專利名稱：一種提高異源重組蛋白在轉(zhuǎn)基因植物種子中表達(dá)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可提高異源重組蛋白在轉(zhuǎn)基因植物種子中表達(dá)量的方法，特別是水稻13KDa醇溶蛋白OsRP5的信號肽編碼序列以及利用該序列于轉(zhuǎn)基因植物的研究與應(yīng)用，將該序列與異源重組蛋白融合，可明顯的提高目標(biāo)蛋白在轉(zhuǎn)基因植物種子中的表達(dá)量，屬于生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在植物中表達(dá)異源重組基因，以提高抗逆性、增加產(chǎn)量和改善品質(zhì)等已成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究開發(fā)的重點(diǎn)與熱點(diǎn)。尤其是近年來，利用植物這一廉價生產(chǎn)系統(tǒng)作為生物反應(yīng)器，來大量生產(chǎn)重組的編碼具重要功能的異源蛋白、醫(yī)用活性多肽或疫苗、抗體、工業(yè)用酶或蛋白質(zhì)等，是目前植物基因工程發(fā)展的一個重要領(lǐng)域之一，其研究與開發(fā)方興未艾，有可能形成一個低投入、高產(chǎn)出的新興生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)。但是，在植物生物反應(yīng)器研究中存在一個較為突出的問題，即重組蛋白的表達(dá)量極低，某些蛋白還不能穩(wěn)定積累下來，如在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的重組抗原的量一般只占總可溶性蛋白的0.01-1％。因此，建立高效穩(wěn)定的新型植物生物反應(yīng)器技術(shù)體系歷來是該領(lǐng)域研究的重點(diǎn)與難點(diǎn)。細(xì)胞代謝合成的蛋白質(zhì)在植物與動物中貯存的方式有所不同；因此，要實(shí)現(xiàn)重組的醫(yī)用蛋白(一般都為非植物來源)在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中高效表達(dá)與穩(wěn)定積累，也需要遵循與植物本身蛋白一致的表達(dá)與貯存規(guī)律。除了對重組蛋白基因的密碼子進(jìn)行修改外，另一關(guān)鍵技術(shù)，便是要應(yīng)用受體植物來源的基因表達(dá)調(diào)控元件和目標(biāo)蛋白靶向序列。其中，使用組織特異性基因表達(dá)的啟動子及其相關(guān)靶向調(diào)控元件，尤其是種子特異性表達(dá)基因的啟動子及其N-端的信號肽編碼序列，被認(rèn)為是實(shí)現(xiàn)異源重組蛋白在植物特定的組織中高效表達(dá)的有效途徑。
種子貯藏蛋白是植物種子中的一種富含成分，其編碼基因的表達(dá)往往具有極嚴(yán)格的組織與時空特異性，而且還含有特定的蛋白靶向調(diào)控元件。這些基因在翻譯形成蛋白前體時，其氨基末端都含有一段信號肽(signal peptide，SP)序列，長度隨物種和貯藏蛋白種類的不同而有所不同，它們在貯藏蛋白及其mRNA分子的定位及運(yùn)輸中起重要作用。在植物貯藏蛋白基因轉(zhuǎn)錄出成熟mRNA后，翻譯形成含信號肽的前體蛋白，此時該前體蛋白由信號肽序列牽引定向地轉(zhuǎn)移到粗糙型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)，隨后這一信號肽序列從前體蛋白上被剪除下來，以便貯藏蛋白能正確地加工(Coleman等1995)。除了在目標(biāo)蛋白的正確定向中具有決定作用外，信號肽序列在調(diào)控基因表達(dá)水平上也具有重要的作用(Boehm等2000)。信號肽序列的上些特性已在轉(zhuǎn)基因植物研究中獲得了很好的應(yīng)用。例如，利用水稻谷蛋白Gt3的信號肽序列可將入細(xì)胞巨化病毒的糖蛋白B成功地定位在轉(zhuǎn)基因煙草種子中的蛋白貯藏囊泡中(Wright等2001)；人的溶菌酶基因在水稻谷蛋白Gt1基因啟動子及其信號肽序列控制下，可特異性地在轉(zhuǎn)基因水稻種子中高效表達(dá)(Huang等2002)；而菜豆肌動蛋白內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異的信號肽序列可明顯增強(qiáng)大腸桿菌輔酶Q在轉(zhuǎn)基因煙草中的轉(zhuǎn)錄與隨后的表達(dá)量。由此可見，貯藏蛋白的信號肽序列對于在轉(zhuǎn)基因植物中外源蛋白的表達(dá)與沉積是有積極作用的。
