專利名稱：使用表面增強拉曼散射(sers)進行dna測序的方法和設(shè)備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本方法、組合物和設(shè)備涉及分子生物學(xué)和基因組學(xué)領(lǐng)域。更具體地說，本方法、組合物和設(shè)備涉及使用拉曼光譜術(shù)進行核酸表征。表征可以涉及核酸的鑒定或測序。
背景技術(shù)：
基因信息以非遺傳信息以組織成染色體的非常長的脫氧核糖核酸(DNA)分子的形式儲存。人類基因組含有大約30億個堿基的DNA序列。該DNA序列信息決定了每個個體的多種特征。許多常見的疾病都至少部分地基于DNA序列中的變異。
人類基因組整個序列的測定已經(jīng)為鑒定這些疾病的遺傳根據(jù)提供了基礎(chǔ)。然而，為了鑒定與每一種疾病相聯(lián)系的遺傳變異，仍有大量的工作需要去做。為了鑒定在DNA序列中促發(fā)疾病的特定變化，就要求對表現(xiàn)有每一種這樣的疾病的個體或家族的染色體部分進行DNA測序。核糖核酸(RNA)是加工遺傳信息時所需要的中間分子，它也能被測序以確定各種疾病的遺傳基礎(chǔ)。
核酸測序的已有方法是基于按大小分離開的熒光標記核酸的檢測，它受到了能被測序的核酸長度的限制。一般來說，一次只能測定500到1000個堿基的核酸序列。這比DNA的功能單位，即基因的長度短得多，后者可能有上萬個，甚至十萬個堿基長。使用目前的方法來測定一個完整的基因序列，就需要制得該基因的若干拷貝，把它們切為相互重疊的片段，并測序，之后再把相互重疊的DNA序列組合為完整的基因。這個過程費力、昂貴、低效而且耗時。它也通常需要使用熒光或放射性標記，這潛在地引起安全和廢物處理問題。
最近，核酸測序的方法已經(jīng)得以發(fā)展，涉及雜交到被限定測序的、附著于DNA芯片上特定位置的短寡核苷酸。這些方法可用于推斷短的核酸序列或者用于檢測特定核酸在樣品中的存在，但不適合用于鑒定長的核酸序列。


下面的圖構(gòu)成本說明書的組成部分，其被包括以進一步示范本公開的方法和設(shè)備的某些方面。通過參考這些圖中的一個或多個，結(jié)合在此提出的具體實施方案的詳細描述，該方法和設(shè)備可以被更好地理解。
圖1圖解說明了示范性的設(shè)備100(非按比例)和核酸109測序的方法，其通過表面增強拉曼光譜(surface enhanced Raman spectroscopy，SERS)，表面增強共振拉曼光譜(surface enhanced resonance Raman spectroscopy，SERRS)和/或相干反斯托克斯拉曼光譜(coherent anti-Stokes Raman spectroscopy，CARS)檢測。
圖2顯示所有四種脫氧核糖核苷一磷酸(dNTP)在100mM濃度下的拉曼光譜，其使用100微秒的數(shù)據(jù)采集時間。每種不同類型的核苷酸的特征拉曼發(fā)射峰如圖所示。數(shù)據(jù)的采集不使用表面增強或者核苷酸標記。
圖3顯示1nM鳥嘌呤的SERS檢測，其由dGMP經(jīng)酸處理取得，酸處理根據(jù)Nucleic Acid Chemistry，Part 1，L.B.Townsend和R.S.Tipson(Eds.)，Wiley-Interscience，New York，1978。
圖4顯示100nM胞嘧啶的SERS檢測。
圖5顯示100nM胸腺嘧啶的SERS檢測。
圖6顯示100pM腺嘌呤的SERS檢測，其中腺嘌呤由dAMP經(jīng)酸處理而取得。
圖7顯示以熒光素共價標記的脫氧腺苷三磷酸(上部的曲線)和未標記的dATP(下部的曲線)的500nM溶液的比較性的SERS譜圖。dATP-熒光素從RocheApplied Science(Indianapolis，IN)獲得。在熒光素標記的dATP中檢測到SERS信號的強烈增加。
圖8顯示0.9nM(納摩)腺嘌呤溶液的SERS檢測。檢測體積為100到150飛升(femtoliter)，包含估計60個腺嘌呤分子。
圖9顯示滾環(huán)擴增產(chǎn)物的SERS檢測，使用單鏈、環(huán)狀M13 DNA模板。
說明性實施方案的描述 公開的方法、組合物和設(shè)備是用于核酸的快速、自動化的測序。這些方法和設(shè)備可以適合用于獲得很長的核酸分子的序列，其長度大于1000個、大于2000個、大于5000個、大于10000個、大于20000個、大于50000個、大于100000個或甚至更多個堿基。相比現(xiàn)有技術(shù)方法的優(yōu)越之處包括在單輪測序中閱讀長核酸序列的能力，獲得序列數(shù)據(jù)的速度更快，測序的花費降低，以及在產(chǎn)生每單位的序列數(shù)據(jù)所需要的操作時間上效率更高。
核酸序列信息可以在使用單個核酸分子的單輪測序過程中獲得?；蛘?，可以對核酸分子的多個拷貝同時或逐個地測序，以確認核酸序列或獲得完整的序列數(shù)據(jù)。以其它可以選擇的方式，可以既對核酸分子又對其互補鏈測序，以確認序列信息的準確?？梢岳缤ㄟ^外切核酸酶處理，將核苷酸從附著于表面的核酸釋放。被釋放的核苷酸可以例如通過微流體系統(tǒng)傳送到拉曼檢測器，從而允許被釋放核苷酸被檢測而沒有來自核酸、外切核酸酶和/或其它系統(tǒng)組分的背景拉曼信號。盡管在此公開的某些方法涉及核酸測序，技術(shù)人員將會意識到，相同類型的方法也可以被利用以獲得有關(guān)核酸的其它信息，諸如一個或者多個單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的狀態(tài)或者樣品中出現(xiàn)的其它遺傳變異。
在本發(fā)明的某些實施方式中，要測序的核酸是DNA，雖然考慮，其它包含RNA或合成核苷酸類似物的核酸也可以被測序。下面的詳細描述包含許多具體的細節(jié)，以便提供對公開的方法和設(shè)備的更全面理解。然而，對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，在沒有這些具體細節(jié)的情況下，可以實施這些方法和設(shè)備。在其它情況中，本領(lǐng)域熟知的設(shè)備、方法、過程和個別組分在這里未進行描述。
在本發(fā)明的各種實施方式中，通過拉曼光譜術(shù)，例如表面增強拉曼光譜術(shù)(surface enhanced Raman spectroscopy(SERS))、表面增強共振拉曼光譜術(shù)(surfaceenhanced resonance Raman spectroscopy(SERRS))、相干反斯托克斯拉曼光譜術(shù)(coherenct anti-Stokes Raman spectroscopy(CARS))或其它已知的拉曼檢測技術(shù)，可以檢測未標記的核苷酸?？梢赃x擇地，可將核苷酸共價地連接于拉曼標記，以增強拉曼信號。在一些實施方式中，可使用標準的核酸聚合技術(shù)，將標記的核苷酸整合進新合成的核酸鏈。通常地，將特定序列的引物或一個或多個隨機引物與模板核酸雜交。在加入聚合酶和標記的核苷酸后，將拉曼標記的核苷酸共價連接于引物的3′末端，形成在序列上與模板互補的標記核酸鏈。標記的鏈可以與未標記模板分離，例如通過加熱到大約95℃或其它已知的方法。通過本領(lǐng)域熟知的技術(shù)，可以將兩個鏈彼此分離。例如，可以用生物素殘基共價地修飾引物寡核苷酸，并可以通過與包被抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白的表面結(jié)合，分離形成的生物素化核酸。
用一個或多個外切核酸酶，可以消化標記或未標記的單鏈核酸分子。技術(shù)人員將認識到，本公開的方法并不限于外切核酸酶本身，而可以使用能夠?qū)⒑塑账釓暮怂岬闹辽僖欢酥饌€除去的任何酶或其它試劑。標記或未標記的核苷酸逐個地從核酸的3′末端被釋放。在與核酸分離后，用拉曼檢測單元檢測核苷酸。逐個地被檢測的核苷酸的信息被用于匯編核酸的序列。從核酸的3′末端釋放的核苷酸可通過微流體流動通路傳送通過拉曼檢測器。該檢測器能夠在單分子水平檢測標記或未標記的核苷酸。用拉曼檢測器檢測核苷酸的順序與核苷酸從核酸的3′末端釋放的順序相同。由此，核酸的序列通過被釋放核苷酸的檢測順序而被確定。根據(jù)標準的沃森-克里克氫鍵堿基配對(即，即腺嘌呤“A”對胸腺嘧啶“T”，鳥嘌呤“G”對胞嘧啶“C”)，在互補鏈被測序的情況下，模板鏈在序列上將是互補的。
在某些可選的實施方式中，可將標簽分子添加到檢測單元上游的反應(yīng)室或流動通路(flow path)中。當(dāng)自由核苷酸從核酸分子釋放時，該標簽分子與游離核苷酸結(jié)合并標記所述游離核苷酸。這種釋放后標記避免了核酸分子的核苷酸在其釋放進入溶液前被標記時遇到的問題。例如，在整合進核酸分子的每個核苷酸在外切核酸酶處理之前被標記時，大體積拉曼標記分子的使用可能產(chǎn)生空間位阻，這降低效率并增加測序反應(yīng)所需的時間。
在本發(fā)明的某些實施方案中，四種核苷酸中的每一種都可以連接有可區(qū)分的拉曼標記。其它的可選方案也可以使用，諸如只把拉曼標記整合入嘧啶殘基(C和T)。通過只標記嘧啶并且對雙鏈DNA的兩條鏈都進行測序，可以獲得DNA分子的完整序列。單鏈DNA分子中的每個核苷酸必為嘌呤或嘧啶。當(dāng)核苷酸為嘌呤時，其必然通過氫鍵鍵合于互補鏈上的嘧啶。這樣，通過對兩條鏈中所有嘧啶進行測序，可以獲得完整序列。在一個示范性的實施方案中，標記的核苷酸可以包括生物素標記的脫氧胞苷-5′-三磷酸(生物素-dCTP)和地高辛標記的脫氧尿苷-5′-三磷酸(地高辛-dUTP)。
在可選的方法中，沒有核苷酸被標記，用拉曼光譜術(shù)鑒定未標記的核苷酸。如上文討論的，只鑒定半數(shù)的核苷酸并且通過對雙鏈DNA的兩條鏈進行測序來獲得完整的序列數(shù)據(jù)是可能的。例如，可以只鑒定腺嘌呤和鳥嘌呤并且對兩條鏈進行測序，測定出完整序列。
