專利名稱：：導(dǎo)致番茄高色素-1突變表型(hp-1和hp-1^w)的分離的核苷酸序列及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及導(dǎo)致番茄產(chǎn)生高色素p/gme/i^Z)和高色素-l"(/i/g/i/;/g挑^^r)表型的改變的核苷酸序列。更具體而言，本發(fā)明公開了擬南齊(爿m6/^/m:y)和人2XRB7(UV損傷的DNA結(jié)合蛋白l)基因的番茄同源物中的點(diǎn)突變，以及該改變的核苦酸序列的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：植物通過調(diào)整它們的稱為光形態(tài)發(fā)生的一系列相互作用中的發(fā)育過程對(duì)光強(qiáng)、方向、持續(xù)時(shí)間和光譜性質(zhì)作出反應(yīng)。已證實(shí)光形態(tài)發(fā)生突變體在光和植物發(fā)間的復(fù)雜相互作用研究方面是極好的工具，它們中的一些也已用在幾個(gè)農(nóng)作物育種計(jì)劃中。在包括擬南芥(4ra6/rfops/s)、高粱(5W^M柳)、蕓苔(5ram.cfl)、煙草、番癡和豌豆的多個(gè)物種中已報(bào)道了光形態(tài)發(fā)生突變體。通常，這些突變體可分為光受體缺陷或光信號(hào)傳導(dǎo)鏈某方面的改變(Chory，1993)。番茄(/jco/7ers/c^m^sof/^i似挑)中的幾種光形態(tài)發(fā)生突變體已經(jīng)有過描述。其中，攜帶單基因隱性似gA/7/g/W^^(，/r/;-廣，和—J)和深綠(&)突變的突變體的特征在于它們的過度光反應(yīng)。這些突變體與它們的半等基因(Semi-isogenic)野生型植株相比顯示出較高的花青素水平、較短的下胚軸和較強(qiáng)的果實(shí)色素沉積(Mochizuki和Kaiiiimura1984;Wann""/.1985)。在這些突變體中看到的增加的果實(shí)色素沉積歸結(jié)于成熟的紅色果實(shí)中類胡蘿卜素主要是番茄紅素水平的顯著增加以及類黃酮水平的顯著增加。由于它們對(duì)果實(shí)顏色的影響，/^和rfg突變滲入到幾種商業(yè)處理和現(xiàn)已作為L(zhǎng)ycopeneRichTomatoes(LRT)(Wann,1997)上市的新鮮市場(chǎng)(fresh-market)番茄栽培品種中。突變體最初于1917年在CampbellSoupCompany農(nóng)場(chǎng)(Riverton，NJ)(Reynard,1956)作為自發(fā)突變體被發(fā)現(xiàn)；/|/7-產(chǎn)突變體出現(xiàn)在經(jīng)甲磺酸乙酯(EMS)處理的基因型GT種子的栽培植林后代中(Peters""/.1989);突變體于l"5年報(bào)道在意大利SanMarzano品種中(Soressi1975);突變體發(fā)現(xiàn)于T-DNA轉(zhuǎn)化的植林后代中(Moneymaker栽培品種)(vanTuinenCa/.1997);dg突變體出現(xiàn)在Manapal品種格子狀栽培中(Konsler1973)。盡管開始時(shí)有些困惑，現(xiàn)在已經(jīng)清楚，在番茄基因組中存在兩個(gè)^P基因-HiW和好尸-2，分別定位于2號(hào)和1號(hào)染色體上(vanTuinen"a/.1997;Yen"1997)。(vanTuinenetal.1997;Yenetal.1997)。在每一上述基因位點(diǎn)，最初鑒定出兩個(gè)上文提到的突變體等位基因/^-7和/^-,，/*-2和/^-(Kerckhoff和Kendrick1997;VanTumen"a/.1997)。WO99/29866公開了基因的克隆和測(cè)序，該基因被發(fā)現(xiàn)編碼擬南芥核蛋白Z)J^2TO/^r五Z)/(Z^77)的番茄同源物。該文獻(xiàn)還公開了都位于iy尸-2的編碼序列的3，端的外顯子11內(nèi)的點(diǎn)突變和缺失突變，分別導(dǎo)致先前鑒定的/^-^'和/i/;-2突變體。對(duì)于》/7-2突變體，點(diǎn)突變指導(dǎo)內(nèi)含子10的選擇性剪接，導(dǎo)致外顯子11的9個(gè)堿基對(duì)的缺失。共有的WO03/57917公開了另一位于擬南芥基因的番茄同源基因中的點(diǎn)突變，其造成rfg突變，由此在及P-2位點(diǎn)包括第三突變體等位基因。本發(fā)明的目的是提供分離的核苷酸序列，該核苷酸序列包含造成番蒜植林A妙/7/g膨fl"(/^7-_/)和A妙/7&附^-,()光形態(tài)發(fā)生突變體的突變。本發(fā)明的另一目的是提供DNA標(biāo)記物，該標(biāo)記物可用作鑒定和選擇—-7和^-嚴(yán)突變體的分子診斷工具。本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供分子診斷工具，該分子診斷工具可用于番茄紅素增加雙重突變體生產(chǎn)中的基因型選擇。本發(fā)明其它的目的和優(yōu)點(diǎn)會(huì)隨著繼續(xù)說明而變得明顯。
發(fā)明內(nèi)容現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)造成和/^-2"突變體表型的突變位于人和擬南芥紫外線破壞的DNA結(jié)合蛋白1(UVDAMAGEDDNABINDINGProtein1，Z)Z)57)基因的番茄同源基因中。本發(fā)明主要涉及造成番茄和/t/^r表型的分離的核苷酸序列，其中每一所述序列包括改變的番茄基因序列或其片段或同源物。對(duì)于突變，在所述序列或片段或同源物中的改變包括Z)Z)^編碼序列的番茄同源物中單個(gè)A^到T短的堿基顛換。對(duì)于V-嚴(yán)突變，在所述序列或片段或同源物中的改變包括ZXO必J編碼序列的番茄同源物中單個(gè)G2392到A2392的轉(zhuǎn)換。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，編碼^-/突變的分離的核苷酸序列包括序列表中SEQIDNO:l定義的序列。要注意的是，所附序列表中包含的所有序列應(yīng)被認(rèn)為形成了本公開內(nèi)容的組成部分。