醇溶蛋白是禾谷類作物中主要的種子貯藏蛋白。水稻醇溶蛋白(prolamin)是水稻種子中僅次于谷蛋白的第二大類種子貯藏蛋白，占胚乳總蛋白的5-10％，在水稻種子中合成后，可定向地沉積到蛋白體II中。水稻醇溶蛋白的分子量較小，但種類較多，至少可分為三類10KDa、13KDa和16KDa，但以13KDa的為最多。從蛋白或DNA序列上分析，同一分子量大小的醇溶蛋白多肽間有70％的同源性；不同分子量大小多肽間的同源性較小，而13KDa與16KDa多肽間有47％的同源性，但10KDa多肽與13KDa多肽之間完全不同源。雖然不同組分的水稻醇溶蛋白在序列上有較大的差異，但每個醇溶蛋白基因在合成前體蛋白時，在其氨基末端都含有由18-24個氨基酸組成的信號肽序列，該信號肽序列的存在對于醇溶蛋白表達(dá)的穩(wěn)定及其定位是非常重要的。已有的研究表明，水稻醇溶蛋白mRNA上與信號肽對應(yīng)的序列在將該mRNA定位到特定的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的過程中起著決定作用(Mitsukawa和Tanaka 1991)；Choi等(2000)最近的研究指出，將水稻醇溶蛋白基因中的信號肽編碼序列除去，可有正常的醇溶蛋白轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生，但卻檢測不到最后的蛋白。OsRP5是水稻醇溶蛋白家族的成員之一，其編碼蛋白的分子量為13KDa，其前體蛋白的氨基末端含有由19個氨基酸組成的信號肽序列。該基因的基因組序列已被克隆(GenBank登記號為AF156714)。對該基因的表達(dá)特性研究表明，OsRP5基因只有發(fā)育的水稻胚乳中特異性地表達(dá)。發(fā)明人的前期研究已表明，該基因啟動子可指導(dǎo)外源基因在轉(zhuǎn)基因水稻的胚乳中特異性高效表達(dá)。但在本發(fā)明之前，尚沒有OsRP5蛋白信號肽序列在調(diào)控異源重組蛋白在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是要一種提高異源重組蛋白在轉(zhuǎn)基因植物種子中表達(dá)量的方法，通過先制備可用于提高異源重組蛋白在轉(zhuǎn)基因植物種子中表達(dá)量的信號肽編碼序列，再將該序列轉(zhuǎn)化進(jìn)入作物或植物細(xì)胞中再生植株，從而提高異源重組蛋白在轉(zhuǎn)基因植物種子中的表達(dá)量。
本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣的一種提高異源重組蛋白在轉(zhuǎn)基因植物種子中表達(dá)量的方法，其特征是將OsRP5基因信號肽編碼序列與異源重組蛋白基因編碼序列連接在一起構(gòu)建成融合蛋白基因，融合蛋白基因再與種子特異性表達(dá)啟動子連接并克隆到植物的載體上，轉(zhuǎn)化進(jìn)入植物細(xì)胞中，從該轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生出植株，結(jié)實(shí)生產(chǎn)種子，采用Northern blot和Western blot技術(shù)檢測異源重組蛋白在轉(zhuǎn)基因植物種子中的表達(dá)量。所述的信號肽編碼序列有57位堿基的核酸，該核酸編碼水稻醇溶蛋白OsRP5基因的氨基末端的信號肽，共19個氨基酸殘基。所述的核酸具有Seq ID No.1所示的核苷酸序列。
