專利名稱：：用轉(zhuǎn)化的微藻生物合成外源蛋白質(zhì)的制作方法1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用轉(zhuǎn)化的微藻生物合成外源蛋白質(zhì)。更具體地說，本發(fā)明涉及通過用含有所需的外源蛋白質(zhì)基因的DNA載體轉(zhuǎn)化微藻原生質(zhì)體，然后大規(guī)模培養(yǎng)以便生物合成外源蛋白質(zhì)的方法。2.現(xiàn)有技術(shù)描述大腸桿菌是使用最廣泛的異源表達(dá)系統(tǒng)，但是該細(xì)菌有一些限制i)很難或不能表達(dá)某些特定的蛋白質(zhì)，ii)一些重組蛋白質(zhì)沒有生物活性，iii)一些重組蛋白質(zhì)對(duì)大腸桿菌是有毒的，以及iv)一些重組蛋白質(zhì)形成不溶型包涵體。用酵母表達(dá)系統(tǒng)可能會(huì)發(fā)生類似的問題。已經(jīng)用培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物和昆蟲細(xì)胞解決這些問題，但這些系統(tǒng)由于培養(yǎng)基、裝置以及需要進(jìn)一步純化過程而變得昂貴。因此，本發(fā)明人對(duì)小球藻轉(zhuǎn)化進(jìn)行了研究，用其作為一種新的異源過量表達(dá)系統(tǒng)，它可以代替大腸桿菌以解決上述問題。結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)由于微藻有比動(dòng)物或植物更簡(jiǎn)單的代謝途徑并可用含有光和二氧化碳的培養(yǎng)缸大規(guī)模培養(yǎng)，因此，微藻表達(dá)系統(tǒng)比細(xì)胞培養(yǎng)或動(dòng)物或植物表達(dá)系統(tǒng)更經(jīng)濟(jì)。此外，微藻具有與大腸桿菌不同的翻譯后修飾過程，這一事實(shí)表明在微藻中表達(dá)的外源蛋白質(zhì)的生物活性應(yīng)該與天然蛋白質(zhì)的更類似。在這種情況下，我們計(jì)劃開發(fā)微藻過量表達(dá)系統(tǒng)用于生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)。已有人試圖轉(zhuǎn)化小球藻，微藻的一種。Jarvis和Brown描述了在Chlorellaellipsoidea的原生質(zhì)體中瞬時(shí)表達(dá)螢光素酶(Jarvis，E.E.，andBrown.L.M.1991.TransientexpressionoffireflyluciferaseinprotoplastsofthegreenalgaChlorellaellipsoidea，CurrentGenetics19，317-321)，Dawson等發(fā)現(xiàn)通過用從Chlorellavulgaris分離出的硝酸鹽還原酶基因轉(zhuǎn)化Chlorellasorokiniana的硝酸鹽還原酶缺陷型突變可以使所述突變體獲救(Dawson，H.N.，Burlingame，R.，andCannons，A.C.1997.StabletransformationofChlorellaRescueofnitratereductase-deficientmutantswiththenitratereductasegene.CurrentMicrobiology35，356-362)。但是，這些試驗(yàn)僅描述了源自小球藻的蛋白質(zhì)基因的瞬時(shí)表達(dá)或表達(dá)。因此，本發(fā)明人對(duì)通過用含源自微藻以外之基因的載體DNA轉(zhuǎn)化微藻的原生質(zhì)體然后大規(guī)模培養(yǎng)從而生物合成外源蛋白質(zhì)的方法進(jìn)行了研究。結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)用所述方法可以達(dá)到上述目的。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明方法的特征在于所述方法包括下列步驟(i)獲得微藻的原生質(zhì)體；(ii)制備含編碼所需蛋白質(zhì)之基因的載體，所述基因源自微藻以外的生物；(iii)將所述載體導(dǎo)入所述原生質(zhì)體中以得到轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體，和(iv)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的微藻以生產(chǎn)所需的蛋白質(zhì)。