在本發(fā)明另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，編碼/^-,突變的分離的核苷酸序列包括序列表中SEQIDNO:2定義的序列。可以理解的是，本發(fā)明還包括在其范圍內(nèi)的編碼和突變的上述定義序列的所有片段，其中所述片段包括包含突變核苷酸的D/)fi2基因序列區(qū)域，也就是說，對(duì)于突變?cè)搮^(qū)域包含核香酸931,對(duì)于突變?cè)搮^(qū)域包含核苷酸2392。本發(fā)明還涉及檢測(cè)在植物材料中的和(獨(dú)立地)/^-r7突變存在的方法。因此，這方面的一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種在植物中檢測(cè)/^-J突變存在的方法，包括從所述植物分離基因組DNA、通過使用PCR技術(shù)從所述基因組DNA擴(kuò)增含有/y7-J突變的基因片段和在所述基因組DNA中測(cè)定所述A/7-2突變存在的步驟。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種在植物中檢測(cè)/r/^"突變存在的方法，包括從所述植物分離基因組DNA、通過使用PCR技術(shù)從所述基因組DNA擴(kuò)增含有突變的基因片段和在所述基因組DNA中測(cè)定所述A/7-r突變存在的步驟。任何合適的技術(shù)可用于測(cè)定植物材料中和(獨(dú)立地)—-嚴(yán)突變的存在。但是，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述突變的存在使用焦磷酸測(cè)序(pyrosequencing)技術(shù)進(jìn)行測(cè)定，其中由該技術(shù)獲得的序列數(shù)據(jù)與SEQIDNO:1(對(duì)于Zip")和SEQIDNO:2(對(duì)于/i/7-r)定義的序列進(jìn)行比較。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，以上定義的測(cè)定/li7-J和(獨(dú)立地)/z/7-,突變的存在的方法應(yīng)用于從物種番癡(Z^a/^/"s/c0WescM/e/i似附)得到的材料。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，以上公開的測(cè)定/^-J和(獨(dú)立地)^-廣突變的存在的方法用作種子生產(chǎn)的質(zhì)量控制或后控制，用于檢測(cè)栽培品種和它們的母本品種中々等位基因的存在。這里使用的術(shù)語(yǔ)后控制是指在種子生產(chǎn)后的質(zhì)量控制檢驗(yàn)，用以確認(rèn)所述種子的預(yù)期基因型。另一方面，本發(fā)明還涉及在植林中測(cè)定兩種不同的光形態(tài)發(fā)生突變存在的方法，其中一種所述突變是/^pJ或突變，包括通過基因型或表型選擇手段檢測(cè)不同于A/7-7或突變的光形態(tài)發(fā)生突變的存在，以及通過以上公開的方法檢測(cè)Zi/;-7或/i/7-嚴(yán)突變的存在。本發(fā)明這方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，用于測(cè)定非/i/;-7、非—-尸光形態(tài)發(fā)生突變存在的表型選擇手段包括在溫控室中在對(duì)于波長(zhǎng)小于500nm光不通透的黃色塑料屏下，使獲得自要測(cè)定突變存在的植物的種子發(fā)芽，并選擇非黃化的幼苗。本發(fā)明還涉及制備具有基因型—-///^-/的Z^a/7ers/c賴"cm/^^m附雙重突變體品種的方法，其中表示任何隱性的遺傳上與/^刁突變不連鎖的光形態(tài)發(fā)生番茄紅素增加突變，該方法包括步驟a)將純合/^-J//1/^品種或植林與純合/^P品種或植林交叉雜交以產(chǎn)生雙重雜合戶/+F,植林；b)將步驟(a)獲得的F!植抹自交以產(chǎn)生F2種子；c)通過應(yīng)用權(quán)利要求7定義的方法和檢測(cè)p突變存在的方法鑒定雙重純合植林/^-J/Z^-Jd)將步驟(c)鑒定的雙重純合植林自交以產(chǎn)生F3種子，并使所述種子發(fā)芽。在本發(fā)明這方面一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變戶是&突變。這種情況下，所述方法的步驟(c)中對(duì)rfg突變存在的測(cè)定可使用在共有的、同時(shí)待決的申請(qǐng)PCT/IL03/00023中公開的用于*突變的標(biāo)記物來進(jìn)行。類似地，本發(fā)明還涉及制備具有基因型/^-rv/^-r/7//7的Z^copef^om"cw/ew似附雙重突變體品種的方法，其中/7表示任4可隱性的遺傳上與突變不連鎖的光形態(tài)發(fā)生番茄紅素增加突變，該方法包括步驟a)將純合/^-廣Mp-r1品種或植林與純合p//7品種或植林交叉雜交以產(chǎn)生雙重雜合/^-,/+p/+Ft植林；b)將步驟(a)獲得的R植林自交以產(chǎn)生F2種子；c)通過應(yīng)用權(quán)利要求7定義的方法和檢測(cè)p突變存在的方法鑒定雙重純合植抹/^-^T/Zip-F;^;d)將步驟(c)鑒定的雙重純合植林自交以產(chǎn)生F3種子，并使所述種子發(fā)芽。在本發(fā)明這方面一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變p是々突變。這種情況下，所述方法的步驟(c)中對(duì)rfg突變存在的測(cè)定可使用在共有的、同時(shí)待決的申請(qǐng)PCT/IL03/00023中公開的rfg突變標(biāo)記物來進(jìn)行。本發(fā)明在其范圍內(nèi)還包括由以上公開的方法制備的具有基因型/r/7-J//r/7-J和(獨(dú)立地)/jp-/w/A!/;-尸的物種Z^c。/;w'cow"C"fcrt故/M的雙重突變體雜種植林。通過其優(yōu)選實(shí)施方式的以下說明性和非限制性的實(shí)例，本發(fā)明以上的和其它的全部特征和優(yōu)點(diǎn)會(huì)得到進(jìn)一步的理解。附圖簡(jiǎn)述1用來設(shè)計(jì)用于突變的焦磷酸測(cè)序引物的基因組片段的核苷酸序列(單核苷酸多態(tài)性為加有下劃線的大粗體字母，正向和反向引物加有下劃線，測(cè)序引物以斜體表示)。