信號肽編碼序列表SEQ ID NO.1Sequence nameOsRP5_SP，水稻13KDa醇溶蛋白OsRP5信號肽編碼序列Length57bpTypeDNA CDSSource水稻(Oryza sativa)atg aag atc att ttc gta ttt gct ctc cttMet Arg Ile Ile Phe Val Phe Ala Leu Leugct att gtt gca tgc aac gct tct gcaAla Ile Val Ala Cys Asn Ala Ser Ala本發(fā)明利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在植物中表達(dá)異源重組基因，提高異源重組蛋白在轉(zhuǎn)基因植物種子中的表達(dá)量，方法科學(xué)簡單先進(jìn)。將包括SEQ IDNO.1的OsRP5基因信號肽編碼序列與異源重組蛋白基因編碼序列連接在一起，構(gòu)建成融合蛋白基因，再與相關(guān)的種子特異性表達(dá)啟動子連接并克隆到可用于轉(zhuǎn)化植物的載體上；通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將構(gòu)建的嵌合基因轉(zhuǎn)化進(jìn)入作物或植物細(xì)胞中，從該轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生出植株，經(jīng)自交或人工授粉結(jié)實(shí)生產(chǎn)種子；采用Northern blot和Western blot等技術(shù)檢測異源重組蛋白在轉(zhuǎn)基因植物種子中的表達(dá)量，相比于未使用OsRP5基因信號肽編碼序列的構(gòu)建，目標(biāo)蛋白的表達(dá)量明顯提高。
所述的轉(zhuǎn)基因植物包括轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或?qū)⑥D(zhuǎn)化的植物細(xì)胞培育成植株，以及由這些轉(zhuǎn)基因植株的有性或無性繁殖的后代。
所述的目標(biāo)蛋白可以包括任何在生產(chǎn)上的有應(yīng)用價值的蛋白或酶，編碼該蛋白的基因可以來自植物、人、動物或微生物。


圖1為RPG和RPSG轉(zhuǎn)基因水稻植株未成熟種子總RNA的Northern雜交分析。上圖為Northern雜交結(jié)果，下圖顯示總RNA中的28S核糖體RNA?？俁NA分別抽提自轉(zhuǎn)基因水稻植株(RPG-1~RPG-5，RPSG-1~RPSG-7)或武香粳9號未轉(zhuǎn)化植株(標(biāo)記為W)的未成熟種子(~12DAP)，其中RPSG轉(zhuǎn)基因水稻植株中的GUS嵌合基因含有醇溶蛋白的信號肽編碼序列。雜交所用的探針為地高辛標(biāo)記的反義GUS編碼區(qū)片段。
圖2為RPG和RPSG轉(zhuǎn)基因水稻植株成熟種子總蛋白的Western雜交分析。胚乳總蛋白分別抽提自轉(zhuǎn)基因水稻植株(RPG-2~RPG-9，RPSG-2~RPSG-6)或武香粳9號未轉(zhuǎn)化植株(標(biāo)記為W)的成熟種子，其中RPSG轉(zhuǎn)基因水稻植株中的GUS嵌合基因含有醇溶蛋白的信號肽編碼序列。每個泳道所加的總蛋白量一致，各為30微克，蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，然后用抗GUS蛋白的特異抗體進(jìn)行雜交分析。箭頭所指即為GUS蛋白。
具體實(shí)施例方式
以下分四個最佳步驟進(jìn)一步闡明本發(fā)明的具體實(shí)施方式
。實(shí)施例所述內(nèi)容不構(gòu)成對本發(fā)明權(quán)利要求范圍的限制。
1、水稻醇溶蛋白OsRP5基因啟動子及其信號肽編碼序列的克隆根據(jù)已發(fā)表的水稻13KDa醇溶蛋白OsRP5基因的核苷酸序列，設(shè)計并合成了三個引物P1(5’-TCAAGCTTTGAACGGGCAGAACCGGTC-3’)、P2(5’-CCGGATCCTTTTGTAG GATTCTACTACTATGCTTC-3’)和P3(5’-GACCATGGCAGAAGCGTTGCATGCAACAA-3’)。其中正向引物P1位于OsRP5基因ATG上游1.1kb處(不含ATG序列)，在引物5’末端加接上了HindIII酶切位點(diǎn)(下劃線)；反向引物P2位于ATG上游-1至-22位堿基處(以翻譯起始位點(diǎn)為+1位，下同)，在其5’末端加接上Bam HI酶切位點(diǎn)；另一反向引物P3位于ATG下游+35~+57位堿基處，在其5’末端加接上Nco I酶切位點(diǎn)。