在本發(fā)明的多種實施方案中，例如圖1所示范的，核苷酸110例如通過核酸外切酶的處理，被連續(xù)地從一個或多個核酸分子109移去。核苷酸110從反應(yīng)室101中離開，進入微流體通道(microfluidic channel)102。微流體通道102與通道103有著流體交流(fluid communication)，通道103可以是納米通道(nanochannel)或者微通道(microchannel)。核苷酸110可以響應(yīng)于電場而進入納米通道103或微通道103，其中電場在微流體通道102一側(cè)為負，在納米通道103或微通道103一側(cè)為正。電場可以例如通過使用負極104和正極105而被施加。當(dāng)核苷酸110沿著納米通道103或微通道103通過時，它們可以經(jīng)過緊密填裝有納米顆粒(nanoparticle)111的區(qū)域。納米顆粒111可以被處理以便形成“熱點(hot spot)”。與“熱點”發(fā)生聯(lián)系的核苷酸110產(chǎn)生增強的拉曼信號，其可使用檢測單元進行檢測，檢測單元包括，例如激光器106和CCD照相機107。被CCD照相機107檢測到的拉曼信號可以被連接的計算機108處理。經(jīng)過納米顆粒111的每個核苷酸110的種類以及通過時間可以被記錄，并用來構(gòu)建核酸109的序列。在本發(fā)明的某些實施方案中，核苷酸110是未修飾的。在本發(fā)明可選的實施方案中，核苷酸110可被共價地修飾，例如通過連接拉曼標記。
定義 如本文所使用，“一個(a)”或“一個(an)”指一個或多于一個的項目。
如本文所用，“多個(multiplicity)”的項目意味著兩個或更多個的該項目。
如本文所用，“微通道(microchannel)”為截面直徑介于1微米(μm)和999μm之間的任何通道，“納米通道(nanochannel)”為截面直徑介于1納米(nm)和999nm之間的任何通道。在本發(fā)明的某些實施方案中，“納米通道或者微通道”可以是直徑約1μm或更小?！拔⒘黧w通道(microfluidic channel)”是液體可以在其中被微流體流移動的通道。通道直徑、流體黏度和流速對微流體流的影響是本領(lǐng)域已知的。
如本文所使用，“可操作地連接(operably coupled)”意指，在兩個或更多個元件之間存在功能性相互作用。例如，如果布置拉曼檢測器，使得它可以在分析物如核苷酸經(jīng)過納米通道或者微通道時可以進行檢測，則該檢測器就是與納米通道或者微通道“可操作地連接”。
“核酸(nucleic acid)”包括DNA、RNA，可以是單鏈的、雙鏈或三鏈的以及它們的任何化學(xué)修飾形式。事實上，可以考慮核酸的任何修飾形式?！昂怂帷笨梢詾閹缀跞魏伍L度，它的堿基數(shù)可以是10、20、30、40、50、60、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、10000、15000、20000、30000、40000、50000、75000、100000、150000、200000、500000、1000000、1500000、2000000、5000000或者甚至更多，直到全長染色體DNA分子。
“核苷(nucleoside)”是包括嘌呤或嘧啶堿基或它們的任何化學(xué)修飾形式或結(jié)構(gòu)類似物的分子，這些堿基共價連接到戊糖如脫氧核糖、核糖或者戊糖的衍生物或類似物上。
“核苷酸(nucleotide)”指進一步包括至少一個磷酸基團的核苷，該磷酸基團共價連接于戊糖上。要被檢測的核苷酸可為核糖核苷一磷酸或脫氧核糖核苷一磷酸，盡管也可以使用核苷二磷酸或三磷酸?？蛇x地，核苷可從核酸中釋放并且被檢測。在其它可選方案中，嘌呤或嘧啶可被釋放，例如通過酸處理，并且通過拉曼光譜術(shù)檢測。可在核苷酸結(jié)構(gòu)上做出各種不同的取代或者修飾，只要它們?nèi)匀豢梢詮暮怂嵘厢尫?，例如通過核酸外切酶的作用從核酸上釋放。例如，核糖或脫氧核糖部分可以被別的戊糖或者戊糖類似物取代。磷酸基團可被各種類似物取代。嘌呤和嘧啶堿基可以被取代或共價修飾。在涉及標記核苷酸的實施方案中，標記可以連接于核苷酸的任何部分，只要它不干擾核酸外切酶的處理。
“拉曼標記(Raman label)”可以是任何能夠產(chǎn)生可檢測的拉曼信號的有機或無機分子、原子、復(fù)合物或結(jié)構(gòu)，包括但不限于合成的分子、染料、天然生成的色素如藻紅蛋白、有機納米結(jié)構(gòu)如C60、巴基球(buckyball)和碳納米管，金屬納米結(jié)構(gòu)如金或銀納米顆?；蚣{米菱鏡(nanoprism)以及納米尺寸半導(dǎo)體如量子點。下面公開了拉曼標記的大量例子。技術(shù)人員將認識到，這些例子不是限制性的，“拉曼標記”包括本領(lǐng)域已知的可用拉曼光譜術(shù)檢測的任何有機或無機原子、分子、化合物或結(jié)構(gòu)。
納米顆粒 本發(fā)明的某些實施方案涉及使用納米顆粒，以增強從核苷酸獲得的拉曼信號。納米顆?？蔀殂y或金納米顆粒，盡管能夠提供表面增強拉曼光譜(SERS)、表面增強共振拉曼光譜(SERRS)和/或相干反相斯托克斯拉曼光譜(CARS)信號的所有納米顆粒均可使用。直徑介于1nm和2μm之間的納米顆?？杀皇褂??？蛇x地，可使用直徑介于2nm和1μm，5nm和500nm，10nm和200nm，20nm和100nm，30nm和80nm，40nm和70nm或者50nm和60nm之間的納米顆粒。平均直徑為10到50nm，50到100nm或約100nm的納米顆粒被預(yù)期用于某些應(yīng)用。納米顆粒的形狀可為近似球形，盡管任何形狀或者為不規(guī)則形狀的納米顆粒都可以被使用。制備納米顆粒的方法為已知的(例如，美國專利6,054,495；6,127,120；6,149,868；Lee和Meisel，J.Phys.Chem.863391-3395，1982)。也可以通過商業(yè)途徑獲得納米顆粒(例如，Nanoprobes Inc.，Yaphank，NY；Polysciences，Inc.，Warrington，PA；Ted-pellaInc.，Redding CA)。
在本發(fā)明的某些實施方案中，納米顆?？蔀榧{米顆粒的隨機聚集體(膠體納米顆粒(colloidal nanoparticle))。在其它實施方案中，納米顆?？杀唤宦?lián)以制得納米顆粒的特定聚集體，諸如二聚物，三聚物，四聚物或其它聚集體。用于SERS、SERRS和/或CARS檢測的“熱點(hot spot)”的形成可與納米顆粒的顆粒聚集體相關(guān)聯(lián)。某些可選的實施方案可以使用不同尺寸的聚集體的異質(zhì)混合物或者納米顆粒聚集體的均質(zhì)群體。包含選定數(shù)量的納米顆粒的聚集體(二聚物、三聚物等等)可以使用已知技術(shù)進行富集或純化，諸如在蔗糖溶液中超速離心。尺寸為100，200，300，400，500，600，700，800，900到1000nm或更大的納米顆粒聚集體是預(yù)期的。納米顆粒聚集體的尺寸可介于約100nm到約200nm之間。
交聯(lián)納米顆粒的方法是本領(lǐng)域已知的(參見，例如，F(xiàn)eldheim，“Assembly ofmetal nanoparticle arrays using molecular bridges，”The Electrochemical SocietyInterface，F(xiàn)all，2001，pp.22-25)。金納米顆粒與連接化合物(linker compound)的反應(yīng)是已知的，其中所述連接化合物具有末端硫醇或者巰基基團(Feldheim，2001)。單個連接化合物的兩端可用硫醇基團衍生化。與金納米顆粒反應(yīng)之后，該連接子可以形成納米顆粒二聚物，其被連接子的長度分開?？墒褂镁哂腥齻€、四個或者更多個硫醇基團的連接子以同時連接多個納米顆粒(Feldheim，2001)。使用相對于連接化合物為過量的納米顆粒，防止形成多重交聯(lián)和納米顆粒沉淀。銀納米顆粒的聚集體可以通過本領(lǐng)域已知的標準合成方法來形成。
可選地，使用的連接化合物可以包含單個反應(yīng)活性基團(single reactivegroup)，諸如硫醇基團。含有單個附著的連接化合物的納米顆?？梢宰晕揖奂啥畚?，例如，通過附著于兩個不同納米顆粒的連接化合物的非共價相互作用。例如，連接化合物可以包含烷烴硫醇(alkane thiols)。硫醇基團與金納米顆粒連接之后，烷烴基團將傾向于通過疏水作用相互聯(lián)系。在其它可選方案中，連接化合物可以在兩個末端包含不同的官能團。例如連接化合物可以在一個末端包含巰基以允許其連接于金納米顆粒，在另一個末端包含不同的反應(yīng)基團以允許其連接于其它連接化合物。許多這樣的反應(yīng)基團是本領(lǐng)域已知的并且可以應(yīng)用于本方法和設(shè)備。
金或銀納米顆粒可以包被有衍生化的硅烷，諸如氨基硅烷、3-環(huán)氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷(3-glycidoxypropyltrimethoxysilane(GOP))或氨基丙基三甲氧基硅烷(APTS)。硅烷末端的反應(yīng)基團可以用來形成納米顆粒的交聯(lián)聚集體。預(yù)期使用的連接化合物可以為幾乎任何長度，其范圍從約0.05、0.1、0.2、0.5、0.75、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、27、30、35、40、45、50、55、60、65、70、80、90到100nm或者甚至更長。長度不一的連接子可被使用。
在納米顆粒連接于連接化合物之前，其可被修飾以包含各種活性基團。修飾的納米顆?？梢酝ㄟ^商業(yè)途徑獲得，諸如來自Nanoprobes，Inc.(Yaphank，NY)的Nanogold納米顆粒。Nanogold納米顆粒可被獲得，每個納米顆粒上連接有單個或多個馬來酰亞胺、胺或者其它基團。Nanogold納米顆粒還可以以帶正電或者負電的形式被獲得，以使得在電場中對納米顆粒的操縱更加方便。這樣的修飾的納米顆?？梢员贿B接于各種已知的連接化合物，以提供納米顆粒的二聚體、三聚體或者其它聚集體。
