專利名稱：相思樹AmCesA2基因及提高植物纖維素含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及相思樹纖維素合酶基因^wCeW2及通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)利用它來提高植物纖維素含量，研究 其可能功能的方法。
背景技術(shù)：
相思樹種共有1200余種，原產(chǎn)地為澳大利亞和非洲。它是一種適應(yīng)性較強的樹種，速生，能迅速固 組，改良十.壤。其生長量、制漿性能和纖維質(zhì)量都可以和桉樹媲美甚至優(yōu)T桉樹，是一種優(yōu)良的紙漿工業(yè)原料。
我國引種的主要相思樹種有大葉相思"cac/a咖rfcw/i/orw/s ，馬占相思(Jcada w""g&w wz7W) 和厚莢相思C4rada craM^w"/w)。目前，主要分布于海南、福建及兩廣地區(qū)。在幾種相思樹種中，馬占相 思的制衆(zhòng)性能及纖維質(zhì)量都優(yōu)亍其它兩類相思樹種，且由于其生長期相對較短(6年)，對土壤具有改良作 用，成為東南亞一種普遍種植的造紙用樹。
纖維素是細(xì)胞壁的主要組成成分之一，也是評價造紙原料性能優(yōu)劣的一個重要指標(biāo)。纖維素的基本結(jié) 構(gòu)單位是吡喃式D—葡萄糖，以B—1,4糖苷鍵相連。植物細(xì)胞壁中多糖的結(jié)構(gòu)、糖基組成、糖基間的連接 鍵及糖基的修飾作ffl等已研究的較為清楚，但對涉及多糖合成的酶與多糖聚合還知之甚少(Gibeaut et a1,1994)。相思樹作為一種重要的造紙原料，目前還沒有有關(guān)其纖維素合酶方面的報道。
纖維素合酶屬于糖基轉(zhuǎn)移酶類家族，后者基于其氨基酸序列的相似性被劃分為47個家族。植物因其 具有廣泛的糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，從而有大量的糖基轉(zhuǎn)移酶類基因被分離、鑒定(SaxenalMetal,2000)。
第一個纖維素合酶基因是在本醋桿菌(A^to&ac欣^/z'加;w)中分離得到的(Saxena IM. et al， 1990; Wong HC. et al,1990, Saxena， 1995),它含有糖基轉(zhuǎn)移酶類的D， D， D, QXXRW保守區(qū)域。植物中的纖維素 合酶基因首先發(fā)現(xiàn)于棉花。由Pear等(1996)對棉花纖維cDNA文庫進(jìn)行隨機時發(fā)現(xiàn)，其編碼的蛋白具 D，D，D，QxxRW保守特征。而在N—末端與保守的天冬氨酸殘基之間還具額外的特異性片斷，顯示了獨特 的序列特征。
目前，在擬南芥、玉米、楊樹、水稻中已得到了編碼纖維素合酶的基因全長(RichmondTA，2000;Samuga A，2002等)。植物的纖維素合酶在N端特有一個類似于植物轉(zhuǎn)錄因子的"亮氨酸拉鏈"區(qū)域，稱作LIM-like Zn-binding domain /RING finger區(qū)域(Kawagoe and Deltner， 1997a, 1997b; Arioli et al， 1998)，前者介導(dǎo)蛋白與 蛋白間的相互作用(Bach, 2000)，而后者在蛋白的泛數(shù)降解中具有功斷Freemont，2000)，因此推測這個結(jié)構(gòu) 在CesA的功能實現(xiàn)中參與蛋白偶聯(lián)和定向降解。
與細(xì)菌的纖維素合酶不同，植物的CesA貝.有一個特異的植物特異性保守區(qū)CR-P(for conserved plant-specif ic)和植物特異的高度可變區(qū)HVR(for hyper-variable plant-specif ic) ( Delmer DP,1999)。 但其功能目前還不淸楚。.目前，CesA的功能推測主要來自于基因表達(dá)、UDP-G結(jié)合實驗(PearJReta1，1996)、突變分析(Fagard M et al,2000)及基因沉默實驗(Burton et a1,2000)。 Burton等(2000)借助病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)對植物纖維 素合酶基因進(jìn)行了研究。他們采用馬鈴薯X病毒為載體，將一個推測可能編碼纖維素合酶的基因?qū)霟煵荩?結(jié)果煙草出現(xiàn)了矮化現(xiàn)象，纖維素含量明顯降低，從而驗證了目標(biāo)基因編碼的蛋白具纖維素合酶功能。但 這種降低可被同源的乳糖的增加所抵消，從而說明在纖維素和果膠的生物合成過程中或其他可能的新陳代 謝途徑中存在著反饋環(huán)。
