粒中的特定啟動(dòng)子模塊的
DNA序列中可含有罕見限制性位點(diǎn)(也存在于其樞點(diǎn)上),因此使樞點(diǎn)上含有一 個(gè)以上限制性位點(diǎn)有優(yōu)點(diǎn)。因此,優(yōu)選在一個(gè)樞點(diǎn)上采用一個(gè)以上罕見限制性 位點(diǎn),因?yàn)楦信d趣模塊的DNA序列內(nèi)存在一個(gè)以上某限制性位點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)概 率低得多。然而,也優(yōu)選單個(gè)樞點(diǎn)上存在不多于三個(gè)或四個(gè)限制性位點(diǎn),否則 限制性位點(diǎn)開始"群集",影響靶分子的轉(zhuǎn)錄/翻譯。對(duì)于上述數(shù)目,群集的限制 性位點(diǎn)組合的長度至多為18-24 bp。
結(jié)構(gòu)域模塊載體
圖1顯示了本發(fā)明第一個(gè)實(shí)施方式結(jié)構(gòu)域模塊停靠載體1的簡(jiǎn)化示意圖。 載體l由具有多克隆位點(diǎn)2的DNA鏈組成, 一般是質(zhì)粒。該結(jié)構(gòu)域模塊停靠 載體包含由五個(gè)克隆位點(diǎn)組成的多克隆模塊(MC模塊),這五個(gè)克隆位點(diǎn)的排 列依次是MC-1、 MC-2、 MC-3、 MC-4和MC-S。該多克隆位點(diǎn)包含獨(dú)立地選 自常見限制性位點(diǎn)的多個(gè)限制性位點(diǎn),如下所述。兩個(gè)限制性位點(diǎn)確定感興趣 遺傳物質(zhì)的??课恢?,如感興趣基因3。 MC模塊使得能夠?qū)⒏信d趣遺傳物質(zhì) 亞克隆到MC模塊多克隆位點(diǎn)中兩個(gè)限制性位點(diǎn)之間。感興趣基因3 —般由感 興趣基因載體釋放(未顯示),包含一對(duì)克隆位點(diǎn)4a和4b,如MC-1和MC-3所 示。
結(jié)構(gòu)域模塊停靠載體也包含側(cè)接多克隆位點(diǎn)2的一對(duì)限制性位點(diǎn),稱為基 因樞5和6。所述基因樞各自包含至少兩個(gè)恒定的罕見限制性位點(diǎn),如下所述。 基因樞5和6通過操作分別確定了 MC模塊的5'和3'部分。
在本發(fā)明的第二個(gè)實(shí)施方式中,關(guān)聯(lián)限制性酶MC-1和MC-3(未顯示)可
由感興趣基因的載體上切下感興趣基因,并在MC-l和MC-3 MC位點(diǎn)上打開 MC模塊,從而將感興趣基因連接到MC-1和MC-3 MC位點(diǎn)之間,形成結(jié)構(gòu) 域模塊載體7。在說明性實(shí)施方式中,感興趣基因包含表達(dá)結(jié)構(gòu)域,因此該結(jié) 構(gòu)域模塊是表達(dá)模塊,該結(jié)構(gòu)域模塊載體更具體是表達(dá)模塊載體。表達(dá)模塊載 體包含表達(dá)模塊8,該模塊含有第一和第二基因樞5和6,所述基因樞側(cè)接的 核酸序列包含亞克隆的含有表達(dá)結(jié)構(gòu)域的感興趣基因3。
在說明性實(shí)施方式中,感興趣基因包含表達(dá)結(jié)構(gòu)域,其中在下文中將第一 基因樞(或表達(dá)結(jié)構(gòu)域5'部分)稱為GP2,將第二基因樞(或表達(dá)結(jié)構(gòu)域3'部分) 稱為GP3??衫斫猓谄渌鼘?shí)施方式中,感興趣基因可包含啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)域或3' 調(diào)控結(jié)構(gòu)域,因此其亞克隆分別提供了啟動(dòng)子模塊載體中的啟動(dòng)子模塊和3' 調(diào)控模塊載體中的3'調(diào)控模塊模塊。在啟動(dòng)子模塊??枯d體中,在下文中將第 一基因樞(或啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)域5'部分)稱為GP1 ,將第二基因樞(或啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)域3' 部分)稱為GP2。在3'調(diào)控模塊??枯d體中,在下文中將第一基因樞(或3'調(diào)控 結(jié)構(gòu)域5'部分)稱為GP3,將第二基因樞(或3'調(diào)控結(jié)構(gòu)域3'部分)稱為GP4。
任何結(jié)構(gòu)域模塊停靠載體的基因樞,包括基因樞GP1、GP2、GP3和GP4, 可包含選自下組的罕見限制性位點(diǎn)AsiSI、 Pacl、 Sbfl、 Fse I、 Asc I、 Mlu I、 SnaB I、 Not I、 Sal I、 Swa I、 Rsr II、 BsiW I、 Sfo I、 SgrA I、 AflIII、 Pvu I、 NgoMIV、 Asel、 Flpl、 Pmel、 Sdal、 Sgfl、 Srf I和Sse8781 I,更一般地 選自AsiS I、 Pac I、 Sbf I、 Fse I、 Asc I、 Mlu I、 SnaB I、 Not I、 Sal I、 Swa I、 RsrII、 BSiWI。基因樞的更一般的實(shí)施方式含有一系列(至少3個(gè)、不多于 4個(gè))罕見限制性位點(diǎn),任何一種基因樞一般都不包含任何其它基因樞的罕見限 制性位點(diǎn)。
在優(yōu)選實(shí)施方式中,基因樞GP1至少選自AsiSI、 Pac I或Sbf I,基因樞 GP2至少選自Fsel、 Asc I或Mlu I,基因樞GP3至少選自SnaB I、 Not I或Sal I,基因樞GP4至少選自Swal、 RsrII和BSiWI。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式 中,基因樞GPI依次由AsiSI、 PacI和SbfI組成;基因樞GP2依次由Fse I、 Asc I和Mlu I組成;基因樞GP3依次由SnaB I、 Not I和Sal I組成;基因樞 GP4依次由Swa I、 Rsr II和BSiW I組成。
也可理解,多克隆位點(diǎn)可包含采用反向順序(如MC-5、 MC-4、 MC-3、MC-2和MC-1)和其它類型克隆位點(diǎn)的限制性位點(diǎn)的其它組合(較多或較少數(shù)量 的位點(diǎn))??筛淖兌嗫寺∥稽c(diǎn),以適應(yīng)具體感興趣基因的克隆位點(diǎn)對(duì)。
在另一實(shí)施方式中還考慮了結(jié)構(gòu)域模塊停靠載體文庫,可采用這些載體容 易地亞克隆各種感興趣基因??蓸?gòu)建結(jié)構(gòu)域模塊??枯d體文庫,以用作專用的 啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)域模塊載體、表達(dá)結(jié)構(gòu)域模塊載體或3'調(diào)控模塊載體,這取決于根 據(jù)具體結(jié)構(gòu)域模塊??枯d體選擇的基因樞的類型。啟動(dòng)子、表達(dá)和3'調(diào)控結(jié)構(gòu) 域模塊載體的各個(gè)亞文庫含有其專用的基因樞對(duì)(即,GP1和GP2、 GP2和GP3 以及GP3和GP4),以保證將各個(gè)結(jié)構(gòu)域模塊適當(dāng)?shù)乜寺〉礁呒?jí)的PE3???載體中,如下所述。
PE3停靠和PE3 MC??枯d體
圖2顯示了本發(fā)明第三個(gè)實(shí)施方式、第一 PE3??枯d體10的簡(jiǎn)化示意圖。 PE3??枯d體10由具有至少第一克隆模塊lib的DNA鏈組成, 一般是質(zhì)粒。 所述至少第一克隆模塊至少含有第一和第二基因樞,如GP2禾卩GP3所示,其 側(cè)接于含有填充片段18b的核酸序列。DNA填充片段結(jié)構(gòu)域是不編碼PE3停 靠載體內(nèi)存在的限制性位點(diǎn)或任何其它生物學(xué)功能的隨機(jī)核苷酸序列。填充片 段DNA通過提供限制性酶可結(jié)合的較長的DNA鏈,而提高限制性酶切割活 性的效率。這很重要,因?yàn)槿绻鸇NA長度有限,則許多限制性酶無法結(jié)合和 切割其關(guān)聯(lián)識(shí)別位點(diǎn)。第一和第二基因樞如本文所述。構(gòu)建第一克隆模塊llb, 以便將至少一個(gè)第一結(jié)構(gòu)域模塊克隆到PE3克隆模塊中。在第一克隆模塊是表 達(dá)結(jié)構(gòu)域克隆模塊的說明性實(shí)施方式中,第一和第二基因樞表示為GP2和 GP3,其定義如上所述。含有填充片段的第一克隆模塊llb也稱為表達(dá)填充模 塊,它提供了用于插入含有相容性基因樞的表達(dá)結(jié)構(gòu)域模塊的??课恢?。相容 性基因樞是含有與克隆模塊的基因樞相同的限制性位點(diǎn),或者至少一個(gè)獨(dú)特的 罕見限制性位點(diǎn)相同的基因樞。
也說明了 ,第二克隆模塊1 la是啟動(dòng)子填充模塊,其第一基因樞12是GP1 , 第二基因樞13是GP2, GP2是與克隆模塊lib的5'部分共有的連接。啟動(dòng)子 填充模塊lla包含填充片段,并提供了插入含有相容性基因樞的啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)域 模塊的??课恢?,所述啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)域模塊在克隆后取代了啟動(dòng)子填充模塊。第 三克隆模塊llc是3'調(diào)控填充模塊,其第一基因樞14是GP3,第二基因樞15 是GP4, GP3是與克隆模塊lib的3'部分共有的連接。3'調(diào)控性填充模塊llc 含有填充片段,并為含有相容性基因樞的3'調(diào)控結(jié)構(gòu)域模塊的插入提供了???位置,所述3'調(diào)控結(jié)構(gòu)域模塊在克隆后取代3'調(diào)控填充模塊。
