專利名稱：制備發(fā)酵產(chǎn)物和逆境抗性微生物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備發(fā)酵產(chǎn)物的方法。具體地說，本發(fā)明涉及一種使用微生物來發(fā)酵制備一種有用物質(zhì)如一種氨基酸的方法以及一種對抑制其生長和/或發(fā)酵產(chǎn)物生產(chǎn)的逆境具有抗性的微生物。
當(dāng)細(xì)胞處于逆境如高溫、高滲透壓、代謝抑制、重金屬存在和病毒感染時(shí)，就會在短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)合成一組被稱為“熱休克蛋白”(以下簡稱“HSP”)的蛋白，來產(chǎn)生對逆境的防御反應(yīng)。這些HSP在廣泛的原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中具有同源性，它們大致被分為幾個(gè)族，如HSP60、HSP70、HSP90、TRiC和其他族(Hendrick，J.P.和Hartl，F(xiàn).-V.《生物化學(xué)年鑒》62卷，349-384頁(1993))。
HSP提供逆境抗性的機(jī)制是基于HSP形成蛋白高級結(jié)構(gòu)(蛋白折疊)的功能。也就是說，HSP能夠與因逆境而變性變得無法形成正確的高級結(jié)構(gòu)的蛋白結(jié)合，通過將其折疊成正確的高級結(jié)構(gòu)而恢復(fù)該蛋白的正常功能。
由于已經(jīng)清楚，HSP在蛋白高級結(jié)構(gòu)形成中的這種功能，不僅在變性蛋白中而且也在正常細(xì)胞中的蛋白裝配、跨膜運(yùn)輸?shù)戎凶鳛榉肿影閭H。因此其重要性已被人們認(rèn)識，并且吸引了人們的注意(E1lis，R.J.等《科學(xué)》250卷，954-959頁(1990))?！鞍閭H”一詞意指一種支持者，被給予這個(gè)名稱是因?yàn)镠SP通過與不同的蛋白結(jié)合來發(fā)揮其功能。
當(dāng)細(xì)胞處于上面提到的逆境中時(shí)，HSP的表達(dá)被誘導(dǎo)。這種誘導(dǎo)通常是暫時(shí)的。它很快減弱并達(dá)到一種新的穩(wěn)定狀態(tài)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HSP的這種誘導(dǎo)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平(Cowing，D.C.等，《美國科學(xué)院院報(bào)》80卷，2679-2683頁，(1995)；Zhou，Y.N.等《細(xì)菌學(xué)雜志》170卷，3640-3649頁，(1988))。已經(jīng)知道，一組HSP基因共同具有一種被稱為熱休克啟動(dòng)子的啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)，并且存在一種特異性地作用于這種熱休克啟動(dòng)子的因子---σ-32(σ32)。還已經(jīng)知道，σ32由rpoH基因編碼，σ32是一種半衰期非常短(約1分鐘)的蛋白質(zhì)，并與HSP的短暫誘導(dǎo)密切相關(guān)(Straus，D.B.等，《自然》329卷，348-351頁，(1987))。σ32自身的表達(dá)控制已經(jīng)顯示在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平完成，但其主要的控制在翻譯水平完成。
熱休克對HSP的誘導(dǎo)是基于兩種機(jī)制，即增加σ32的合成數(shù)量和穩(wěn)定性。在這些機(jī)制中，就σ32合成數(shù)量的增加而言，已經(jīng)搞清楚熱修飾的σ32mRNA結(jié)構(gòu)增強(qiáng)其翻譯(Yura，T等，《微生物學(xué)年鑒》47卷，321-350頁，(1993))。就σ32的穩(wěn)定性而言，已經(jīng)表明有一種HSP(DnaK等)參與σ32的解離，并且據(jù)認(rèn)為是受到HSP作用的反饋控制(Tilly，K.等，《細(xì)胞》34卷，641-646頁，(1983)；Liberk和K.，《美國科學(xué)院院報(bào)》89卷，3516-3520頁，(1984))。