另外，本發(fā)明的方法除上述步驟之外，還可包括在步驟(iii)與(iv)之間用抗生素篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞的步驟。通過下列詳細(xì)描述，本發(fā)明的上述和其他目的、特征和應(yīng)用對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將是顯而易見的。圖2表示用熒光顯微鏡觀察的在轉(zhuǎn)化的Chlorellaellipsoidea中的GFP表達(dá)的照片。圖3表示轉(zhuǎn)化載體pCTV的示意圖。圖4表示在含有或不含有腐草霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化的和未轉(zhuǎn)化的Chlorellaellipsoidea的生長(zhǎng)。圖5表示插入到轉(zhuǎn)化的Chlorellaellipsoidea的基因組DNA中的鲆生長(zhǎng)激素(下文稱fGH)基因和Shble基因的PCR擴(kuò)增和Southern印跡分析結(jié)果。在圖5中，A圖表示fGH的PCR擴(kuò)增和Southern印跡分析結(jié)果，B圖表示Shble的PCR擴(kuò)增和Southern印跡分析結(jié)果；1道表示分子量標(biāo)記，2道表示轉(zhuǎn)化的Chlorellaellipsoidea，3道表示未轉(zhuǎn)化的Chlorellaellipsoidea，4道表示從pBluescriptSK+消化出的fGH與Shble基因。圖6表示在轉(zhuǎn)化的Chlorellaellipsoidea表達(dá)的fGH的Western印跡分析的結(jié)果。在圖6中，1道表示分子量標(biāo)記，2道表示用于抗體生產(chǎn)的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(下文稱，GST)-fGH融合蛋白，3道表示從未轉(zhuǎn)化的Chlorellaellipsoidea中分離的總蛋白質(zhì)，4道表示從轉(zhuǎn)化的Chlorellaellipsoidea中分離的總蛋白質(zhì)。圖7表示在轉(zhuǎn)化的Chlorellaellipsoidea中表達(dá)的fGH量的Western印跡分析結(jié)果。在圖7中，M道表示分子量標(biāo)記，1&2道表示10μgGST-fGH融合蛋白，3&4道表示從10ml轉(zhuǎn)化的Chlorellaellipsoidea分離的fGH，5&6道表示10μgGST蛋白質(zhì)。圖8表示在Brachionusplicatilis和Artemianaupilus(兩者均是用由fGH轉(zhuǎn)化的Chlorellaellipsoidea飼養(yǎng)的)中積累的fGH的Western印跡分析。在圖8中，1-4道分別表示用轉(zhuǎn)化的Chlorellaellipsoidea飼養(yǎng)后30、60、90和120分鐘的Brachionusplicatilis，6-8道分別表示用轉(zhuǎn)化的Chlorellaellipsoidea飼養(yǎng)后30、60、90和120分鐘的Artemianaupilus。圖9表示通過fGH轉(zhuǎn)化的Chlorellaellipsoidea引起的鲆的生長(zhǎng)促進(jìn)作用。在圖9中，白框表示由轉(zhuǎn)化的Chlorellaellipsoidea引起的生長(zhǎng)促進(jìn)作用，黑框表示由未轉(zhuǎn)化的Chlorellaellipsoidea引起的生長(zhǎng)促進(jìn)作用，垂直線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差，較低的框表示顯著差異(p＜0.05)。圖10表示用經(jīng)fGH轉(zhuǎn)化的Chlorellaellipsoidea飼養(yǎng)1小時(shí)的Brachionusplicatilis與Artemianaupilus飼養(yǎng)，在飼養(yǎng)30天后鲆苗的生長(zhǎng)促進(jìn)作用。本發(fā)明的詳細(xì)解釋在本發(fā)明說明書和權(quán)利要求中，用術(shù)語外源蛋白質(zhì)表示源自與宿主微藻不同的生物體的任何蛋白質(zhì)，并包括保留了其原生物學(xué)活性的活性片段、變體和類似物。