專利名稱：一種提高植物細(xì)胞壁中纖維素含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中一種提高植物細(xì)胞壁中纖維素含量的方法。
背景技術(shù)：
纖維素是木材的主要組分，是地球上具重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的可再生資源，自然界每年可生產(chǎn)約1，800億噸的纖維素。并且，由于木材包含木本植物光合作用產(chǎn)生的絕大部分生物量，因此林木是人類最主要的可再生資源，與國(guó)計(jì)民生息息相關(guān)，更是制漿造紙工業(yè)、建筑業(yè)、紡織業(yè)以及新興的生物能源產(chǎn)業(yè)的重要原材料。木材為木本植物的次生木質(zhì)部，其中次生細(xì)胞壁構(gòu)成了木材的絕大部分生物量， 它的形成主要依賴于次生木質(zhì)部的年度周期性生長(zhǎng)和累加，即通常所說(shuō)的植物次生生長(zhǎng)。 次生細(xì)胞壁形成直接關(guān)系到纖維生物質(zhì)的積累，這一過(guò)程主要包括纖維素和半纖維素、木質(zhì)素等生物合成及組裝。特別是纖維素的定向排列和木質(zhì)素的沉積是次生細(xì)胞壁形成過(guò)程中的標(biāo)志性事件。木材中通常纖維素含量約占45 %，半纖維素約占30 %和木質(zhì)素約占25 %，通常稱為木質(zhì)纖維素生物質(zhì)。它是制漿造紙工業(yè)的重要原料之一，也是高檔紙品生產(chǎn)的主要原料， 生產(chǎn)中利用的主要成分為其中的纖維素。而木質(zhì)素則需要在制漿過(guò)程中利用大量的化學(xué)品從原料中分離，留下的纖維素用于造紙。在生物能源產(chǎn)業(yè)中，利用木質(zhì)纖維生物質(zhì)材料生產(chǎn)乙醇已成為第二代生物基液體燃料研究的熱點(diǎn)。目前已經(jīng)市場(chǎng)化的生物燃料主要包括以糧食為加工原料的第一代生物乙醇和以植物油為加工原料的生物柴油，這兩種生物燃料的發(fā)展都遭遇了生產(chǎn)原料不足的瓶頸問(wèn)題。與之相比，第二代生物燃料纖維素乙醇的發(fā)展因原材料充足，顯示出巨大的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用潛力。因此，我國(guó)《能源發(fā)展“十一五”規(guī)劃》、《可再生能源中長(zhǎng)期發(fā)展規(guī)劃》等一系列政策法規(guī)中明確提出“積極發(fā)展以纖維素生物質(zhì)為原料的生物液體燃料技術(shù)”。同時(shí)以法規(guī)的形式禁止玉米等糧食作物在生物乙醇生產(chǎn)中的應(yīng)用。在燃料乙醇行業(yè)中起作用的主要是纖維素和半纖維素，木質(zhì)素作為一種副產(chǎn)物，必須采取有效的預(yù)處理工藝進(jìn)行脫除；目前由于五碳糖的發(fā)酵相對(duì)困難，燃料乙醇行業(yè)中利用的主要是纖維素。預(yù)處理后通過(guò)酸水解或酶水解等方法把木質(zhì)纖維素生物質(zhì)中纖維素分解成可用于乙醇發(fā)酵的葡萄糖，這個(gè)過(guò)程稱為 “糖化”。經(jīng)預(yù)處理和糖化過(guò)程獲得的單糖，可直接用于微生物發(fā)酵，生產(chǎn)生物乙醇?？偟膩?lái)說(shuō)，木質(zhì)纖維素生產(chǎn)燃料乙醇包括預(yù)處理、糖化和發(fā)酵三個(gè)工藝過(guò)程。綜上所述，纖維素的含量和存在形式直接影響制漿造紙過(guò)程中紙漿得率和生物發(fā)酵乙醇的產(chǎn)率。因此，通過(guò)定向育種手段，提高木材中纖維素的含量在產(chǎn)業(yè)上具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明所提供的培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是降低目的植物中4-香豆酸CoA連接酶編碼基因的表達(dá)，得到與所述目的植物相比，細(xì)胞壁中纖維素含量提高的轉(zhuǎn)基因植物。所述4-香豆酸CoA連接酶為由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。所述4-香豆酸CoA連接酶的編碼基因?yàn)槿缦?)