就大腸桿菌(E.coli)而言，已經(jīng)知道在逆境存在時(shí)HSP與細(xì)胞生長的關(guān)系(Meury，J.等，《FEMS微生物學(xué)通訊》113卷，93-100頁(1993))。并且已經(jīng)知道dnaK和groE分別影響人生長激素的產(chǎn)生和原膠原酶的分泌。(Hockney，R.C.《生物技術(shù)動(dòng)向》12卷，456頁(1994))。
國際公開NO.WO96/26289介紹了通過將至少一個(gè)編碼一種HSP的基因和一個(gè)編碼一種特異性作用于一種HSP的σ因子的基因?qū)胍环N微生物以增加一種HSP的表達(dá)數(shù)量，來使該微生物獲得對抑制微生物生長和/或發(fā)酵產(chǎn)物生產(chǎn)的逆境的抗性。
本發(fā)明的目的是，在發(fā)酵生產(chǎn)一種有用的物質(zhì)如一種氨基酸時(shí)，通過降低抑制微生物生長和/或發(fā)酵產(chǎn)物生產(chǎn)的逆境影響來進(jìn)一步提高發(fā)酵產(chǎn)物的生產(chǎn)率和產(chǎn)量。
本發(fā)明的發(fā)明者進(jìn)行研究來完成上述目標(biāo)。結(jié)果為，他們發(fā)現(xiàn)，通過將一個(gè)來自極端嗜熱古細(xì)菌菌株KOD-1的編碼HSP的基因?qū)胍环N微生物來表達(dá)HSP，能在一種高逆境環(huán)境下使生產(chǎn)率和生長進(jìn)一步提高，至此完成本發(fā)明。
這樣，本發(fā)明提供了一種利用一種微生物來生產(chǎn)一種發(fā)酵產(chǎn)物的方法，該方法包括，在一種培養(yǎng)基中培養(yǎng)該微生物，來在培養(yǎng)物中生產(chǎn)和積累該發(fā)酵物，并收集發(fā)酵產(chǎn)物，其中該微生物通過導(dǎo)入一種編碼熱休克蛋白的基因來在該微生物的細(xì)胞中表達(dá)一種來自極端嗜熱古細(xì)菌菌株KOD-1的熱休克蛋白。
本發(fā)明還提供一種能產(chǎn)生一種發(fā)酵產(chǎn)物的微生物，該微生物通過導(dǎo)入一種編碼熱休克蛋白的基因來在該微生物的細(xì)胞中表達(dá)一種來自極端嗜熱古細(xì)菌菌株KOD-1的熱休克蛋白。
在上面提到的本發(fā)明的方法和微生物中，發(fā)酵產(chǎn)物可以是，例如，一種氨基酸如L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-谷氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸和L-苯丙氨酸；一種核酸或一種核苷如鳥苷酸、肌苷和肌苷酸；一種維生素；一種抗生素等，優(yōu)選是一種氨基酸。
至于本發(fā)明可以應(yīng)用的微生物，可以是屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌和棒狀桿菌。
根據(jù)本發(fā)明，在發(fā)酵生產(chǎn)有用的物質(zhì)如氨基酸時(shí)，逆境的影響可進(jìn)一步減少，生產(chǎn)率和產(chǎn)量可進(jìn)一步提高。


圖1是表示質(zhì)粒pMWcpkB的構(gòu)建示意圖。
以下對本發(fā)明作詳細(xì)解釋。
本發(fā)明能應(yīng)用的發(fā)酵產(chǎn)物沒有特別的限制，只要其能用一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)。其例子包括那些由微生物生產(chǎn)的發(fā)酵產(chǎn)物。例如各種氨基酸如L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-谷氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸和L-苯丙氨酸；核酸或核苷如鳥苷酸、肌苷和肌苷酸；維生素；抗生素等。而且本發(fā)明甚至可用于目前不是由微生物生產(chǎn)的物質(zhì)，一旦這種物質(zhì)按照遺傳重組或類似技術(shù)能夠用微生物進(jìn)行生產(chǎn)時(shí)，就可應(yīng)用本發(fā)明。在上面提到的物質(zhì)中，本發(fā)明的方法可適用于在一種培養(yǎng)基中分泌和積累、并因而增加培養(yǎng)基的滲透壓的物質(zhì)，尤其是如氨基酸。