使用的連接化合物的類型沒有限制，只要它導(dǎo)致產(chǎn)生不會在溶液中沉淀的納米顆粒小聚集體。連接基團(linker group)可以包括苯基乙炔聚合物(Feldheim，2001)?？蛇x地，連接基團可以包括聚四氟乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酰胺、聚乙烯或其它已知聚合物。使用的連接化合物并不局限于聚合物，也可以包括其它類型的分子，諸如硅烷、烷烴、衍生化的硅烷或者衍生化的烷烴。可使用化學(xué)結(jié)構(gòu)相對簡單的連接化合物，諸如烷烴或硅烷，以避免對核苷酸發(fā)射的拉曼信號的干擾。
在將納米顆粒裝填到納米通道或者微通道中的情形下，可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法操縱納米顆粒聚集體進入通道，所述方法諸如微流體學(xué)或者納米流體學(xué)(nanofluidic)、水力聚焦(hydrodynamic focusing)或電滲透(electro-osmosis)。可以使用帶電荷的連接化合物或者帶電荷的納米顆粒，從而便于通過利用電梯度(electrical gradient)將納米顆粒裝填進入通道。
通道、反應(yīng)室和集成芯片材料 反應(yīng)室、微流體通道、納米通道或微通道以及設(shè)備的其它組成部分可以作為單個部件被形成，例如以芯片(chip)的形式，正如在半導(dǎo)體芯片和/或微毛細管或微流體芯片中已知的情形。已知用于這樣的芯片的任何材料都可用在本公開的設(shè)備中，其包括硅、二氧化硅、氮化硅、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、塑料、玻璃、石英等等。設(shè)備的部分或者全部可以被選擇為，對于拉曼光譜術(shù)所使用的激發(fā)和發(fā)射頻率處的電磁輻射是可透過的，諸如玻璃、硅或者石英或者其它任何光學(xué)透明材料。對于可能暴露于核酸和/或核苷酸的充滿流體的部分(compartments)，諸如反應(yīng)室、微流體通道和納米通道或微通道，暴露于這些分子的表面可以通過涂覆來修飾，例如將表面從疏水性表面轉(zhuǎn)變成親水性表面以及/或者減少表面對分子的吸附。普通芯片材料諸如玻璃、硅和/或石英的表面修飾為本領(lǐng)域已知(例如，美國專利6,263,286)。這些修飾可以包括但不僅限于涂覆以可通過商業(yè)途徑獲得的毛細涂料(Supelco，Bellafonte，PA)、具有各種官能團諸如聚環(huán)氧乙烷或丙烯酰胺的硅烷，或者其它任何為本領(lǐng)域已知的涂料。
集成芯片制造 芯片的批制造技術(shù)是計算機芯片制造和/或微毛細管芯片制造領(lǐng)域已知的。這樣的芯片可以使用本領(lǐng)域已知的任何方法來制造，諸如通過光刻法(photolithography)和蝕刻法(etching)、激光消融法(laser ablation)、注塑(injectionmolding)、鑄造法(casting)、分子束外延(molecular beam epitaxy)、蘸水筆納米光刻術(shù)(dip-pen nanolithography)、化學(xué)蒸發(fā)沉積(chemical vapor deposition，CVD)制造、電子束或聚焦離子束技術(shù)(electron beam or focused ion beam technology)或壓印技術(shù)(imprinting techniques)。非限制性例子包括用可流動的、光學(xué)上透明的材料諸如塑料或玻璃進行的傳統(tǒng)的模塑；二氧化硅的光刻蝕和干刻蝕(dryetching)；電子束光刻(electron beam lithography)，其使用聚甲基丙烯酸甲酯抗蝕劑在二氧化硅襯底上進行鋁掩模構(gòu)圖，然后進行活性離子蝕刻(reactive ionetching)。根據(jù)Anderson等(″Fabrication of topologically complex three-dimensionalmicrofluidic systems in PDMS by rapid prototyping，″Anal.Chem 723158-3164，2000)，可以通過模塑聚二甲基硅氧烷(PDMS)制造微流體通道?？墒褂糜糜谥圃旒{米機電系統(tǒng)(nanoelectromechanical system)的方法。(參見，例如Craighead，Science 2901532-36，2000.)。微加工的芯片(microfabricated chip)是可通過商業(yè)途徑獲得的，其來源諸如Caliper Technologies Inc.(Mountain View，CA)和ACLARABioSciences Inc.(Mountain View，CA)。
微流體通道和微通道 從一個或多個核酸分子釋放的核苷酸可以沿微流體通道被移動然后進入通道，其可為納米通道或微通道。在某些實施方案中，微通道或納米通道的直徑可以介于約3nm和約1μm之間。該通道的直徑可以被選為稍小于激發(fā)激光束(excitatory laser beam)的尺寸。微流體通道和/或通道可包括微毛細管(可從例如ACLARA BioSciences Inc.，Mountain View，CA獲得)或者液體集成線路(liquidintegrated circuit)(例如，Caliper Technologies Inc.，Mountain View，CA)。這樣的微流體平臺僅僅需要納升體積的樣品。通過溶劑的整體流動(bulk flow)、電滲透或者本領(lǐng)域所知的其它任何技術(shù)，核苷酸可沿著微流體通道移動。
可選地，可利用微毛細管電泳來運輸核苷酸。微毛細管電泳一般涉及使用細的毛細管或通道，其可以充滿或者不充滿特定的分離介質(zhì)。帶有適當(dāng)電荷的分子物質(zhì)例如帶負電荷的核苷酸，響應(yīng)于施加的電場而發(fā)生電泳。盡管電泳通常是被用來將同時加進微毛細管的成分的混合物按大小分開，但它也可以被用來運送連續(xù)地從核酸分子釋放的尺寸相似的核苷酸。因為嘌呤核苷酸比嘧啶核苷酸大并且因此會更慢地遷移，所以可以將各個通道的長度以及相應(yīng)的通過檢測器的通行時間保持為最小，以防止有差異的遷移將從核酸上釋放的核苷酸的順序弄混?？蛇x地，填充微毛細管中的分離介質(zhì)可以被選擇，以便嘌呤和嘧啶核苷酸的遷移速率相似或相同。微毛細管電泳的方法已被公開，例如被Wolley和Mathies公開的(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9111348-352，1994)。
包括微毛細管電泳設(shè)備在內(nèi)的微流體設(shè)備的微細加工已經(jīng)被討論，例如Jacobsen等(Anal.Biochem，209278-283，1994)；Effenhauser等(Anal.Chem.662949-2953，1994)；Harrison等(Science 261895-897，1993)和美國專利5,904,824。一般地，這些方法包含在二氧化硅、硅或其它晶體基材或芯片上進行微米級通道的照相平版印刷蝕刻(photolithographic etching)，它們可以被容易地調(diào)整以在本公開的方法和設(shè)備中使用。直徑更小的通道，諸如納米通道，可以通過已知的方法制備，諸如涂覆微通道的內(nèi)壁以使直徑更窄，或者使用納米光刻術(shù)(nanolithography)、聚焦電子束、聚焦離子束或聚焦原子激光技術(shù)。為便于核苷酸的檢測，構(gòu)成納米通道或微通道的材料可以被選為可透過所使用的激發(fā)和發(fā)射頻率處的電磁輻射?？墒褂貌ＡА⒐韬驮诶庾V術(shù)所使用的頻率范圍內(nèi)為可透過的任何其它材料。納米通道或微通道可以由用于制造反應(yīng)室的相同材料來制造，其中使用注塑或者其它已知技術(shù)。
納米通道 納米通道的制造可利用本領(lǐng)域所知的任何納米級制造技術(shù)。下面的技術(shù)僅為示范性的。例如使用高通量電子束光刻系統(tǒng)(high-throughput electron-beamlithography system)，可制造出納米通道。電子束光刻可用來在硅芯片上寫出像5nm那么小的特征。靈敏性抗蝕劑諸如聚甲基丙烯酸甲酯被涂布于硅的表面，可以不使用掩模而形成圖案。電子束陣列可以與具有微通道放大器的場發(fā)射簇(fieldemitter cluster)結(jié)合，以增加電子束的穩(wěn)定性，允許在低電流下的操作。SoftMaskTM計算機控制系統(tǒng)可以被用來控制在硅或者其它芯片上的納米級特征的電子束光刻。
可選地，納米通道可以使用聚焦原子激光(focused atom laser)來制造。(例如，Bloch等，“Optics with an atom laser beam，”Phy.Rev.Lett.87123-321，2001.)。聚焦原子激光可以被用于光刻法(lithography)，這很像標準激光或者聚焦電子束。這樣的技術(shù)可以在芯片上制造出微米級或甚至納米級的結(jié)構(gòu)。蘸水筆納米光刻也可以被用來形成納米通道。(例如，Ivanisevic等，Dip-pen’Nanolithography onSemiconductor Surfaces，”J.Am.Chem.Soc.，1237887-7889，2001.)蘸水筆納米光刻使用原子力顯微術(shù)(atomic force microscopy)在表面諸如硅芯片上沉積分子。尺寸上像15nm那么小的特征都可以被形成，具有10nm的空間分辨率。使用蘸水筆納米光刻，結(jié)合常規(guī)的光刻(photolithography)技術(shù)，可形成納米級通道。例如，抗蝕劑層上的微米級的線可以用標準的光刻術(shù)來形成。使用蘸水筆納米光刻，可以通過在抗蝕劑的邊緣沉積額外的抗蝕劑化合物來使線的寬度(以及蝕刻之后通道的對應(yīng)直徑)變窄。蝕刻更窄的線之后，可形成納米級的通道。可選地，可用原子力顯微術(shù)移除光致抗蝕劑(photoresist)以形成納米級的特征。