用術(shù)語“外源基因”表示編碼上述外源蛋白質(zhì)的任何核酸序列，不論其來源如何(可以是天然或合成的)，并可包括DNA、RNA、cDNA或其因堿基缺失、替代或插入而產(chǎn)生的變體，只要它們?nèi)跃幋a具有其生物學(xué)活性的外源蛋白質(zhì)。對(duì)于生產(chǎn)復(fù)合蛋白來說，由于Chlorellaellipsoidea的真核特征以及用于大規(guī)模培養(yǎng)的低成本使其成為是一種有吸引力的生物。本發(fā)明人首次報(bào)告了外源蛋白質(zhì)鲆生長(zhǎng)激素(fGH)在Chlorellaellipsoidea中的功能性表達(dá)，以及用轉(zhuǎn)化的小球藻飼養(yǎng)鲆而對(duì)魚產(chǎn)生的生長(zhǎng)促進(jìn)作用。用含有在花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子控制下的fGH基因和在ChlamydomonasRBCS2基因啟動(dòng)子控制下列的腐草霉素抗性Shble基因的載體轉(zhuǎn)化Chlorellaellipsoidea的原生質(zhì)體。PCR擴(kuò)增和Southern印跡分析來自轉(zhuǎn)化體的染色體DNA的fGH與Shble基因，證實(shí)了導(dǎo)入DNA的穩(wěn)定整合。Western印跡分析表明在轉(zhuǎn)化的小球藻中表達(dá)了fGH蛋白質(zhì)。在不含腐草霉素的培養(yǎng)基中連續(xù)轉(zhuǎn)移7次后檢測(cè)導(dǎo)入的DNA和表達(dá)的fGH。將轉(zhuǎn)化的小球藻細(xì)胞首先喂給浮游動(dòng)物以除去纖維素細(xì)胞壁，然后把浮游生物喂給鲆苗。在喂養(yǎng)30天后，與對(duì)照魚相比，這些魚總長(zhǎng)度和寬度增加25％。這些結(jié)果表明可以用Chlorellaellipsoidea以低成本生產(chǎn)有價(jià)值的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明中，來自用GFP基因轉(zhuǎn)化的小球藻的綠色熒光和用Shble基因轉(zhuǎn)化的小球藻的腐草霉素抗性表明了這些蛋白質(zhì)的功能性表達(dá)。通過喂養(yǎng)鲆苗確定重組fGH的生物學(xué)活性。因此，在本發(fā)明中已證實(shí)用鲆生長(zhǎng)激素基因轉(zhuǎn)化的微藻可以表達(dá)生物活性形式的激素。因此，可以從轉(zhuǎn)化的微藻中生產(chǎn)有價(jià)值的蛋白質(zhì)用于藥物和工業(yè)。具體地說，可用簡(jiǎn)單的裝置低成本生產(chǎn)微藻，從中分離和純化表達(dá)的蛋白質(zhì)的方法也很簡(jiǎn)單，這樣就可以顯著降低生產(chǎn)蛋白質(zhì)的成本。此外，本發(fā)明描述了成功地利用Shble基因作為Chlorellaellipsoidea轉(zhuǎn)化的選擇性標(biāo)記，首次表明生物活性外源蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)化的Chlorellaellipsoidea中的穩(wěn)定基因整合和表達(dá)。用于本發(fā)明的微藻沒有特別地限制，但所述技術(shù)可用于其他藻類包括來自海洋和活水的小球藻屬，例如Chlorellaellipsoidea、Chlorellasorokiniana和Chlorellavulgaris，衣藻屬(Chlamydomonas)、團(tuán)藻屬(Volvox)、Cheatoceros、普哈特屬(Phaeodactylum)、骨條藻屬(Skeletonema)、舟形藻屬(Navicula)、Caloneise、菱形藻屬(Nitzschia)、海鏈藻屬(Thalassiosira)、雙眉藻屬(Amphora)、Nannochloris、Nannochloropsis、Tetraselmis、杜氏藻屬(Dunaliella)、Spirulina、微孢藻屬(Microcystis)、Oscillatoria、Tricodesminus、Isochryosis、Pavlova、Dinophyceae等。用于本發(fā)明的外源基因是鲆生長(zhǎng)激素基因。但是也可以通過本發(fā)明過量表達(dá)源自細(xì)菌、真菌、病毒、動(dòng)物、植物或魚的其他基因。另外，載體生產(chǎn)、克隆、通過載體轉(zhuǎn)化宿主、轉(zhuǎn)化體的篩選和培養(yǎng)，以及培養(yǎng)后回收所需蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。