此外，還可以根據(jù)突變分析、基因表達(dá)實驗以及同源序列比較來分析不同的Ces的功能。目前已有研 究證明，初生、次生細(xì)胞壁形成過程中，纖維素的合成涉及不同的纖維素合酶(Saxena and Brown,2000)。 Holland等(2000)對棉花、楊樹、擬南芥及玉米的纖維素合酶進(jìn)行了比較研究，結(jié)果表明這些酶本身的某些 特異性序列決定其在初生或次生細(xì)胞壁中表込，而并非單獨由啟動子決定。初生與次生細(xì)胞壁中的纖維素 具有不同的特征，比如聚合度，其特征差異可能與不同的纖維素合酶有關(guān)(Delmer，1999)。 Wu等(2000)從楊 樹中克隆了一個纖維素合酶基因PtCesA,正常生長時，其在木質(zhì)部表達(dá)，在受到外界壓力脅迫時，它在韌 皮部微管中也有表達(dá)，說明它可能參與信號傳導(dǎo)機制。

發(fā)明內(nèi)容
迄今為L匕我們對Ces的所知還相當(dāng)有限。纖維素合酶超家族的基因分離和酶的結(jié)構(gòu)及功能分析將有 利T了解它們Q然存在的結(jié)構(gòu)及形態(tài)。而且，木材作為一種重要的造紙原料，對其也存在著速生性與高纖 維品質(zhì)的耍求。但傳統(tǒng)的改良措施對于生長周期相對較長的林木類植物的改造功效十分有限，以基因工程 的手段去提高其品質(zhì)，加快其生長速度不失為一種切實可行的方法。本發(fā)明的一個主要目的是加快一些熱 帶、亞熱帶樹種的生長速度，縮短其生育周期，增加其纖維素含量，提高可利用性。另外，多種植物的纖 維素品質(zhì)是重要的經(jīng)濟性狀，纖維素合酶研究的深入最終會應(yīng)用到經(jīng)濟植物目標(biāo)改善的改良中。纖維素合
酶的基因工程改造將提高纖維的品質(zhì)，樹種中纖維素的長度、長寬比、均勻度等。本發(fā)明現(xiàn)已
1、 從相思樹中克隆得到了一個新的纖維素合酶基因，命名為^wCe^42，與2004100461112分案1中 的JmC仏4/基因核昔酸序列有5%的差異，該差異可能導(dǎo)致基因功能的不同；
2、 構(gòu)建了該相思樹纖維素合酶基因JmCe^(2的正義表達(dá)載體，用于轉(zhuǎn)化煙草及桉樹、楊樹、矮牽牛 等。由于外源Ce"基因的引進(jìn)，植物纖維素表達(dá)量增高，從而剌激植物生長，加快其生長速度。
3、 構(gòu)建了該相思樹纖維素合酶基因^77C^42的反義表達(dá)載體，利用反義基因技術(shù)，即通過引入一個 特定內(nèi)源基因的反義序列來抑制其表達(dá)，從而深入研究該纖維素合酶基因的功能。
4、 通過^nCe^^和^附CeW2的比較，確定兩個基因的功能相同和差異。 具體的技術(shù)方案如下
1.從相思中獲得纖維素合酶基因
由于相思樹中的纖維素合酶基因為未知序列，因此，我們比較了一系列已知的纖維素合酶的氨基酸序 列，設(shè)計了兩條簡并引物，利用RT-PCR技術(shù),再結(jié)合5'RACE技術(shù)，以獲得全長的相思樹纖維素合酶基因。 簡并引物序列
保守區(qū)域I:VICE I (V)W F A CesDel:5、 >g GT1 at(a/C/T) tg(t/c) ga(a/g) (a/g)ti tgg tt(t/Q gc<3'保守區(qū)域II:FPQR FDGI D
CesDe2:5、 >TT(T/C) CCI CA(A/G) (A/C)GI TT(T/C)GA(T/C) GGI AT(A/C/T) GA<3、
2. 構(gòu)建正義及反義形式的纖維素合酶基因^wCeW2的植物表達(dá)載體
我們選用了適用于大多數(shù)植物且啟動能力很強的、亦是在植物基因工程中最常用的花椰菜花葉病毒 (CaMV)的35S啟動子，將克隆得到的正義及反義纖維素合酶基因連于其后，構(gòu)建成功雙元表達(dá)載體， 轉(zhuǎn)化植物。
3. 以煙草及桉樹、楊樹、矮牽牛等進(jìn)行植物轉(zhuǎn)基因操作
煙草作為一種模式植物常常被用丁轉(zhuǎn)化外源基因以研究其功能。本發(fā)明以煙草為轉(zhuǎn)化受體，導(dǎo)入纖維 素合酶的正義及反義基因，以觀察其對植物生長速率及生長狀態(tài)的影響，進(jìn)一步探討其可能的功能。另外， 也在楊樹及桉樹上進(jìn)行了轉(zhuǎn)化研究。
此外，還應(yīng)該特別指出以下事項
本發(fā)明利用我們所得纖維素合酶基因，構(gòu)建正義及反義表達(dá)載體，但這并不意味著此基因只有這一個