圖2番茄DD^基因的部分定位結(jié)果(番茄2號(hào)染色體圖譜，顯示丑尸-7基因(hp)的位點(diǎn)，來自Yen""/.(1997))。圖3位點(diǎn)的/r/7-7突變的典型焦磷酸測(cè)序基因定型結(jié)果(由于測(cè)序引物的反向，突變體基因型的特征在于A，正?；蛐偷奶卣髟谟赥)。圖4D2)5J的部分ClustalW蛋白質(zhì)比對(duì)，顯示Zi/^(a)和(b)氨基酸替換的定位顯示的有擬南芥DDB1A(At—DDB1A-NP一192451，擬南芥DDB1B(At—DDB1B=NP一193842)，AilsaCraig番茄栽培品種(Le=AY452480)，大米(Os=BAB20761)，人(Hs=DDBl—Human)，果繩(Dm=XP_081186)，雞(Gg=BAC56999)和裂殖酵母(&po附&)(Sp=NP—外3580)。相同的殘基加有黑陰影，而類似的殘基加有灰陰影。圖5正常野生型番茄/XDB/基因的完整核苷酸編碼序列(起始點(diǎn)ATG和終點(diǎn)TAG密碼子加有下劃線。其顛換和轉(zhuǎn)換導(dǎo)致和表型的A短和G""位點(diǎn)分別為大粗體字母)。圖6正常野生型番茄DDfiJ基因的完整氨基酸序列(其替換導(dǎo)致和表型的天門冬酰胺311和谷氨酸798分別為大粗體字母)。實(shí)現(xiàn)發(fā)明的最佳方式如上所描述的，在其一方面，本發(fā)明提供了在植株中檢測(cè)/^-J和/^-產(chǎn)突變存在的方法。對(duì)于/^-J突變來說，該方法包括以下步驟分離出包括D/XBJ基因區(qū)域的基因組DNA片段，該基因區(qū)域包含造成/^-J表型的單核苷酸多態(tài)性(SNP)(在核苷酸931位點(diǎn))；克隆所述片段；對(duì)所述克隆片段測(cè)序并通過對(duì)測(cè)序的基因組片段931位點(diǎn)A/T顛換的檢測(cè)而測(cè)定突變的存在。在本發(fā)明所述方法的特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，對(duì)克隆片段的測(cè)序通過焦磷酸測(cè)序反應(yīng)實(shí)現(xiàn)。在焦磷酸測(cè)序反應(yīng)之前，包含SNP的基因組片段通過PCR技術(shù)擴(kuò)增，以下將描述其細(xì)節(jié)。在上文和下文使用的術(shù)語(yǔ)"PCR"(或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)指一類技術(shù)，它們基于熱穩(wěn)定性聚合酶的使用通過反復(fù)的聚合酶反應(yīng)實(shí)現(xiàn)特定DNA序列的擴(kuò)增(即增加拷貝數(shù))。該反應(yīng)可用于替代克隆所需的一切為核酸序列的信息。設(shè)計(jì)與感興趣序列互補(bǔ)的引物以進(jìn)行PCR。接著通過自動(dòng)DNA合成生成引物。在現(xiàn)有技術(shù)中PCR和其它的擴(kuò)增DNA和/或RNA的方法是公知的，基于這里提供的教導(dǎo)和指示它們可以用于本發(fā)明而無需過度的試驗(yàn)。幾種PCR方法(以及相關(guān)技術(shù))描述在例如美國(guó)專利4,683,195，4,683,202，4,800,159，4,965,188以及InnisW"/.所編的PCRProtocols:Aguidetomethodandapplications。以下提供實(shí)施例用于說明性目的以及為了更加詳細(xì)地解釋和描述本發(fā)明。但是本發(fā)明并不限于公開于這些實(shí)施例中的特定實(shí)施方式。實(shí)施例材料與方法植物材料和雜交來自正常的自由傳粉的番癡(Lycopersiconesculentum)AilsaCraig栽培品種(cv.)和/^-/突變的近等基因和純合品種的種子由美國(guó)紐約伊薩卡BoyceThompson植物研究所(BoyceThompsonInstituteforPlantResearch,Ithaca，NY,USA)的J.J.Giovannoni友好提供。來自突變(LA3004)純合的Rutgers栽培品種的種子以及來自/^-r7/^-r突變體植林和它們的GT背景方面(LALA4012和LA4011,分別地)的等基因(isogenic)正常植林的種子由美國(guó)加利福尼亞州戴維斯市加利福尼亞大學(xué)的番茄遺傳合作組織(TomatoGeneticsCooperative,UCDavis,CA，USA)的R.T.Chetelat提供?；蛐虶T為番茄繁殖系，對(duì)花葉病毒有抵抗力并在形態(tài)學(xué)上與起初從荷蘭的BleiswijkDeruiterzonen(Deruiterzonen，BIeiswijk，theNetherlands)獲得的Moneymaker栽培品種(Koornneef"fl/.1990)類似。/^-^7/^-尸突變體植林出現(xiàn)在經(jīng)EMS處理的基因型GT種子培育的植林的后代中(Peterset"1989)。因此，這些植林與正常GT基因型高度等基因。與/^^//i/^植林相比，突變體/^-rv/^-7w植林顯示更加極端的表型，并且清楚顯示A/7-7和/^-嚴(yán)為等位的(Peterset"fl/.1989)。加工(processing)/z/7-2/Zi/7-J突變體雜種，LRT89，兩種繁殖品系，L525和L527，以及正常的繁殖品系，N671，由VolcaniCenter已故的R.Frankel，D.Lapushner和I.Levin開發(fā)。來自以色列HazeraGeneticsInc.開發(fā)的兩種加工雜種HA3501和HA3502的種子由Mr.EzriPeleg.提供。雜合/|/^/+栽培品種cv.124的種子也由以色列HazeraGeneticsInc.提供。本研究中4吏用的幾種正常的+/+番茄栽培品種即Moneymaker,M82，Brigade,VF陽(yáng)36，189,Manapal，NC8288和Florida來自Volcanicenter的種子庫(kù)。DNA也從單個(gè)植株AB427,AB510和AB747提取，該三種/^-J/Zi/^加工雜種由以色列ABSeedsInc.開發(fā)。