為了能在引物P3的5末端加上一個酶切位點(diǎn)而又不影響其讀碼框，在加入Nco I位點(diǎn)時，將+55至+57位的GCA密碼子改為GCC，但其編碼的氨基酸仍未改變。以引物P1和P2配對用于擴(kuò)增OsRP5基因5’末端非翻譯區(qū)1.1kb長的啟動子區(qū)序列(稱為OsRP5_PRO片段)；引物P1和P3配對用于擴(kuò)增包括5’末端非翻譯區(qū)1.1kb和起始密碼子下游57個bp在內(nèi)的5’上游區(qū)序列(稱為OsRP5_PRO+SP片段)，起始密碼子下游57bp序列為OsRP5基因的信號肽(signal peptide，SP)編碼序列。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃、5min；95℃、50sec，55℃、50sec，72℃、1min 30sec，30個循環(huán)；72℃、10min。用于PCR的DNA模板為抽提自粳稻品種武運(yùn)粳8號葉片的總DNA。經(jīng)測序分析，OsRP5_PRO片段為OsRP5基因ATG上游-1075到-1位的啟動子區(qū)序列，全長1075bp；OsRP5_PRO+SP片段為從-1075到+57位堿基之間的序列，全長1132bp。其中，OsRP5基因起始密碼子下游57bp序列，即該基因的信號肽編碼序列見序列表SEQ ID NO.1中。
2、OsRP5信號肽編碼序列與GUS融合基因的構(gòu)建為檢測上述所克隆兩個調(diào)控?zé)o片段指導(dǎo)外源基因在轉(zhuǎn)基因植物種子中的表達(dá)效率，并進(jìn)一步研究OsRP5蛋白信號肽序列對于外源蛋白在轉(zhuǎn)基因植物種子胚乳中表達(dá)后的影響，分別將OsRP5_PRO和OsRP5_PRO+SP片段與GUS(β-半乳糖苷酸酶)報告基因編碼區(qū)、胭脂堿(NOS)基因終止子序列構(gòu)建成嵌合基因。將OsRP5_PRO+SP片段經(jīng)HindIII和Nco I雙酶切，替代雙元載體pCAMBIA1301中GUS編碼區(qū)上游的35S啟動子，即構(gòu)建成雙元載體p13RPSG。該載體中，在OsRP5_PRO啟動子與GUS基因編碼區(qū)(保留有自己的ATG序列)之間即含有OsRP5基因的信號肽編碼序列，信號肽編碼序列與GUS編碼區(qū)序列組成一個融合基因，經(jīng)測序證明兩者的讀碼框都沒有發(fā)生改變。
同時，為比較OsRP5基因信號肽編碼序列對GUS基因表達(dá)的影響，又構(gòu)建了只含有OsRP5基因啟動子(OsRP5_PRO片段)的GUS嵌合基因，構(gòu)建流程如下。首先用限制性內(nèi)切酶Sac I和Eco RI從質(zhì)粒pBI121上切下270bp長的NOS終止子，克隆進(jìn)雙元載體pCAMBIA1300的相應(yīng)位點(diǎn)中，構(gòu)建成質(zhì)粒pC1300/NOS。再從雙元載體pIG121Hm(Hiei等1994)上用Bam HI和Sac I切下并回收2.0kb長的GUS基因編碼區(qū)序列，將其克隆進(jìn)質(zhì)粒pC1300/NOS的相應(yīng)位點(diǎn)中，形成質(zhì)粒pC1300/GN。進(jìn)一步用Hind III和Bam HI雙酶切OsRP5_PRO片段，連接入質(zhì)粒pC1300/GN的相應(yīng)酶切位點(diǎn)中，構(gòu)建成含OsRP5_PRO啟動子與GUS報告基因相融合的質(zhì)粒p13RPG。
3、OsRP5信號肽編碼序列與GUS融合基因?qū)胨精@轉(zhuǎn)基因植株將上述實(shí)施例2中所構(gòu)建的兩個雙元載體經(jīng)凍融法導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105感受態(tài)細(xì)胞中，按申請人已建立的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻的程序(劉巧泉等，植物生理學(xué)報，1998)將所構(gòu)建的兩個GUS融合基因中導(dǎo)入水稻中。