-4)中任一所述的基因1)序列表中序列1第180位到1568位所示的DNA分子；2)序列表中序列1所示的DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)所示的DNA分子雜交且編碼序列表中序列2所示氨基酸序列組成的蛋白的基因；4)與1)或2)或3)的基因具有90%以上的同源性且編碼序列表中序列2所示氨基酸序列組成的蛋白的基因。所述降低目的植物中4-香豆酸CoA連接酶編碼基因的表達(dá)是通過(guò)將4-香豆酸 CoA連接酶編碼基因的反義基因?qū)肽康闹参镏袑?shí)現(xiàn)的。所述4-香豆酸CoA連接酶編碼基因的反義基因的核苷酸序列與序列表中序列1 第180位到1568位所示的核苷酸序列反向互補(bǔ)。所述降低目的植物中4-香豆酸CoA連接酶編碼基因的表達(dá)是通過(guò)將重組表達(dá)載體pAS4CLl導(dǎo)入目的植物中實(shí)現(xiàn)的；所述重組表達(dá)載體pAS4CLl是通過(guò)包括如下步驟的方法制備得到的(1)在⑶S基因片段的5'端引入BamHI和SpeI酶切位點(diǎn)和3'端引入^icI和 MlI酶切位點(diǎn)，得到⑶S'基因片段；將所述⑶S'基因片段插入載體PBI121的BamHI和 SacI位點(diǎn)間，替換載體PBI121上的⑶S基因，得到中間重組載體；(2)將與序列表中序列1第180位到1568位所示的核苷酸序列反向互補(bǔ)的DNA序列沿著從)(bal至MlI的方向插入所述中間重組載體的^CbaI和MlI位點(diǎn)間，得到的重組載體 PAS4CL1。所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述雙子葉植物具體為毛白楊(Populus tomentosa)0
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種重組表達(dá)載體。本發(fā)明所提供的重組表達(dá)載體，是通過(guò)包括如下步驟的方法制備得到的(1)在⑶S基因片段的5'端引入BamHI和SpeI酶切位點(diǎn)和3'端引入^icI和 MlI酶切位點(diǎn)，得到⑶S'基因片段；將所述⑶S'基因片段插入載體PBI121的BamHI和 SacI位點(diǎn)間，替換載體PBI121上的⑶S基因，得到中間重組載體；(2)將與序列表中序列1第180位到1568位所示的核苷酸序列反向互補(bǔ)的DNA序列沿著從)(bal至MlI的方向插入所述中間重組載體的^CbaI和MlI位點(diǎn)間，即得到的所述重組表達(dá)載體。所述重組表達(dá)載體在提高植物細(xì)胞壁中纖維素含量中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述雙子葉植物具體為毛白楊(Populus tomentosa)0本發(fā)明通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)和反義RNA技術(shù)結(jié)合，獲得4CL基因表達(dá)受到抑制的轉(zhuǎn)基因楊樹，轉(zhuǎn)基因楊樹成熟木材的細(xì)胞壁中纖維素含量顯著增加，轉(zhuǎn)基因植株較野生型對(duì)照
4植株細(xì)胞壁中纖維素含量增加了 3% -7%。


圖1為毛白楊莖次生木質(zhì)部的總RNA快速電泳示意圖。。圖2為4CL特異性RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖。圖3為中間載體pBI121-M示意圖。圖4為植物雙元表達(dá)載體pAS4CLl示意圖。圖5為表達(dá)反義4CL基因的轉(zhuǎn)基因毛白楊RT-PCR檢測(cè)結(jié)果。圖6為表達(dá)反義4CL基因的轉(zhuǎn)基因毛白楊Wfestern blot檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、細(xì)胞壁合成相關(guān)基因克隆木材即是植物的次生細(xì)胞壁，主要由纖維素、木質(zhì)素和半纖維素三種成分組成，也就是我們通常所說(shuō)的纖維生物質(zhì)。利用基因工程方法，改變細(xì)胞壁組分，有望提高能源植物生物質(zhì)在燃料乙醇生產(chǎn)中的利用效率。