離子束光刻可被用來在芯片上制造納米通道。(例如，Siegel，”Ion BeamLithography，”VLSI Electronics，Microstructure Science，Vol.16，Einspruch and Wattseds.，Academic Press，New York，1987.)精細聚焦的離子束可被用來直接在抗蝕劑層上寫出痕跡諸如納米通道而不使用掩模?？蛇x地，寬的離子束可以與掩模結(jié)合使用以形成小至100nm級別的痕跡?；瘜W(xué)蝕刻，例如氫氟酸蝕刻，可以用來移除未被抗蝕劑保護的暴露的硅。技術(shù)人員將會意識到上面公開的技術(shù)并不是限制，納米通道可以使用本領(lǐng)域所知的任何方法來形成。
反應(yīng)室 可以設(shè)計反應(yīng)室以在水環(huán)境中保持核酸分子和核酸外切酶。反應(yīng)室也可以具有核酸分子可以附著于其上的固定化表面。反應(yīng)室可以被設(shè)計為溫度可控的，例如通過結(jié)合佩爾帖元件(Pelletier element)或者已知其它方法。各種控制小體積液體的溫度的方法是本領(lǐng)域已知的。(參見，例如美國專利5,038,853、5,919,622、6,054,263和6,180,372)。反應(yīng)室可以具有約1、2、5、10、20、50、100、250、500或750皮升，約1、2、5、10、20、50、100、250、500或750納升，約1、2、5、10、20、50、100、250、500或750微升，或者約1毫升的內(nèi)容積。反應(yīng)室可以使用上文討論的已知芯片技術(shù)來制造。
核酸 要測序的核酸分子可以用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)制備。例如，核酸可以是天然生成的DNA或RNA分子。實際上，使用公開的方法，可以制備和測序任何天然生成的核酸，包括但不限于染色體DNA、線粒體DNA和葉綠體DNA，和核糖體RNA、轉(zhuǎn)運RNA、不均一核RNA或信使RNA。用于制備和分離各種形式的細胞內(nèi)核酸的方法是已知的。(見，例如，Guide to Molecular Cloning Techniques，eds.Berger and Kimmel，Academic Press，New York，NY，1987；Molecular CloningALaboratory Manual，2nd Ed.，eds.Sambrook，F(xiàn)ritsch and Maniatis，Cold Spring HarborPress，Cold Spring Harbor，NY，1989)。在所引用的參考文獻中公開的方法僅僅是示例性的，可以使用本領(lǐng)域已知的任何變通的方法。在對單鏈DNA(ssDNA)進行測序的情況下，可以采用任何已知方法，從雙鏈DNA(dsDNA)制備ssDNA。這些方法可以涉及加熱dsDNA和使鏈分離，或者可以替代地涉及通過已知的擴增或復(fù)制方法，從dsDNA制備ssDNA，例如克隆到M13中?？梢允褂萌魏芜@樣的已知方法制備ssDNA或ssRNA。
事實上，可用作外切核酸酶或等效試劑的底物的任何類型的核酸都可能被使用。例如，用各種擴增技術(shù)如聚合酶鏈式反應(yīng)(PCRTM)擴增制得的核酸可以被測序。(見美國專利4,683,195、4,683,202和4,800,159。)作為選擇，待測序的核酸可以用標準載體克隆，標準載體如質(zhì)粒、粘粒、BACs(細菌人工染色體)或YACs(酵母人工染色體)。(見，例如，Berger and Kimmel，1987；Sambrook et al.，1989。)核酸插入物可以從載體DNA中分離，例如，用合適的限制性內(nèi)切核酸酶切割，然后進行瓊脂糖凝膠電泳。插入核酸的分離方法是本領(lǐng)域已知的。
單個核酸分子的分離 待測序的核酸分子可以是ssDNA或ssRNA的單個分子?？梢允褂糜糜谶x擇和操作單個ssDNA或ssRNA分子的各種方法，如流體動力學(xué)聚焦(hydrodynamicfocusing)、微操縱器偶聯(lián)(micro-manipulator coupling)、光捕獲或這些方法的組合和類似的方法。(見，例如，Goodwin等，1996，Acc.Chem.Res.29607-619；美國專利4,962,037、5,405,747、5,776,674、6,136,543、6,225,068。) 可以應(yīng)用微流體學(xué)或超微流體學(xué)(nanofluidics)來分選和分離核酸分子?？梢赃\用流體動力學(xué)來操縱核酸的運動，使其進入微通道、微毛細管或微孔?？梢允褂昧黧w動力來移動核酸分子通過一個梳狀結(jié)構(gòu)，從而分離出單個核酸分子。一旦核酸分子被分離開，就可以使用流力聚焦將這些分子定位在反應(yīng)室內(nèi)。熱學(xué)或電學(xué)上的勢差、壓力或真空也都可用來提供操作核酸所需的驅(qū)動力。為了測序而對核酸進行的操作可以涉及到使用通道砌塊(channel block)設(shè)計，它整合了微構(gòu)造出的通道和一體化的膠質(zhì)材料，如在美國專利5,867,266和6,214,246中公開的。
含有核酸分子的樣品可以在偶聯(lián)到固定化表面之前被稀釋。固定化表面可以是磁性或非磁性珠子(bead)的形式，或是其他離散的結(jié)構(gòu)單元。經(jīng)過適當(dāng)?shù)南♂?，每個珠子將具有結(jié)合零個或一個核酸分子的統(tǒng)計概率。連接有一個核酸分子的珠子可以用例如熒光染料和流式細胞儀篩選或磁性篩選來鑒定。取決于珠子和核酸的相對大小和均一性，使用磁濾器和質(zhì)量分離法來分離含有單個結(jié)合核酸分子的珠子是可能的。作為選擇，連接到單個珠子或其他固定化表面的多個核酸可以被測序。
可以用有包被的纖維探頭(coated fiber tip)，產(chǎn)生用于測序的單個核酸分子(例如，美國專利6,225,068)?？梢灾苽浜锌股锼氐鞍谆蚱渌宦?lián)劑的單個分子的固定化表面。這樣的表面能夠連接將被測序的單個生物素化核酸分子。這個實施方式不限于抗生物素蛋白-生物素結(jié)合體系，而是可以適用于任何已知的偶聯(lián)體系。
在其它可選方案中，可以使用光捕獲來操縱用于測序的單個核酸分子。(例如，美國專利5,776,674)。示例性的光捕獲系統(tǒng)可以通過商業(yè)渠道從Cell Robotics，Inc.(Albuquerque，NM)、S+L GmbH(Heidelberg，Germany)和P.A.L.M Gmbh(Wolfratshausen，Germany)獲得。
固定化的方法 在本發(fā)明的多個實施方案中，要被測序的核酸分子可以被附著于固體表面(固定化)。核酸分子的固定化可以通過多種方法來實現(xiàn)，其涉及核酸分子和表面之間的非共價或共價連接。在示例性的實施方式中，固定化可以通過這樣的方法完成，即用鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白包覆表面，并進行生物素化核酸的連接(Holmstrom等，Anal.Biochem.209278-283，1993)。固定化亦可這樣實現(xiàn)，即用聚L-Lys(賴氨酸)或聚L-Lys，Phe(苯丙氨酸)包覆硅、玻璃或其他表面，接著用雙功能交聯(lián)劑共價連接氨基或巰基修飾的核酸(Running等，BioTechniques8276-277，1990；Newton等，Nucleic Acids Res.211155-62，1993)。通過使用用于交聯(lián)的氨基硅烷，可以將胺基殘基引入到表面上。
可以將5′-磷酸化核酸直接共價連接到化學(xué)修飾的表面，從而實現(xiàn)固定化(Rasmussen等，Anal.Biochem.198138-142，1991)。核酸與表面之間的共價鍵通過與水溶性碳二亞胺的縮合而形成。這種方法有助于核酸通過其5′-磷酸進行主要的5′-連接。
要將DNA結(jié)合到玻璃上，通常要先對玻璃表面進行硅烷化，然后用碳二亞胺或戊二醛活化?？蛇x擇的步驟可以使用的試劑例如3-環(huán)氧丙氧丙基三甲氧基硅烷(GOP)或氨丙基三甲氧基硅烷(APTS)，DNA通過整合到分子的3′或5′端的氨基連接子來聯(lián)接。使用紫外輻射可以將DNA直接結(jié)合到膜表面。核酸固定化技術(shù)的其他非限制性實例公開在美國專利5,610,287、5,776,674和6,225,068。
用于核酸固定化的表面的類型沒有限制。該固定化表面可以是磁珠、非磁性珠、平表面、尖銳的表面或者任何其它構(gòu)型的固體表面，它們可以包括幾乎任何材料，只要該材料足夠耐用和有足夠的惰性以允許核酸測序反應(yīng)發(fā)生?？杀皇褂玫谋砻娴姆窍拗菩缘睦影úＡА⒐枋?、硅酸鹽、PDMS、銀或其它金屬涂覆的表面、硝化纖維、尼龍，活化的石英、活化的玻璃、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺，其它聚合物，諸如聚氯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、或聚二甲基硅氧烷，以及光聚合物，其含有光活性物質(zhì)如氮賓、卡賓和能與核酸分子形成共價連接的羰自由基(參見美國專利申請5,405,766和5,986,076)。
