專利名稱：來自葡糖桿菌屬細菌的質粒和載體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及可在屬于葡糖桿菌屬的細菌中自主復制的質粒，它為氧化葡糖桿菌IFO3171菌株的內源質粒pAG5并具有約5.6kb的大小，以及從該質粒構建的穿梭載體和來自屬于埃希氏菌屬細菌的質粒。該穿梭載體可用于在屬于葡糖桿菌屬的細菌中的基因操作。
屬于葡糖桿菌屬的細菌為工業(yè)有用微生物。例如，它們從D-阿拉伯糖醇產生D-木酮糖、木糖醇等?；虿僮骷夹g為一種從這些細菌繁殖進一步優(yōu)良菌株的有效方法。為了進行葡糖桿菌屬細菌的這一基因操作，必需首先開發(fā)一種用于目的細菌的宿主-載體系統(tǒng)。另外，另一方面，當在葡糖桿菌屬細菌中進行基因操作時，如果可獲得不僅在葡糖桿菌屬細菌，而且在其它宿主細胞，如大腸桿菌中可復制的質粒載體(在下文被稱為“穿梭載體”)，這將非常方便。
來自葡糖桿菌屬細菌的質粒以及使用它們的載體目前被報道在Hakkokogaku Kaishi，卷61，pp.15-18，(1983)，日本專利未審公開[KOKAI]號59-162883，歐洲專利公開EP0381027，國際專利公開WO95/23220等。尤其是，在Hakkokogaku Kaishi，卷61，pp.15-18，(1983)中，報道了氧化葡糖桿菌IFO3171菌株攜帶有一種大質粒(約2.6×107道爾頓)。
本發(fā)明的目的是提供一種新的可用于葡糖桿菌屬細菌的基因操作的質粒和使用該質粒的穿梭載體。
本發(fā)明人進行研究以獲得上述目的。結果，他們發(fā)現(xiàn)氧化葡糖桿菌IFO3171菌株擁有新的內源質粒，至此完成本發(fā)明。
也就是說，本發(fā)明提供(1)一種可在屬于葡糖桿菌屬的細菌中自主復制的質?；蚱溲苌?，所述質粒為氧化葡糖桿菌IFO3171菌株的內源質粒并具有約5.6kb的大小；(2)具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列的上面(1)項的質粒；(3)可在屬于葡糖桿菌屬的細菌和屬于埃希氏菌屬的細菌中自主復制的穿梭載體，它由上面(1)或(2)項的質?；蚱湟徊糠忠约翱稍趯儆诎ＯＪ暇鷮俚募毦凶灾鲝椭频馁|?；蚱湟徊糠謽嫿?；
(4)上面(3)的穿梭載體，其中可在屬于埃希氏菌屬的細菌中自主復制的質粒為pUC18；和(5)為pSG8或pSG6的上面(4)項的穿梭載體。
根據(jù)本發(fā)明，提供新的來自葡糖桿菌屬細菌的質粒，和使用該質粒的穿梭載體。穿梭載體可在葡糖桿菌屬細菌和大腸桿菌的細胞中自主復制，因而它可用于載體DNA的基因操作和基因轉移至葡糖桿菌屬的細菌中。
在下文將進一步詳細解釋本發(fā)明。
可從氧化葡糖桿菌IFO3171菌株制備本發(fā)明新的質粒?？蓮陌l(fā)酵研究所，Osaka(郵編532-8686，17-85，Juso-honmachi，2-chome，Yodogawa-ku，Osaka，日本)獲得IFO3171菌株。
本發(fā)明的質?？赏ㄟ^在如YPG培養(yǎng)基中培養(yǎng)IFO3171菌株，并通過從細胞中制備質粒DNA的常用方法，例如堿裂解法(核酸研究，7，1513(1979))，從獲得的細胞中制備細胞質DNA部分來獲得。而且，可通過EtBr-CsCl等密度梯度離心法、瓊脂糖凝膠電泳等純化DNA部分。
以如上所述的方式在下文描述的在實施例中獲得的本發(fā)明的質粒具有約5.6kb的大小，并被稱為pAG5。pAG5為一種在其大小上明顯不同于Hakkokogaku Kaishi，卷61，pp.15-18，(1983)中報道的來自氧化葡糖桿菌IFO3171菌株的質粒(約26百萬道爾頓)的新的質粒。pAG5的限制性圖譜示于

圖1中，其核苷酸序列示于序列表的SEQ ID NO1中。示于SEQID NO1的核苷酸序列代表來自在5’末端的pAG5的限制酶HindIII識別位點。
除開具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列的質粒外，本發(fā)明的質粒還包括在葡糖桿菌屬細菌中自主復制的它的衍生物。該衍生物可為對應于pAG5的質粒，從中除去了非復制區(qū)，或其中一部分插入了其它DNA序列。
通過將pAG5與可在非葡糖桿菌屬的細菌中自主復制的質粒連接，可獲得在該細菌中可自主復制的穿梭載體。作為非葡糖桿菌屬的細菌，可提及屬于埃希氏菌屬的細菌，具體地為大腸桿菌等。