提供下列實(shí)施例說明本發(fā)明，它們不應(yīng)被看成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。[實(shí)施例1]Chlorellaellipsoidea培養(yǎng)和原生質(zhì)體形成Chlorellaepillsoidea得自Pukyong國(guó)立大學(xué)的韓國(guó)海洋微藻培養(yǎng)物中心(菌株號(hào)KMCCC-20)。將細(xì)胞以l×l06細(xì)胞/ml的起始濃度接種在分別含50μg/ml氯霉素和鏈霉素的新鮮f/2培養(yǎng)基(Guillard，R.R.L.，andRyther，J.H.1962.Studiesonmarineplanktonicdiatoms.I.CyclotellananaHustedtandDetonulaconfervacea(Cleve)Gran.Can.J.Microbiol.3，229-239)中，然后在25℃，在3000lux熒光燈下以18∶6小時(shí)的光照期培養(yǎng)。在接種后8-9天，當(dāng)細(xì)胞計(jì)數(shù)達(dá)到1-2×108細(xì)胞/ml時(shí)收集細(xì)胞用于原生質(zhì)體形成。將細(xì)胞(50ml)以1500xg離心5分鐘，用25mM磷酸鹽緩沖液(pH6.0)洗滌一次，然后懸浮在含0.6M山梨糖醇、0.6M甘露醇、4％(w/v)纖維素酶(Calbiochem，USA)、2％(w/v)解析酶(macerase)(Calbiochem)和50單位果膠酶(SigmaChemicals，USA)的5ml磷酸緩沖液中。將細(xì)胞懸浮液在25℃黑暗中保溫16小時(shí)，同時(shí)溫和振蕩。用兩種方法確定Chlorellaellipsoidea的原生質(zhì)體形成。在滲透-穩(wěn)定性試驗(yàn)中，在蒸餾水中的酶處理的細(xì)胞數(shù)在8小時(shí)內(nèi)從1.7×106細(xì)胞/ml減少到1.0×105細(xì)胞/ml，而未處理的小球藻的數(shù)量沒有變化。該結(jié)果通過卡爾科弗盧爾熒光增白劑染色(Maeda，H.，andIshida，N.1967.Specificityofbindingofhexapyranosylpolysaccharideswithfluorescentbrightner.J.Biochem.62，276-278)得到證實(shí)。用熒光顯微鏡觀察時(shí)，80％以上的酶處理的細(xì)胞是紅色，而未處理的細(xì)胞是藍(lán)色(見圖1)；這些結(jié)果表明完全除去了與卡爾科弗盧爾熒光增白劑結(jié)合的細(xì)胞壁的纖維素組分。[實(shí)施例2]pMinGFP的制備和GFP的表達(dá)作為開發(fā)小球藻轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的第一步，從植物轉(zhuǎn)化載體Bin19(Bevan，M.1984.BinaryAgrobacteriumvectorsforplanttransformation.NucleicAcidsRes.12，8711-8712)構(gòu)建小的5kb雙載體。被稱為pMIN的新載體含有大腸桿菌和農(nóng)桿菌屬的oriV復(fù)制原點(diǎn)、卡那霉素抗性的nptII基因、用于DNA復(fù)制的trfA基因以及用于整合的右和左邊界T-DNA元件。隨后克隆含指導(dǎo)綠熒光蛋白質(zhì)(GFP)表達(dá)的花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子的DNA片段，產(chǎn)生用于高等植物和藻類轉(zhuǎn)化的載體pMinGFP。通過聚乙烯處理用pMinGFP轉(zhuǎn)化小球藻原生質(zhì)體，然后測(cè)定GFP的表達(dá)。在不對(duì)轉(zhuǎn)化進(jìn)行選擇的條件下在f/2培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天后，少量小球藻細(xì)胞有GFP熒光，而未轉(zhuǎn)化的小球藻細(xì)胞沒有(見圖2)。[實(shí)施例3]克隆fGH基因用LambdaZAP-IIcDNA合成試劑盒(Stratagene，USA)，從日本鲆腦垂體分離的總mRNA構(gòu)建鲆cDNA文庫(kù)。擴(kuò)增文庫(kù)的滴度為3×109pfu/ml，用1ul樣品用于PCR擴(kuò)增。