選擇木質(zhì)素單體合成途徑的早期酶促反應(yīng)的關(guān)鍵酶基因，即4-香豆酸CoA連接酶(4CL，coumarate =CoA ligase)基因，進(jìn)行表達(dá)調(diào)控，在改變細(xì)胞壁中纖維素、木質(zhì)素組分的基礎(chǔ)上，提高木材原材料的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用效率。毛白楊(Populus tomentosa)4CL基因全長(zhǎng)cDNA序列是通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR) 方法獲得的。首先以毛白楊次生木質(zhì)部總RNA為模板，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈；再以 cDNA第一鏈為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增克隆出全長(zhǎng)基因。具體方法如下一、總RNA的分離提取選取田間生長(zhǎng)一年以上的毛白楊(Populus tomentosa)(購(gòu)自寧夏萊州市興林園藝場(chǎng))，剝掉樹干的樹皮后，用手術(shù)刀片刮取莖桿外部一層白色組織，作為次生木質(zhì)部材料用于總RNA的提取。取材過(guò)程中所用剪刀、手術(shù)刀片均經(jīng)高溫烘烤后使用。刮取的次生木質(zhì)部材料置于沒(méi)有RNA酶污染的離心管中，立刻投入液氮中保存。使用TRIzol (購(gòu)自Invitrogen)提取毛白楊次生木質(zhì)部的RNA。取IOOmg毛白楊次生木質(zhì)部材料，液氮研磨后，轉(zhuǎn)移到1. 5ml離心管中，迅速加入Iml TRIzol試劑，25°C下溫育5min ；4°C下12000rpm離心IOmin ；取上清水相，轉(zhuǎn)移到一新的離心管中，加0. 2ml氯仿，劇烈震蕩；25°C下溫育:3min ；4°C下12000rpm離心15min ；取上清水相，轉(zhuǎn)移到一新的離心管中；加等體積5M LiCl，混勻；-20°C下靜止lhr，沉淀RNA ； 12000rpm離心45min，4°C ； 棄上清，加Iml 75%乙醇，7500rpm離心5min，2-8°C;重復(fù)3次；棄乙醇，超鏡臺(tái)中空氣干燥 IOmin ；加50 μ 1 DEPC處理的雙蒸水溶解lOmin，55_60°C。毛白楊莖干次生木質(zhì)部的總RNA 快速電泳如圖1所示。二、RT-PCR方法擴(kuò)增4CL基因使用Thermc^cript RT-PCR試劑盒(購(gòu)自Invitrogen)，按照說(shuō)明書的說(shuō)明合成 00嫩第一鏈。以01丨80((11020為引物，421保溫1虹，之后加入1口1 RNase H(2U/μ 1), 37°C保溫10分鐘。以1 μ 1 cDNA第一鏈反應(yīng)混合物為模板，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增4CL cDNA片段，上游引物為 4CLf 1:5' -CGCCACAATGAATCCACA，下游引物為4CLrl :5' -ATGGTGCCTTGGGAATAGC。反應(yīng)體系為25μ 1，其中包含2· 5μ 1 10XPCR Buffer、1. 5 μ 1 MgC12(25mM)、 0· 5 μ IdNTP mix (IOmM each)、各 1 μ 1 的上游引物 4CLfl 和下游引物 4CLrl (10 μ Μ)、 1 μ IcDNA 第一鏈反應(yīng)混合物、0. 15 μ 1 Taq DNA 聚合酶(5U/μ 1)和 17. 35 μ 1 Η20。PCR 反應(yīng)程序如下95°C，5min ；94°C，30s, 58°C，30s, 72°C，50s, 30cycles ；72°C，IOmin0 反應(yīng)結(jié)束后，取20 μ 1 PCR產(chǎn)物在1 %瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示，其中M為marker，泳道1為4CL cDNA擴(kuò)增片段，約為1. 61Λ。三、DNA片段的電泳純化回收采用Vitagene-DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒，純化4CL片段電泳完畢在紫外燈下切下目的條帶，放在1. 