正常的AilsaCraig栽培品種植林與它們的近等基因Zi/7-J突變體植林雜交產(chǎn)生R種子。這些Ft植林自花授粉以產(chǎn)生F2種子。123F2幼苗的樣本用于本研究進(jìn)行的連鎖分析?；蚪MDNA提取和Southernblot雜交基因組DNA按照Fulton"fl/.(1995)的方法從單個(gè)植林提取。為了測(cè)定番茄基因組中/>1>5/基因的拷貝數(shù)，按照以下程序進(jìn)行Southernblot雜交從^cw/ew似/w(栽培品種M82)和1./7ert"e〃//二者提取的基因組DNA用I，Eco及V,Z)raI，好"eIII，SeaI和AfvflI限制性內(nèi)切酶消化。在1.0%瓊脂糖凝膠電泳和Southern轉(zhuǎn)移后，使DNA與p"標(biāo)記的包含i)2)^基因5'編碼序列1346堿基對(duì)的DNA探針雜交。Southernblot轉(zhuǎn)移和DNA雜交按照Levin和Smith(1990)進(jìn)行。PCR引物設(shè)計(jì)序列分析和位點(diǎn)特異性引物的設(shè)計(jì)采用DNAMAN,序列分析軟件4.1版(LyrnionBioSoft，Quebec,Canada)進(jìn)行。所用的全部DNA引物購(gòu)自以色列Ness-Ziona的M.B.CMolecularBiologyCenterLtd.。PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)用于作圖、克隆和擴(kuò)增DNA產(chǎn)物，用于直接測(cè)序和焦磷酸測(cè)序。對(duì)所有這些目的來說，擴(kuò)增反應(yīng)(25ml終體積)在10ng模板DNA，25mMTAPS(pH=9.3，250C)，50mMKC1，2mMMgCl2，ImMB-巰基乙醇，四種脫氧核苷三磷酸(dATP，dCTP，dGTP和dTTP)各0.2mM，兩種引物各10pmole和1單位的熱穩(wěn)定TaqDNA聚合酶(SuperNovaTaqpolymerase,MadiLtd.，RishonLeZion，Israel)下進(jìn)行。反應(yīng)在自動(dòng)溫度循環(huán)器(MJResearchInc.，Watertown,MA，USA)中進(jìn)行。為了作圖和直接測(cè)序，起始溫浴941C3分鐘，接著是35個(gè)循環(huán)的941C30秒鐘變性，58"C30秒鐘退火，72*C由PCR產(chǎn)物大小決定的l-2分鐘的聚合反應(yīng)。完成上述循環(huán)后，最后的聚合反應(yīng)在72"C進(jìn)行5分鐘。通過在1.0%瓊脂糖凝膠中電泳可觀察到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，并通過溴化乙錠染色進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)焦磷酸測(cè)序反應(yīng)前的PCR擴(kuò)增，起始溫浴94匸2分鐘，接著是35個(gè)循環(huán)的94"C30秒鐘變性，57t:30秒鐘退火，72X:20秒鐘的聚合反應(yīng)。完成上述循環(huán)后，最后的聚合反應(yīng)在72TC進(jìn)行5分鐘。Z)腦基因定位基因定位通過Z^co/7g/^/cow/^/me〃//漸滲品系(introgressionlines)進(jìn)行(Eshed"a/.1992)。從包括它們的原始母本品種(lines)M82和丄.i^wwe////的各個(gè)漸滲品種的單個(gè)植林中提取的DNA用作PCR反應(yīng)的模板。用于這些定位反應(yīng)的引物為mTDDBF和mTDDBR(表1)。這些引物來源于InstituteofGenomicResearch(TIGR)數(shù)據(jù)庫(kù)登記號(hào)(accession)TC117372(http:〃www.tigr.org/)，發(fā)現(xiàn)它們與A.thaliana基因的兩個(gè)拷貝高度同源。為了獲得M82和L/^wie////間的多態(tài)性，PCR反應(yīng)后的PCR產(chǎn)物用尸WI內(nèi)切酶消化。對(duì)來自和突變體植林的番茄/)/)必JcDNA的克隆和測(cè)序從25mg的單獨(dú)的和A/7-尸突變體幼苗以及它們的近等基因自由授粉野生型基因型(分別為AilsaCraig和GT)的葉片組織提取總RNA。RNA提取采用TRIzol試劑系統(tǒng)(GibcoBRLLifeTechnologies,Gaithersburg,MD，USA)進(jìn)行?？俁NA用作第一鏈cDNA合成的模板，采用Superscript前擴(kuò)增系統(tǒng)(GibcoBRLLifeTechnologies,Paisley,UK)。制備的cDNA用作PCR反應(yīng)的模板，從突變體和正常遺傳accessions二者中擴(kuò)增編碼番茄/)/)^的基因的重疊片段。隨后直接地對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序，或按照廠家建議(Promega，Madison,WI，USA)在使用pGEM-TEasyVectorSystems將PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)pGEM-TEasyVector后再對(duì)其測(cè)序。在克隆進(jìn)pGEM-TEasyVector后，基于載體T7、SP6和番茄DDBJ基因的互補(bǔ)引物對(duì)每個(gè)重疊擴(kuò)增片段的四或五個(gè)獨(dú)立克隆測(cè)序。當(dāng)采用直接測(cè)序時(shí)，對(duì)代表與番茄D"B7基因互補(bǔ)的每一引物組合的至少兩種PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序采用ABIPRISM377自動(dòng)DNA測(cè)序儀(AppliedBiosystems,FosterCity，CA，USA)進(jìn)行。番茄D/XB/基因3'區(qū)采用與TIGR數(shù)據(jù)庫(kù)登記號(hào)TC117372互補(bǔ)的引物(http:〃www.tigr.org/)擴(kuò)增的重疊片段直接測(cè)序，該TIGR數(shù)據(jù)庫(kù)登記號(hào)TC117372與A.thalianaDD57基因的兩個(gè)拷貝高度同源。