應(yīng)用價值。使用本發(fā)明中的基因進(jìn)行其他方面的應(yīng)用均在本發(fā)明權(quán)利要求之內(nèi)，包括利用RNAi技術(shù)對植 物進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化以影響植物生長狀態(tài)及途徑。
在本發(fā)明的一個實施方案中，纖維素合酶基因^wCeM2被置于CaMV35s啟動子和nos polyA終止子 的調(diào)控之F，再連至CAMBIA公司的雙元表達(dá)載體pCAMBIA1301,構(gòu)成一個植物表達(dá)載體。根據(jù)本發(fā)明 的這一實施方案，構(gòu)建所選用的植物表達(dá)載體除了 pCAMBIA1301之外，還可以選用CAMBIA公司的其 它表達(dá)載體或者本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的其它如pGPTV系列，pBI系列，pCB系列等的植物表達(dá)載體。
在本發(fā)明的一個實施方案中，我們選用煙草作為轉(zhuǎn)基因植物材料。但這并不意味著本發(fā)明所構(gòu)建的轉(zhuǎn) 基因載體只能用于轉(zhuǎn)化煙草。使用含本發(fā)明中纖維素合酶基因的正義及反義表達(dá)載體轉(zhuǎn)化其他植物材料， 以調(diào)控植物生長速度的轉(zhuǎn)基因植物的方法，均在本發(fā)明的權(quán)利要求之內(nèi)。 有益效果
1. 得到一個新的來源于相思樹的纖維素合酶基因^KCe"2,該基因與分案1中的JwC戰(zhàn)4/基因有序 列差異，該差異可能導(dǎo)致基因功能的不同。
2. 利用該纖維素合酶基因的正義形式轉(zhuǎn)化煙草，煙草生長加快，推測它們對桉樹及楊樹等材料的轉(zhuǎn) 化，將會對加快其生長周期，提高其生長速度大有裨益。
3. 得到了內(nèi)源纖維素合酶基因沉默的轉(zhuǎn)基因植株，觀察這個纖維素合酶基因?qū)χ参锷L發(fā)育的影響， 確定其在相思樹中的功能。


圖1.正義植物表達(dá)載體pCAmCesA2的示意圖 圖2.反義植物表達(dá)載體pCAmCesAR2的示意圖 圖3.轉(zhuǎn)正義及反義^wCe&42基因煙草的形態(tài)學(xué)變化
A:轉(zhuǎn)正義^mCe"2基因煙草B:轉(zhuǎn)空載體煙草；C:轉(zhuǎn)反義^nCe"2基因煙草。
實施方式
實驗所涉及的藥品均購自Promega公司，Takara公司，上海生工及欣經(jīng)科公司。具體實驗操作依據(jù)《分子克隆》及《植物基因工程原理與技術(shù)》。
實施例1:相思樹纖維素合酶基因^4柳Ce"2的獲得
0)用FPCR反應(yīng)的引物設(shè)計
根據(jù)已知的擬南芥、玉米、煙草、棉花的纖維素合酶的氨基酸序列，進(jìn)行比對，找出其保守區(qū)域，設(shè)
計簡并引物
第一條簡并引物-
CesDel: 5、 >g GTI AT(A/C/t) tg(t/c) ga(a/g) (A/G)TI TGG tt(T/C) GC<3'
第二條簡并引物
CesDe2: 5' >TT(T/C) CCI CA(A/G) (A/C)GI TT(T/C)GA(T/C) GGI AT(A/C/T) GA<3、
(2) 相思樹RNA的獲得
a. 取1克植物組織，液氮研磨后加入10ml提取液，同時加入0.1gPVP-40， 200 ul2-巰基乙醇繼續(xù)研磨， 待其充分融解后轉(zhuǎn)移至30ml管子，加等量的CI，劇烈振蕩混勻5min。
b. 4'C下11000rpm離心10min，取上清，加等體積CI抽提，重復(fù)此步驟， 一直至相面無可見物質(zhì)存在。
c. 加2倍體積的無水乙醇和0.1倍體積的5M的NaCl，-20'C過夜。
d. 4'C下U000rpm離心20min，將沉淀溶于10ml的提取緩沖液中，加等量PCI，混勻5min，室溫離心 10min，取水相，重復(fù)抽提，到相面無可見物質(zhì)存在。'
e. 加2倍體積的無水乙醇和0.1倍體積的5MNaCl,-2(TC放置過夜。
f. 4'C下11000rpm離心15min，沉淀溶于lml的DEPC H20中，加入333ul 8M的LiCl溶液，4'C下放 置過夜。
g. 4TT F 11000rpm離心30min，沉淀用80°/。乙醇洗漆，自然干燥，加30ul的DEPC H20溶解。
(3) ESTs的獲得