在本發(fā)明的第四個(gè)實(shí)施方式中,一種結(jié)構(gòu)域模塊載體的各基因樞中所含的 罕見限制性位點(diǎn)之一的關(guān)聯(lián)限制性酶(如表達(dá)模塊7所示)可切割載體上的罕見 限制性位點(diǎn),同樣在相應(yīng)基因樞GP2和GP3中的相同罕見限制性位點(diǎn)上打開 PE3??枯d體,從而用表達(dá)模塊取代表達(dá)填充模塊。在另一獨(dú)立的克隆事件中, 可采用啟動(dòng)子模塊基因樞(未顯示)和啟動(dòng)子填充模塊lla的相應(yīng)基因樞12和 13的合適關(guān)聯(lián)限制性酶,以將啟動(dòng)子模塊連接到PE3模塊中,從而用啟動(dòng)子 模塊取代啟動(dòng)子填充模塊。同樣,可將3'調(diào)控模塊連接到PE3模塊中。
在本發(fā)明中,至少兩種,更一般地至少三種罕見限制性位點(diǎn)被用作??繕?或基因樞。遺傳序列中罕見限制性位點(diǎn)的稀有性使得不可能在??枯d體中發(fā)現(xiàn) 雙位點(diǎn)基因樞中的兩個(gè)罕見限制性位點(diǎn),更不可能發(fā)現(xiàn)三位點(diǎn)基因樞中的全部 三個(gè)罕見限制性位點(diǎn)。發(fā)現(xiàn)DNA克隆載體含有該基因樞罕見限制性位點(diǎn)中的 一種時(shí),技術(shù)人員可用一種其它關(guān)聯(lián)罕見限制性酶切割該基因樞。例如,如果 GP2基因樞由Fsel、 AscI和MluI組成,PE3停靠載體或E結(jié)構(gòu)域本身的序 列內(nèi)含有Asc I,那么技術(shù)人員可采用Fse I或Mlu I來切割該基因樞。
PE3載體的DNA克隆載體一般還含有由PE3??枯d體釋放PE3克隆模塊, 以便克隆到多基因停靠載體中的部件,如下所述。
圖3顯示了將結(jié)構(gòu)域模塊克隆到PE3多克隆(MC)??枯d體20中的另一種 實(shí)施方式。稱為PE3 MC-啟動(dòng)子停靠載體20a的第一 PE3 MC??枯d體由含有 至少第一克隆模塊21a的DNA鏈組成, 一般是質(zhì)粒。第一克隆模塊21a至少 包含第一和第二基因樞(如GP1和GP2所示),其側(cè)接的核酸序列包含含有獨(dú)立 地選自常見限制性位點(diǎn)的多個(gè)限制性位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)(MCS),如下所述。在 說明性實(shí)施方式中,PE3MC-啟動(dòng)子??枯d體20有三個(gè)克隆模塊21a、 21b和 21c,各自通過基因樞GP1、 GP2、 GP3和GP4結(jié)合,如本文所述。第二和第 三克隆模塊表示為包含含有填充片段的核酸序列的填充模塊。
多克隆位點(diǎn)由五個(gè)克隆位點(diǎn)組成,它們依次是MC-l、MC-2、MC-3、MC-4、
MC-5和MC-6。任何兩個(gè)限制性位點(diǎn)可確定感興趣遺傳物質(zhì)的??课恢谩T?PE3 MC??枯d體20a中,感興趣遺傳物質(zhì)一般是啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)域。可根據(jù)在PE3 MC??枯d體20a中這些限制性位點(diǎn)是獨(dú)特的這一理解來選擇兩個(gè)感興趣的克 隆位點(diǎn)。
另一種實(shí)施方式包括PE3 MC-表達(dá)??枯d體,其中第二克隆模塊21b含有 多克隆位點(diǎn),其余第一和第三克隆模塊21a和21c含有填充片段,以及PE3 MC-3調(diào)控??枯d體,其中第三克隆模塊21c包含多克隆位點(diǎn),其余第一和第 二克隆模塊21a和21b含有填充片段。在其它另選實(shí)施方式中,三種克隆模塊 中兩種可含有多克隆位點(diǎn)。
如上所述,在PE3??枯d體中,用感興趣遺傳物質(zhì)亞克隆多克隆位點(diǎn)和 將結(jié)構(gòu)域模塊克隆到填充模塊中。
GP1、 GP2、 GP3和GP4基因樞相對(duì)于啟動(dòng)子、表達(dá)和3'調(diào)控結(jié)構(gòu)域模塊 中各個(gè)模塊的位置如上所述。
本發(fā)明也提供了由模塊結(jié)構(gòu)域載體和PE3模塊克隆載體制備PE3載體的 方法。構(gòu)建PE3模塊載體的第一種方法包括以下步驟
a) 提供含有PE3克隆模塊的PE3克隆載體,所述PE3克隆模塊依次包含 含有至少兩個(gè)恒定的罕見限制性位點(diǎn)的第一基因樞,由含有填充片段的核酸序 列組成的至少第一填充模塊,和第二基因樞;
b) 提供至少第一結(jié)構(gòu)域模塊載體,其依次包含第一基因樞,由含有感興 趣遺傳物質(zhì)的核酸序列組成的感興趣遺傳模塊;和第二基因樞;
c) 提供第一基因樞罕見限制性位點(diǎn)之一的第一關(guān)聯(lián)限制性酶和第二基因 樞罕見限制性位點(diǎn)之一的第二關(guān)聯(lián)限制性酶;
d) 用所述第一和第二關(guān)聯(lián)限制性酶由所述第一結(jié)構(gòu)域模塊載體切下和分 離感興趣遺傳模塊;
e訴所述第一和第二關(guān)聯(lián)限制性酶由所述PE3克隆載體的PE3克隆模塊切 下第一填充模塊;和
f)將感興趣遺傳模塊連接到PE3克隆模塊中。
提供的PE3克隆模塊在第二基因樞后還依次包含第二填充模塊和第三基 因樞時(shí),該方法還包括以下步驟 g) 提供第二結(jié)構(gòu)域模塊載體,其依次包含第二基因樞、由含有第二種感興 趣遺傳物質(zhì)的核酸序列組成的感興趣的第二遺傳模塊;和第三基因樞;
h) 提供第三基因樞罕見限制性位點(diǎn)之一的第三關(guān)聯(lián)限制性酶;
i) 用第二和第三關(guān)聯(lián)限制性酶由第二結(jié)構(gòu)域模塊載體切下和分離感興趣的 第二遺傳模塊;
j)采用第二和第三關(guān)聯(lián)限制性酶切下PE3克隆載體的PE3克隆模塊中的第
二填充模塊;和
k)將感興趣的第二遺傳模塊連接到PE3克隆模塊中。
相似地,可采用第三基因樞和關(guān)聯(lián)限制性酶將感興趣的第二遺傳模塊切下 并連接到PE3克隆模塊中,從而將感興趣的第三遺傳模塊插入PE3中。該方 法能將感興趣遺傳模塊連續(xù)安置到PE3克隆載體中。感興趣的第一、第二和第 三遺傳模塊通常分別對(duì)應(yīng)于啟動(dòng)子模塊、表達(dá)模塊和3'調(diào)控模塊。在典型實(shí)施 方式中,第一基因樞是GP1,第二基因樞是GP2,第三基因樞是GP3,第四基 因樞是GP4,如上所述。
在另一實(shí)施方式中,提供了制備PE3克隆載體的方法,所述方法包括以 下步驟
a) 提供具有主鏈的PE3克隆載體,所述主鏈至少包含第一、第二、第三和 第四基因樞,這些基因樞以5'-3'方向連續(xù)(sequentially)排列,各自具有可通 過操作被關(guān)聯(lián)限制性酶切割的至少兩個(gè)恒定的罕見限制性位點(diǎn);
b) 用第一基因樞中恒定的罕見限制性位點(diǎn)之一的第一關(guān)聯(lián)限制性酶切割 第一基因樞,產(chǎn)生3'端露出的切割的第一基因樞;
c) 用第二基因樞中恒定的罕見限制性位點(diǎn)之一的第二關(guān)聯(lián)限制性酶切割 第二基因樞,產(chǎn)生5'端露出的切割的第二基因樞;
d) 提供含有5'端、感興趣的第一遺傳物質(zhì)和第一基因樞3'端的第一結(jié)構(gòu)域 模塊,其中第一結(jié)構(gòu)域模塊的5'端與切割的第一基因樞露出的3'端相容,第一 結(jié)構(gòu)域的3'端與切割的第二基因樞露出的5'端相容;和
e) 將第一結(jié)構(gòu)域模塊和切割的PE3克隆載體放入合適的反應(yīng)混合物中,以 便使所述第一結(jié)構(gòu)域模塊連接和自身定向到第一基因樞和第二基因樞之間的 主鏈內(nèi),重新組裝所述主鏈。
該方法還可包括以下步驟
f) 隨后用第二關(guān)聯(lián)限制性酶切割第二基因樞,產(chǎn)生3'端露出的切割的第二 基因樞;
g) 用第三基因樞的罕見限制性位點(diǎn)之一的第三關(guān)聯(lián)限制性酶切割第三基 因樞,產(chǎn)生5,端露出的切割的第三基因樞;
h) 提供含有5'端、感興趣的第一遺傳物質(zhì)和3'端的第二結(jié)構(gòu)域模塊,其中 第二結(jié)構(gòu)域模塊的5'端與切割的第二基因樞露出的3'端相容,第二結(jié)構(gòu)域模塊 的3,端與切割的第三基因樞露出的5,端相容;和
i) 將第二結(jié)構(gòu)域模塊和切割的PE3克隆載體放入合適的反應(yīng)混合物中,以 便使所述第二結(jié)構(gòu)域模塊連接和自身定向到第二基因樞和第三基因樞之間的 主鏈內(nèi),重新組裝所述主鏈。
該方法還可提供以下步驟
j)隨后用第三關(guān)聯(lián)限制性酶在第三基因樞上切割主鏈,產(chǎn)生3'端露出的切 割的第三基因樞;