這些引物列于以下表l中表l正向(F)和反向(R)引物，與TIGR數(shù)據(jù)庫(kù)登記號(hào)TC117372互補(bǔ)，用于番茄/>/>^基因3'區(qū)測(cè)序。引物名稱引物序列序列表參考號(hào)5TDDBF51'-ACGACCTATCGTGGACTTCTGT-.3,SEQIDNO:35TDDBR5''-CTGGACTTGAGAATTGAAGCCT-SEQIDNO:4工ri5TDDBF51'-GAGCCTATAAGGATGGATCAC-3''SEQIDNO:5ATDDBF5'-CAGCAGTTGGAATGTGGACAG-3'SEQ工DNO:mTDDBF5'-GCAATCGCTAAAGAAGGTGAGT-31SEQIDNO:7mTDDBR5'-GCATTATAGTCTCTGGCTCGCT-3,SEQIDNO:8i麗TDDBF5,-GGACATTTGCTCTATGCAGT-3'SEQIDNO'-9inmTDDBR5'-AGGCATTTAGAGAGTAGACAGC-31SEQ工DNO:10TDDBF5,-TTTGGAGAAGCTGCAGACAA-3'SEQIDNO:11TDDBR5'-CACAACCTCACAGAAGAAGAAG-3,SEQIDNO.-12In3TpDBR5'-CCACTCTCTTCATTAGTTCCTC-3'SEQIDNO:13DDB1基因5'區(qū)起初從pBluescriptSK(+/-)phagemidcDNA文庫(kù)利用以下引物克隆T7=5,-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3'(SEQIDNO:14)以及5'TDDB—R=5'-CTGGACTTGAGAATTGAAGCCT-3'。由以色列VolcaniCenter的R.Barg和Y.Salts友好提供的該cDNA文庫(kù)是從直徑4-6mm的幼小單性果實(shí)(ca.開花后4-8天)制備的，該單性果實(shí)來源于兼性單性生殖有限花序品種(facultativeparthenocarpicdeterminateline)L-179(/mf-2^;fl"2)。該品種以前曾描述過(Barget"a/.1990)。該文庫(kù)按照廠家指導(dǎo)用StratagenInc.的cDNASynthesisKit#200400、Zap-cDNASynthesisKit#200401和ZapcDNAGigapackIIIGoldCloningKit#200450制備。來自和—rv/i/^w突變體品種以及它們的相應(yīng)近等基因(nearlyisogenic)正常品種的番茄DDB1基因5'區(qū)采用上述的引物(5'TDDB—R)和引物TDB一UTR=5'-atagcgggaagagggaagatac-3((SEQIDNO:15)，其互補(bǔ)于番茄DZXB7基因的5'UTR。幾種與以上片段互補(bǔ)的重疊引物例如那些用于焦磷酸測(cè)序基因定型的(參見下文)用于番茄DDB1基因5'編碼序列的序列驗(yàn)證。連鎖分析采用突變體植林和野生型植林(AilsaCraig栽培品種)間雜交的F2種子進(jìn)行番茄Z)DjB7位點(diǎn)和以過度的光形態(tài)發(fā)生去黃化反應(yīng)為特征的—-2突變體間的連鎖分析。在環(huán)境控制生長(zhǎng)室(白天25TC/晚上18"C)中，使這些種子在防止波長(zhǎng)小于500nm光穿透的黃色塑料屏下(Mochizuki和Kamimura1984)發(fā)芽。這些發(fā)芽和起初的生長(zhǎng)條件導(dǎo)致突變體和正常植株間下胚軸長(zhǎng)度的巨大差異(Mochizuki和Kamimura1984)。各個(gè)F2幼苗的下胚軸長(zhǎng)度在播種后8天測(cè)量，它們的基因型采用這里公開和描述的基于焦磷酸測(cè)序的DNA標(biāo)記物來測(cè)定。焦磷酸測(cè)序基因定型開發(fā)出基于上述的突變體品種和它的AilsaCraig背景近等基因正常品種間的單核苷酸多態(tài)性(SNP)的焦磷酸測(cè)序基因定型(genotyping)系統(tǒng)。為此，對(duì)包含該SNP的基因組片段進(jìn)行克隆和測(cè)序，如圖1所示。用于該反應(yīng)的生物素標(biāo)記的正向引物為5'-tgttttccagagttaccggact-3'(SEQIDNO:16);反向引物為s'-tagcttgagccaatgaagacaa-3'(SEQIDNO:17);測(cè)序引物為51-atgaagacaaaagcat-3((SEQIDNO:18)。該反應(yīng)中擴(kuò)增子(amplicon)的大小為106bp。焦磷酸測(cè)序反應(yīng)之前的PCR擴(kuò)增反應(yīng)如同以上所描述的(見PCR反應(yīng))。2pmole的測(cè)序引物在焦磷酸測(cè)序分析前添加到擴(kuò)增反應(yīng)中。采用MegaBASE1000儀器(DanyelBiotech,NesZiona，Israel)進(jìn)行分析。因?yàn)闇y(cè)序引物為反向的，所以正常的基因型的特征在于在SNP位點(diǎn)為T，而純合突變體/i/7^基因型的為A，如圖3所示。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析通過JMPStatisticalDiscoverysoftware(SASInstitute,Cary,NC，USA)進(jìn)行方差分析(ANOVA)。通過QGENEsoftwareVersion3.06d(Nelson1997)進(jìn)行連鎖分析和LOD值測(cè)定。采用Clustal方法(Higgins和Sharp1988)進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)。實(shí)施例1鑒定和克隆DDB1番茄同源物DDBl蛋白質(zhì)是由兩個(gè)亞基DDBl和DDB2構(gòu)i的異二聚體。與大米、雞、人、小鼠、果蠅()和裂殖酵母(5"c始05Yia^"ro附y(tǒng)cey)不同，AA"/zVmfl基因組具有兩份高度同源的Z>/)^/基因拷貝(Schroedereffl/.2002;Zolezzief/.2002;Fue,fl/.2003;Ishibashief/2003):DDB1A和DDB1B，二者長(zhǎng)度1088氨基酸(Genbank蛋白質(zhì)登記號(hào)分別為NP一192451和NP_193842)。