5ml EP管中；加入3倍體積的凝膠熔化劑，混合后75°C溫浴8分鐘，期間間斷混合，使凝膠徹底熔化；加0. 5倍凝膠熔化劑體積的高離液序列溶液，混合均勻；取一新的離心吸附柱，置于2ml離心管中，將上一步所得的溶液加入離心吸附柱中， 3600rpm，離心lmin，棄濾液；將離心吸附柱置回離心管中，加0. 5ml洗滌液Wl，3600rpm， 離心30s，棄濾液；將離心吸附柱置回離心管中，加0. 7ml洗滌液W2，3600rpm，離心30s，棄濾液，重復(fù)上步操作一次；將離心吸附柱置回離心管中，12000rpm離心lmin，盡量除去漂洗液；將離心吸附柱置于潔凈的1. 5ml離心管中，在DNA制備膜正中央加25 μ 1水，室溫靜置 lmin, 12000rpm離心Imin洗脫DNA，得到純化的4CL片段。四、4CL克隆及測(cè)序使用pGEM-T Easy (購(gòu)自promega)載體克隆4CL片段，具體方法如下取4 μ 1純化的4CL片段，依次加入5 μ 1 2ΧΤ4連接酶緩沖液，0. 5 μ 1 pGEM-T Easy vector (50ng/ μ 1)，0. 5 μ 1 T4DNA 連接酶(3U/ μ 1)，4°C溫浴過(guò)夜。獲得 4CL cDNA 片段與 pGEM-T Easy 載體的連接產(chǎn)物。在超凈臺(tái)內(nèi)，將連接產(chǎn)物加入到50μ 1大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞(購(gòu)自 invitrogen,產(chǎn)品目錄號(hào)為18265017)中，混勻，置冰上30分鐘；42°C，熱激90s ；冰浴 2min ；250 μ 1 LB液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)Ihr ；將150 μ 1細(xì)胞懸液混勻涂布在含100 μ g/ml Amp、X-gal (40mg/L)，IPTG(40mg/L)的LB固體培養(yǎng)基上，37°C避光倒置培養(yǎng)過(guò)夜。挑取LB平板上的白色克隆，置于:3ml LB培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)過(guò)夜；隨后的質(zhì)粒DNA提取和EcoRI限制性內(nèi)切酶反應(yīng)參照《分子克隆》(Cold Spring Harbor Laboratory Press, edition 1，1989)進(jìn)行。電泳檢測(cè)酶切片段的大小。含重組克隆的質(zhì)粒經(jīng)雙氧法測(cè)序，獲得的4CL cDNA片段的核苷酸序列如序列表中序列1所示，它含有完整的開放閱讀框， 編碼含有520個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(其氨基酸序列如序列表中序列幻，將其命名為4CL。將含序列表中序列1所示核苷酸序列的質(zhì)粒載體命名為T-Pt4CLl。實(shí)施例2、獲得表達(dá)反義4CL的轉(zhuǎn)基因毛白楊一、基因工程表達(dá)載體的構(gòu)建在植物雙元表達(dá)載體pBI121(購(gòu)自美國(guó)Clontech公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為6018-1)上引入SpeI和MlI限制性酶切位點(diǎn)，構(gòu)建中間載體PBI121-M。具體地說(shuō)，首先在⑶S基因片段的5'和3'端分別引入8￡ 11!11/^^1和&^1/5￡111位點(diǎn)，得到^5'基因片段。所用的引物為GUSf2 5' -AACTTGGATCCACTAGTTCTACACCACGCCGAACACCT-3' (BamHI/Spel)，GUSr2 5' -GCACCGAGCTCGTCGACCAGCAGCAGTTTCATCAATCACC-3' (Sacl/Sall),PCR擴(kuò)增模板為雙元表達(dá)載體pBI121。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)BamHI和^icI雙酶切后， 克隆到植物雙元表達(dá)載體PBI121的BamHI和McI位點(diǎn)間，由GUS'基因片段替換原載體的 ⑶S全長(zhǎng)基因，同時(shí)在⑶S'基因片段的兩側(cè)分別引入了 SpeI和MlI限制性酶切位點(diǎn)。