取開花后12~15天的水稻品種武香粳9號未成熟種子經(jīng)70％乙醇表面消毒2min后，于含2％活性氯的NaClO溶液中消毒90min以上，并不時搖動，用無菌水沖洗4～5次，然后用解剖刀和鑷子剝出幼胚并培養(yǎng)于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織，經(jīng)4-7天預(yù)培養(yǎng)后誘導(dǎo)出的初生愈傷組織用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。將在超低溫保存的根癌農(nóng)桿菌菌種于含50mg/l卡那霉素的YEB半固體培養(yǎng)基上活化后，挑取單菌落接種到3ml含50mg/l Km的YEB液體培養(yǎng)基中，于28℃振搖培養(yǎng)過夜；第2天按1％接種量轉(zhuǎn)接入40ml含50mg/l Km的AB液體培養(yǎng)基中，于28℃、250rpm繼續(xù)培養(yǎng)6~8hr。將新鮮的培養(yǎng)液于6000rpm、4℃離心5min，收集菌體并重懸于10~15ml的AAM(含100~400μmol/l乙酰丁香酮)液體培養(yǎng)基中，立即用于與水稻受體材料的共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化。將各種適宜的水稻受體材料浸沒在新鮮的AAM農(nóng)桿菌菌液中15～30min，間或搖動幾次。然后將水稻材料移出，在無菌濾紙上吸去過多的菌液，隨即轉(zhuǎn)移到N6D2C共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，于26-28℃黑暗條件下共培養(yǎng)3天。3天后，切去胚芽并轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇培養(yǎng)。10～14天后長出的新鮮愈傷組織再轉(zhuǎn)移到新的選擇培養(yǎng)基上繼續(xù)篩選2代(10~14天/代)，然后選擇生長旺盛的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上分化小苗(12hr光照/天)，再生的小苗經(jīng)生根壯苗后移入網(wǎng)室或人工氣候室盆栽。兩個融合基因構(gòu)建中，各獲得了20個以上的獨(dú)立轉(zhuǎn)化子，含OsRP5_PRO+GUS融合基因的轉(zhuǎn)基因植株稱為RPG1、RPG2和RPG20等，而含OsRP5_PRO_SP+GUS融合基因的轉(zhuǎn)基因植株稱為RPSG1、RPSG2和RPSG20等。每個轉(zhuǎn)化子含有2-6個轉(zhuǎn)基因水稻植株。轉(zhuǎn)基因水稻植株移栽入大田后，絕大多數(shù)能正常生長、開花并結(jié)實(shí)。
所有轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)PCR和Southern雜交分析證明GUS融合基因已整合進(jìn)轉(zhuǎn)基因水稻的基因組中，整合位點(diǎn)從1至4個不等，RPG與RPSG兩類轉(zhuǎn)基因水稻植株中的整合情況相似。
4、OsRP5信號肽編碼序列與GUS融合基因在轉(zhuǎn)基因水稻胚乳中的表達(dá)在轉(zhuǎn)基因水稻開花后12天左右，從每一植株上收取40粒左右未成熟種子，提取總RNA，并用與GUS基因編碼區(qū)序列特異的反義DNA探針進(jìn)行Northern雜交分析，結(jié)果顯示在兩類轉(zhuǎn)基因水稻植株未成熟種子中都有較高的GUS基因的轉(zhuǎn)錄本(圖1)。從雜交信號的強(qiáng)弱判斷，雖然在不同轉(zhuǎn)化子間的表達(dá)量有較大的差異，但從總體情況分析，在RPSG轉(zhuǎn)基因水稻中，與OsRP5信號肽序列融合的GUS嵌合基因的表達(dá)水平明顯高于RPG轉(zhuǎn)基因水稻種子中GUS嵌合基因(即不含信號肽序列、只含OsRP5啟動子序列的GUS嵌合基因)的轉(zhuǎn)錄水平，說明有信號肽序列的存在，可提高外源基因的轉(zhuǎn)錄能力(圖1)。
在轉(zhuǎn)基因水稻成熟后，收取成熟種子，從其胚乳中提取種子總蛋白，用抗GUS的特異抗體進(jìn)行Western雜交分析，結(jié)果也顯示在兩類轉(zhuǎn)基因水稻成熟種子中都有GUS蛋白的積累(圖1)。與Northern雜交的結(jié)果相類似，在不同轉(zhuǎn)基因水稻種子中GUS蛋白的表達(dá)量有所不同，但從總體趨勢分析，在RPSG轉(zhuǎn)基因水稻中GUS蛋白的積累量明顯高于RPG轉(zhuǎn)基因水稻種子中的(圖2)。