當(dāng)將這兩個(gè)蛋白質(zhì)登記號(hào)的每個(gè)用作在包含番茄表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)的TIGR數(shù)據(jù)庫(kù)(http:〃www.tigr.org/)中的tblastn分析查詢?cè)~時(shí)，二者都揭示了兩高度同源的序列TC117371(394bp)和TC117372(2206bp)。A,/^//fl朋登記號(hào)NP—192451被發(fā)現(xiàn)與番癡TC117371和TC117372登記號(hào)分別有87和86%的同一性。另一方面，登記號(hào)NP_193842與番茄TC117371和TC117372登記號(hào)分別有87和83%的同一性。基于起初的較長(zhǎng)的TIGR登記號(hào)TC117372和后來的我們從cDNA文庫(kù)克隆的單基因的仔細(xì)序列分析，使得我們清楚番茄TIGR登記號(hào)TC117371和TC117372都互補(bǔ)于相同的基因序列。另外，以DDBJ基因序列作為探針的番茄基因組DNASouthern-blot轉(zhuǎn)移和雜交揭示出實(shí)際上番茄基因組包含DD^7基因的單個(gè)拷貝(未提供數(shù)據(jù))。實(shí)施例2番癡D"^基因的定位部分定位結(jié)果，包括番茄"i)^基因的大致定位位點(diǎn)，示于圖2。這些結(jié)果表明位于具有基因的漸滲品種中的番茄2號(hào)染色體(Yen"fl/.1997)。實(shí)施例3/^-J和/tjp-7"突變體中番癡DD必7的序列表征采用互補(bǔ)于番茄D1XB7基因(TIGR登記號(hào)TC117372)3，區(qū)域的幾種正向和反向引物(表l)，以對(duì)制備自AilsaCraig背景的/y-J和正常植林的幼苗葉片的cDNA進(jìn)行直接測(cè)序。在該區(qū)域沒有獲得和正常植林間的多態(tài)性。由此對(duì)兩基因型中的/XD5/基因的5，區(qū)域也進(jìn)行克隆和全序列測(cè)序。計(jì)算機(jī)處理的所有序列翻譯結(jié)果顯示番茄DDB1是1090氨基酸的蛋白質(zhì)。來自/1/;-J和它的近等基因正?；蛐偷腪XDB7編碼序列的序列分析揭示出在突變體植林/)/)必J基因編碼序列中存在單個(gè)A931到T931的堿基顛換。該顛換導(dǎo)致保守的天冬酰胺311到酪氨酸311的替換(圖4)。基于在AilsaCraig背景中獲得的序列信息，我們還對(duì)突變體植林和它的GT背景中近等基因正常對(duì)應(yīng)植林中的DP^基因的全部編碼區(qū)進(jìn)行了序列分析。由于與/1/;-J等位，~-尸突變體Z)"W基因的編碼序列中的大突變(majormutation)將有力地支持這樣的設(shè)想，即番茄DD^基因?qū)е?^"和/i/7-廣突變體表型。事實(shí)上，已在—-廣突變體植林的DDBJ編碼序列中觀察到單個(gè)G2392到A2392的轉(zhuǎn)換，其引起保守的谷氨酸798到賴氨酸798的替換(圖4)。正常野生型番茄PD丑7基因完整的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列分別示于圖5和圖6。實(shí)施例4品種和栽培品種的基因定型通過直接測(cè)序和焦磷酸測(cè)序方法的結(jié)合對(duì)多種來源的19個(gè)品種(lines)或栽培品種進(jìn)行基因定型(圖3)。其中包括單雜合的/1/7-7/+，10個(gè)和8個(gè)正常的+Z+accessions。已發(fā)現(xiàn)在JW)^基因中鑒定的SNP和已知的植林HP-1位點(diǎn)的基因型完全相符(結(jié)果未示出)。實(shí)施例5分析位點(diǎn)和光形態(tài)發(fā)生反應(yīng)間的連鎖進(jìn)行連鎖分析研究以測(cè)試DZ)B2位點(diǎn)和突變體幼苗(即抑制下胚軸伸長(zhǎng)表型)顯示出的特征性過敏光形態(tài)發(fā)生反應(yīng)間的聯(lián)系。為此，在調(diào)控生長(zhǎng)室中黃色塑料屏下使有限的(determinate)/i/7-J突變體植林和野生型植林(AilsaCraig栽培品種)間雜交的F2種子發(fā)芽。播種8天后，記錄單個(gè)幼苗的下胚軸長(zhǎng)度，并如上所述在焦磷酸測(cè)序DNA標(biāo)記物的協(xié)助下對(duì)它們的D2XBJ位點(diǎn)進(jìn)行基因定型。結(jié)果證實(shí)了/)Z)B7位點(diǎn)(locus)和下胚軸長(zhǎng)度間的明顯相關(guān)性，如以下表2所示表2番茄DDBl位點(diǎn)和hp-l突變體幼苗顯示出的光形態(tài)發(fā)生反應(yīng)間的連鎖分析。幼苗播種后在黃色塑料屏下生長(zhǎng)8天。不同的上標(biāo)字母表示依Tukey-KramerHSD測(cè)試(Kramer1956)的均值間統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P〈0.05)。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>與其它兩種基因型群體相比，純合隱性/^-7M/7-7幼苗顯示高度顯著的下胚軸伸長(zhǎng)抑制，表現(xiàn)出更加過度的光形態(tài)發(fā)生去黃化反應(yīng)(25<LOD值<26，R2=62.8%)。這些結(jié)果證實(shí)/i/^突變體植林位點(diǎn)中鑒定的突變與其主要特征性表型之一即幼苗中抑制的下胚軸伸長(zhǎng)相關(guān)。有趣地是，這項(xiàng)研究中獲得了A，/等位基因的輕微的部分顯性效果。該效果可從+/+和/^7-//+群體均值間統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異了解到(表2)。說明和描述本發(fā)明各種實(shí)施方式的進(jìn)一步非限制性實(shí)施例(可行的和理論上的)在以下部分給出。