中間載體PBI121-M示意圖見(jiàn)圖3。將4CL基因經(jīng)McI和^CbaI反向克隆到中間載體pB1121-M上，替換原載體的⑶S ‘ 基因片段，構(gòu)建好的表達(dá)載體命名為PAS4CL1。具體方法如下首先通過(guò)PCR方法在4CL基因的5'和3'端分別引入McI和^CbaI位點(diǎn)，所用的引物為4CLf2 5' ACTGAGCTCCAGCAAGAAGAGTTGCTTCT(SacI),4CLr2 5' TACTCTAGAATGGTGCCTTGGGAATA(XbaI)。PCR擴(kuò)增模板為質(zhì)粒T_Pt4CLl。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)^icI和)(baI雙酶切后，反向克隆到中間載體PBI121-M的^CbaI和Mel位點(diǎn)間，替換中間載體pBI 121-M上的⑶S‘基因片段， 得到目的質(zhì)粒。將目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，抗性篩選，挑取陽(yáng)性克隆，將陽(yáng)性克隆進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果表明，序列表中序列1第180位到1568 位所示的4CL基因片段反向插入到中間重組載體pBI121-M的)(baI和McI位點(diǎn)間(即與序列表中序列1第180位到1568位所示的核苷酸序列反向互補(bǔ)的DNA序列沿著從^CbaI至 SalI的方向插入所述中間重組載體的^CbaI和MlI位點(diǎn)間)，證明質(zhì)粒構(gòu)建正確，將重組載體命名為植物雙元表達(dá)載體PAS4CL1。植物雙元表達(dá)載體PAS4CL1的示意圖見(jiàn)圖4。二、獲得表達(dá)反義4CL1基因的轉(zhuǎn)基因毛白楊1、植物雙元表達(dá)載體pAS4CLl轉(zhuǎn)化毛白楊(1)制備農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞挑取農(nóng)桿菌C58(公眾可從北京市農(nóng)林科學(xué)院獲得，記載過(guò)該材料的非專利文獻(xiàn)是:K. -H. Han, R. Meilan，C. Ma, S. H. Strauss, An Agrobacterium tumefaciens transformation protocol effective on a variety of cottonwood hybrids(genus Populus). Plant Cell Reports,2000,19 :315-320, p316 immaterial and method”)單菌落，接種在:3ml LB培養(yǎng)基(含終濃度為5mg/L的四環(huán)素， 終濃度為50mg/L的利福平)中震蕩培養(yǎng)過(guò)夜；取Iml培養(yǎng)物接種在100ml LB培養(yǎng)基中，28°C震蕩培養(yǎng)至0D600為0. 5(約5_ ir)；用50ml聚丙烯管收集菌液，4000rpm離心 10min，4°C;棄上清液，用15ml預(yù)冷純水(18 Ω )懸浮細(xì)胞沉淀，4000rpm離心10min，4°C;重復(fù)上步一次；棄上清液，用IOml預(yù)冷的10%甘油(18 Ω純水配制)懸浮細(xì)胞沉淀，4000rpm 離心10min，4°C ；棄上清液，用0. 75ml (每100ml菌液)預(yù)冷的10%甘油懸浮細(xì)胞沉淀；分裝在1. 5ml EP管中，每管40 μ 1，液氮冷凍后，于-80°C冰箱內(nèi)保存。(2)植物雙元表達(dá)載體PAS4CL1電擊，轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌C58中，具體方法如下自冰箱中取出農(nóng)桿菌C58電擊用感受態(tài)細(xì)胞，置冰上緩慢融化；將2 μ 1質(zhì)粒pAS4CLl的DNA加入到感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，置冰上；將感受態(tài)細(xì)胞和質(zhì)粒PAS4CL1的DNA混合物加入到預(yù)冷的電擊杯中；2. 