為了構建穿梭載體，可使用完整的pAG5或其一部分。當使用其一部分時，該部分必須包含負責pAG5復制的區(qū)域，但可排除復制非必需區(qū)?？赏ㄟ^將用限制酶消化pAG5獲得的部分與可在大腸桿菌中自主復制的載體連接，用獲得的重組質粒轉化氧化葡糖桿菌，并確定轉化體是否攜帶有重組質粒來確定復制所需的區(qū)域。作為具有該區(qū)域的pAG5的部分片段的實例，可提及用HindIII和EcoRI消化pAG5獲得的兩個片段中較長的片段。
可在大腸桿菌中自主復制的質粒沒有特別限制，其實例包括通常用于使用大腸桿菌的基因操作的質粒載體。具體地說，可提及pUC18、pUC119、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHS398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219和pMW218等。對于這些質粒，還可使用整個質?；蚱湟徊糠?。當使用其一部分時，該部分必須包含涉及pAG5復制的區(qū)域，但可排除復制非必需的區(qū)域。對于許多大腸桿菌常用的載體，復制所需的區(qū)域和非必需區(qū)域已為熟知。
本發(fā)明的穿梭載體優(yōu)選包含標記基因，如藥物抗性基因。作為藥物抗性基因，可提及氨芐青霉素抗性基因、氯霉素抗性基因等。這些藥物抗性基因包含在大腸桿菌常用的載體中，并且隨著它們用于穿梭載體的構建，它們可與復制所需的區(qū)域一起使用。例如，pUC18具有氨芐青霉素抗性基因。
而且，本發(fā)明的穿梭載體具有克隆位點較好，優(yōu)選多克隆位點。上述許多用于大腸桿菌的質粒載體具有一個多克隆位點，它們可用于本發(fā)明的穿梭載體的構建。
作為本發(fā)明的的穿梭載體的實例，可提及pSG8和pSG6?？赏ㄟ^連接用限制酶HindIII消化的pAG5和用相同的限制酶HindIII消化的pUC18獲得pSG8?？赏ㄟ^連接將pAG5用HindIII和EcoRI消化獲得的片段中較長的片段和將pUC18用HindIII和EcoRI消化獲得的片段中較長的片段獲得pSG6。這些穿梭載體可在屬于埃希氏菌屬和葡糖桿菌屬的細菌中自主復制。因此，例如，如將DNA片段插入到穿梭載體中的操作可通過使用大腸桿菌來進行，并且將靶基因導入葡糖桿菌屬細菌可通過用獲得的重組載體轉化葡糖桿菌屬細菌來完成。作為克隆位點，在pSG8中可使用SacI、BamHI、XbaI、SalI和PstI，在pSG6中可使用EcoRI和HindIII位點。
當使用本發(fā)明的穿梭載體轉化葡糖桿菌屬細菌時，可使用常用的轉化方法，例如電脈沖法等。葡糖桿菌屬細菌的優(yōu)選實例為氧化葡糖桿菌。
下文將根據(jù)下面的實施例進一步具體地解釋本發(fā)明。
(1)質粒的分離和純化將氧化葡糖桿菌IFO3171菌株培養(yǎng)在YPG培養(yǎng)基中(酵母提取物0.5％，細菌蛋白胨0.3％，葡萄糖3％，pH6.5)，通過離心收集細胞，用常用的堿裂解法(核酸研究，7，1513(1979))提取細胞質DNA部分，并通過瓊脂糖裂解電泳分離和純化。結果，發(fā)現(xiàn)了約5.6kb的新的質粒，被稱為pAG5。
基于用一些限制酶消化pAG5制成的限制性圖譜示于圖1中。
(2)核苷酸序列的確定通過雙脫氧終止法確定pAG5的核苷酸序列。通過根據(jù)試劑盒所附的說明書使用染料終止循環(huán)測序盒(ABI生產)進行測序反應。通過使用DNA測序儀373(ABI生產)進行電泳。測定的核酸序列示于序列表SEQ ID NO1中。
(3)穿梭載體的構建將pAG5用限制酶HindIII消化?；旌舷a物和用HindIII消化的大腸桿菌的載體質粒pUC18(包含氨芐青霉素抗性基因)，并用DNA連接酶連接。使用連接產物，通過感受態(tài)細胞法轉化大腸桿菌JM109菌株。從顯示氨芐青霉素抗性的轉化體中選擇攜帶有pAG5和pUC18嵌合質粒的菌株，該嵌合質粒被稱為pSG8。
進一步，將pAG5用限制酶HindIII和EcoRI消化。混合消化的產物和用HindIII和EcoRI消化的大腸桿菌載體質粒pUC18，并用DNA連接酶連接。使用連接產物，通過感受態(tài)細胞法轉化大腸桿菌JM109菌株。從顯示氨芐青霉素抗性的轉化體中選擇攜帶有pAG5和pUC18一部分的嵌合質粒(約6.4kb)的菌株，該嵌合質粒被稱為pSG6。pSG8和pSG6構建的示意圖示于圖2中。
攜帶有pSG8的大腸桿菌JM109菌株被給予非公開編號AJ13485，1998年7月21日，它被保藏在專利微生物保藏單位通產省，工業(yè)技術院，生命工學工業(yè)技術研究所(郵編305-8566，1-3 Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本)，并給予了保藏號FERM P-16903，根據(jù)布達佩斯條約，于1999年6月14日，從原始保藏轉為國際保藏，保藏號FERM BP-6760。