對(duì)這些實(shí)施方式進(jìn)行描述僅出于說明性目的，并非企圖以任何方式限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例6鑒定一-J和/iff-r突變的診斷工具由Ronaghi2001詳盡評(píng)述的焦磷酸測(cè)序DNA標(biāo)記物系統(tǒng)被開發(fā)用作分子診斷工具以基于測(cè)序結(jié)果(圖1)鑒定/^p"突變體植林。該DNA標(biāo)記物是基于這項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)的—J//^7突變體品種和它的AilsaCraig背景栽培品種近等基因正常品種間的單核苷酸多態(tài)性(SNP)。為此，對(duì)包含該SNP的基因組片段克隆和測(cè)序?；蚪M片段的序列示于圖1用于該反應(yīng)的生物素標(biāo)記正向引物為5'-tgttttccagagttaccggact-3'(SEQIDNO:16);反向引物為5'-TAGCTTGAGCCAATGAAGACAA-3'(SEQIDNO:17);效寸序引物為5'-ATGAAGACAAAAGCAT-3'(SEQIDNO:18)。該反應(yīng)的擴(kuò)增子大小為106bp。焦磷酸測(cè)序反應(yīng)之前的PCR擴(kuò)增反應(yīng)如同以上所描述的(見PCR反應(yīng))。2pmole的測(cè)序引物在焦磷酸測(cè)序分析前添加到擴(kuò)增反應(yīng)中。采用以色列NesZicma的DanyelBiotech公司的MegaBASE1000儀器進(jìn)行分析。因?yàn)闇y(cè)序引物為反向的，所以正常的基因型的特征在于在SNP位點(diǎn)為T，而純合突變體hp-l基因型的為A，如圖3所示。利用焦磷酸測(cè)序方法和上述的引物，可看到^p-J和野生型植林間明顯的多態(tài)性，如圖3所證實(shí)的。對(duì)于純合/i/7-J突變體植林，在SNP位點(diǎn)觀察到代表腺噤呤(A)的單峰，而在野生型植林中在SNP位點(diǎn)上觀察到代表胸腺嘧啶(T)的單峰(圖3)。正如所料，—-7突變雜合植林產(chǎn)生雙峰，代表A和T兩種核苦酸(圖3)?；谠?f/-尸突變體植林中觀察到的SNP,類似的基于焦磷酸測(cè)序的標(biāo)記物系統(tǒng)已經(jīng)建立。實(shí)施例7將兩種遺傳上不連鎖的番茄紅素增加突變并入單個(gè)番茄雜種試驗(yàn)方迭育種人員的一種通常做法是將兩種或多種積極影響相同特征的突變結(jié)合或合并。這種方法可通過費(fèi)時(shí)費(fèi)力的測(cè)交進(jìn)行檢驗(yàn)。這里產(chǎn)生的診斷工具有助于將兩種光過敏番茄紅素增加突變并入單個(gè)植林或繁殖品種。番茄中的幾種突變積極影響成熟番茄果實(shí)中的番茄紅素含量。其中，至少5種顯示出顯著的過敏光反應(yīng)。這些包括<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>/^-J和突變定位于番茄2號(hào)染色體的HP-1位點(diǎn)(YenWa/.1997，與本發(fā)明一致)。^J和&突變定位于番茄1號(hào)染色體的〃尸-2位點(diǎn)(Mustilli"fl/.1999;Levin"a/.2003)。通過以下的程序(對(duì)于*和/|/^突變的說明)可更加有效地實(shí)現(xiàn)及戶-2位點(diǎn)的番茄紅素增加^-2、/^-7'或rfg和定位于HP-1位點(diǎn)的兩突變(/t"-J和r)中的任一個(gè)的并入1.將純合rfg與純合突變體雜交以產(chǎn)生雙重雜合Fi植林+/+X+/+—-2~-7超/+/r/7-2/十2.將Fi雙重雜合植林自交以產(chǎn)生F2種子。這些F2種子將分為9種基因型rfg/dgAi7-J//^-2，/ip-J/+，rfg/rfg+/+，/ip"http://i/;-J，/^/7-7/+，+/+，+/+^p-J/A(/7-J，+/+/^-7/+，+/++/+。采用這里公開的用于突變的焦磷酸測(cè)序標(biāo)記物系統(tǒng)和共有的待決申請(qǐng)PCT/IL03/00023公開的用于&突變的標(biāo)記物，能容易地鑒定雙重純合植林*/*/|/^//|/7-2，并自交以產(chǎn)生對(duì)這兩種突變純合的繁殖品種。實(shí)施例8將兩種遺傳上不連鎖的番茄紅素增加突變并入單個(gè)番茄雜種顯著增加番茄紅素產(chǎn)量可行(working)實(shí)施例兩種半等基因雜種，一種是突變純合的和另一種是*突變純合的*/<&,進(jìn)行交叉雜交以產(chǎn)生F!植林(/^-7/+*/+)。這些Fn植林自交以產(chǎn)生F2幼苗。對(duì)這些F2幼苗進(jìn)行基因定型和自交以產(chǎn)生雙重突變體植林(/^^//^-i&力&)，如實(shí)施列7所述。兩種園藝上可接受的植林被選擇出來并自交以產(chǎn)生兩種F4品種。這些F4品種交叉雜交以產(chǎn)生雙重突變體雜種。該雜種與起始雜交使用的半等基因單突變體雜種(參見上文)一起在以色列北部的4個(gè)地點(diǎn)在春季開放田地條件下進(jìn)行測(cè)試。示于表3(下文)的結(jié)果顯示，令人意外地雙重突變體雜種的番茄紅素產(chǎn)量在統(tǒng)計(jì)學(xué)上高于它的等基因單突變體雜種。雙重突變體雜種的番茄紅素產(chǎn)量與倉(cāng)/&和/|/7-7//^-7單突變體雜種相比分別增加了19和61%。表3.攜帶有過敏番茄紅素增加突變的單個(gè)和雙重突變體雜種栽培品種的番茄紅素產(chǎn)量。不同的上標(biāo)字母表示依Tukey-KramerHSD測(cè)試(Kramer1956)的均值間統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P〈0力5)。栽培品種基因型番茄紅素產(chǎn)量(gr/dimam頭)+/+hp-l/hp-l1136cdg/dg+/+1538Bdg/dghp國(guó)l/hp-l1824Adunam-1000平方米實(shí)施例9診斷工具用于對(duì)母本品種和雜種種子的后控(postcontrol)分析種子公司經(jīng)常使用成組分子量標(biāo)記物進(jìn)行母本種子庫(kù)和雜種種子的后控或質(zhì)量控制。