5kv，400 Ω，25 μ F條件下電擊；迅速向電擊杯加入Iml LB培養(yǎng)基；將電擊杯中的全部溶液轉(zhuǎn)移到1. 5ml EP管中，28°C溫育Ihr ；4000rpm離心2分鐘，棄800 μ 1上清，余 200 μ 1 ；重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液混勻涂布在含5mg/L四環(huán)素、50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上；待液體完全吸收后，28°C避光倒置培養(yǎng)，3天可見(jiàn)菌落。經(jīng)PCR檢測(cè)陽(yáng)性農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子，獲得含有植物表達(dá)載體PAS4CL1的農(nóng)桿菌菌株。PCR檢測(cè)所用的引物序列如下5' -CAGCAAGAAGAGTTGCTTCT 和 5 ‘ -ATGGTGCCTTGGGAATA。PCR 檢測(cè)獲得 1389bp 的擴(kuò)增產(chǎn)物即為陽(yáng)性農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子。(3)毛白楊的遺傳轉(zhuǎn)化挑取一個(gè)新鮮的含有植物表達(dá)載體PAS4CL1的農(nóng)桿菌單菌落，接種到LB液體培養(yǎng)基中(含終濃度為5mg/L四環(huán)素，終濃度為50mg/L利福平，終濃度為50mg/L卡那霉素)，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。取Iml菌液加入新鮮40ml的LB液體培養(yǎng)基活化培養(yǎng)，280C 220rpm 振蕩培養(yǎng) 2_3h (0D600 = 0. 4-0. 8)，待用。取當(dāng)年毛白楊(Populus tomentosa)(購(gòu)自寧夏萊州市興林園藝場(chǎng))的健壯無(wú)菌苗莖段切成0. 5-lcm,作為培養(yǎng)外植體，在預(yù)培養(yǎng)基(1/2MS+6-BA 0. 25mg/L+ZT0. 25mg/ L+IBA 0. 25mg/L,蔗糖20g/L)上于25 °C暗培養(yǎng)1_2天。然后在活化的菌液中侵染10-20分鐘。取出外植體，用無(wú)菌濾紙吸干后，轉(zhuǎn)入覆有一層無(wú)菌濾紙的共培養(yǎng)基 (1/2MS+6-BA0. 25mg/L+ZT 0. 25mg/L+IBA 0. 25mg/L，蔗糖 20g/L)中于 25°C暗培養(yǎng) 2-3 天， 在無(wú)菌水中洗3次，在250mg/L的頭孢霉素的水溶液中洗一次，放入含卡那霉素50mg/L篩選培養(yǎng)基(1/2MS+6-BA 0. 25mg/L+ZT 0. 25mg/L+IBA 0. 125mg/L+抗生素，蔗糖 20g/L)中于 25°C，光照每日16小時(shí)的條件下培養(yǎng)。每2周繼代培養(yǎng)一次；分化出的小芽長(zhǎng)至1. 5-2. Ocm 后，剪取小芽置于含50mg/L篩選生根培養(yǎng)基(1/2MS+IBA0. 25mg/L+VB110mg/L+抗生素，蔗糖15g/L)中培養(yǎng)。大約一個(gè)月后，獲得批量轉(zhuǎn)化株系。表1 MS培養(yǎng)基的組成
權(quán)利要求
1.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是降低目的植物中4-香豆酸CoA連接酶編碼基因的表達(dá)，得到與所述目的植物相比，細(xì)胞壁中纖維素含量提高的轉(zhuǎn)基因植物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述4-香豆酸CoA連接酶為由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述4-香豆酸CoA連接酶的編碼基因?yàn)槿缦?)