k)用第四基因樞的罕見限制性位點(diǎn)之一的第四關(guān)聯(lián)限制性酶切割第四基 因樞,產(chǎn)生5'端露出的切割的第四基因樞;
1)提供含有5,端、感興趣的第三遺傳物質(zhì)和3,端的第三結(jié)構(gòu)域模塊,其中 第三結(jié)構(gòu)域模塊的5'端與切割的第三基因樞露出的3'端相容,第三結(jié)構(gòu)域模塊 的3'端與切割的第四基因樞露出的5'端相容;和
m)將第三結(jié)構(gòu)域模塊和切割的PE3克隆載體放入合適的反應(yīng)混合物中, 以便使第三結(jié)構(gòu)域模塊連接和自身定向到第三基因樞和第四基因樞之間的主 鏈內(nèi),重新組裝所述主鏈。
感興趣的第一、第二和第三遺傳模塊通常分別對(duì)應(yīng)于啟動(dòng)子模塊、表達(dá)模 塊和3'調(diào)控模塊。在典型的實(shí)施方式中,第一基因樞是GP1,第二基因樞是 GP2,第三基因樞是GP3,第四基因樞是GP4,如上所述。
多基因克隆載體
本發(fā)明的PE3停靠載體和MC??枯d體提供了容易和快速地組裝一個(gè)或 多個(gè)感興趣的PE3轉(zhuǎn)基因的方法。本發(fā)明也提供了將一個(gè)或多個(gè)PE3模塊快
速和容易地插入模塊多基因載體中的方法。圖4顯示將PE3模塊插入含有一個(gè) 或(如本文所述)多個(gè)PE3填充模塊的多基因??枯d體的簡(jiǎn)化示意圖,其中不難 釋放所述填充模塊,以便插入一個(gè)或多個(gè)PE3模塊。下文和圖16-21中更詳細(xì) 地描述了多基因載體。
按照出現(xiàn)等級(jí)選擇本發(fā)明所用的限制性位點(diǎn)。為了確定限制性位點(diǎn)出現(xiàn)的 頻率,用載體NTI軟件分析對(duì)應(yīng)于19種不同基因的DNA序列信息。這種搜 索總共覆蓋了 DNA序列中的110,530個(gè)核苷酸。按照所分析的110,530個(gè)核苷 酸中限制性位點(diǎn)的出現(xiàn)次數(shù)計(jì)算這些分析的結(jié)果。然后按照四種分類指定這些 限制性位點(diǎn)的等級(jí),其中"常見"位點(diǎn)在每110,530個(gè)核苷酸中出現(xiàn)25次以上, "低頻6bp位點(diǎn)"在每110,530個(gè)核苷酸中出現(xiàn)6-24次,"罕見"位點(diǎn)在每110,530 個(gè)核苷酸中出現(xiàn)0-5次。按照其出現(xiàn)情況的分類,列出了"合適"酶的部分列表
常見限制性位點(diǎn)
合適的常見限制性酶可包括但不限于Ase I、 BamH I、 Bgl II、 Blp I、 BstX I、 EcoR I、 Hine II、 Hind III、 Nco I、 Pst I、 Sac I、 Sac II、 Sph I、 Stu I、 Xbal。
含有6 bp識(shí)別位點(diǎn)、但出現(xiàn)頻率較低的合適的限制性位點(diǎn)可包括但不限 于Aarl、 AatII、 AflII、 Agel、 ApaL I、 AvrII、 BseA I、 BspD I、 BspEI、 BstBI、 Clal、 Eagl、 Eco0109 I、 EcoRV、 Hpal、 Kpnl、 Mfe I、 Narl、 Nde I、 NgoMIV、 Nhel、 Nsi I、 Pml I、 SexAI、 Smal、 Spel、 Xhol。
罕見限制性位點(diǎn)
合適的罕見酶可包括但不限于Acl I、 Nru I、 Pac I、 Pme I、 Sbf I、 Sfi I、 PI-Sce I、 I-Sce I、 I-Ceu I、 PI隱Psp I、 I-Tli I、 Fse I、 Sfo I 、 Asi SI、 Sgr Al、 Ascl、 Mlul、 SnaBI、 Not I、 Sal I、 Swal、 Rsr II、 Bsi WI、 AflIII、 Pvu I、 NgoMIV、 Asel、 Flpl、 Pme I、 Sdal、 Sgfl、 Srf I和Sse8781 1。
尋靶核酸內(nèi)切酶
合適的尋靶核酸內(nèi)切酶可包括但不限于I-Scel、 PI-Sce I、 I-Ceu I、PI-Psp I、 I-Chu I、 I-Cmoe I、 I-Cpa I、 I-Cpa II、 I-Cre I、 I陽Cvu I、 I-Dmo I、 ILlaI、 I-Msol、 I-Nanl、 I-Nitl、 I-Njal、 I-Pakl、 I-Porl、 I-Ppo I、 I-Scal、 I-Sce II、 I-Sce III、 ISce N、 I-Sce V、 I-Sce VI、 I誦Ssp68031、 I-Tev I、 I-Tev II、 I-Two I、 PI-Mga I、 PI畫Mtu I、 PIPfu I、 PI-Pfii II、 PI誦Pko I、 PI-Pko II、 PI-TfuI、 PI-TfuH、 PI-Thy I和PI-Tli
本發(fā)明實(shí)施方式詳述
PE3載體或轉(zhuǎn)基因的單個(gè)組分是啟動(dòng)子增強(qiáng)子模塊(稱為"P")、表達(dá)的蛋白 質(zhì)模塊("E")和/或3'調(diào)控區(qū)模塊("3"),可作為模塊組裝,由結(jié)構(gòu)域模塊(或"穿梭 ")載體轉(zhuǎn)移到PE3??枯d體(也可稱為??空军c(diǎn))的。圖5顯示了啟動(dòng)子載體內(nèi) 的啟動(dòng)子模塊,可將其切下并插入PE3??枯d體的預(yù)定??课恢弥小R踩鐖D5 所示,如果需要較高的復(fù)雜性級(jí)別,那么可將組裝的PE3模塊轉(zhuǎn)基因或其它核 苷酸序列轉(zhuǎn)移到多基因??枯d體(也稱為原始??空军c(diǎn)質(zhì)粒)或位點(diǎn)靶向性 (locus targeting)??枯d體中。分別更詳細(xì)地解釋五種類型的克隆載體質(zhì)粒(啟 動(dòng)子模塊、表達(dá)模塊和3'調(diào)控模塊載體、PE3??枯d體和多基因載體),以便說 明摻入其中的組分。
結(jié)構(gòu)域模塊停靠載體也稱為"穿梭載體",其包含多克隆位點(diǎn),所述多克隆 位點(diǎn)一般含有常見限制性位點(diǎn)并側(cè)接于基因樞,所述基因樞一般包含罕見限制 性位點(diǎn)和/或HE位點(diǎn)。由pUC19主鏈構(gòu)建結(jié)構(gòu)域模塊??枯d體,它對(duì)pUC19 主鏈進(jìn)行了以下修飾,其中按照pUC 19 Genbank序列文件,登錄號(hào)L09137對(duì) 該序列進(jìn)行編號(hào)
1. 停靠質(zhì)粒中只采用806-2617 (Afl3-Aat2)的序列,
2. pUC19中1729上的BspHl位點(diǎn)由TCATGA突變?yōu)镚CATGA,
3. pUC19中1493上的Acll位點(diǎn)由AACGTT突變?yōu)锳ACGCT,
4. pUC19中1120上的Acll位點(diǎn)由AACGTT突變?yōu)镃ACGCT,
5. pUC19中的Ahdl位點(diǎn)由GACNNNNNGTC突變?yōu)镃ACNNNNNGTC, 在上述突變步驟2之后,將編碼BspHl/I-Ppo 1/BspHl的序列插入pUC19
中剩余的唯一BspHl位點(diǎn)中。
在具體實(shí)施方式
中描述了本發(fā)明的三種單獨(dú)的穿梭載體啟動(dòng)子模塊停靠
載體、表達(dá)模塊停靠載體和3'調(diào)控模塊??枯d體,它們分別稱為啟動(dòng)子/內(nèi)含子
穿梭載體("SVP")、表達(dá)穿梭載體("SVE")和3'調(diào)控穿梭載體("SV3")。下面更詳 細(xì)地描述各載體。
穿梭載體P
圖IO中顯示了 SVP,它是可用于制備組裝到PE3??枯d體(轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物) 中的啟動(dòng)子和內(nèi)含子序列的克隆載體質(zhì)粒,如上所述。
圖11顯示了 MCS中依次含有以下元件的SVP質(zhì)粒的例子
1. 兩個(gè)恒定和獨(dú)特的常見限制性位點(diǎn),它們限定了上述突變pUC19載體 的5'插入位點(diǎn)(如AatII和Blpl),
2. T7引物位點(diǎn),
3. 能夠有效克隆T7引物位點(diǎn)下游的穿梭載體模塊的恒定和獨(dú)特的常見限 制性位點(diǎn)(如EcoOl(M),
4. 限定啟動(dòng)子模塊5'部分的恒定的罕見限制性位點(diǎn)的固定群(例如AsiSI 和SgrAI),
5. 由在穿梭載體中獨(dú)特的常見或罕見限制性位點(diǎn)的任何群組成的可變 MCS(例如,圖ll所示的一系列限制性位點(diǎn)),
6. 限定啟動(dòng)子模塊3'部分的恒定的罕見限制性位點(diǎn)的固定群(如PacI、AscI 和Mlul),
7. 能夠有效克隆T3引物位點(diǎn)上游的穿梭載體模塊的恒定和獨(dú)特的常見限 制性位點(diǎn)(如BspEI),
8. 反向T3引物位點(diǎn),和
9. 限定上述突變的pUC19載體的3'插入位點(diǎn)的兩個(gè)恒定和獨(dú)特的常見限 制性位點(diǎn)(例如Pmel和Sapl)。