對所獲得的相思樹RNA按Promage的反轉(zhuǎn)錄Kit說明，以O(shè)ligodT作為下游引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，對所得 到的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物以CesDe2和OligodT為引物進(jìn)行PCR擴增，之后與T-easy進(jìn)行連接，對所得到的菌落進(jìn) 行鑒定后進(jìn)行測序，得到了一個與CesA同源的cDNA片段.依據(jù)測序后核苷酸序列，分別設(shè)計引物，對相 思樹的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物以CesDel和后設(shè)計引物進(jìn)行PCR，獲得大約2. 5kb的cDNA片段。
其引物序列分別為
Aces 1.3-3: 5'>TTTTGCTGCCCTCTTCTTGTCAA< 3 Aces2.3-3: 5，> TGGTTGGGTCAACATGCTTGCT〈3'
(4) 5'RACE技術(shù)
根據(jù)己知序列，設(shè)計這個纖維素合酶基因的GSP引物，其序列分別如下 Aces2GSPl: 5'-ATATATCAACAGCTGCTAGT-3、 Aces2GSP2: 5、-AGATATGTTTCCCGGTTTACC-3'
參照5'RACE (Invitrogen公司)的操作說明進(jìn)行操作，將所獲得片段進(jìn)行測序。 測序后，發(fā)現(xiàn)這個基因已得到了基因的起始序列，在此基礎(chǔ)上設(shè)計引物，擴增全fe的cDNA. 序列。(5)全長cDNA序列的獲得
^wCe"2全長擴增的弓I物序列 Aces2.3、-1: 5'-TGAGCTCTTCTAGCAGTTTATTCCACACT-3' Aces2.5'-1: 5'-ATCTAGACAGCTTATGGAGTCAGAAGG-3'
對所獲得的相思樹RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，以基因兩端引物進(jìn)行PCR擴增，得到一個新的纖維素合酶基因， 命名為」/wC^42。將該全長基因連接到pT-easy(Promega公司)載體上，得到含有JmCeM2基因的載體 pT隱AC2。
實施例2:植物表達(dá)載體的構(gòu)建
正義植物表達(dá)載體pCAmCesA2的示意圖見附圖1。
正義表達(dá)載體pCAmCesA2的具體構(gòu)建流程如下將35S以HindlII+Pstl從中間載體pMM23上轉(zhuǎn)移至 pCAMBIA1300上，以Xbal+Sacl進(jìn)行酶切，同時對連有全長爿wCe^基因的pT-AC2進(jìn)行Spel+Sacl酶切， 連接，得到正義的JwCe"2雙元表達(dá)載體pCAmCesA2。
反義植物表達(dá)載體pCAmCesAR2的示意圖見附圖2。
反義表達(dá)載體pCAmCesAR2的具體構(gòu)建流程如下將35S以Hindlll+Pstl從pMM23上轉(zhuǎn)移至 pCAMBIA1300上，以PstI十SphI進(jìn)行酶切，同時對連有全長JwCeW基因的pT-AC2進(jìn)行Pstl+Sphl酶切， 連接，得到反義的爿w""2雙元表達(dá)載體pCAmCesAR2。
中間載體pMM23農(nóng)部植物基因表達(dá)研究中心David Ow教授惠贈，其作用為提供植物基因工程常用的 CaMV35S (簡稱35S)啟動子。植物表達(dá)載體pCAMBIA1300從CAMBIA公司購得，是植物基因工程中 非常常用的載體。pT-easy載體由Promega公司購得，是分子克隆非常常用的構(gòu)建載體。具體資料見 http:〃www.promega.com/catalog/catalogproducts.asp catalog. name=Promega Products&category name=pGEM -T+Easy+Vector+ Systems 。
實施例3:農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化
〔l)感受態(tài)的制備
a. 挑取土壤農(nóng)桿菌單齒落接種于5 ml含適當(dāng)抗生素的LB/YEB液體培養(yǎng)基中，28°C、 250 rpm振蕩培 養(yǎng)過夜；
b. 按1: 25-50接種丁 20 ml含適當(dāng)抗生素的LB/YEB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)4-6h;
c. 4°C， 5,000rpm離心10min，去上清；
d. 用600n冰預(yù)冷的TE緩沖液(PH7.5)洗滌菌體;.