-4)中任一所述的基因1)序列表中序列1第180位到1568位所示的DNA分子；2)序列表中序列1所示的DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)或幻所示的DNA分子雜交且編碼序列表中序列2所示氨基酸序列組成的蛋白的基因；4)與1)或幻或幻的基因具有90%以上的同源性且編碼序列表中序列2所示氨基酸序列組成的蛋白的基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述降低目的植物中4-香豆酸CoA連接酶編碼基因的表達(dá)是通過(guò)將4-香豆酸CoA連接酶編碼基因的反義基因片段導(dǎo)入目的植物中實(shí)現(xiàn)的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述4-香豆酸CoA連接酶編碼基因的反義基因的核苷酸序列與序列表中序列1第180位到1568位所示的核苷酸序列反向互補(bǔ)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述降低目的植物中4-香豆酸=CoA連接酶編碼基因的表達(dá)是通過(guò)將重組表達(dá)載體PAS4CL1導(dǎo)入目的植物中實(shí)現(xiàn)的；所述重組表達(dá)載體PAS4CL1是通過(guò)包括如下步驟的方法制備得到的(1)在⑶S基因片段的5'端引入BamHI和SpeI酶切位點(diǎn)和3'端引入^icI和Mil 酶切位點(diǎn)，得到⑶S'基因片段；將所述⑶S'基因片段插入載體ρΒΙ121的BamHI和McI 位點(diǎn)間，替換載體ΡΒΙ121上的⑶S基因，得到中間重組載體；(2)將與序列表中序列1第180位到1568位所示的核苷酸序列反向互補(bǔ)的DNA序列沿著從^CbaI至McI的方向插入所述中間重組載體的^CbaI和McI位點(diǎn)間，得到的重組載體 PAS4CL1。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述雙子葉植物為毛白楊(Populus tomentosa)。
8.一種重組表達(dá)載體，是通過(guò)包括如下步驟的方法制備得到的(1)在⑶S基因片段的5'端引入BamHI和SpeI酶切位點(diǎn)和3'端引入^icI和Mil 酶切位點(diǎn)，得到⑶S'基因片段；將所述⑶S'基因片段插入載體ρΒΙ121的BamHI和McI 位點(diǎn)間，替換載體ΡΒΙ121上的⑶S基因，得到中間重組載體；(2)將與序列表中序列1第180位到1568位所示的核苷酸序列反向互補(bǔ)的DNA序列沿著從^CbaI至McI的方向插入所述中間重組載體的^CbaI和McI位點(diǎn)間，即得到的所述重組表達(dá)載體。
9.權(quán)利要求8所述的重組表達(dá)載體在提高植物細(xì)胞壁中纖維素含量中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用。其特征在于所述植物為單子葉植物或雙子葉植物； 所述雙子葉植物為毛白楊(Populus tomentosa)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提高植物細(xì)胞壁中纖維素含量的方法。本發(fā)明提供了一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明所提供的培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是降低目的植物中4-香豆酸CoA連接酶編碼基因的表達(dá)，得到與所述目的植物相比，細(xì)胞壁中纖維素含量提高的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)和反義RNA技術(shù)結(jié)合，獲得4CL基因表達(dá)受到抑制的轉(zhuǎn)基因楊樹，轉(zhuǎn)基因楊樹成熟木材的細(xì)胞壁中纖維素含量顯著增加，轉(zhuǎn)基因植株較野生型對(duì)照植株細(xì)胞壁中纖維素含量增加了3％-7％。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102373236SQ201110359369
公開日2012年3月14日 申請(qǐng)日期2011年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月14日
發(fā)明者張中保, 張杰偉, 李云伏, 李瑞芬, 王宏芝, 陳亞娟, 魏建華 申請(qǐng)人:北京市農(nóng)林科學(xué)院