(4)使用嵌合質粒轉化氧化葡糖桿菌ATCC621將氧化葡糖桿菌ATCC621菌株培養(yǎng)在YPG培養(yǎng)基中。將通過離心收集的細胞用10％蔗糖溶液洗滌，重新懸浮在10％蔗糖溶液中，并與嵌合質粒pSG8或pSG6(100ug/ml)混合。用電脈沖法，使用細胞融合設備Shimadzu SSH-10(Shimadzu生產)，通過7次施加1400V電脈沖進行轉化。在使用質粒pSG8和pSG6時均獲得氨芐青霉素抗性菌株。通過堿裂解法從這些菌株中分離質粒，并通過瓊脂糖凝膠電泳分析。結果證實轉化體攜帶有導入的質粒。
序列表(110)Ajinomoto Co.，Inc(120)來自葡糖桿菌屬細菌的質粒和載體(130)OP873(141)1999-08-(150)JP 10-227227437(151)1998-08-11(160)1(170)PatenIn Ver.2.0(210)1(211)5648(212)DNA(213)氧化葡糖桿菌(400)1aagctttgca cagatccttg gtctacacgg ctcgtggaac ctcaaaggcc gcactgtagc 60cagccaagtg aaagggaggc tcgtctaatg gggacgtttt atgaagagct ggcaaagctc 120caacatgccc gtttcatcgg aaaaacactg gatgaggtag taaggatcga aaagatttct 180gctaaccatc caaccaccat cgcaaggcag gccacaaagg cagaagaaca gcaaaccgtc 240gctgatctgg acaaggcgat ggccgcgcac gttcactcaa aaatgcatcc gggtgaaaac 300gagaagcagg catttatccg cctcgtaaac gagcatgatc ctgatgtgtc agcactctac 360agcagacgaa aagcagctat cgcattagcc gacaaaacaa cgggtcgata atggcgcaag 420cgtacacgcc caagggatca agaagagcct ttcagacatt catgacgctc aacaagctga 480aatcgtcaaa gcgtctatga ccggagagac cataagcgaa aacgaaccat ggttcgagcc 540atacaaagct catccagaaa tctacttagc tattcgaaca gcacggataa tgaggcaaaa 600cgggatggat ggagaatgac tgtgaaaatc cgcactcaag aggacgtggc aaagcagctc 660atccagattt acagcgatgc acgagaaggc agaattacac ccaaggccgc cgatcggctc 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權利要求
1.一種可在屬于葡糖桿菌屬的細菌中自主復制的質?；蚱溲苌铮鲑|粒為氧化葡糖桿菌IFO3171菌株的內源質粒并具有約5.6kb的大小。
2.權利要求1的質粒，它具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
3.可在屬于葡糖桿菌屬的細菌和屬于埃希氏菌屬的細菌中自主復制的穿梭載體，它由權利要求1或2的質?；蚱湟徊糠忠约翱稍趯儆诎ＯＪ暇鷮俚募毦凶灾鲝椭频馁|?；蚱湟徊糠謽嫿?。
4.權利要求3的穿梭載體，其中可在屬于埃希氏菌屬的細菌中自主復制的質粒為pUC18。
5.權利要求4的穿梭載體，其為pSG8或pSG6。
全文摘要
從氧化葡糖桿菌IF03171菌株的內源質粒構建可在屬于葡糖桿菌屬的細菌和屬于埃希氏菌屬的細菌中自主復制的具有約5.6kb大小的穿梭載體,或其一部分,以及可在屬于埃希氏菌屬的細菌中自主復制的質粒或其一部分。本發(fā)明提供新的可用于葡糖桿菌屬細菌中的基因操作的質粒以及使用該質粒的穿梭載體。
文檔編號C12N15/74GK1256308SQ9911770
公開日2000年6月14日 申請日期1999年8月11日 優(yōu)先權日1998年8月11日
發(fā)明者外內尚人, 杉山雅一, 橫關健三 申請人:味之素株式會社