e. 4°C， 5,000rpm離心lOmin，去上清；
f. 用200nl冰預(yù)冷的液體LB/YEB重懸菌體，液氮冷凍，于-7(TC保存。 (2)轉(zhuǎn)化
a. 將感受態(tài)農(nóng)桿菌置冰浴中溶化，然后加入約0.5-l.(Hig質(zhì)粒DNA，輕輕混勻，冰上放置5 min;
b. 置于液氮中5 min;
c. 37'C溫育5min;
d. 加入800nl LB/YEB液體培養(yǎng)基，28'C振蕩培養(yǎng)5-6h;e. 6,000rpm離心5 min，去大部分上清，剩50nl左右，懸浮菌體，
f. 均勻涂布于含適當(dāng)抗生素的LB/YEB選擇平板上，28X:倒置培養(yǎng)兩天。
實施例4:煙草的遺傳轉(zhuǎn)化及再生
(1 )接種轉(zhuǎn)化菌單菌落于含適當(dāng)抗生素的2ml YEB液體培養(yǎng)基中，28'C培養(yǎng)1 一2天，轉(zhuǎn)接入20ml YEB 液體培養(yǎng)基中，28'C繼續(xù)培養(yǎng)至OD600約0.5;
(2) 將健壯的煙草葉片剪成0.5-lcm見方，放入MS液體培養(yǎng)基稀釋過的農(nóng)桿菌中，浸泡10—15分 鐘，其間不斷輕搖兒次；
(3) 収出材料，用無菌紙吸去多余菌液，于MS固體培養(yǎng)基中28'C暗培養(yǎng)兩天；
(4) 用無菌紙吸去生長過度的菌體，把材料轉(zhuǎn)入含選擇壓Hyg 10 mg/L、 Cb 500mg/L和6-BA 1.0 mg/L+NAAO.l mg/L的分化培養(yǎng)基中(基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基)，25"C光下培養(yǎng)，每兩周換一次培養(yǎng)基，至 分化出愈傷組織，直至長出芽；
(5) 將長至lcm以上的芽轉(zhuǎn)入含HyglOmg/L、 Cb 500mg/L的生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根； 實施例5:桉樹，楊樹，矮牽牛的遺傳轉(zhuǎn)化及再生
除在培養(yǎng)基的營養(yǎng)成份及激素配比上有適當(dāng)?shù)恼{(diào)整外，其它大至方法相同。所用抗生素濃度與煙草一 致。具體方法見《植物基因工程原理與技術(shù)》。
實施例6:以AmCesA2基因進(jìn)行的幾種轉(zhuǎn)化方法
除農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法外，本發(fā)明還涉及到電擊法、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、花粉管通道法及基因槍轉(zhuǎn)化方法。具 體操作方法見《植物基因工程原理與技術(shù)》。
專利菌種說明
此專利涉及的菌種已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，單位地址中國北京中關(guān) 村，該微生物分類名稱為大腸埃希氏菌(&cfen'cWaco/,'(DH5a))，保藏代號為pT-AmcesA2，保藏編號為 CGMCCNO. 1136，保藏日期為2004年4月22日。
相思樹生長周期短，生長速度快，土壤適應(yīng)性廣，作為一種優(yōu)質(zhì)的造紙原料，在我國南方的種植面積 呈上長趨勢，在整個東南亞也占有很大的種植比例。作為一種極有應(yīng)用前景的樹木品種，有關(guān)其纖維素生 化性狀的研究報道相對較少，而有關(guān)纖維素合酶的信息無論是在國內(nèi)還是在國際均未見報道。
本專利運用基因工程的方法克隆得到了具有0主知識產(chǎn)權(quán)的相思樹纖維素合酶基因，從基因水平上推 測其酶的功能進(jìn)而應(yīng)用于生產(chǎn)實踐，在加快相思樹的生長速度，提高纖維素的產(chǎn)量和質(zhì)量方面都將產(chǎn)生積 極的影響。<110〉 <120> <140> <141> <160> <210> 〈211> <212> <213〉 〈220> <221〉 <222> 〈400>
林忠平
相思樹^z;Ce^^基因及提高植物纖維素含量的方法
2004100461112
2004-06-01
1
1
3228 DNA
馬占相思樹(力cac/a鵬"^7'"雙willd)
CDS (1). 1
scg Thr
ggt Gly
tst Tyr
Lys
agt Ser
Leu
gas Glu
tct Ser
gca Ala
gsg Glu
Glu
gga Gly
gsc Asp
sgt Ser
gtt Val
gca Ala
(3228)