雙功能交聯(lián)劑可以用來將核酸分子連接到表面?？梢愿鶕?jù)雙功能交聯(lián)劑的功能基團特異性，例如氨基、胍基、吲哚或羧基特異性基團來劃分它們。其中，涉及自由氨基基團的試劑是受歡迎的，因為它們可以通過商業(yè)途徑獲得、易于合成并且其可應(yīng)用的反應(yīng)條件溫和。用于交聯(lián)分子的示范性的方法在美國專利5,603,872和5,401,511中公開。交聯(lián)劑包括戊二醛(GAD)、雙功能環(huán)氧乙烷(OXR)、乙二醇二縮水甘油醚(EGDE)和碳二亞胺如1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(EDC)。
核酸合成聚合酶 在此公開的某些方法可以涉及將合成試劑例如DNA聚合酶結(jié)合到引物分子以及將拉曼標記核苷酸添加到該引物的3′末端。聚合酶的非限定性例子包括DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA依賴型RNA聚合酶。關(guān)于這些聚合酶在“校正”活性以及要求或不要求引物和啟動子序列方面的差別是本領(lǐng)域已知的。當(dāng)RNA聚合酶用作聚合酶時，要測序的模板分子可以是雙鏈DNA。聚合酶的非限定性例子包括海棲熱袍菌(Thermatoga maritima)DNA聚合酶、AmplitaqFSTMDNA聚合酶、TaquenaseTMDNA聚合酶、ThermoSequenaseTM、TaqDNA聚合酶、QbetaTM復(fù)制酶、T4 DNA聚合酶、嗜熱菌(Thermus thermophilus)DNA聚合酶、RNA依賴型RNA聚合酶和SP6 RNA聚合酶。
許多聚合酶可以通過商業(yè)途徑獲得，包括Pwo DNA聚合酶(BoehringerMannheim Biochemicals，Indianapolis，IN)；Bst聚合酶(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)；IsoThermTMDNA聚合酶(Epicentre Technologies，Madison，WI)；莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶，Pfu DNA聚合酶，禽成髓細胞瘤病毒逆轉(zhuǎn)錄酶，黃色棲熱菌(Thermus flavus(Tfl))DNA聚合酶和熱球菌(Thermococcus litoralis(Tli))DNA聚合酶(Promega Corp.，Madison，WI)；RAV2逆轉(zhuǎn)錄酶，HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶，T7 RNA聚合酶，T3 RNA聚合酶，SP6 RNA聚合酶，大腸桿菌(E.coli)RNA聚合酶，水生棲熱菌(Thermos aquaticus)DNA聚合酶，T7 DNA聚合酶+/-3′→5′外切核酸酶，DNA聚合酶I的Klenow片段，‘普遍存在’棲熱菌(Thermus′ubiquitous′)DNA聚合酶以及DNA聚合酶I(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)。可以使用具有模板依賴性的標記核苷酸聚合能力的本領(lǐng)域已知的任何聚合酶。(參見，例如，Goodman和Tippin，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.1(2)101-9，2000；美國專利6,090,589。)使用聚合酶從標記核苷酸合成核酸的方法是已知的(例如，美國專利4,962,037；5,405,747；6,136,543；6,210,896)。
引物 一般地，引物的長度在10到20個堿基之間，雖然可以使用更長的引物。引物可以被設(shè)計為，在序列上與模板核酸分子的已知部分互補?？梢允褂靡阎囊镄蛄?，例如，在引物被選擇用于鑒定與已知的恒定染色體序列鄰近的序列變體時，在將未知的核酸序列插入已知序列的載體時，或者在天然核酸已經(jīng)被部分測序時。任何序列的引物的合成方法是已知的。作為選擇，在不存在已知的引物結(jié)合位點的情況下，可以使用隨機引物，例如隨機六聚體或隨機寡聚體，以啟動核酸聚合。
核酸外切酶 核酸測序方法可以涉及核酸外切酶與核酸分子自由端結(jié)合和每次移除一個核苷酸。可使用的核酸外切酶的類型沒有限制?？梢允褂玫暮怂嵬馇忻傅姆窍拗菩缘睦影ù竽c桿菌(E.coli)外切核酸酶I、III、V或VII、Bal 31外切核酸酶、綠豆核酸酶、S1核酸酶、E.coli DNA聚合酶I全酶或Klenow片段、RecJ、外切核酸酶T、T4或T7 DNA聚合酶、Taq聚合酶、外切核酸酶T7基因6、蛇毒磷酸二酯酶、脾磷酸二酯酶、熱球菌(Thermococcus litoralis)DNA聚合酶、熱球菌屬(Pyrococcus sp.)GB-D DNA聚合酶、λ(lambda)外切核酸酶、金黃色葡萄球菌(S.aureus)微球菌核酸酶、脫氧核糖核酸酶I、核糖核酸酶A、T1微球菌核酸酶或本領(lǐng)域已知的其他外切核酸酶。外切核酸酶可以由商業(yè)來源獲得，如NewEngland Biolabs(Beverly，MA)、Amersham Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ)、Promega(Madison，WI)、Sigma Chemicals(St.Louis，MO)或Boehringer Mannheim(Indianapolis，IN)。
技術(shù)人員將會意識到，具有核酸外切酶活性的酶具有為本領(lǐng)域所知的各種性質(zhì)。核酸外切酶活性速率可以被控制以與檢測器進行的核苷酸分析的最佳速率相匹配。已知多種調(diào)整核酸外切酶活性速率的方法，包括調(diào)整反應(yīng)室中的溫度、壓力、pH、鹽濃度或二價陽離子濃度。核酸外切酶活性的優(yōu)化方法為本領(lǐng)域已知。
雖然通過外切核酸酶活性，核苷單磷酸一般會從核酸釋放，但是公開的方法并不限于游離核苷酸或核苷的任何特定形式的檢測，而是包括可以從核酸釋放的任何單體。在某些情況下，要被檢測的分子可以是嘌呤或者嘧啶堿基，其通過酸水解從核苷酸或核苷上被釋放出來，例如，如下面公開的。
拉曼標記 在此公開的某些方法可以涉及將標記連接到一個或多個核苷酸、核苷或者堿基，以有助于它們被拉曼檢測器檢測?？梢杂糜诶庾V術(shù)的標記的非限定性例子包括TRIT(四甲基羅丹明異硫醇)、NBD(7-硝基苯-2-氧雜-1，3-二唑)、德克薩斯紅染料、鄰苯二甲酸、對苯二甲酸、間苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚藍紫、亮甲酚藍、對氨基苯甲酸、藻紅、生物素、地高辛、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′二甲氧基熒光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯熒光素、5-羧基熒光素、5-羧基羅丹明、6-羧基羅丹明、6-羧基四甲基氨基酞菁、偶氮甲堿(azomethine)、花菁、黃嘌呤、琥珀酰熒光素以及氨基吖啶。這些以及其它拉曼標記可以從商業(yè)來源獲得(例如，Molecular Probes，Eugene，OR)。
多環(huán)芳香化合物通?？捎米骼鼧擞洠绫绢I(lǐng)域已知的。其它可以使用的標記包括氰化物、硫醇、氯、溴、甲基、磷和硫。碳納米管也可用作拉曼標記。標記在拉曼光譜術(shù)中的用法是已知的(例如美國專利5,306,403和6,174,677)。技術(shù)人員將會意識到，當(dāng)拉曼標記結(jié)合于不同類型的核苷酸時，其應(yīng)該產(chǎn)生可區(qū)分的拉曼光譜。
標記可以直接與核苷酸連接或者通過各種連接化合物與之連接?？蛇x地，與拉曼標記共價連接的核苷酸前體可以從標準商業(yè)來源得到(例如，RocheMolecular Biochemicals，Indianapolis，IN；Promega Corp.，Madison，WI；Ambion，Inc.，Austin，TX；Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)。含有被設(shè)計為可以與其它分子如核苷酸共價反應(yīng)的活性基團的拉曼標記是商業(yè)上可獲得的(例如，Molecular Probes，Eugene，OR)。制備標記的核苷酸以及將它們整合進核酸的方法是已知的(例如美國專利4,962,037；5,405,747；6,136,543；6,210,896)。
檢測單元(detection unit) 在此公開的示范性的設(shè)備可以包括檢測單元，其被設(shè)計為可以通過拉曼光譜術(shù)檢測和/或量化核苷酸、核苷、嘌呤和/或嘧啶。用拉曼光譜術(shù)檢測核苷酸的各種方法為本領(lǐng)域已知。(參見，例如美國專利5,306,403；6,002,471；6,174,677)。與通過其它的已知方法諸如熒光光譜術(shù)進行的鑒定相比，這些已知的方法一般涉及更高濃度的核苷酸的檢測。在本文的描述之前，單分子水平的核苷酸拉曼檢測沒有被公開過。表面增強拉曼光譜術(shù)(SERS)、表面增強共振拉曼光譜術(shù)(SERRS)和相干反斯托克斯拉曼光譜術(shù)(CARS)中的變化已經(jīng)被公開。在SERS和SERRS中，對于吸附于粗糙金屬表面諸如銀、金、鉑、銅或鋁表面的分子，拉曼檢測的靈敏度被增強的系數(shù)為106或更多。拉曼檢測單元的非限制性的例子在美國專利6,002,471中公開。
激發(fā)光束可以由釹:釔鋁石榴石(Nd:YAG)激光器產(chǎn)生，波長為532nm；或者由鈦:藍寶石(Ti:sapphire)激光器產(chǎn)生，波長為365nm?？梢允褂妹}沖激光束或連續(xù)激光束。激發(fā)光束可以經(jīng)過共聚焦光學(xué)元件和顯微物鏡，并且可以聚焦在含有填充的納米顆粒的納米通道或微通道上。來自核苷酸的拉曼發(fā)射光可以由顯微物鏡和共聚焦光學(xué)元件收集，然后連到單色儀上進行光譜分離。共聚焦光學(xué)元件用于降低背景信號，包括雙色濾片、二次濾片、共聚焦孔、透鏡和平面鏡。標準的全視場光學(xué)元件可以同共聚焦光學(xué)元件一起使用。拉曼發(fā)射信號可以由拉曼檢測器檢測，該檢測器包括與用于信號計數(shù)和數(shù)字化的計算機相連接的雪崩光電二極管。