在另一個(gè)例子中,限定啟動(dòng)子模塊5'部分的恒定的罕見限制性位點(diǎn)的固定 群(GPl基因樞)包含AsiSI、 PacI和SbfI,限定啟動(dòng)子模塊3'部分的罕見限制 性位點(diǎn)(GP2基因樞)包含F(xiàn)se I、 AscI和MluI。在一個(gè)更具體的例子中,GP1 基因樞由AsiSI、 Pacl和Sbfl的序列組成,GP2基因樞由Fsel、 AscI禾BMlu I的序列組成。
穿梭載體E (SVE)
圖12所示的SVE是可用于制備轉(zhuǎn)基因表達(dá)的序列,以便模塊化組裝到 PE3載體(轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物)中的克隆載體質(zhì)粒,如本文所述。
圖13顯示了 MCS中依次含有以下元件的SVE質(zhì)粒的例子
1. 兩個(gè)恒定和獨(dú)特的常見限制性位點(diǎn),它們限定了上述突變pUC19載體 的5'插入位點(diǎn)(如Blpl),
2. T7引物位點(diǎn),
3. 能夠有效克隆T7引物位點(diǎn)下游的穿梭載體模塊的恒定和獨(dú)特的常見限 制性位點(diǎn)(如EcoO109I),
4. 限定表達(dá)模塊5'部分的恒定的罕見限制性位點(diǎn)的固定群(如PacI、 Ascl 和Mlul),
5. 由在穿梭載體中獨(dú)特的常見或罕見限制性位點(diǎn)的任何群組成的可變 MCS(例如,圖13所示的一系列限制性位點(diǎn)),
6. 限定表達(dá)模塊3'部分的恒定的罕見限制性位點(diǎn)的固定群(如SnaBI、Notl 和Sall),
7. 能夠有效克隆T3引物位點(diǎn)上游的穿梭載體模塊的恒定和獨(dú)特的常見限 制性位點(diǎn)(如BspEI),
8. 反向T3引物位點(diǎn),和
9. 限定上述突變的pUC19載體的3'插入位點(diǎn)的兩個(gè)恒定和獨(dú)特的常見限 制性位點(diǎn)(如Pmel)。
在另一個(gè)例子中,限定表達(dá)模塊5'部分的恒定的罕見限制性位點(diǎn)的固定 群(GP2基因樞)包含F(xiàn)sel、 AscI和MluI,限定表達(dá)模塊3'部分的罕見限制性 位點(diǎn)(GP3基因樞)包含SnaB I、 Not I和Sal I。在一個(gè)更具體的例子中,GP2基 因樞由Fse I、 Asc I和Mlu I的序列組成,GP3基因樞由SnaB I、 Not I和Sal I 的序列組成。
穿梭載體3 (SV3)
圖14所示的SV3是可用于制備3'調(diào)控序列,以便組裝到PE3載體(轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物)中的克隆載體質(zhì)粒,如本文所述。
在圖15中,示例性SV3質(zhì)粒的MCS中可依次包含以下元件
1. 兩個(gè)恒定和獨(dú)特的常見限制性位點(diǎn),它們限定了上述突變pUC19載體 的5'插入位點(diǎn)(如Blpl),
2. T7引物位點(diǎn),
3. 能夠有效克隆T7引物位點(diǎn)下游的穿梭載體模塊的恒定和獨(dú)特的常見限 制性位點(diǎn)(如EcO0109I),
4. 限定3'調(diào)控模塊5'部分的恒定的罕見限制性位點(diǎn)的固定群(如SnaBI、 Notl和Sall),
5. 由在穿梭載體中獨(dú)特的常見或罕見限制性位點(diǎn)的任何群組成的可變 MCS(例如,圖15所示的一系列限制性位點(diǎn)),
6. 限定3'調(diào)控模塊3'部分的恒定的罕見限制性位點(diǎn)的固定群(如Swal、 RsrII和BsiWI),
7. 能夠有效克隆T3引物位點(diǎn)上游的穿梭載體模塊的恒定和獨(dú)特的非罕見 限制性位點(diǎn)(如BspEI),
8. 反向T3引物位點(diǎn),和
9. 限定上述突變的pUC19載體的3'插入位點(diǎn)的兩個(gè)恒定和獨(dú)特的非罕見 限制性位點(diǎn)(如Pmel)。
在另一個(gè)例子中,限定表達(dá)模塊5'部分的恒定的罕見限制性位點(diǎn)的固定 群(GP3基因樞)包含SnaB I、 Not I和Sal I,限定表達(dá)模塊3'部分的罕見限制性 位點(diǎn)(GP4基因樞)包含Swal、 RsrII和BsiWI。在一個(gè)更具體的例子中,GP3 基因樞由SnaBI、Notl和Sail的序列組成,GP4基因樞由Swa I、Rsr II和BsiW I的序列組成。
圖6所示的PE3??枯d體(PE3停靠質(zhì)粒)包含如上述例子所述修飾的 pUC19主鏈。
圖7所示的PE3停靠質(zhì)粒中的多克隆位點(diǎn)(MCS)依次包含以下元件
1. 三個(gè)恒定和獨(dú)特的常見限制性位點(diǎn),它們限定了上述突變pUC19載體 的5'插入位點(diǎn)(如Aat II、 Blpl和EcoO109I),
2. T7引物位點(diǎn),
3. 第一獨(dú)特HE位點(diǎn)(例如,I-Scel(在本文中是正向)),
4. 一對(duì)恒定和獨(dú)特的常見限制性位點(diǎn),它們側(cè)接于可用作染色質(zhì)修飾結(jié) 構(gòu)域接受模塊(RNAS-CMD-1)的隨機(jī)核苷酸序列(如Kpn I和Avr 11),
5. 限定啟動(dòng)子模塊5'部分的恒定的罕見限制性位點(diǎn)的固定群。在啟動(dòng)子 模塊5'端用作基因樞的恒定的罕見限制性位點(diǎn)的例子優(yōu)選包括AsiS I、 Pacl和 Sfol,但也可包括PvuI、 AsiSI和SgrAI。
6. 可用作啟動(dòng)子/內(nèi)含子接受模塊(RNAS-P)的隨機(jī)核苷酸序列,
7. 限定啟動(dòng)子/內(nèi)含子模塊3'部分和表達(dá)模塊5'部分之間的共有連接的恒 定的罕見限制性位點(diǎn)的固定群。在啟動(dòng)子模塊3'端用作基因樞的恒定的罕見限 制性位點(diǎn)的例子優(yōu)選包括Fsel、 AscI和MluI,但也可包括Pacl.
8. 可用作表達(dá)接受模塊(RNAS-E)的隨機(jī)核苷酸序列,
9. 限定表達(dá)模塊3'部分和3'調(diào)控模塊5'部分之間的連接的恒定的罕見限 制性位點(diǎn)的固定群(如SnaBI、 Notl和Sall),
10. 可用作3'調(diào)控結(jié)構(gòu)域接受模塊(RNAS-3)的隨機(jī)核苷酸序列,
11. 限定3'調(diào)控模塊3,部分的恒定的罕見限制性位點(diǎn)的固定群(如Swal、 Rsr II禾卩BsiW 1),
12. —對(duì)恒定和獨(dú)特的常見限制性位點(diǎn),它們側(cè)接于可用作染色質(zhì)修飾結(jié) 構(gòu)域接受模塊(RNAS-CMD-2)的隨機(jī)DNA核苷酸序列(如Xho I和Nhe 1),
13. 第二獨(dú)特的RE位點(diǎn)(與上述第3項(xiàng)中的位點(diǎn)(IScel)相同,反向)。然 而,近期觀察到,如果兩個(gè)獨(dú)特的HE位點(diǎn)相同并反向,則可能發(fā)生不想要的 重組。因此,優(yōu)選采用不同于第一獨(dú)特HE位點(diǎn)的第二獨(dú)特HE位點(diǎn)。
14. 反向T3引物位點(diǎn),和
15. 四個(gè)恒定和獨(dú)特的常見限制性位點(diǎn),它們限定了上述突變pUC19載 體的3'插入位點(diǎn)(如BspEI、 Pmel、 SapI和BspHI)。
在另一個(gè)例子中,限定啟動(dòng)子模塊5'部分的恒定的罕見限制性位點(diǎn)的固定 群(GPI基因樞)包含AsiS I、 Pac I和Sbf I;限定啟動(dòng)子模塊3'部分和表達(dá)模塊 5'部分的罕見限制性位點(diǎn)(GP2基因樞)包含F(xiàn)sel、 Asc I和Mlu I;限定表達(dá)模 塊3,部分和3'調(diào)控模塊5,部分的罕見限制性位點(diǎn)(GP3基因樞)包含SnaB 1、Not I和Sal I;限定3'調(diào)控模塊3'部分的罕見限制性位點(diǎn)(GP4基因樞)包含Swa I、
Rsr II和BsiWI。
在一個(gè)更具體的例子中,GPI基因樞由AsiS I、Pac I和Sbf I的序列組成, GP2基因樞由Fse I、 Asc I和Mlu I的序列組成,GP3基因樞由SnaB I、 Not I 和SalI的序列組成,GP4基因樞由Swal、 Rsr II和BsiW I的序列組成。
多基因??枯d體
圖16顯示了含有pUC19主鏈的多基因停靠載體,所述pUC19主鏈與PE3 ??枯d體中的主鏈相同,除了還包含其它限制性位點(diǎn),以產(chǎn)生側(cè)接載體主鏈模 塊的模塊邊界。這些主鏈模塊包括復(fù)制宿主選擇物(RHS)基因模塊和復(fù)制起點(diǎn) 基因模塊(ORI)。 RHS由載體主鏈樞(VII)Aat II(編碼復(fù)制宿主選擇物基因的 DNA序列)以及兩個(gè)其它的載體主鏈樞Age I和Avr II限定。圖16的RHS模 塊由載體主鏈樞VB-l=Aat II、 RHS模塊=氨節(jié)青霉素抗性基因和載體主鏈樞 VB-2=Age I和VB-3=Avr II限定。ORI由載體主鏈樞Age I和Avr II(復(fù)制起點(diǎn) 的DNA序列)以及載體主鏈樞Pme I限定。圖16的ORI模塊由載體主鏈樞 VB-2=Age I和VB-3=Avr II、 ORI模塊zpUC10復(fù)制起點(diǎn)和載體主鏈樞 VB-4=PmeI限定。