gtc est
ttg 乙eu 15
Pro 35
sgg Arg 55
sgt Ser 75
ctg Leu 95
tgg Trp 115
tct Ser 135
gcc
Ala 155
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cct ges Pro Ala
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tgc tat gag 156 Cys Tyr Glu 50
aag aga cac 216
get cca sat Ala Pro Asn
gag gtc tct
Glu Val Ser
ggt cct ggt
Gly Pro Gly
aat att agg
Lys Arg 70
gst ggt Asp Gly 90
gsg cgs Glu Arg 110
tat gat Tyr Asp 130
ggs gas Gly Giu 150
ggg , Gly Lys 170
get gtg
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act 276 Thr
atg 336 Met
333 396 Lys
tt3 459 Leu
cgt 516
gat 57 6ValHisSer 175LeuProSerSer 180AsplieAsnGinSer 185ProAsnArgAla Val Asp 190
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ProGlyLeuGlyAsnValAlaTrpLysGki ArgValAspGlyTrp LysMetLys Gin Giu
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Leu Leu Trp Val Arg Ala Asp Pro Phe lie Thr Arg Val Arg Gly Pro Asp Thr Glu Gin Cys Gly lie Asn Cys 1055 1060 1065 1070 107權(quán)利要求
1、一種纖維素合酶基因，其特征在于具有序列1，cDNA長度為3228bp，該基因來源于相思樹植物組織。
2、 一種纖維素合酶，其特征在于具有序列2，序列2是由序列1編碼，其長度為1075個氨基酸。
3、 一種植物表達(dá)載體，其特征在于該表達(dá)載體具有附圖1所示的結(jié)構(gòu)，并且該載體含有權(quán) 利要求1所述的基因序列。
4、 一種植物表達(dá)載體，其特征在于該表達(dá)載體具有附圖2所示的結(jié)構(gòu)，并且該載體含有權(quán) 利要求1所述的基因的反義序列。
5、 一種轉(zhuǎn)基因植物的獲得方法，其特征在于利用權(quán)利要求4或權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體 轉(zhuǎn)化植物，獲得轉(zhuǎn)基因植物。
6、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述的轉(zhuǎn)化是通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、電擊法、原生質(zhì)體 轉(zhuǎn)化法、花粉管通道法及基因槍轉(zhuǎn)化方法來實現(xiàn)的。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6和7所述的方法，其中所指的植物為煙草、矮牽牛、桉樹、楊樹。
全文摘要
本發(fā)明涉及一個新的相思樹纖維素合酶基因AmCesA2及以轉(zhuǎn)基因技術(shù)利用它來提高植物纖維素含量，并研究其可能功能的方法。本發(fā)明從相思樹中克隆了一個新的纖維素合酶基因AmCesA2，并構(gòu)建了正義及反義的植物雙元表達(dá)載體。其主要的目的就是加快一些熱帶、亞熱帶樹種的生長速度，縮短其生育周期，增加其纖維素含量，同時改良多種植物的纖維素品質(zhì)。其次，探討這個基因在相思樹中的表達(dá)機制與機能。目前，在煙草中這個基因已表現(xiàn)出提高轉(zhuǎn)化受體植物纖維素含量的特性。
文檔編號A01H1/00GK101550419SQ20081012677
公開日2009年10月7日 申請日期2004年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月1日
發(fā)明者張愛琴, 朱廣廉, 林忠平, 勇 王, 胡鳶雷 申請人:林忠平;王 勇;胡鳶雷;朱廣廉;張愛琴