用來通過導(dǎo)入一個(gè)編碼HSP的基因來在其細(xì)胞中表達(dá)衍生自極端嗜熱古細(xì)菌菌株KOD-1的HSP的微生物并沒有特別的限制，只要它能通過發(fā)酵生產(chǎn)一種發(fā)酵產(chǎn)物。其例子包括那些常規(guī)用于發(fā)酵生產(chǎn)的微生物，例如屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌、棒狀桿菌、屬于芽孢桿菌屬的細(xì)菌、屬于沙雷氏菌屬的細(xì)菌等。該微生物優(yōu)選是這樣一種微生物，獲得了含有質(zhì)粒所需的復(fù)制區(qū)域的DNA片段、在該微生物中上面提到的HSP基因具有功能、并且該基因的拷貝數(shù)能夠增加。前面提到的棒狀桿菌是指《伯杰氏細(xì)菌學(xué)鑒定手冊》第8版，599頁(1974)中定義的細(xì)菌種類，它們包括屬于棒狀桿菌屬的細(xì)菌、屬于以前歸于短桿菌屬但現(xiàn)在歸于棒狀桿菌屬的短桿菌屬的細(xì)菌、以及屬于與屬于棒狀桿菌屬的細(xì)菌相近的短桿菌屬的細(xì)菌。
具體地說，上面所提到的這種微生物可以是大腸桿菌VKPM B-3996(RIA1867，見美國專利NO.5,175,107)、嗜乙酰乙酸棒桿菌AJ12318(FERM BP-1172，見美國專利NO.5,188,949)或其他生產(chǎn)L-蘇氨酸的細(xì)菌；大腸桿菌A.J1442(NRRL B-12185和FERM BP-1543，見美國專利NO.4,346,170)、大腸桿菌W3110(tyrA)(該菌株可通過從大腸桿菌W3110(tyrA)/pHATerm(FERM BP-3653)中去除質(zhì)粒pHATerm來獲得，見國際公開NO.WO95/16042)、乳發(fā)酵短桿菌AJ12435(FERM BP-2294，見美國專利NO.5,304,476)、乳發(fā)酵短桿菌AJ3990(ATCC 31269，見美國專利NO.4,066,501)、或其他生產(chǎn)L-賴氨酸的菌株；大腸桿菌AJ12624(FERM BP-3853，見法國專利公開NO.2,680,178)、乳發(fā)酵短桿菌AJ12821(FERM BP-4172，見日本專利申請公開NO.5-26811(1993)、法國專利公開NO.2,701,489)、乳發(fā)酵短桿菌AJ12475(FERM BP-2922，見美國專利NO.5,272,067)、乳發(fā)酵短桿菌AJ13029(FERM BP-5189，見國際公開NO.WO96/06180)或其他生產(chǎn)L-谷氨酸的菌株；大腸桿菌AJ11478(FERM P-5274，見日本專利公開NO.62-34397(1987))、乳發(fā)酵短桿菌AJ3718(FERM P-2516，見美國專利NO.3,970,519)或其他生產(chǎn)L-亮氨酸的菌株；大腸桿菌KX141(VKPM B-4781，見歐洲專利公開NO.519,113)、黃色短桿菌AJ12149(FERM BP-759，見美國專利NO.4,656,135)或其他生產(chǎn)L-異亮氨酸的菌株；大腸桿菌VL1970(VKPMB-4411，見歐洲專利公開519,113)、乳發(fā)酵短桿菌AJ12341(FERMBP-1763，見美國專利NO.5,188,948)或其他生產(chǎn)L-纈氨酸的菌株；大腸桿菌AJ12604(FERM BP-3579，日本專利申請公開NO.5-236947(1993)、歐洲專利申請NO.488,424)、乳發(fā)酵短桿菌AJ12637(FERMBP-4160，見法國專利公開NO.2,686,898)或其他生產(chǎn)苯丙氨酸的菌株。
本發(fā)明的微生物是如上所述的這樣一種微生物，該微生物通過導(dǎo)入一個(gè)編碼HSP的基因而在其細(xì)胞中表達(dá)來自極端嗜熱古細(xì)菌菌株KOD-1的HSP。通過這種HSP的表達(dá)，賦予該微生物對抑制該微生物生長和/或發(fā)酵產(chǎn)物生產(chǎn)的逆境的抗性。
編碼極端嗜熱古細(xì)菌菌株KOD-1的HSP的基因優(yōu)選以提高HSP表達(dá)量的方式進(jìn)行導(dǎo)入。具體地說，一個(gè)細(xì)胞中的HSP基因的拷貝數(shù)可通過使用能在微生物細(xì)胞中自主復(fù)制的載體、特別是一種多拷貝質(zhì)粒作為將該HSP基因?qū)胛⑸锛?xì)胞的載體進(jìn)行提高。而且，HSP的表達(dá)還可通過使用具有高表達(dá)效率的啟動(dòng)子以增加每個(gè)HSP基因的表達(dá)量來有效提高。