為了產(chǎn)生結(jié)構(gòu)域接受區(qū)的多樣化陣列,通過準(zhǔn)確安置隨機(jī)核苷酸序列和限 定常見、罕見和尋靶核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)的非隨機(jī)核苷酸序列,確定多基因??枯d 體。這些模塊接受區(qū)分為以下類型GHS、 BRD、 SRS、 CMD、 (CMD/BRD)、 PE3填充片段、PE3MCS。這些模塊的定義如下
A. GHS:基因組表達(dá)宿主選擇基因(如NEO或PURO)
B. BRD:可用作"能夠進(jìn)行重組工程"的細(xì)菌細(xì)胞系中的同源重組位點(diǎn)的非 隨機(jī)核酸序列
C. SRS:可用作位點(diǎn)特異性重組酶基因產(chǎn)物介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性同源重組的 位點(diǎn)的非隨機(jī)核酸序列(如Cre/Lox或Flp/Frt)
D. CMD:可改變宿主基因組的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的非隨機(jī)核酸序列(如HS4雞p 珠蛋白絕緣子)
E. CMD/BRD:編碼可用作在"能夠進(jìn)行重組工程"的細(xì)菌細(xì)胞系中進(jìn)行同 源重組的DNA序列的染色質(zhì)修飾結(jié)構(gòu)域的非隨機(jī)核酸序列
F. PE3填充片段=不編碼限制性位點(diǎn)或多基因停靠載體內(nèi)存在的任何其它 功能的隨機(jī)核苷酸序列
G. PE3 MCS:由多基因??枯d體特有的多個(gè)限制性位點(diǎn)組成的非隨機(jī)核
苷酸序列
這些模塊側(cè)接于可用于制備模塊??枯d體的限制性位點(diǎn)。可按照以下分類 確定這些連接于模塊的限制性位點(diǎn)
A. VB:限定載體主鏈模塊的邊界的限制性位點(diǎn)
B. ES:限定基因組表達(dá)宿主選擇模塊的邊界的限制性位點(diǎn)
C. TX-產(chǎn)生與特定罕見和尋靶核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)相容的突出端的合成 BstXI位點(diǎn)(如I誦CeuI, I-Scel, Sbfl)
D. CM-限定染色質(zhì)修飾模塊的邊界的限制性位點(diǎn)
E. SB-限定位點(diǎn)特異性重組模塊的邊界的限制性位點(diǎn)
F. BI^產(chǎn)生鈍端的限制性位點(diǎn)
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式可由存在于載體主鏈樞VB-1和VB-5之間的核苷 酸序列限定,其中VB-l=AatII, VB-5=BspEI。
1. VB-1是AatII
2. 無序列或隨機(jī)核苷酸序列
3. ES-l=SexAI
4. 隨機(jī)核苷酸序列填充片段(或GHS模塊)
5. ES-2=SrfI
6. 隨機(jī)核苷酸序列填充片段(或BRD模塊)
7. HE-3=I-PpoI
8. 隨機(jī)核苷酸序列填充片段(或SRS模塊)
9. 無序列或隨機(jī)核苷酸序列填充片段
10. CM-l=KpnI
11. 隨機(jī)核苷酸序列(或CMD模塊)
12. CM-2=SacI
13. 無序列或隨機(jī)核苷酸序列填充片段
14. TX-l-BstXI(I-CeuI)正向
15. 隨機(jī)核苷酸序列填充片段(或PE3模塊)
16. TX-2=Bst XI (I-Sce I)反向
17. 無序列或隨機(jī)核苷酸序列填充片段
18. CM-3=MfeI
19. 隨機(jī)核苷酸序列填充片段(或CMD模塊)
20. CM-4=SacII
21. 無序列或隨機(jī)核苷酸序列填充片段
22. GP- l=(AsiS I/Pac I/Sbf I)
23. 隨機(jī)核苷酸序列填充片段(或PE3模塊)
24. G-4/CM-5=(Swa I/Rsr II/BsiW I)
25. 隨機(jī)核苷酸序列填充片段(或CMD模塊)
26. CM-6=NarI,其含有與Kas I相同的基序
27. 無序列或隨機(jī)核苷酸序列填充片段
28. SB-l=NsiI,粘性突出端與SbfI相容
29. 無序列或隨機(jī)核苷酸序列填充片段
30. BL-l=SfoI
31. 無序列或隨機(jī)核苷酸序列填充片段
32. BL-2=PvuII
33. 無序列或隨機(jī)核苷酸序列填充片段
34. BL-3=NruI
35. 無序列或隨機(jī)核苷酸序列填充片段
36. SB-2=BsrGI,粘性突出端與BsiW I相容
37. 無序列或隨機(jī)核苷酸序列填充片段
38. CM-7=SpeI
39. 隨機(jī)核苷酸序列填充片段(或CMD模塊)
40. CM-8=SphI
41. 隨機(jī)核苷酸序列填充片段(或SRS模塊)
42. HE-4二PI-Scel(正向)
43. 隨機(jī)核苷酸序列填充片段(或BRD模塊)
44. VB-5=BspEI
圖17、 18和19說明采用常規(guī)的亞克隆方法如何將圖16中的多基因停靠 載體用作DNA主鏈,以建立含有兩個(gè)或多個(gè)PE3模塊的多基因載體。根據(jù)多 基因載體主鏈內(nèi)已經(jīng)包含的任何PE3模塊中不存在??枯d體中產(chǎn)生PE3接受 結(jié)構(gòu)域所需樞軸的統(tǒng)計(jì)學(xué)概率,這種建立含有三個(gè)不同PE3模塊的多基因載體 的例子采用優(yōu)選的亞克隆順序。
將PE3模塊亞克隆到圖16所示的多基因停靠載體中的優(yōu)選順序如下 1.應(yīng)該首先將PE3模塊亞克隆到PE3-2填充片段結(jié)構(gòu)域中,應(yīng)按照不存 在以下位點(diǎn)的順序選擇此PE3模塊
1. Nsi I或BsrG I
ii. Sfol、 PvuII或NruI
iii. BstX I
2. 接著應(yīng)將第二個(gè)PE3模塊亞克隆到PE3-3結(jié)構(gòu)域中,應(yīng)按照不存在以 下位點(diǎn)的順序選擇此PE3模塊
iv. Sbfl或BsiWI
v. 單獨(dú)的Sbf I
vi. BsiW I
vii. BstX I
3. 應(yīng)將第三個(gè)PE3模塊亞克隆到PE3-1結(jié)構(gòu)域中
可采用兩種限制性酶消化而獨(dú)立地制備載體主鏈和PE3模塊,從而將滿 足第1項(xiàng)所述標(biāo)準(zhǔn)的PE3模塊亞克隆到多基因??枯d體中,其中一種酶識(shí)別 GP-1結(jié)構(gòu)域中的單個(gè)限制性位點(diǎn),第二種酶識(shí)別GP-4結(jié)構(gòu)域中的單個(gè)限制性 位點(diǎn)。所選酶一定不能在PE3模塊內(nèi)切割。圖17說明了這一方法的例子。將 圖17所示PE3-A模塊亞克隆到PE3-2填充片段結(jié)構(gòu)域中的一種方法需要通過 酶AsiS I和Rsr II切割該多基因??枯d體而產(chǎn)生線狀載體主鏈。這種分子生物 學(xué)方法產(chǎn)生含有AsiS I-特異性和Rsr II-特異性粘性突出端的DNA??奎c(diǎn)。也 可采用AsiS I和Rsr II消化來制備含有所需PE3-A模塊的線狀DNA片段???通過生化方法用DNA連接酶將得到的載體主鏈和PE3-A模塊連接在一起,產(chǎn) 生含有PE3-A模塊的多基因載體。
圖18引入了一種方法,可將滿足第2項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)的PE3模塊亞克隆到含有 PE3-A模塊的多基因??枯d體中的PE3-3多克隆位點(diǎn)(PE3-3 MCS)上。在這個(gè) 例子中,PE3-A模塊不含Nsi I或BsrG I位點(diǎn)(在圖16中分別標(biāo)為SB-1和SB-2), PE3-B模塊不含Sbf I或BsiW I位點(diǎn)。如圖18所示,用Sbf I和BsiW I消化 PE3-B模塊載體而產(chǎn)生線狀PE3-B模塊。通過Nsi I和BsrG I的消化制備線狀 多基因載體主鏈??赏ㄟ^生化方法采用DNA連接酶將PE3-B模塊和多基因載 體主鏈的互補(bǔ)粘性末端連接在一起。得到的DNA分子由多基因載體組成,其 中PE3-A和PE3-B模塊現(xiàn)在是DNA分子的毗連部分。
圖18僅代表將PE3模塊亞克隆到多基因??枯d體的PE3-3填充片段結(jié)構(gòu) 域中的許多方案之一。其它亞克隆方案包括產(chǎn)生顯示粘性/鈍性、鈍性/粘性或 鈍性/鈍性??奎c(diǎn)的線狀PE3模塊和線狀多基因??枯d體。預(yù)計(jì)這些另選的亞 克隆方案產(chǎn)生連接產(chǎn)物的成功率低于粘性/粘性方案。如果PE3-A或PE3-B模 塊的結(jié)構(gòu)不滿足第2項(xiàng)所列的一項(xiàng)或多項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn),則可選擇這些另選方案。
圖19說明了如何將PE3-C模塊亞克隆到含有PE3-A和PE3-B模塊的多基 因載體中。這種方案需要PE3-A和PE3-B均不含BstXI位點(diǎn)。在這種方案中, 通過BstX I消化使多基因??枯d體成為線狀。通過尋靶核酸內(nèi)切酶I-Ceu I和 I-Sce I的消化使PE3-C模塊成為線狀。通過生化方法用DNA連接酶將得到的 線狀PE3-C模塊和多基因??枯d體連接在一起。得到的DNA分子由多基因載 體組成,其中PE3-A、 PE3-B和PE3-C模塊現(xiàn)在是DNA分子的毗連部分。