檢測單元的可供選擇的例子被公開例如在美國專利5,306,403中，其包括Spex Model 1403雙柵分光光度計，并配有砷化鎵光電倍增管(RCA Model C31034或Burle Industries Model C3103402)，它以單光子計數(shù)模式運作。激發(fā)源可以包括來自SpectraPhysics的514.5nm線氬離子激光器，Model 166和氪離子激光器(Innova70，Coherent)的647.1nm線。
可選擇的激發(fā)源包括337nm的氮激光器(Laser Science Inc.)和325nm的氦-鎘激光器(Liconox)(美國專利6,174,677)。激發(fā)光束可以用帶通濾波器(Corion)進行光譜純化，并可以用6×物鏡(Newport，Model L6X)聚焦到納米通道和/或微通道?？梢杂梦镧R來激發(fā)核苷酸和收集拉曼信號，其中使用全息光束分離器(KaiserOptical Systems，Inc.，Model HB 647-26N18)，以產(chǎn)生激發(fā)光束和發(fā)射的拉曼信號的直角幾何關(guān)系?？梢允褂萌㈦A式濾波器(Kaiser Optical Systems，Inc.)來減少瑞利散射?？蛇x擇的拉曼檢測器包括ISA HR-320光譜攝制儀，其裝配有紅增強放大電荷耦合器件(RE-ICCD)檢測系統(tǒng)(Princeton Instruments)?？梢允褂闷渌愋偷臋z測器，如電荷注入器件、光電二極管陣列或光電晶體管陣列。
本領(lǐng)域已知的任何適當(dāng)形式或結(jié)構(gòu)的拉曼光譜術(shù)或相關(guān)技術(shù)都可以用來檢測核苷酸，包括但不限于常規(guī)拉曼散射、共振拉曼散射(resonance Ramanscattering)、表面增強拉曼散射(surface enhanced Raman scattering)、表面增強共振拉曼散射(surface enhanced resonance Raman scattering)、相干反斯托克斯拉曼光譜術(shù)(CARS)、受激拉曼散射術(shù)(stimulated Raman scattering)、反拉曼光譜術(shù)(inverseRaman spectroscopy)、受激增益拉曼光譜術(shù)(stimulated gain Raman spectroscopy)、超拉曼散射(hyper-Raman scattering)、分子光學(xué)激光檢測器(molecular optical laserexaminer，MOLE)或拉曼顯微探針(Raman microprobe)或拉曼顯微鏡(Ramanmicroscopy)或共聚焦拉曼微光譜測定法(confocal Raman microspectrometry)、三維或掃描拉曼(three-dimensional or scanning Raman)、拉曼飽和光譜術(shù)(Ramansaturation spectroscopy)、時間分辨共振拉曼(time resolved resonance Raman)、拉曼退耦光譜術(shù)(Raman decoupling spectroscopy)或紫外-拉曼顯微術(shù)(UV-Ramanmicroscopy)。
信息處理和控制系統(tǒng)以及數(shù)據(jù)分析 核酸測序設(shè)備可以包含信息處理系統(tǒng)。并不限制所使用的信息處理系統(tǒng)的類型。一個示例性的信息處理系統(tǒng)可以包含計算機，其包括用于信息交流的總線和用于信息處理的處理器。處理器可以選自Pentium系列處理器，包括但不限于PentiumII系列、PentiumIII系列和Pentium4系列處理器，它們可以從IntelCorp.(Santa Clara，CA)獲得?？蛇x地，處理器可以是Celeron、Itanium或PentiumXeon處理器(Intel Corp.，Santa Clara，CA)。處理器可以基于Intel結(jié)構(gòu)，如IntelIA-32或IntelIA-64結(jié)構(gòu)。作為選擇，可以使用其他處理器。
檢測單元可以在操作上連接到信息處理系統(tǒng)。來自檢測單元的數(shù)據(jù)可由處理器處理，然后數(shù)據(jù)儲存在存儲器中。關(guān)于標準核苷酸的發(fā)射譜圖的數(shù)據(jù)也可儲存在主存儲器或者ROM中。處理器可以比較來自納米通道或微通道中核苷酸的發(fā)射光譜以鑒定從核酸分子上釋放的核苷酸的類型。主存儲器也可以存儲從核酸分子釋放的核苷酸的順序。處理器可以分析來自檢測單元的數(shù)據(jù)以確定核酸的序列。當(dāng)只有嘌呤或者嘧啶被標記和/或檢測時，處理器可以比較從兩條互補核酸鏈得到的堿基序列以生成完整的核酸序列。
雖然在此描述的方法可在程控處理器的控制下進行，但這些方法可以完全或部分地由可編程的或硬編碼的邏輯來實施，例如現(xiàn)場可編程門陣列(FieldProgrammable Gate Array，F(xiàn)PGAs)、TTL邏輯或?qū)Ｓ眉呻娐?Application SpecificIntegrated Circuit，ASICs)。另外，可以通過程序控制的通用(general purpose)計算機組件和/或客戶硬件組件的任意組合來實施所公開的方法。
在數(shù)據(jù)收集操作之后，數(shù)據(jù)通常會被報告給數(shù)據(jù)分析操作。為了方便分析操作，由檢測單元獲得的數(shù)據(jù)通常是使用數(shù)字計算機來分析。計算機可以被恰當(dāng)?shù)鼐幊桃越邮芎痛鎯τ蓹z測單元獲得的數(shù)據(jù)，以及分析和報告收集到的數(shù)據(jù)。
可以使用客戶定制軟件包來分析由檢測單元獲得的數(shù)據(jù)。也可以使用信息處理系統(tǒng)及公開可利用的軟件包，進行數(shù)據(jù)分析?？捎糜贒NA序列分析的有用軟件的非限制性例子包括PRISMTMDNA測序分析軟件(Applied Biosystems，F(xiàn)osterCity，CA)、SequencherTM軟件包(Gene Codes，Ann Arbor，MI)和通過美國國家生物技術(shù)信息機構(gòu)(National Biotechnology Information Facility)獲得的各種軟件包。
實施例實施例1使用拉曼檢測和納米微粒進行的核酸測序 本發(fā)明的某些實施方案，例如圖1中的，涉及一個或多個單鏈核酸分子109的測序，核酸分子109可被附著于反應(yīng)室101中的固定化表面。反應(yīng)室101可以包含一個或多個核酸外切酶，其連續(xù)地從核酸分子109未附著的末端每次移除一個核苷酸110。
當(dāng)核苷酸110被釋放，它們可沿著微流體通道102移動并進入納米通道103或微通道103，經(jīng)過檢測單元。檢測單元可以包括激發(fā)源106，諸如激光器，其發(fā)射激發(fā)光束。激發(fā)光束可與釋放的核苷酸110相互作用，以致于電子被激發(fā)到較高能態(tài)。電子回到低能態(tài)所產(chǎn)生的拉曼發(fā)射光譜可以被拉曼光譜檢測器107檢測，拉曼光譜檢測器諸如分光光度計、單色儀或者電荷耦合器件(CCD)，諸如CCD相機。
可以安置激發(fā)源106和檢測器107，使得核苷酸110經(jīng)過納米通道103或微通道103中緊密裝填的納米顆粒111區(qū)域的時候被激發(fā)和檢測。納米顆粒111可被交聯(lián)以形成拉曼檢測的“熱點”。通過使核苷酸110經(jīng)過納米顆粒111熱點，拉曼檢測的靈敏度可增加多個數(shù)量級。
反應(yīng)室、微流體通道和微通道的制備 將Borofloat玻璃晶片(Precision Glass & Opitics，Santa Ana，CA)在濃HF(氫氟酸)中預(yù)蝕刻一小段時間，進行清洗，然后在等離子體增強化學(xué)氣相沉積(PECVD)系統(tǒng)(PEII-A，Technics West，San Jose，CA)中沉積無定形硅犧牲層。晶片可以用六甲基二硅氮烷(HMDS)涂底，然后用光刻膠(Shipley 1818，Marlborough，MA)旋涂并烘烤軟化。使用接觸掩模對準器(Quintel Corp.San Jose，CA)將光刻膠層暴露于一種或多種掩模圖案，然后將暴露的光刻膠用Microposit顯影劑濃縮物(Shipley)和水的混合物除去。顯影的晶片可以被烘烤硬化，然后在PECVD反應(yīng)器中用CF4(四氟化碳)除去暴露的無定形硅。可以用濃HF對晶片進行化學(xué)蝕刻以制造出反應(yīng)室101、微流體通道102和微通道103。剝?nèi)ナＳ嗟墓饪棠z，并除去無定形硅。
可以通過這個方案的變化來制成納米通道103?？梢允褂脴藴实墓饪谭▉硇纬杉尚酒奈⒚准壧卣鳌？蓪⒖刮g劑薄層涂覆于芯片上?？梢允褂迷恿︼@微術(shù)/掃描穿隧探針尖從芯片表面移除5到10nm寬的抗蝕劑條帶?？捎孟♂尩腍F對芯片進行短暫地蝕刻以在芯片表面形成納米級的凹槽。在非限制性的本實施例中，可以制備直徑介于500nm和1μm之間的通道103。
用金剛石打孔鉆頭(Crystalite，Westerville，OH)在蝕刻的晶片上鉆出接通孔(access holes)。在可程控的真空爐(Centurion VPM，J.M.Ney，Yucaipa，CA)中，將蝕刻和鉆孔的兩個互補平板相互熱結(jié)合，制得最終的芯片。整合了反應(yīng)室101、微流體通道102和納米通道103或微通道103的芯片的可選的示范性制造方法在美國專利5,867,266和6,214,246中公開。可在反應(yīng)室101和微流體通道102間插入分子量截留值為2,500道爾頓的尼龍濾件，以防止核酸外切酶和/或核酸109離開反應(yīng)室101。