編碼來自極端嗜熱古細(xì)菌KOD-1的HSP的基因可用日本專利申請公開NO.9-173078(1997)中介紹的方法來獲得。具體地說，這可以用諸如PCR的方法來獲得，PCR用從極端嗜熱古細(xì)菌菌株KOD-1菌株(《應(yīng)用與環(huán)境微生物》60(12)卷，4559-4566(1994)制備的染色體DNA作為模板，以日本專利申請公開NO.9-173078(1997)中公開的、編碼來自極端嗜熱古細(xì)菌菌株KOD-1的HSP的基因的核苷酸序列為基礎(chǔ)制備的寡核苷酸以及其他作為引物來進(jìn)行。用作引物的寡核苷酸的例子是具有顯示于日本專利申請公開NO.9-173078(1997)中SEQ ID NO8和9的核苷酸序列的寡核苷酸。
編碼極端嗜熱古細(xì)菌菌株KOD-1的HSP的基因也可以用整合了含有該基因的DNA片段的質(zhì)粒的方式來獲得。作為這樣一種質(zhì)粒，可以推薦質(zhì)粒pTrc99AcpkB。攜帶了這種質(zhì)粒pTrc99AcpkB的大腸桿菌JM109被命名為AJ13478，它于1998年7月8日在通產(chǎn)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(郵編305-0046，1-3，Higashi，1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)進(jìn)行了保藏，并獲得保藏號FERM P-16887。該保藏隨后在1999年6月14日根據(jù)布達(dá)佩斯條約轉(zhuǎn)為國際保藏，并獲得了保藏號FERM BP-6758。
為將按前面介紹獲得的基因?qū)胍粋€(gè)屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌，例如，可以將一個(gè)含有上述基因的DNA片段連接到一個(gè)能在該細(xì)菌的細(xì)胞中自主復(fù)制的載體DNA中，并用所獲得的重組載體轉(zhuǎn)化該細(xì)菌。為將上述基因?qū)胍粋€(gè)不屬于埃希氏菌屬細(xì)菌的微生物中，例如，可以將一個(gè)含有上述基因的DNA片段連接到一個(gè)能在該微生物中自主復(fù)制的載體DNA中，并用所獲得的重組載體轉(zhuǎn)化該微生物。
作為能用于本發(fā)明的載體DNA，優(yōu)選是一種質(zhì)粒載體DNA，當(dāng)導(dǎo)入基因的微生物是一種屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌時(shí)，可以使用諸如pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399、RSF1010等。噬菌體DNA載體也可以使用。為獲得該HSP的有效表達(dá)，可以用一種在該微生物中有功能的啟動(dòng)子如lac、trp或PL來取代HSP自身的啟動(dòng)子。為將該HSP基因?qū)胍环N微生物，可以采用使用轉(zhuǎn)座子(Berg，D.E.和Berg，C.M.，《生物/技術(shù)》1卷，417(1983))、Mu噬菌體(日本專利申請公開NO.2-109985(1990)、或同源重組(《分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)》冷泉港實(shí)驗(yàn)室(1972))的方法，來將一個(gè)含有該基因的DNA片段整合到上面提到的微生物的染色體中。而且，當(dāng)導(dǎo)入基因的微生物是一種棒狀桿菌時(shí)，可以使用一種能在棒狀桿菌中自主復(fù)制的質(zhì)粒載體，如pMA330(見日本專利公開NO.1-11280(1989))、pHM1519(見日本專利申請公開NO.58-77895(1983))等。