圖21說明了如何采用細(xì)菌重組工程方法將側(cè)接染色質(zhì)修飾結(jié)構(gòu)域(CMD) 或細(xì)菌重組工程結(jié)構(gòu)域(BRD)的PE3模塊引入多基因停靠載體中。在這個(gè)例子 中,PE3模塊通過側(cè)接PE3模塊載體的PE3模塊和多基因??枯d體的PE3-1 填充片段結(jié)構(gòu)域的CMD/BRD結(jié)構(gòu)域之間的同源重組取代了 PE3-1填充片段結(jié) 構(gòu)域。這種方案需要采用輔助性DNA載體或可通過環(huán)境(化學(xué)、溫度或代謝環(huán) 境)改變而誘導(dǎo)重組酶表達(dá)的特殊細(xì)菌菌株。
圖16所示的本發(fā)明另一實(shí)施方式可由載體主鏈樞VB-l和VB-5之間存在 的核苷酸序列限定,其中VB-l=AatII和VB-5=BspEI。
1. VB-1是AatII
2. 無序列或隨機(jī)核苷酸序列
3. ES-l=SexAI
4. 隨機(jī)核苷酸序列填充片段(或GHS模塊)
5. ES-2=SrfI
6. 隨機(jī)核苷酸序列填充片段(或BRD模塊)
7. HE-3=I-PpoI
8. 隨機(jī)核苷酸序列填充片段(或SRS模塊)
9. 無序列或隨機(jī)核苷酸序列填充片段
10. CM-l=KpnI
11. 隨機(jī)核苷酸序列(或CMD模塊)
12. CM-2=SacI
13. 無序列或隨機(jī)核苷酸序列填充片段
14. HE-l=I-CeuI正向
15. 隨機(jī)核苷酸序列填充片段(或PE3模塊)
16. HE-2=I-SceI反向
17. 無序列或隨機(jī)核苷酸序列填充片段
18. CM-3=MfeI
19. 隨機(jī)核苷酸序列填充片段(或CMD模塊)
20. CM-4=SacII
21. 無序列或隨機(jī)核苷酸序列填充片段
22. GP- l=(AsiS I/Pac I/Sbf I)
23. 隨機(jī)核苷酸序列填充片段(或PE3模塊)
24. G-4/CM-5=(Swa I/Rsr IIBsiW I)
25. 隨機(jī)核苷酸序列填充片段(或CMD模塊)
26. CM-6=NarI,其含有與Kas I相同的基序
27. 無序列或隨機(jī)核苷酸序列填充片段
28. TX-l=BstXI(I-CeuI)正向
29. SB-l=NsiI,粘性突出端與SbfI相容
30. 無序列或隨機(jī)核苷酸序列填充片段
31. BL-l=SfoI
32. 無序列或隨機(jī)核苷酸序列填充片段
33. BL-2=PvuII
34. 無序列或隨機(jī)核苷酸序列填充片段
35. BL-3=NruI
36. 無序列或隨機(jī)核苷酸序列填充片段
37. SB-2=BsrGI,粘性突出端與BsiW I相容
38. 無序列或隨機(jī)核苷酸序列填充片段
39. TX-2=Bst X I (I-Sce I)反向
40. 無序列或隨機(jī)核苷酸序列填充片段
41. CM-7=SpeI
42. 隨機(jī)核苷酸序列填充片段(或CMD模塊)
43. CM-8=SphI
44. 隨機(jī)核苷酸序列填充片段(或SRS模塊)
45. HE-4:PI-Scel(正向)
46. 隨機(jī)核苷酸序列填充片段(或BRD模塊)
47. VB-5=BspEI
圖20顯示了如何采用尋耙核酸內(nèi)切酶將PE3模塊引入上述多基因??枯d 體中。在這個(gè)例子中,通過尋靶核酸內(nèi)切酶I-CeuI和I-Scel的消化使PE3模 塊和多基因停靠載體成為線狀??赏ㄟ^生化方法采用DNA連接酶將得到的線 狀PE3模塊連接到線狀多基因??枯d體中。如果多基因??枯d體內(nèi)或引入停靠 載體的PE3模塊不滿足第1-3項(xiàng)所列的一項(xiàng)或多項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn),則可采用這種亞克隆 方案。
可采用圖8所示多基因停靠載體(原始??抠|(zhì)粒)組裝首先在PE3??空军c(diǎn) 質(zhì)粒中構(gòu)建的兩個(gè)完整的PE3轉(zhuǎn)基因,或者構(gòu)建靶向基因(gene-targeting)的 轉(zhuǎn)基因或引入兩種類型的陽性或陰性選擇元件所需的兩個(gè)同源臂。
多基因(或原始)停靠質(zhì)粒中多克隆位點(diǎn)(MCS)的非限制性例子見圖9,其 依次包含以下元件
1.限定上述突變的pUC19載體的5'插入位點(diǎn)的兩個(gè)恒定和獨(dú)特的常見限 制性位點(diǎn)(如AatII和Blp 1), 2. M13反向引物位點(diǎn),
3. 反向側(cè)接DNA隨機(jī)核苷酸序列的一對(duì)獨(dú)特的HE位點(diǎn),所述DNA隨 機(jī)核苷酸序列可用作基因組表達(dá)宿主選擇基因接受模塊(RNAS-GEH-S1)(如 PI-SceI(正向)和PI-SceI(反向)),
4. 能夠克隆HE對(duì)下游的穿梭載體模塊的恒定和獨(dú)特的常見限制性位點(diǎn) (如EcoO謹(jǐn)),
5. 限定左重組臂模塊5,部分的恒定的罕見限制性位點(diǎn)的固定群(如SgrAI 和AsiS 1),
6. 可用作左重組臂接受模塊的隨機(jī)核苷酸序列(RNAS-LRA),
7. 限定左重組臂接受模塊3'部分的恒定的罕見限制性位點(diǎn)的固定群(如 Pacl、 MluI和AscI),
8. 獨(dú)特的HE位點(diǎn)(如I-CeuI(正向)),
9. 側(cè)接DNA隨機(jī)核苷酸序列的一對(duì)恒定和獨(dú)特的常見限制性位點(diǎn),所 述DNA隨機(jī)核苷酸序列可用作染色質(zhì)修飾結(jié)構(gòu)域接受模塊(RNAS-CMD-1)(如 Kpnl禾卩AvrII),
10. T7引物位點(diǎn),
11. 一對(duì)反向的獨(dú)特BstXI位點(diǎn)(其中限定BstXI限制性位點(diǎn)中的可變核 苷酸區(qū)的核苷酸與通過排列反向互補(bǔ)取向的兩個(gè)相同HE限制性位點(diǎn)產(chǎn)生的非 互補(bǔ)性尾相同;例如,PI-SceI(正向)和PI-SceI(反向))側(cè)接DNA隨機(jī)核苷酸序 列,所述DNA隨機(jī)核苷酸序列可用作復(fù)雜的轉(zhuǎn)基因接受模塊(RNAS-PE3-1),
12. 側(cè)接DNA隨機(jī)核苷酸序列的一對(duì)反向的獨(dú)特HE位點(diǎn),所述DNA 隨機(jī)核苷酸序列可用作復(fù)雜的轉(zhuǎn)基因接受模塊(RNASPE3-2)(如I-Scel(正向)和 I-Scel (反向)),
13. 反向T3引物位點(diǎn),
14. 側(cè)接DNA隨機(jī)核苷酸序列一對(duì)恒定和獨(dú)特的常見限制性位點(diǎn),所述 DNA隨機(jī)核苷酸序列可用作染色質(zhì)修飾結(jié)構(gòu)域接受模塊(RNAS-CMD-2)(如 XhoI禾口Nhe 1),
15. 獨(dú)特的HE位點(diǎn)(在這里與上述第8項(xiàng)的位點(diǎn)(Iscel)相同,也是反向),
16. 限定右重組臂模塊5'部分的恒定的罕見限制性位點(diǎn)的固定群(如SnaBI、 SalI和NotI),
17. 可用作右重組臂接受模塊的隨機(jī)核苷酸序列(RNAS-RRA),
18. 限定右重組臂接受模塊3'部分的恒定的罕見限制性位點(diǎn)的固定群(如 RsrII、 SwaI和BsiWI),
19. 能夠?qū)⒋┧筝d體模塊克隆到HE對(duì)上游的恒定和獨(dú)特的常見限制性位 點(diǎn)(如BspE 1),
20. 反向側(cè)接DNA隨機(jī)核苷酸序列的一對(duì)獨(dú)特的HE位點(diǎn),所述DNA 隨機(jī)核苷酸序列可用作基因組表達(dá)宿主選擇基因接受模塊(RNAS-GEH-S2)(如 PI-Psp I(正向)和PI-Psp I(反向)),
21. 反向安置的M13正向引物位點(diǎn),
22. 限定上述突變pUC19載體3'插入位點(diǎn)的三個(gè)恒定和獨(dú)特的常見限制 性位點(diǎn)(如Pme I、 Sap I和BspH 1)。
作為實(shí)施本發(fā)明的方法例子,可構(gòu)建含有這些元件的轉(zhuǎn)基因
1. 表面活性劑蛋白C(SP-C)的人啟動(dòng)子的核苷酸序列,
2. 編碼小鼠基因粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子-受體(3-c(GMRI3c)的蛋白 產(chǎn)物的序列
3. 兔P珠蛋白內(nèi)含子序列,和
4. SV40聚A信號(hào)。
SP-C序列含有內(nèi)部BamHI位點(diǎn),可僅用Notl和EcoRl從母體質(zhì)粒釋放。 GMR卩c含有內(nèi)部Notl位點(diǎn),可用BamHl和Xhol由母體質(zhì)粒切下GMR(3c。 可采用EcoRl從母體質(zhì)粒上切下兔(3珠蛋白內(nèi)含子序列??捎肵hol和Sacl 從其母體質(zhì)粒上切下SV-40聚A尾。因?yàn)閹追N限制性位點(diǎn)的冗余度,所有母 體質(zhì)粒均無法用于組裝所有所需片段。
在本發(fā)明PE3停靠質(zhì)粒中構(gòu)建所需轉(zhuǎn)基因所用的步驟如下