納米顆粒的制備 可以根據(jù)Lee和Meisel(J.Phys.Chem.863391-3395，1982)，制備銀納米顆粒111。金納米顆粒111可從Polysciences，Inc.(Warrington，PA)、Nanoprobes，Inc.(Yaphank，NY)或者Ted-pella Inc.(Redding，CA)購買。在非限制性的例子中，可以使用60nm的金納米顆粒111。技術(shù)人員會意識到，也可使用其它尺寸的納米顆粒111，諸如5、10或20nm。
可將金納米顆粒111與烷烴二硫醇(alkane dithiols)反應(yīng)，鏈長范圍為5nm到50nm。連接化合物可在烷烴的兩端包含硫醇基團以便與金納米顆粒111反應(yīng)?？墒褂孟鄬τ谶B接化合物為過量的納米顆粒111，將連接化合物緩慢地加入納米顆粒111以避免形成大的納米顆粒聚集體。在室溫下溫育兩個小時以后，納米顆粒111聚集體可以通過在1M蔗糖中超離心，與單個的納米顆粒111分離。電子顯微術(shù)顯示，這種方法制備的聚集體中每個聚集體含有兩個到六個納米顆粒111。可以使用微流體流將聚集的納米顆粒111裝填到微通道103中?？稍谖⑼ǖ?03的末端使用阻塞物或濾器，以使納米顆粒聚集物111保持在適當(dāng)?shù)奈恢谩?br> 核酸的制備和核酸外切酶處理 可以根據(jù)Sambrook等(1989)的方法，純化人染色體DNA。在用Bam H1消化之后，可以將基因組DNA片段插入pBluescriptII噬粒載體(Stratagene，Inc.，La Jolla，CA)的多克隆位點，并在大腸桿菌(E.coli.)中生長?？梢栽阡伆逵诤邪逼S青霉素的瓊脂糖板上之后，選擇單個菌落，并使其生長，用于測序?？梢酝ㄟ^用輔助噬菌體進行共感染，援救基因組DNA插入物的單鏈DNA拷貝?？梢栽诘鞍酌窴:十二烷基硫酸鈉(SDS)的溶液中進行消化之后，對該DNA進行酚提取，并加入乙酸鈉(pH6.5，約0.3M)和0.8體積的2-丙醇使其沉淀?？梢詫⒑蠨NA的顆粒重新懸浮在Tris-EDTA緩沖液中，并在-20℃下存放待用。
與位置鄰接于基因組DNA插入物的已知pBluescript序列互補的M13正向引物可以從Midland Certified Reagent Company(Midland，TX)購得。這些引物可以被共價地修飾，以包含與寡核苷酸5′末端連接的生物素部分。可以通過(CH2)6間隔物，將生物素基團與引物的5′-磷酸共價地連接。可以將標記生物素的引物與由pBluescript載體制備的ssDNA模板分子雜交?？梢园凑誅orre等(Bioimaging5139-152，1997)的方法，將引物-模板復(fù)合體與包被有鏈霉抗生素蛋白的珠子連接。在合適的DNA稀釋下，單個引物-模板復(fù)合體與單個珠子連接?？梢詫⒑袉蝹€引物-模板復(fù)合體的珠子插入到測序設(shè)備100的反應(yīng)室101中。
可以將引物-模板與修飾型T7 DNA聚合酶(United States BiochemicalCorp.，Cleveland，OH)一起溫育。反應(yīng)混合物可以包含未標記的脫氧腺苷-5′-三磷酸(dATP)和脫氧鳥苷-5′-三磷酸(dGTP)、地高辛標記的脫氧尿苷-5′三磷酸(地高辛-dUTP)以及羅丹明標記的脫氧胞苷-5′-三磷酸(羅丹明-dCTP)?？梢允咕酆戏磻?yīng)在37℃下進行2小時。在合成地高辛和羅丹明標記的核酸之后，可以將模板鏈與標記的核酸分離，并將模板鏈、DNA聚合酶和未整合的核苷酸從反應(yīng)室101中洗掉?？蛇x地，所有的用于聚合的脫氧核苷三磷酸都可以是未標記的。在其它的可選方案中，可以不進行互補鏈的聚合而直接對單鏈核酸測序。
可以通過向反應(yīng)室101中添加核酸外切酶III來起始核酸外切酶活性。反應(yīng)混合物可以保持在pH8.0，37℃。當(dāng)核苷酸110從核酸的3′末端釋放時，它們可被微流體流沿著微流體通道102運輸。在微通道103的入口處，可用由一對電極104，105產(chǎn)生的電勢梯度驅(qū)使核苷酸110離開微流體通道102進入微通道103。當(dāng)核苷酸110通過裝填的納米顆粒111時，它們可以暴露于來自激光器106的激發(fā)輻射。拉曼發(fā)射光譜可被拉曼檢測器107檢測，如下面公開的。
核苷酸的拉曼檢測 可以使用如在實施例2中公開的拉曼檢測單元。拉曼檢測器107可具有檢測和鑒定單個核苷酸110的能力，所述核苷酸110為經(jīng)過檢測器107的dATP、dGTP、羅丹明-dCTP和地高辛-dUTP。檢測標記核苷酸的時間段內(nèi)的數(shù)據(jù)可被匯編和分析以得到該核酸的序列。在可選的實施方案中，檢測器107可具有檢測和鑒定單個未標記核苷酸的能力。
實施例2核苷酸的拉曼檢測方法和設(shè)備 在非限定性的例子中，拉曼檢測單元的激發(fā)光束由鈦:藍寶石激光器(Mira，Coherent)產(chǎn)生，波長為近紅外波長(750～950nm)，或由鎵鋁砷二極管激光器(PI-ECL系列，Process Instruments)產(chǎn)生，波長為785nm或830nm。使用脈沖激光束或連續(xù)光束。激發(fā)光束穿透通過分色鏡(Kaiser Optical的全息階式濾波器或Chroma或Omega Optical的雙色干涉濾光器)，與收集的光束成共線的幾何關(guān)系。發(fā)射的光束通過顯微鏡物鏡(Nikon LU系列)，被聚焦在放置有目標分析物(核苷酸或嘌呤或嘧啶堿基)的拉曼活性基質(zhì)。
來自分析物的拉曼散射光被同一顯微鏡物鏡收集，并通過分色鏡，到達拉曼檢測器。拉曼檢測器包括聚焦透鏡、攝譜儀和陣列檢測器。聚焦透鏡聚焦拉曼散射光，通過攝譜儀的入口狹縫。攝譜儀(Acton Research)包括光柵，光柵按波長分散光線。分散的光線成像在陣列檢測器(RoperScientific公司的背景照明深度耗盡CCD照相機)上。陣列檢測器與控制器電路相連，其與計算機連接，以傳輸數(shù)據(jù)和控制檢測器功能。
對于表面增強拉曼光譜術(shù)(SERS)，拉曼活性基質(zhì)由金屬納米顆?；虬灿薪饘俚募{米結(jié)構(gòu)組成。用Lee和Meisel(J.Phys.Chem.，863391，1982)的方法，制備銀納米顆粒，大小為5到200nm。可選地，將樣品放置在顯微鏡物件下面的鋁基質(zhì)上。下面討論的附圖是從鋁基質(zhì)上的靜止樣品收集的。檢測的分子的數(shù)量取決于被照射樣品的光學(xué)采集體積(optical collection volume)。
單個核苷酸也可通過SERS檢測，其中使用微流體通道。在本發(fā)明的各種實施方案中，核苷酸可以通過微流體通道(約5到200μm寬)被輸送到拉曼活性基質(zhì)。微流體通道可通過模塑聚二甲基硅氧烷(PDMS)來制造，其中使用Anderson等(”Fabrication of topologically complex three-dimensional microfluidic systems inPDMS by rapid prototyping，”Anal.Chem.723158-3164，2000)公開的技術(shù)。
在銀納米顆粒存在的情況下進行SERS時，核苷酸、嘌呤或嘧啶分析物與LiCl(最終濃度90μM)和納米顆粒(銀原子最終濃度0.25M)混合。使用室溫的分析物溶液來收集SERS數(shù)據(jù)。
結(jié)果 用SERS分析核苷單磷酸、嘌呤和嘧啶，其中使用上文公開的系統(tǒng)。表1顯示了各種感興趣的分析物的示范性的檢測限。
表1核苷單磷酸、嘌呤和嘧啶的SERS檢測
僅對腺嘌呤核苷酸優(yōu)化了條件。確定LiCl(最終濃度為90μM)，以提供腺嘌呤核苷酸的最佳SERS檢測。通過使用其它堿金屬鹵化物鹽例如NaCl、KCl、RbCl或CsCl，可能有助于其它核苷酸的檢測。要求保護的方法并不被所用的電解質(zhì)溶液限制，可以考慮使用其它類型的電解質(zhì)溶液，例如MgCl、CaCl、NaF、KBr、LiI等。技術(shù)人員將認識到，不顯示強拉曼信號的電解質(zhì)溶液將對核苷酸的SERS檢測提供最小的干擾。結(jié)果表明，上面公開的拉曼檢測系統(tǒng)和方法能夠檢測和鑒定單個分子的核苷酸和嘌呤堿基。這是在單個核苷酸水平上未標記核苷酸的拉曼檢測的首次報道。
實施例3核苷酸、嘌呤和嘧啶的拉曼發(fā)射光譜 使用實施例2中的方案獲得感興趣的各種分析物的拉曼發(fā)射光譜，其中的的修改被指出。圖2顯示了，在不存在表面增強并且無拉曼標記的情況下，四種核苷一磷酸中的每一種的100mM溶液的拉曼發(fā)射光譜。溶液中未添加LiCl。使用10秒鐘的數(shù)據(jù)采集時間。使用更長的采集時間，使用表面增強，使用標記的核苷酸和/或使用添加的電解質(zhì)溶液可以檢測更低濃度的核苷酸。激發(fā)發(fā)現(xiàn)在514nm。下面的每個圖都使用785nm的激發(fā)波長。如圖2所示，未經(jīng)增強的拉曼光譜顯示了四種未標記的核苷一磷酸中的每一種的特征發(fā)射峰。
圖3顯示在存在LiCl和銀納米顆粒的情況下，1nm鳥嘌呤溶液的SERS光譜。鳥嘌呤通過dGMP的酸處理獲得，如在Nucleic Acid Chemistry，Part 1，L.B.Townsend and R.S.Tipson(eds.)，Wiley-Interscience，New York，1978中討論的。使用100毫秒的數(shù)據(jù)采集時間來獲得SERS光譜。
圖4顯示10nM的胞嘧啶溶液的SERS光譜，其中胞嘧啶通過dCMP的酸水解獲得。使用1秒的采集時間來采集數(shù)據(jù)。
圖5顯示100nM的胸腺嘧啶溶液的SERS光譜，其中胸腺嘧啶通過酸水解dTMP獲得。使用100毫秒的采集時間采集數(shù)據(jù)。
圖6顯示100pM的腺嘌呤溶液的SERS光譜，其中腺嘌呤通過酸水解dAMP獲得。采集數(shù)據(jù)1秒種。