轉(zhuǎn)化可按照傳統(tǒng)的微生物轉(zhuǎn)化子制備方法來完成。例如，屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌可用D.A.Morrison的方法(《酶學(xué)方法》68卷，326頁(1979))或一種受體細(xì)胞用氯化鈣處理以增加DNA的通透性的方法(Mandel，M.和Higa，A.，《分子生物學(xué)雜志》53卷，159頁(1970))來進(jìn)行轉(zhuǎn)化。棒狀桿菌的轉(zhuǎn)化可用上面介紹的Mandel等人的方法或一種將DNA導(dǎo)入處于生長期的細(xì)胞(所謂的感受態(tài)細(xì)胞)以使細(xì)胞像在枯草芽孢桿菌中報(bào)道的那樣(Duncan，C.H.，Wilson，G.A.和Yong，F(xiàn).E.《基因》1卷，153頁(1971))整合DNA的方法來完成。也可以制備一種DNA受體菌株的原生質(zhì)體和球質(zhì)體，而原生質(zhì)體和球質(zhì)體容易整合DNA，然后像已知的枯草芽孢桿菌、放線菌和酵母那樣(Changs，S.和Choen，S.N.，《分子和普通遺傳學(xué)》168卷，111頁(1979)；Bibb，M.J.，Ward，J.M.和Hopwood，O.A.，《自然》274卷，398頁(1978)；Hinnen，A.，Hicks，J.B.和Fink，G.R.，《美國科學(xué)院院報(bào)》75卷，1929頁(1978))將DNA導(dǎo)入其中。而且，還可以用電脈沖技術(shù)(Sugimoto等，日本專利申請公開No.2-207791(1990))將重組DNA導(dǎo)入屬于短桿菌屬和棒狀桿菌屬的細(xì)菌。
當(dāng)一種普通微生物處于逆境如培養(yǎng)基溫度升高、發(fā)酵產(chǎn)物引起的高滲透壓、一種高濃度的培養(yǎng)基成分等或伴隨一種靶發(fā)酵產(chǎn)物生成的不正常代謝時(shí)，其生長會受到抑制或發(fā)酵產(chǎn)物的生產(chǎn)率可能會降低。但通過表達(dá)來自極端嗜熱古細(xì)菌菌株KOD-1的HSP，該微生物能獲得對逆境非常好的抗性。結(jié)果，在該微生物處于上面提到的逆境中時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物的生產(chǎn)率會進(jìn)一步提高。因此，除了直接檢測HSP外，在導(dǎo)入了來自極端嗜熱古細(xì)菌菌株KOD-1的HSP編碼基因以在其細(xì)胞中表達(dá)HSP的微生物中，上述HSP的表達(dá)也可用對上述逆境的抗性進(jìn)行評價(jià)來證明。
對逆境的抗性可能不是完全的抗性，它還指降低逆境影響的能力。而且，根據(jù)導(dǎo)入基因的種類和宿主微生物的種類，生長抑制和發(fā)酵產(chǎn)量降低也不一定都需要獲得改善，可能只有發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量得到提高而生長受到抑制。本發(fā)明的方法能對之提供抗性的逆境包括溫度(例如溫度升高)、培養(yǎng)基滲透壓(例如高滲透壓)、一種培養(yǎng)基中的一種氨基酸高濃度等，這些逆境對微生物的生長有害。
本發(fā)明所用的進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)的培養(yǎng)基可以是一種常規(guī)使用的、眾所周知的培養(yǎng)基。也就是說，它可以是一種含有一種碳源、一種氮源、無機(jī)鹽離子和其他所需的有機(jī)成分的普通培養(yǎng)基。使用本發(fā)明并不需要任何特殊的培養(yǎng)基。
就碳源而言，可以使用一種糖類如葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖和淀粉水解物、一種醇類如甘油和山梨醇、一種有機(jī)酸如延胡索酸、檸檬酸和琥珀酸等。
就氮源而言，可以使用一種無機(jī)銨鹽如硫酸銨、氯化銨和磷酸銨、一種有機(jī)氮源如大豆水解物、氨氣、氨水等。
就微量有機(jī)營養(yǎng)而言，需要加入適量的所需物質(zhì)如維生素B1、L-高絲氨酸和L-酪氨酸或酵母抽提物等。除了這些，根據(jù)需要可加入微量的磷酸鉀、硫酸鎂、鐵離子、錳離子等。
培養(yǎng)可在根據(jù)所用微生物的種類而從常規(guī)使用的、眾所周知的條件中選擇的條件下進(jìn)行。例如，培養(yǎng)可在一種厭氧環(huán)境中進(jìn)行16~120小時(shí)，并將發(fā)酵溫度控制在25至45℃，pH控制在5至8。為調(diào)節(jié)pH，可以使用有機(jī)或無機(jī)的酸性或堿性的物質(zhì)以及氨氣等。