1. 由于Notl和PspOMl產(chǎn)生相容性粘性末端,所以用Notl和EcoRl切 下人SP-C啟動(dòng)子序列,并將其克隆到穿梭載體P的PspOMl和EcoRl位點(diǎn)中。 此反應(yīng)的產(chǎn)物稱為pSVP-SPC
2. 按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的增殖和回收步驟,將兔p珠蛋白內(nèi)含子序 列克隆到pSVP-SPC的EcoRl位點(diǎn)中。通過測(cè)序該產(chǎn)物,驗(yàn)證得到的中間體構(gòu)
建物中內(nèi)含子的取向,為pSVP-SPC-rpG。
3. 用AsiSl和Ascl切下pSVP-SPC-rpG的啟動(dòng)子和內(nèi)含子,分離成一個(gè) 毗連片段。同時(shí),用AsiSl和Ascl切割PE3停靠質(zhì)粒,以便與啟動(dòng)子/內(nèi)含子 節(jié)段連接。將啟動(dòng)子/內(nèi)含子片段連接到??抠|(zhì)粒中,增殖并回收。
4. 采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知技術(shù)填滿GMRI3c片段的Xhol位點(diǎn),產(chǎn)生鈍 性3,端。然后將其克隆到pSVP-SPC-rpG的BamHl位點(diǎn)和鈍端Pvu2位點(diǎn)中。 增殖和回收得到的質(zhì)粒(pDPSPC-GMR卩c-r(3G)。
5. 最后的克隆步驟是加入SV-40聚A尾。用Xho 1和Sac 1切割SV40-聚A片段,對(duì)接受載體pDSl-SPC-GMRpc-rbpG進(jìn)行同樣操作。凝膠純化并回 收這兩種DNA。用摩爾比為10:1的SV-40聚A與pDSl-SPC-GMpc-rpG制備 連接混合物。增殖并收獲連接產(chǎn)物。
新質(zhì)粒pDSl-SPC-GMR|3c-rpG-pA含有轉(zhuǎn)基因所需的所有元件,包括3' 端的獨(dú)特限制性位點(diǎn),通過它使整個(gè)pDSl-SPC-GMR卩c-rpG-pA質(zhì)粒成為線狀, 以便轉(zhuǎn)染到真核細(xì)胞中或顯微注射到受精卵原核中。
關(guān)于HE位點(diǎn),通常將各自能夠被至少一種HE限制性酶切割的至少兩個(gè) HE限制性位點(diǎn)安置在側(cè)接模塊區(qū)的位置,以便產(chǎn)生無法自身退火的基因盒接 受位點(diǎn)。另外,如果需要,可能但不一定使這些HE位點(diǎn)互相反向得安置。艮P, 因?yàn)镠E位點(diǎn)不對(duì)稱并且無回文序列,可能通過反向安置兩個(gè)HE限制性位點(diǎn) 產(chǎn)生非互補(bǔ)的3'粘性突出尾。例如,HEI-Scel切割其關(guān)聯(lián)限制性位點(diǎn)(如"/"所 示)
5'.. .TAGGGAT AA/C AGGGTAAT. .3, 3'…ATCCC/TATTGTCCCATTA…5'
將第二位點(diǎn)反向安置在MCS內(nèi)會(huì)產(chǎn)生兩種非互補(bǔ)的粘性突出尾 5'…TAGGGATAA CCCTA...3' 3'…ATCCC AATAGGGAT...5'
當(dāng)載體中需要包含大的轉(zhuǎn)基因時(shí),這特別有用。由于插入物較大,從熱力 學(xué)角度看載體更易于自身退火,而非接受大插入物。通過安置HE限制性位點(diǎn) 產(chǎn)生的非互補(bǔ)尾提供了有利的化學(xué)作用力,以抵消自身連接的熱力學(xué)傾向。
另外,與BstXI限制性酶位點(diǎn)(5'CCANNNNN/NTGG3')聯(lián)用時(shí),大多數(shù) HE突出尾的不對(duì)稱特性也產(chǎn)生了有力的克隆工具??刹捎肂stXI的序列-中性 區(qū)("N"可以是任何核苷酸)產(chǎn)生兩個(gè)反向HE突出尾的相容性粘性末端,而防止 自身退火。
BstXI(I-SceI正向)I-Scel正向I-Scel反向 BxtXI(I-SceI反向) 5'-CCAGATAA CAGGGTAAT〃ATTACCCTGTTAT GTGG-3' 3'-GGTC TATTGTCCCATTA〃TAATGGGAC AATACACC-5'
也可采用這些列表中未包括、但保持相同功能且屬于本發(fā)明構(gòu)思和內(nèi)涵的 其它核酸內(nèi)切酶。
在本發(fā)明的許多優(yōu)點(diǎn)中,不難理解的是,可以在非常短的時(shí)間內(nèi)快速組裝 一般含有啟動(dòng)子、表達(dá)和3'調(diào)控模塊的轉(zhuǎn)基因,以及快速和容易地改變或重新 設(shè)計(jì)新組裝的轉(zhuǎn)基因。釆用己知方法改變組裝的轉(zhuǎn)基因的常規(guī)方式通常需要一 年或更長時(shí)間的實(shí)驗(yàn)室工作。采用本發(fā)明方法,可以在數(shù)天或數(shù)周內(nèi)制備所需 的轉(zhuǎn)基因,然后對(duì)其進(jìn)行所需測(cè)試,從而為研究人員節(jié)省大量時(shí)間和花費(fèi)???將最初通過從頭合成、重組工程和PCR終止子突出端克隆法產(chǎn)生的穿梭載體 用于本發(fā)明停靠點(diǎn)技術(shù),以將這些預(yù)先制備的元件快速組裝到多個(gè)轉(zhuǎn)基因中。 只要稍作改動(dòng)或無需改動(dòng),即可將采用本發(fā)明產(chǎn)生的PE3轉(zhuǎn)基因用于單個(gè)生物 體,或用于各種生物體,包括細(xì)菌、酵母、小鼠和其它真核生物。
雖然通過本發(fā)明實(shí)施方式介紹本發(fā)明,并且相當(dāng)詳細(xì)地描述了這些實(shí)施方 式,但它們不應(yīng)局限或以任何方式限制所附權(quán)利要求書的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人 員容易明白其它優(yōu)點(diǎn)和修改。因此,廣義來看,本發(fā)明不僅限于顯示和描述的
具體細(xì)節(jié)、代表性方法和結(jié)構(gòu)以及實(shí)施例。因此,背離這些細(xì)節(jié)并不一定背離 本發(fā)明的權(quán)利范圍。
權(quán)利要求
1.一種由DNA克隆載體組成的結(jié)構(gòu)域模塊??枯d體,其包含用于將感興趣遺傳物質(zhì)亞克隆到多克隆(MC)模塊中的MC模塊,所述MC模塊包含a. 第一基因樞(GP),其含有可通過操作限定MC模塊5′部分的至少兩個(gè)恒定的罕見限制性位點(diǎn);b. 含有包括多個(gè)限制性位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)(MCS)的核酸序列,以便為將感興趣遺傳物質(zhì)克隆到MC模塊中提供克隆位點(diǎn),所述限制性位點(diǎn)選自結(jié)構(gòu)域模塊停靠載體中獨(dú)特的常見限制性位點(diǎn);和c. 第二基因樞,其含有可通過操作限定MC模塊3′部分的至少兩個(gè)恒定的罕見限制性位點(diǎn)。
2. 如權(quán)利要求1所述的結(jié)構(gòu)域模塊??枯d體,其特征在于,所述第一基 因樞和第二基因樞獨(dú)立地包含至少3個(gè)、不多于4個(gè)恒定的罕見限制性位點(diǎn)。
3. 如權(quán)利要求1所述的結(jié)構(gòu)域模塊??枯d體,其特征在于,所述感興趣 的遺傳物質(zhì)選自啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)域、表達(dá)結(jié)構(gòu)域或3'調(diào)控結(jié)構(gòu)域。
4. 如權(quán)利要求1所述的結(jié)構(gòu)域模塊??枯d體,其特征在于,所述恒定的 罕見限制性位點(diǎn)選自AsiSI、 Pacl、 Sbfl、 Fsel、 Ascl、 Mlul、 SnaB I、 Notl、 Sall、 Swal、 RsrII、 BSiWI、 Sfo I、 SgrAI、 AflIII、 Pvul、 Ngo MIV、 Asel、 Flpl、 Pmel、 Sdal、 Sgfl、 Srf I或Sse8781 I。
5. 如權(quán)利要求4所述的結(jié)構(gòu)域模塊??枯d體,其特征在于,當(dāng)所述感興 趣遺傳物質(zhì)是啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)域時(shí),所述第一組恒定的罕見限制性位點(diǎn)至少選自 AsiSI、 PacI或SbfI,所述第二組恒定的罕見限制性位點(diǎn)至少選自Fsel、 AscI或Mlul;當(dāng)所述感興趣遺傳物質(zhì)是表達(dá)結(jié)構(gòu)域時(shí),所述第一組恒定的罕見限制性位點(diǎn)至少選自Fsel、 AscI或MluI,所述第二組恒定的罕見限制性位點(diǎn)至少選自 SnaBI、 Not I或Sal I;和當(dāng)所述感興趣遺傳物質(zhì)是3'調(diào)控結(jié)構(gòu)域時(shí),所述第一組恒定的罕見限制性 位點(diǎn)至少選自SnaB I、 Not I或Sal I,所述第二組恒定的罕見限制性位點(diǎn)至少 選自Swal、 RsrII或BSiWI。