OsRP5基因ATG上游的啟動子序列可引導(dǎo)外源基因在轉(zhuǎn)基因水稻胚乳中高表達(dá)，當(dāng)在GUS基因編碼區(qū)前加上其信號肽編碼序列時，不僅可明顯促進(jìn)GUS融合基因的轉(zhuǎn)錄效率，而且可使最終的蛋白產(chǎn)物表害量也明顯增多。對Northern和Western雜交中各雜交信號進(jìn)行掃描定量比較分析，在RPSG轉(zhuǎn)基因水稻種子中GUS蛋白的表達(dá)量比RPG轉(zhuǎn)基因水稻種子中的要高5-10倍。
權(quán)利要求
1.一種提高異源重組蛋白在轉(zhuǎn)基因植物種子中表達(dá)量的方法，其特征是將OsRP5基因信號肽編碼序列與異源重組蛋白基因編碼序列連接在一起構(gòu)建成融合蛋白基因，融合蛋白基因再與種子特異性表達(dá)啟動子連接并克隆到植物的載體上，轉(zhuǎn)化進(jìn)入植物細(xì)胞中，從該轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生出植株，結(jié)實(shí)生產(chǎn)種子，在該轉(zhuǎn)基因植物種子中表達(dá)有目標(biāo)重組蛋白，采用Northern blot和Western blot技術(shù)檢測異源重組蛋白在轉(zhuǎn)基因植物種子中的表達(dá)量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高異源重組蛋白在轉(zhuǎn)基因植物種子中表達(dá)量的方法，其特征是所述的信號肽編碼序列有57位堿基的核酸，該核酸編碼水稻醇溶蛋白OsRP5基因的氨基末端的信號肽，共19個氨基酸殘基。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種提高異源重組蛋白在轉(zhuǎn)基因植物種子中表達(dá)量的方法，其特征是所述的核酸具有的核苷酸序列Sequence nameOsRP5_SP，水稻13KDa醇溶蛋白OsRP5信號肽編碼序列Length57bpTypeDNA CDSSource水稻(Oryza sativa)atg aag atc att ttc gta ttt gct ctc cttMet Arg Ile Ile Phe Val Phe Ala Leu Leugct att gtt gca tgc aac gct tct gcaAla Ile Val Ala Cys Asn Ala Ser Ala。
4.根據(jù)權(quán)利要求1和3所述的轉(zhuǎn)基因植物包括轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或?qū)⑥D(zhuǎn)化的植物細(xì)胞培育成植株，以及由這些轉(zhuǎn)基因植株的有性或無性繁殖的后代。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組蛋白可以包括任何在生產(chǎn)上的有應(yīng)用價值的蛋白或酶，編碼該蛋白的基因可以來自植物、人、動物或微生物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水稻貯藏蛋白的信號肽編碼序列，以及利用該序列提高異源重組蛋白在轉(zhuǎn)基因植物種子中表達(dá)量的方法。該序列來自于水稻醇溶蛋白家族的成員之一OsRP5基因，包含SEQ ID NO.1的序列共有57位堿基的核酸，該核酸編碼水稻醇溶蛋白OsRP5基因的氨基末端的信號肽，共19個氨基酸殘基。借助于包含SEQ ID NO.1序列的OsRP5信號肽編碼序列，將異源重組蛋白編碼序列與其構(gòu)建成融合基因，并導(dǎo)入植物中，可以顯著地提高目標(biāo)蛋白在轉(zhuǎn)基因植物種子中的表達(dá)量。
文檔編號C12N15/82GK1693469SQ20051003904
公開日2005年11月9日 申請日期2005年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月21日
發(fā)明者劉巧泉, 王紅梅, 辛世文, 顧銘洪 申請人:揚(yáng)州大學(xué)