圖7顯示dATP(下面的跡線)和熒光素標記的dATP(上面的跡線)的500nM溶液的SERS光譜。dATP-熒光素購買自Roche Applied Science(Indianapolis，IN)。該圖顯示了由于使用熒光素標記而產(chǎn)生SERS信號的強烈增加。
實施例4核苷酸和擴增產(chǎn)物的SERS檢測銀納米顆粒的形成 根據(jù)Lee和Meisel(1982)的方法，產(chǎn)生用于SERS檢測的銀納米顆粒。將18毫克AgNO3溶解在100mL(毫升)的蒸餾水中，并加熱沸騰。用10min的時間，逐滴加入10mL的1％檸檬酸鈉溶液到AgNO3溶液中。維持溶液再沸騰一小時。將形成的銀膠體溶液冷卻并存放。
腺嘌呤的SERS檢測 拉曼檢測系統(tǒng)如實施例2所公開。用2mL蒸餾水稀釋1mL銀膠體溶液。在鋁盤上，將稀釋的銀膠體溶液(160μL)(微升)與20μL 10nM(納摩爾)的腺嘌呤溶液和40μL的LiCl(0.5摩爾)混合。LiCl作為腺嘌呤的拉曼增強劑。樣品中腺嘌呤的最終濃度是0.9nM，樣品的檢測體積為約100到150飛升，含有估計60個腺嘌呤分子。拉曼發(fā)射光譜的收集使用785nm處激發(fā)的激發(fā)源，收集時間為100毫秒。如圖8所示，這個過程說明了60個腺嘌呤分子的檢測，其中檢測到的強發(fā)射峰在大約833nm和877nm處。如實施例2所討論，已經(jīng)表明，使用所公開的方法和設(shè)備，檢測到腺嘌呤的單個分子。
滾環(huán)擴增 將1皮摩爾(pmol)的滾環(huán)擴增(RCA)引物加入到0.1pmol的環(huán)形單鏈M13DNA模板中。用1×T7聚合酶160緩沖液(20mM(毫摩爾)Tris-HCl、pH7.5、10mM MgCl2、1mM二硫蘇糖醇)、0.5mM dNTPs和2.5單位的T7DNA聚合酶，在37℃溫育該混合物2小時，形成RCA產(chǎn)物。通過混合和溫育不含DNA聚合酶的相同試劑，制備陰性對照(negative control)。
RCA產(chǎn)物的SERS檢測 將1μL的RCA產(chǎn)物和1μL的陰性對照樣品分別點到鋁盤上并進行空氣干燥。用5μL的1×PBS(磷酸鹽緩沖的鹽水)潤洗每個點。重復(fù)潤洗三次，最后的潤洗完畢后，對鋁盤進行空氣干燥。
將上述制備的1mL銀膠體溶液用2mL蒸餾水稀釋。將8微升的稀釋銀膠體溶液與2μL的0.5M LiCl混合，并加入到鋁盤上的RCA產(chǎn)物點上。將同樣的溶液加入到陰性對照物點上。按上述收集拉曼信號。如圖9所示，RCA產(chǎn)物是SERS可檢測的，其中發(fā)射峰在約833和877nm處。在此方案的條件下，用LiCl增強劑，腺嘌呤部分的信號強度強于鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的信號強度。陰性對照(未圖示)表明，拉曼信號對RCA產(chǎn)物是特異性的，因為在沒有擴增的情況下未觀察到信號。
實施例5核酸的外切核酸酶消化 按照Sauer等的方法(J.Biotech.86181-201，2001)，進行外切核酸酶處理。在5′端用生物素標記的單個核酸分子通過核酸模板的PCR擴增進行制備，其中使用5′-生物素化寡核苷酸引物。制備錐形的3μm單模式光學(xué)纖維(single-modeoptical fiber)(SMC-A0630B，Laser Components GmbH，Olching，Germany)。用HF對玻璃纖維進行化學(xué)蝕刻，形成鋒利的尖端。在涂覆3-巰基丙基三甲氧基硅烷后，用γ-馬來酰亞胺丁酸N-羥基琥珀酰胺(GMBS)處理尖端。用鏈霉抗生物素蛋白活化纖維尖端，其被允許與生物素化DNA結(jié)合。通過洗滌，除去未結(jié)合的DNA。
將包含單個分子的結(jié)合DNA的纖維插入與5μm微通道相連的PDMS反應(yīng)室。在反應(yīng)室中加入外切核酸酶I，以起始ssDNA的切割。通過使用光學(xué)捕獲，將外切核酸酶限制在反應(yīng)室(例如Walker等，F(xiàn)EBS Lett.45939-42，1999；Bennink等，Cytometry 36200-208，1999；Mehta等，Science 2831689-95，1999；Smith等，Am.J.Phys.6726-35，1999)。光學(xué)捕獲儀器可從Cell Robotics，Inc.(Albuquerque，NM)、S+L GmbH(Heidelberg，Germany)和P.A.L.M.Gmbh(Wolfratshausen，Germany)得到。核苷單磷酸由外切核酸酶消化釋放，并通過微流體流被運輸通過拉曼檢測器，如實施例2所公開。通過使用水力聚焦，將溶液中的核苷酸定焦在激光的激發(fā)和檢測體積中。將90μM濃度的LiCl加入到檢測混合物中，用銀納米顆粒填充鄰近檢測器的微流體通道，所述銀納米顆粒按照Lee和Meisel(1982)的方法制備。當(dāng)流過拉曼檢測器時，單個核苷酸被檢測，從而可以測定核酸序列。
根據(jù)本公開內(nèi)容，這里公開的和要求保護的所有方法和設(shè)備都可以被制造和使用，而無需過度的實驗。對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，明顯的是，在不偏離要求保護的主題的概念、精神和范圍的情況下，可以對這里所述的方法和設(shè)備進行改變。更具體地，明顯的是，化學(xué)及生理學(xué)上相關(guān)的某些試劑可以替代這里所述的試劑，而獲得相同的或相似的結(jié)果。所有這些類似的替代和修飾對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是明顯的，它們都被認為在所要求保護主題的精神、范圍和概念之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種方法，其包括a)從至少一個核酸分子的一個末端連續(xù)地移除核苷酸；b)移動所述核苷酸使其經(jīng)過裝填有納米顆粒的通道；c)通過拉曼光譜術(shù)鑒定一個或多個核苷酸；和d)表征該核酸。
2.權(quán)利要求1的方法，其中核苷酸是通過外切核酸酶活性從核酸上移除。
3.權(quán)利要求1的方法，進一步包含鑒別單個的核苷酸分子。
4.權(quán)利要求3的方法，其中核苷酸是未標記的。
5.權(quán)利要求3的方法，其中核苷酸是被標記的。
6.權(quán)利要求3的方法，進一步包括鑒定單個的腺苷核苷酸分子。
7.權(quán)利要求1的方法，其中僅僅鑒定腺苷和鳥苷核苷酸。
8.權(quán)利要求1的方法，其中僅僅鑒定胞苷和胸苷核苷酸。
9.權(quán)利要求1的方法，進一步包括從核苷酸上分離嘌呤或嘧啶堿基。
10.權(quán)利要求9的方法，其中使用拉曼光譜術(shù)鑒定被分離的嘌呤或嘧啶堿基。
11.權(quán)利要求1的方法，其中單個核酸分子被測序。
12.權(quán)利要求1的方法，其中核苷酸通過表面增強拉曼光譜術(shù)(SERS)、表面增強共振拉曼光譜術(shù)(SERRS)和/或相干反斯托克斯拉曼光譜術(shù)(CARS)來鑒定。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述通道為納米通道或微通道。
14.權(quán)利要求1的方法，進一步包括鑒定該核酸。
15.權(quán)利要求1的方法，進一步包括測序該核酸。
16.權(quán)利要求1的方法，進一步包括鑒定核酸分子中的單核苷酸多態(tài)性。
17.一種方法，其包括a)制備包含標記核苷酸的核酸；b)從該核酸的一個末端連續(xù)地移除核苷酸；c)移動所述核苷酸使其通過裝填有納米顆粒的通道；d)通過拉曼光譜術(shù)鑒定一個或多個核苷酸；和e)表征該核酸。
18.權(quán)利要求17的方法，其中各種類型的核苷酸用可區(qū)分的拉曼標記來標記。
19.權(quán)利要求18的方法，其中僅僅標記嘧啶核苷酸。
20.權(quán)利要求18的方法，其中僅僅標記嘌呤核苷酸。
21.權(quán)利要求17的方法，其中單個的核苷酸分子被鑒定。
22.權(quán)利要求17的方法，進一步包括鑒別單個的腺苷核苷酸分子。
23.權(quán)利要求17的方法，進一步包括從核酸上分離核苷酸。
24.權(quán)利要求23的方法，進一步包括施加電場以移動所述核苷酸通過通道。
25.權(quán)利要求12的方法，進一步包括記錄每個核苷酸通過所述通道的時間。
26.一種設(shè)備，其包括a)反應(yīng)室；b)第一通道，其與反應(yīng)室有流體交流；c)第二通道，其與第一通道有流體交流；d)裝填于第二通道中的多個納米顆粒；和e)拉曼檢測器，其可操作地連接于裝填有納米顆粒的通道。
27.權(quán)利要求26的設(shè)備，其中該設(shè)備能夠檢測單個的核苷酸分子。
28.權(quán)利要求26的設(shè)備，其進一步包括第一電極和第二電極，以將核苷酸從第一通道移動到第二通道。
29.權(quán)利要求20的設(shè)備，其中第一通道為微流體通道。
30.權(quán)利要求20的設(shè)備，其中第二通道為納米通道或者微通道。
全文摘要
在此公開的方法和設(shè)備涉及使用增強的拉曼光譜術(shù)進行的核酸表征。在本發(fā)明的某些實施方案中，對核酸的外切核酸酶處理導(dǎo)致核苷酸的釋放。核苷酸可以從反應(yīng)室通過微流體通道進入納米通道或微通道。納米通道或微通道可填充以納米微粒集合體，其包含拉曼檢測的熱點。當(dāng)核苷酸經(jīng)過納米顆粒熱點，它們可由拉曼光譜術(shù)檢測。從核酸釋放的核苷酸的順序的鑒定被用來表征核酸，例如測序或鑒定核酸。本發(fā)明的其它實施方案涉及核酸測序的設(shè)備。
文檔編號C07H19/00GK1878875SQ200480031168
公開日2006年12月13日 申請日期2004年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月26日
發(fā)明者X·蘇, S·陳 申請人:英特爾公司