將用fGH-AN(5′CGGGATCCCAGCCAATCACAGA-3′)和fGH-AC(5′CGGGCTACAGAATTC-3′)引物擴(kuò)增的DNA片段克隆到pGEM-T載體(Promega，USA)中用于序列確定。將BamHI/NdeI片段亞克隆到pGEX-3X載體(AmershamPharmaciaBiotech，USA)中用于谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶-fGH(GST-fGH)融合蛋白的表達(dá)；用該融合蛋白進(jìn)行多克隆抗體的生產(chǎn)。[實(shí)施例4]制備pMinfGH已經(jīng)從數(shù)種魚中克隆了生長(zhǎng)激素并在轉(zhuǎn)基因魚中觀察了其生長(zhǎng)增強(qiáng)作用。用來自日本鲆，Paralichthysolivaceus(韓國(guó)的主要水產(chǎn)養(yǎng)殖魚)的生長(zhǎng)激素基因(fGH)轉(zhuǎn)化小球藻。通過PCR擴(kuò)增鲆腦垂體cDNA文庫(kù)克隆fGH基因，使用fGH-N引物(5′-CGGGATCCGGTCAGTCCCTTATGCAGCCAATCACA-3′)和fGH-C引物(5′-AAAAGCTCGAGCTCTTGGCGGAG-3′)(Watahiki，M.，Yamamoto，M.，Yamakawa，M.，Tanaka，M.&Nakashima，K.1989.ConservedanduniquesaminoacidresiduesinthedomainsofthegrowthhormonefloundergrowthhormonededucedfromthecDNAsequencehastheminimalsizeinthegrowthhormoneprolactingenefamily.J.Biol.Chem.264，312-316)。用560bpPCR產(chǎn)物代替pMinGFP載體中的GFP基因產(chǎn)生載體pMinfGH。[實(shí)施例5]制備pCTV我們使用Shble基因，該基因源自Streptoalloteichushindustamus，編碼通過與抗生素結(jié)合然后抑制其DNA裂解活性而賦予他利霉素、博萊霉素、腐草霉素和zeomycin抗性的小蛋白質(zhì)(13.7kDa)。為了確定腐草霉素是否抑制Chlorellaellipsoidea，將藻類在含不同濃度腐草霉素的f/2培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在含0.1或0.5μg/ml腐草霉素的培養(yǎng)基中發(fā)生生長(zhǎng)降低，藻類在含1μg/ml以上腐草霉素的培養(yǎng)基中不生長(zhǎng)。因此，賦予腐草霉素抗性的Shble基因適用于篩選轉(zhuǎn)化的小球藻。從質(zhì)粒pSP109(Lumbreras，V，Stevens，D.R.，&Purton，S.1998.EfficientforeigngeneexpressioninChlamydomonasreinhardtiimediatedbyanendogenousintron.PlantJ.14，441-447)，用ble-N引物(5′-AAACTCGAGGGCGCGCCAGAAGGAGC3′)和ble-C引物(5′-AAACTCGAGAATTCGAGGTCGGTACC-3′)擴(kuò)增Shble編碼區(qū)和上游ChlamydomonasreinhardtiiRBCS2啟動(dòng)子。將880bpPCR產(chǎn)物用XhoI消化，然后亞克隆到pMinfGH中以構(gòu)建小球藻轉(zhuǎn)化載體pCTV(見圖3)。[實(shí)施例6]用pCTV載體轉(zhuǎn)化Chlorellaellipsoidea將小球藻原生質(zhì)體(1×108)以400xg離心5分鐘，重懸在5ml含0.6M山梨糖醇/甘露糖醇的f/2培養(yǎng)基中，以400xg離心5分鐘，然后重懸在1ml含0.05MCaCl2的0.6M山梨糖醇/甘露糖醇溶液中。然后將在0.4ml中1×108原生質(zhì)體放在新鮮微離心管中，加入5μgpCTV載體和25μg牛胸腺DNA(SigmaChemicals)。在室溫保溫15分鐘后，加入200μlPNC，然后在室溫溫和混合30分鐘。然后加入用0.6M山梨糖醇/甘露糖醇、1％酵母提取物和1％葡萄糖補(bǔ)充的0.6mlf/2培養(yǎng)基，然后在黑暗中將細(xì)胞在25℃保溫12小時(shí)進(jìn)行細(xì)胞壁再生。