在本發(fā)明中，完成培養(yǎng)后從培養(yǎng)基中收集發(fā)酵產(chǎn)物不需要特別的方法。也就是說，根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的代謝產(chǎn)物可以用一種眾所周知的傳統(tǒng)方法如離子交換層析、沉淀、以及這些或其他技術(shù)的任意組合等進(jìn)行收集。
本發(fā)明將參照下面的實(shí)施例作更具體的解釋。
實(shí)施例1
使用導(dǎo)入了來自極端嗜熱古細(xì)菌菌株KOD-1的HSP編碼基因(cpkB基因)的L-賴氨酸生產(chǎn)大腸桿菌來生產(chǎn)L-賴氨酸。
大腸桿菌W3110(tyrA)被用作一種生產(chǎn)L-賴氨酸的宿主。菌株W3110(tyrA)在歐洲專利申請No.488424中有詳細(xì)的介紹，其制備方法將在下面概述。大腸桿菌W3110獲自國立遺傳研究所(Mishima-shiShizuoka，日本)。將該菌株接種于含有鏈霉素的LB平板，并通過挑選形成菌落的菌株來獲得一個(gè)鏈霉素抗性菌株。將所選擇的鏈霉素抗性菌株和大腸桿菌K-12 ME8424的細(xì)胞混合，并在一種完全培養(yǎng)基(L-肉湯1％細(xì)菌用胰蛋白胨、0.5％酵母抽提物、0.5％NaCl)中在37℃靜止培養(yǎng)15分鐘來誘導(dǎo)細(xì)胞接合。大腸桿菌K-12 ME8424的遺傳特征為(HfrPO45、thi、relA1、tyrATn10、ung-1、nadB)，并可從國立遺傳所獲得。然后，將培養(yǎng)物接種于一種含有鏈霉素、四環(huán)素和L-酪氨酸的完全培養(yǎng)基(L-肉湯1％細(xì)菌用胰蛋白胨、0.5％酵母抽提物、0.5％NaCl、1.5％瓊脂)，選擇一個(gè)能形成菌落的菌株。該菌株被命名為大腸桿菌W3110(tyrA)。
在歐洲專利申請No.488424中公開了通過向這種菌株導(dǎo)入一種質(zhì)粒而制備的多種菌株。例如，通過向該菌株導(dǎo)入質(zhì)粒pHATerm而制備的一個(gè)菌株被命名為大腸桿菌W3110(tyrA)/pHATerm，它于1991年在通產(chǎn)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(郵編305-0046，1-3，Higashi，1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)根據(jù)布達(dá)佩斯條約作為國際保藏進(jìn)行了保藏，并獲得了保藏號FERM BP-3653。大腸桿菌W3110(tyrA)可用一種常規(guī)方法從上述菌株中去除質(zhì)粒pHATerm來獲得。
質(zhì)粒pCABD2含有賴氨酸生物合成基因，并在國際公開No.WO95/16042中公開。將該質(zhì)粒導(dǎo)入上述大腸桿菌W3110(tyrA)中，在一種含有50ug/ml鏈霉素的L平板培養(yǎng)基(在1升純水中含有10克聚胨、5克酵母抽提物、5克NaCl和15克瓊脂，pH7.2)中選擇導(dǎo)入了該質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子。
另一方面，一種用于導(dǎo)入cpkB的質(zhì)粒按下述方法構(gòu)建。一個(gè)含有cpk基因的PCR片段按日本專利申請公開No.9-173078(1997)的實(shí)施例5中介紹的方法獲得，并用NcoI和BamHI消化。將酶切片段克隆到一種載體質(zhì)粒pTrc99A(Pharmacia制造)的NcoI和BamHI位點(diǎn)之間來獲得一種質(zhì)粒pTrc99AcpkB。攜帶質(zhì)粒pTrc99AcpkB的大腸桿菌JM109被命名為大腸桿菌AJ13478，它已于1998年7月8日在通產(chǎn)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(郵編305-0046，1-3，Higashi，1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)進(jìn)行了保藏，并獲得保藏號FERMP-16887。