6. 如權(quán)利要求5所述的結(jié)構(gòu)域模塊??枯d體,其特征在于,當(dāng)所述感興 趣遺傳物質(zhì)是啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)域時(shí),所述第一組恒定的罕見限制性位點(diǎn)依次由AsiS I、 PacI和SbfI組成,所述第二組恒定的罕見限制性位點(diǎn)依次由FseI、 Asc I 和MluI組成;當(dāng)所述感興趣遺傳物質(zhì)是表達(dá)結(jié)構(gòu)域時(shí),所述第一組恒定的罕見限制性位 點(diǎn)依次由Fse I、 Asc I和Mlu I組成,所述第二組恒定的罕見限制性位點(diǎn)依次 由SnaB I、 Not I和Sal I組成;和當(dāng)所述感興趣遺傳物質(zhì)是3'調(diào)控結(jié)構(gòu)域時(shí),所述第一組恒定的罕見限制性 位點(diǎn)依次由SnaB I、 Not I和Sal I組成,所述第二組恒定的罕見限制性位點(diǎn)依 次由Swa I、 Rsr II和BSiW I組成。
7. —種由DNA克隆載體組成的PE3??枯d體,其包含含有多個(gè)克隆模 塊的PE3克隆模塊,經(jīng)構(gòu)建該模塊可用于將多個(gè)結(jié)構(gòu)域模塊克隆到PE3克 隆模塊中,所述PE3克隆模塊包含a. 第一基因樞,其含有克隆后可通過操作限定啟動(dòng)子模塊5'部分的至 少兩個(gè)恒定的罕見限制性位點(diǎn);b. 由含有填充片段的第一核酸序列組成的第一填充模塊,克隆后被啟 動(dòng)子模塊取代;c. 第二基因樞,其含有克隆后可通過操作限定啟動(dòng)子模塊3'部分與表 達(dá)模塊5'部分之間的共有連接的至少兩個(gè)恒定的罕見限制性位點(diǎn);d. 由含有填充片段的第二核酸序列組成的第二填充模塊,克隆后被表 達(dá)模塊取代;e. 第三基因樞,其含有克隆后可通過操作限定表達(dá)模塊3,部分與3'調(diào)控 模塊5'部分之間的共有連接的至少兩個(gè)恒定的罕見限制性位點(diǎn);f. 由含有填充片段的第三核酸序列組成的第三填充模塊,克隆后被3' 調(diào)控模塊取代;和g. 第四基因樞,其含有克隆后可通過操作限定3'調(diào)控模塊3'部分的至 少兩個(gè)恒定的罕見限制性位點(diǎn)。
8. 如權(quán)利要求7所述的PE3??枯d體,其特征在于,所述第一基因樞和 第二基因樞獨(dú)立地包含至少3個(gè)、不多于4個(gè)恒定的罕見限制性位點(diǎn)。
9. 如權(quán)利要求7所述的PE3??枯d體,其特征在于,所述恒定的罕見限制性位點(diǎn)選自AsiSI、 Pacl、 Sbfl、 Fsel、 Ascl、 Mlu I、 SnaB I、 Notl、 Sall、 Swal、 RsrII、 BSiWI、 Sfol、 SgrAl、 AflIII、 Pvul、 NgoMIV、 Asel、 Flp I、 Pmel、 Sdal、 Sgfl、 Srf I或Sse8781 I。
10. 如權(quán)利要求9所述的結(jié)構(gòu)域模塊??枯d體,其特征在于,當(dāng)所述感興 趣遺傳物質(zhì)是啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)域時(shí),所述第一組恒定的罕見限制性位點(diǎn)至少選自 AsiSI、 PacI或SbfI,所述第二組恒定的罕見限制性位點(diǎn)至少選自Fsel、 AscI或MluI;當(dāng)所述感興趣遺傳物質(zhì)是表達(dá)結(jié)構(gòu)域時(shí),所述第一組恒定的罕見限制性位點(diǎn)至少選自Fsel、 AscI或MluI,所述第二組恒定的罕見限制性位點(diǎn)至少選自 SnaBI、 NotI或Sail;和當(dāng)所述感興趣遺傳物質(zhì)是3'調(diào)控結(jié)構(gòu)域時(shí),所述第一組恒定的罕見限制性 位點(diǎn)至少選自SnaB I、 Not I或Sal I,所述第二組恒定的罕見限制性位點(diǎn)至少 選自SwaI、 RsrII或BSiWI。
11. 如權(quán)利要求10所述的結(jié)構(gòu)域模塊??枯d體,其特征在于,當(dāng)所述感 興趣遺傳物質(zhì)是啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)域時(shí),所述第一組恒定的罕見限制性位點(diǎn)依次由 AsiSI、 PacI和SbfI組成,所述第二組恒定的罕見限制性位點(diǎn)依次由FseI、 AscI和MluI組成;當(dāng)所述感興趣遺傳物質(zhì)是表達(dá)結(jié)構(gòu)域時(shí),所述第一組恒定的罕見限制性位 點(diǎn)依次由FseI、 AscI和MluI組成,所述第二組恒定的罕見限制性位點(diǎn)依次 由SnaB I、 Not I和Sal I組成;和當(dāng)所述感興趣遺傳物質(zhì)是3'調(diào)控結(jié)構(gòu)域時(shí),所述第一組恒定的罕見限制性 位點(diǎn)依次由SnaBI、 NotI和SalI組成,所述第二組恒定的罕見限制性位點(diǎn)依 次由Swa I、 Rsr II和BSiW I組成。
12. 如權(quán)利要求7所述的PE3??枯d體,還包含將所述PE3模塊插入多 基因??枯d體的部件。
13. —種由DNA克隆載體組成的PE3多克隆(MC)停靠載體,其包含PE3 克隆模塊,經(jīng)構(gòu)建該模塊可用于將啟動(dòng)子、表達(dá)和3'調(diào)控模塊克隆到PE3克 隆模塊中,所述PE3克隆模塊包含a.第一基因樞,其含有克隆后可通過操作限定啟動(dòng)子模塊5'部分的至 少兩個(gè)恒定的罕見限制性位點(diǎn);b. 第一核酸序列;c. 第二基因樞,其含有克隆后可通過操作限定啟動(dòng)子模塊3'部分與表 達(dá)模塊5'部分之間的共有連接的至少兩個(gè)恒定的罕見限制性位點(diǎn);d. 第二核酸序列;e. 第三基因樞,其含有克隆后可通過操作限定表達(dá)模塊3,部分與3'調(diào)控 模塊5'部分之間的共有連接的至少兩個(gè)恒定的罕見限制性位點(diǎn);f. 第三核酸序列;和g. 第四基因樞,其含有克隆后可通過操作限定3'調(diào)控模塊3'部分的至 少兩個(gè)恒定的罕見限制性位點(diǎn);其中所述第一、第二和第三核酸序列中至少一個(gè)是包含多克隆位點(diǎn)(MCS) 的多克隆模塊,以便為將感興趣遺傳物質(zhì)克隆到多克隆模塊中提供克隆位 點(diǎn),其余核酸序列是填充片段序列,所述多克隆位點(diǎn)(MCS)含有選自在PE3停靠載體中獨(dú)特的常見限制性位點(diǎn)的多個(gè)限制性位點(diǎn)。
14. 如權(quán)利要求13所述的PE3 MC??枯d體,其特征在于,所述第一核 酸序列是多克隆模塊,所述第一基因樞至少選自AsiSI、 PacI或SbfI,所述第 二基因樞至少選自Fsel、 AscI或MluI。
15. 如權(quán)利要求13所述的PE3MC??枯d體,其特征在于,所述第二核 酸序列是多克隆模塊,所述第二基因樞至少選自Fsel、 AscI或MluI,所述第 三基因樞至少選自SnaB I、 Not I或Sal I。
16. 如權(quán)利要求13所述的PE3 MC停靠載體,其特征在于,所述核酸序 列是多克隆模塊,所述第二基因樞至少選自SnaB I、 NotI或SalI,所述第三 基因樞至少選自SwaI、 RsrII或BSiWI。
17. 如權(quán)利要求13所述的PE3MC??枯d體,其特征在于,所述第一基 因樞依次由AsiS I、 Pac I和Sbf I組成,所述第二基因樞依次由Fse I、 Asc I 和Mlu I組成,所述第三基因樞依次由SnaB I、 Not I和Sal I組成;所述第四 基因樞依次由SwaI、 RsrII和BSiWI組成。
18. 如權(quán)利要求13所述的PE3MC停靠載體,還包含由所述PE3載體釋 放PE3模塊,以插入多基因??枯d體的部件。
全文摘要
提供用于合成轉(zhuǎn)基因或其它復(fù)雜DNA構(gòu)建物的一組模塊克隆載體質(zhì)粒??赏ㄟ^本發(fā)明,采用經(jīng)優(yōu)化減少頻繁需要的操作量的克隆載體將各種DNA片段組裝到從頭DNA構(gòu)建物或轉(zhuǎn)基因中。模塊載體含有以線性方式排列的至少一個(gè)多克隆位點(diǎn)和多組罕見限制性位點(diǎn)和/或獨(dú)特的尋靶核酸內(nèi)切酶(“H”)位點(diǎn)。這種排列方式限定了模塊結(jié)構(gòu),這種結(jié)構(gòu)使得使用者能夠?qū)⒔Y(jié)構(gòu)域模塊或插入物放入PE3轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建物、但不破壞在先克隆步驟中已摻入PE3的DNA元件的完整性。只要稍作改動(dòng)或無需改動(dòng),即可將采用本發(fā)明產(chǎn)生的PE3轉(zhuǎn)基因用于單個(gè)生物體,或用于各種生物體,包括細(xì)菌、酵母、小鼠和其它真核生物。
文檔編號(hào)C12N7/00GK101370936SQ200680043379
公開日2009年2月18日 申請(qǐng)日期2006年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月22日
發(fā)明者J·F·周, T·里德 申請(qǐng)人:英特瑞克斯頓股份有限公司