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含腐草霉素(1μg/ml)的新鮮f/2培養(yǎng)基中，然后按上述培養(yǎng)。到第5天產(chǎn)生可檢測(cè)的生長(zhǎng)，到第15天細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期。相反，在未轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體中沒有可檢測(cè)的生長(zhǎng)(見圖4)。轉(zhuǎn)化小球藻細(xì)胞的慢生長(zhǎng)與用pMinGFP進(jìn)行的初步轉(zhuǎn)化試驗(yàn)一致，其中僅少量百分比(2％)的細(xì)胞現(xiàn)出綠熒光。當(dāng)將穩(wěn)定期的轉(zhuǎn)化小球藻細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新鮮f/2培養(yǎng)或含腐草霉素的f/2培養(yǎng)基中時(shí)，沒有產(chǎn)生可檢測(cè)的生長(zhǎng)差異。此外，在兩個(gè)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)率與未轉(zhuǎn)化小球藻在不含腐草霉素的f/2培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)相似(見圖4)。這些結(jié)果表明導(dǎo)入的DNA對(duì)小球藻生長(zhǎng)沒有影響，另外轉(zhuǎn)化的細(xì)胞也沒有任何形態(tài)學(xué)變化。[實(shí)施例7]導(dǎo)入DNA的穩(wěn)定整合導(dǎo)入的DNA穩(wěn)定整合到染色體DNA中是用小球藻作為表達(dá)系統(tǒng)的先決條件。用PCR和Southern分析確定導(dǎo)入的DNA是否整合到了小球藻染色體DNA中。(A).DNA分離從3ml培養(yǎng)物中沉淀約3×108個(gè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，重懸在500μlCTAB緩沖液[250ml溴化十六烷基三甲基銨(CTAB)5g、1MTris(pH8.0)25ml、NaCl20.45g、EDTA1.68g、β-巰基乙醇(2％)]中，在65℃保溫1小時(shí)，然后用等體積苯酚/氯仿提取。提取數(shù)次以3,000xg離心5分鐘后回收的水相，用乙醇沉淀染色體DNA，再沉淀，然后重懸在30μlTE緩沖液中。(B).PCR與Southern印跡分析分別用fGH-N/fGH-C和ble-N/ble-C引物對(duì)擴(kuò)增從染色體DNA分離的fGH基因和Shble基因。將200ng染色體DNA和各100pmole引物加到50μl反應(yīng)物中，然后經(jīng)30個(gè)循環(huán)的如下過程94℃變性1分鐘，分別在54或57℃對(duì)fGH和Shble基因退火30秒，在72℃延伸1分鐘，然后再在72℃延伸5分鐘。用DIG-DNA標(biāo)記試劑盒(BoehringerMannheim，Germany)合成用于Southern印跡分析的探針。僅用從轉(zhuǎn)化的小球藻分離的DNA生產(chǎn)預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物。用fGH或Shble基因特異性探針通過Southern分析鑒定DNA片段(見圖5)。在連續(xù)7次轉(zhuǎn)移到不含腐草霉素的培養(yǎng)基中后，通過PCR擴(kuò)增來自從小球藻分離的染色體DNA的上述兩基因來確定整合DNA的穩(wěn)定性。[實(shí)施例8]fGH在轉(zhuǎn)化的Chlorellaellipsoidea中的表達(dá)按下文所述通過Western分析檢測(cè)fGH表達(dá)。通過以17,000xg離心5分鐘從含108-109個(gè)細(xì)胞的3ml培養(yǎng)物中回收轉(zhuǎn)化的Chlorellaellipsoidea。將細(xì)胞在液氮中勻漿，重懸于20μl樣品負(fù)載緩沖液[1mMEDTA、250mMTris-Cl(pH6.8)、4％SDS、2％β-巰基乙醇、0.2％溴酚藍(lán)(bromophenylblue)、50％甘油]，然后煮沸10分鐘。將樣品以12,000xg離心10分鐘，然后將上清液在15％SDS-PAGE上電泳。另外通過SDS-PAGE分離從未轉(zhuǎn)化的小球藻中制備的蛋白提取物。