該保藏隨后在1999年6月14日根據(jù)布達(dá)佩斯條約轉(zhuǎn)為國際保藏，并獲得了保藏號FERM BP-6758。而且，一個(gè)含有加入的trc啟動(dòng)子(用EcoRI和BamHI從pTrc99AcpkB中消化切出)的cpkB基因被克隆到pMW218(Wako Pure Chemical Industries制造)的SmaI和BamHI位點(diǎn)之間來獲得一個(gè)質(zhì)粒pMWcpkB，構(gòu)建該質(zhì)粒的概述示于圖1。用前面提到的方法將此pMWcpkB導(dǎo)入一個(gè)大腸桿菌W3110(tyrA)/pCABD2的細(xì)胞。在含有50ug/ml鏈霉素和50ug/ml卡那霉素的L平板培養(yǎng)基上選擇導(dǎo)入了該質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
而且，按下面的方法構(gòu)建一個(gè)用于導(dǎo)入rpoH基因的質(zhì)粒。rpoH基因用國際公開No.WO96/26289的實(shí)施例1<1>中介紹的PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，并使用一個(gè)用于平末端化DNA末端的商業(yè)試劑盒(Blunting試劑盒，Takara Shuzo制造)將所獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物在兩端平末端化，并克隆到載體質(zhì)粒pMW119(Wako Pure Chemical Industries制造)的HincII位點(diǎn)來獲得質(zhì)粒pMWrpoH。用上面提到的方法將該質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌W3110(tyrA)/pCABD2。在含有50ug/ml鏈霉素和50ug/ml青霉素的L平板培養(yǎng)基上選擇導(dǎo)入了該質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
評價(jià)按上述介紹獲得的大腸桿菌W3110(tyrA)/pCABD2、大腸桿菌W3110(tyrA)/pCABD2+pMWrpoH、和大腸桿菌W3110(tyrA)/pCABD2+pMWcpkB的L-賴氨酸生產(chǎn)率。
對所獲轉(zhuǎn)化子的L-賴氨酸生產(chǎn)率的評價(jià)按下述進(jìn)行。將細(xì)胞在L平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)進(jìn)行復(fù)蘇，并將每種復(fù)蘇的轉(zhuǎn)化子在1升純水中含有40克葡萄糖、1克KH2PO4、0.01克MnSO47H2O、0.01克FeSO47H2O、2克酵母抽提物、0.1克L-酪氨酸、1克MgSO47H2O和25克CaCO3(pH用KOH調(diào)至7.0)的培養(yǎng)基中在37℃培養(yǎng)30小時(shí)。還將細(xì)胞在相同條件下但在開始培養(yǎng)時(shí)加入40克/升的L-賴氨酸鹽酸鹽進(jìn)行培養(yǎng)。L-賴氨酸的定量試驗(yàn)使用Asahi Chemical Industry Co.，Ltd制造的Biotech Analyzer AS210來進(jìn)行。L-賴氨酸的產(chǎn)量(數(shù)量用從培養(yǎng)后培養(yǎng)基中的L-賴氨酸數(shù)量中減去開始時(shí)加入的L-賴氨酸數(shù)量來獲得)用培養(yǎng)基中基于糖的L-賴氨酸鹽酸鹽的產(chǎn)量(重量％)來表示。結(jié)果示于表1。
表1基于糖的L-賴氨酸鹽酸鹽產(chǎn)量(％)菌株開始時(shí)加入的L-賴氨酸鹽酸鹽(g/L)0 40W3110(tyrA)/pCABD2 30.027.4W3110(tyrA)/pCABD2+pMWrpoH30.228.8W3110(tyrA)/pCABD2+pMWcpkB30.429.3從這些結(jié)果可明顯看出，與沒有cpkB基因?qū)氲木旰蛯?dǎo)入了rpoH基因的菌株相比，導(dǎo)入了cpkB基因的大腸桿菌即使在存在高濃度的L-賴氨酸的情況下，也能顯示提高的L-賴氨酸生產(chǎn)率。