通過標(biāo)準(zhǔn)方法完成Western印跡分析。將通過SDS-PAGE從轉(zhuǎn)化的和未轉(zhuǎn)化的小球藻中分離的蛋白質(zhì)提取物轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上?？筬GH的多克隆抗體的最終稀釋度為1∶3,000，用堿性磷酸酶—結(jié)合的抗小鼠IgG作為二級(jí)抗體。在轉(zhuǎn)化的小球藻中存在20kDafGH，但在未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中則沒有(見圖6)。對(duì)一個(gè)成功表達(dá)系統(tǒng)的要求是以高水平生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)。通過酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)和Western印跡，用純化的GST、GST-fGH融合蛋白以及來自轉(zhuǎn)化的小球藻的提取物，利用抗GST-fGH融合蛋白的多克隆抗體確定在轉(zhuǎn)化小球藻中表達(dá)的fGH的量(見圖7)。從1×108個(gè)穩(wěn)定期細(xì)胞(在1毫升培養(yǎng)物中總蛋白為400μg)中得到約400ngfGH。該產(chǎn)率等于400μgfGH/升培養(yǎng)的小球藻，估計(jì)小球藻的最終細(xì)胞計(jì)數(shù)為1×108細(xì)胞/ml?？紤]到藻類培養(yǎng)基的低成本，可以用該系統(tǒng)生產(chǎn)真核細(xì)胞蛋白質(zhì)，特別是在藥物學(xué)上重要的蛋白質(zhì)。[實(shí)施例8]生物學(xué)活性檢測(cè)盡管由于小球藻細(xì)胞壁中高含量的纖維素而不能將小球藻直接喂給魚和甲殼綱動(dòng)物幼蟲，但已用小球藻大量培養(yǎng)含纖維素酶的浮游動(dòng)物。還知道魚可通過飲液作用攝取飼料中的蛋白質(zhì)，有報(bào)告認(rèn)為通過口服重組哺乳動(dòng)物和魚生長(zhǎng)激素可促進(jìn)魚的生長(zhǎng)。因此，將4天齡的鲆幼苗分成1000條一組，各裝在含200升海水的300升容器中。用輪蟲(Brachionusplicatilis)和鹽水蝦(Artemianauplius)積累生長(zhǎng)激素并除去小球藻細(xì)胞壁的纖維素。在孵化后將浮游動(dòng)物餓1天，然后給其提供3×108細(xì)胞/ml轉(zhuǎn)化的和未轉(zhuǎn)化的小球藻1小時(shí)。Western分析證實(shí)在藻類中的fGH在飼養(yǎng)后1小時(shí)積累在浮游動(dòng)物體內(nèi)；1小時(shí)后fGH降解，飼養(yǎng)2小時(shí)后消失(見圖8)。用輪蟲每天喂養(yǎng)鲆幼苗一次，共10天，然后用輪蟲和鹽水蝦的混合物喂養(yǎng)5天，然后用鹽水蝦喂養(yǎng)15天。輪蟲和鹽水蝦的最終計(jì)數(shù)分別為10和5個(gè)/ml。用轉(zhuǎn)化的和未轉(zhuǎn)化的小球藻營(yíng)養(yǎng)過1小時(shí)的浮游動(dòng)物將4天齡鲆苗培養(yǎng)30天。飼養(yǎng)10天后測(cè)量魚幼蟲的長(zhǎng)度，飼養(yǎng)30天后測(cè)量幼魚的長(zhǎng)度和寬度。測(cè)定從各含1000條魚的3個(gè)同樣的箱中隨機(jī)選出的50條魚。如圖9所示，在10天后魚的長(zhǎng)度有顯著差異，在30天后長(zhǎng)度和寬度均增加25％(見圖10)。盡管上文詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，應(yīng)清楚地理解對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見的是，本文教導(dǎo)的基本創(chuàng)造性概念的許多變體和/或改變?nèi)栽谒綑?quán)利要求中表明的本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)。權(quán)利要求1.在微藻中生物合成所需外源蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括下列步驟(i)獲得微藻的原生質(zhì)體；(ii)制備含編碼所需外源蛋白質(zhì)之基因的載體，所述基因源自微藻以外的生物；(iii)將所述載體導(dǎo)入原生質(zhì)體以得到轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體；和(iv)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的微藻以生產(chǎn)所需的蛋白質(zhì)。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，該方法還包括在培養(yǎng)步驟后從所述微藻回收所述蛋白質(zhì)的步驟。3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述方法還包括在步驟(iii)與步驟(iv)之間用抗生素篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞的步驟。4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述方法還包括在步驟(iii)與步驟(iv)之間使轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體再生細(xì)胞壁的步驟。5.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述載體含有Shble基因作為轉(zhuǎn)化體的選擇性標(biāo)記，且其中抗生素選自腐草霉素、他利霉素、博萊霉素和zeomycin。6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述載體含有選自花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子和衣藻RBCS2基因啟動(dòng)子的啟動(dòng)子。7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述微藻是來自海洋和活水的小球藻屬，衣藻屬、團(tuán)藻屬、Cheatoceros、普哈特屬、骨條藻屬、舟形藻屬、Caloneise、菱形藻屬、海鏈藻屬、雙眉藻屬、Nannochloris、Nannochloropsis、Tetraselmis、杜氏藻屬、Spirulina、微孢藻屬、Oscillatoria、Tricodesminus、Isochryosis、Pavlova或Dinophyceae中的一種。8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述所需的外源蛋白質(zhì)源自細(xì)菌、真菌、病毒、動(dòng)物、植物或魚。9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述所需的外源蛋白質(zhì)是鲆生長(zhǎng)激素。10.用于在微藻中生物合成所需的外源蛋白質(zhì)的重組DNA載體，所述載體含有編碼所需外源蛋白質(zhì)的基因和作為轉(zhuǎn)化體選擇性標(biāo)記的Shble基因。11.用于生物合成所需外源蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化的微藻，其中該微藻的基因組與所述所需外源基因和Shble基因是整合在一起的。12.根據(jù)權(quán)利要求11的轉(zhuǎn)化的微藻，其中所述微藻可表達(dá)所需的外源蛋白質(zhì)和Shble蛋白。13.一種所需外源蛋白質(zhì)，其是在權(quán)利要求11或12所述的轉(zhuǎn)化的微藻中通過所需外源基因的表達(dá)而生產(chǎn)的。14.一種飼養(yǎng)動(dòng)物的方法，其采用權(quán)利要求11的微藻或權(quán)利要求13的蛋白質(zhì)飼養(yǎng)動(dòng)物。全文摘要本發(fā)明涉及用轉(zhuǎn)化的微藻生物合成所需外源蛋白質(zhì)的一種經(jīng)濟(jì)的方法,即本發(fā)明涉及用轉(zhuǎn)化的微藻作為生物反應(yīng)器的方法,其中通過用含所需外源蛋白質(zhì)基因的DNA載體轉(zhuǎn)化微藻例如Chorellaellipsoidea的原生質(zhì)體,然后大規(guī)模培養(yǎng)可以經(jīng)濟(jì)地生物合成外源蛋白質(zhì)。具體地說,用腐草霉素抗性的Shble基因作為本發(fā)明的選擇性標(biāo)記。文檔編號(hào)C12N1/13GK1354792SQ00808116公開日2002年6月19日申請(qǐng)日期2000年3月17日優(yōu)先權(quán)日1999年5月28日發(fā)明者崔泰辰,金永泰,金大鉉申請(qǐng)人:愛爾基因泰克株式會(huì)社