并且，在培養(yǎng)開始時(shí)加入22g/L的NaCl的條件下，對L-賴氨酸的生產(chǎn)率進(jìn)行了相似的評價(jià)。結(jié)果示于表2。
表2基于糖的L-賴氨酸鹽酸鹽產(chǎn)量(％)菌株開始時(shí)加入的NaCl(g/L)0 22W3110(tyrA)/pCABD2 30.024.3W3110(tyrA)/pCABD2+pMWrpoH30.225.0W3110(tyrA)/pCABD2+pMWcpkB30.425.5從這些結(jié)果可明顯看出，與沒有cpkB基因?qū)氲木旰蛯?dǎo)入了rpoH基因的菌株相比，導(dǎo)入了cpkB基因的大腸桿菌即使在存在高濃度的NaCl的情況下，也能顯示提高的L-賴氨酸生產(chǎn)率。因此，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其對高滲透壓有很好的抗性。
然后，研究了培養(yǎng)溫度對L-賴氨酸生產(chǎn)的影響。L-賴氨酸生產(chǎn)率用上面介紹的相同方式進(jìn)行評價(jià)，但培養(yǎng)在作為標(biāo)準(zhǔn)條件的37℃下和在42℃下進(jìn)行。結(jié)果示于表3。
表3基于糖的L-賴氨酸鹽酸鹽產(chǎn)量(％)菌株培養(yǎng)溫度(℃)37 42W3110(tyrA)/pCABD2 30.026.3W3110(tyrA)/pCABD2+pMWrpoH30.227.7W3110(tyrA)/pCABD2+pMWcpkB30.427.9從這些結(jié)果可明顯看出，與沒有cpkB基因?qū)氲木旰蛯?dǎo)入了rpoH基因的菌株相比，導(dǎo)入了cpkB基因的大腸桿菌即使在高溫的培養(yǎng)中，也能顯示提高的L-賴氨酸生產(chǎn)率。
權(quán)利要求
1.一種利用微生物來生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的方法，該方法包括在一種培養(yǎng)基中培養(yǎng)該微生物來在培養(yǎng)基中生產(chǎn)和積累發(fā)酵產(chǎn)物，并收集發(fā)酵產(chǎn)物，其中該微生物通過導(dǎo)入一種編碼熱休克蛋白的基因來在該微生物的細(xì)胞中表達(dá)一種來自極端嗜熱古細(xì)菌菌株KOD-1的熱休克蛋白。
2.權(quán)利要求1的方法，其中發(fā)酵產(chǎn)物是一種氨基酸。
3.權(quán)利要求1的方法，其中微生物是一種屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌或一種棒狀桿菌。
4.權(quán)利要求2的方法，其中微生物是一種屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌或一種棒狀桿菌。
5.一種生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的微生物，該微生物通過導(dǎo)入一種編碼熱休克蛋白的基因來在該微生物的細(xì)胞中表達(dá)一種來自極端嗜熱古細(xì)菌菌株KOD-1的熱休克蛋白。
6.權(quán)利要求5的微生物，其中發(fā)酵產(chǎn)物是一種氨基酸。
7.權(quán)利要求5的微生物，其中微生物是一種屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌或一種棒狀桿菌。
8.權(quán)利要求6的微生物，其中微生物是一種屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌或一種棒狀桿菌。
全文摘要
一種利用微生物來生產(chǎn)一種發(fā)酵產(chǎn)物的方法,該方法包括,在一種培養(yǎng)基中培養(yǎng)該微生物,來在培養(yǎng)基中生產(chǎn)和積累該發(fā)酵產(chǎn)物,并收集發(fā)酵產(chǎn)物,其中該微生物通過導(dǎo)入一種編碼熱休克蛋白的基因來在該微生物的細(xì)胞中表達(dá)一種來自極端嗜熱古細(xì)菌菌株KOD－1的熱休克蛋白。
文檔編號C12R1/19GK1250102SQ9911770
公開日2000年4月12日 申請日期1999年8月11日 優(yōu)先權(quán)日1998年8月11日
發(fā)明者菊池慶實(shí), 倉橋修, 橫關(guān)健三, 田中崇 申請人:味之素株式會社