幾種市售的富番茄紅素番茄栽培品種攜帶有純合或雜合狀態(tài)的—-7和/^-r突變。到目前為止，在特定庫(kù)中檢測(cè)^;-J和—-尸性狀只能通過使種子樣品發(fā)芽、對(duì)母本栽培品種和后代進(jìn)行復(fù)雜的表型分析這樣漫長(zhǎng)的程序來進(jìn)行。品種中準(zhǔn)確地檢測(cè)A/7-7和/f/-^r等位基因，因此使生產(chǎn)后(post-production)質(zhì)量控制在1-2天而不是幾個(gè)星期或幾個(gè)月的時(shí)間尺度上進(jìn)行。實(shí)施例10其它功能上的活性突變?cè)?)Z)忍/基因中的定位來自正常植林的種子可按照已知方法采用甲磺酸乙酯(EMS)或其它途徑進(jìn)行誘變以產(chǎn)生光形態(tài)發(fā)生突變體(Koornneef"fl/.1990)。這些突變體可在調(diào)節(jié)的光照條件如黃色塑料屏下選出。對(duì)獲得的光形態(tài)發(fā)生突變體可進(jìn)行增進(jìn)健康代謝物的獨(dú)特表達(dá)模式的篩選。這些突變體能通過相對(duì)/^-J和/或的等位基因測(cè)試進(jìn)一步表征，其中的一些可能被表征為與這些突變等位。因此，可能發(fā)現(xiàn)也具有獨(dú)特代謝物特征的與和/或Zi/7-廣等位的誘變植株。對(duì)這些植林中Z)/XBJ基因的序列分析應(yīng)揭示出使這種獨(dú)特代謝結(jié)構(gòu)突出的準(zhǔn)確遺傳改變。類似于以上概述的那些，這些遺傳改變應(yīng)4吏設(shè)計(jì)特定的分子標(biāo)記物成為可能，以用于標(biāo)記物輔助的選擇。另外，這種損傷的定位可揭示/>/>必7基因內(nèi)的區(qū)域，該區(qū)域作為目標(biāo)用于有效的遺傳操作以便獲得在番茄果實(shí)內(nèi)具有獨(dú)特代謝特征的植林。實(shí)施例11在番茄果實(shí)和/或其它植物物種的果實(shí)和蔬菜中過量表達(dá)正?；蚋淖兊腄DgJ基因以獲得過量生成健康增進(jìn)代謝物D"丑2基因在很多在進(jìn)化上遙遠(yuǎn)的物種間高度保守(SchroederWfl/.2002)。它與過量生成健康增進(jìn)代謝物的聯(lián)系也已在上文進(jìn)行過概述。這些結(jié)果提示D2)5J基因?qū)】翟鲞M(jìn)化合物生成的影響在其它植物物種中也不應(yīng)被忽視。從這種實(shí)際的觀點(diǎn)來看，JWXBJ基因可從正?；駻/-2和突變體番茄植林或任何其它植物物種以正義或反義(RNAi)方向在組成型或果實(shí)特異的啟動(dòng)子下克隆。在植物物種中這些構(gòu)建物的過度表達(dá)可導(dǎo)致果實(shí)和蔬菜中功能性代謝物生成的增加。參考文獻(xiàn)BargR，MeirE,LapushnerD，F(xiàn)ranJcelR，SaltsY(1990)Differentialregulationoffruitspecific62kDaproteinindevelopingparthenocarpic(pat-2/pat-2)andseededtomatofruitsP/i;y"c/fcz"80:417-424'ChoryJ(1993)Outofdarkness:mutantsrevealpathwayscontrollinglight-regulateddeve〗opraen〖inpants.TrendsGenet9:167-172EshedY，Abu-AbiedM，SarangaY，ZaxnirD(1992)Lycopersiconesculentumlinesccmteini:ngsmdoverlappingintrogressionsfromL.pennellii.TheorAppGenet83:2027-034FuD，WakasugiM，IshigakiY，NikaidoO，MatsunagaT(2003)cDNAcloningofthechickenDDBlgeneencodingthep127subxmitofdamagedDNA-bindingprotein.GenesGenetSyst200378:169-77FultoriTM，ChunwongseJ，TansieySD(1995)MicroprepprotocolforextractionofDNAfromtomatoandotherherbaceousplants.PlantMolBiolRep13:207-209ffigginsDG，SharpPM(1988)CLUSTAL:apackageforperformingmultiplesequencealignmentonamicrocomputer.Gene73:237-244.IshibashiT，KimuraS，YamamotoT，F(xiàn)urukawaT，TakataK,UchiyamaY,HashimotoJ，SakaguchiK(2003)RiceUV-damagedDNAbindingproteinhomoogues肌mostabmzd如tinpro〗iferatiiigtissues.Gene308:79-87KonslerTR(1973)Threemutantsappearingin'Manapal'tomato.HortSci8:331-333KoornneefM,BosmaTDG，HanhartCJ,vanderVeenJH，ZeevaartJAD(1990)Theisolationandcharacterizationofgibberellin-deficientmutantintomato.TheorApplGenetS0:S52-857KramerCY(1956)Extensionofmultiplerangeteststogroupmeanswithunequalmimberofreplications.Biometrics12:309-310LevinI，F(xiàn)raukeP，GilboaN，TaimyS,LalazarA(2003)Thetomatodarkgreenmutationisa;novdalleleofthetomatohomologoftheDEETIOLATEDlgene.TheorAppiGenet106:454-460LevinI,SmMiEJ(1990)Molecularanalysisofendogenousvirusev21-slowfeatheringcomplexofchickens.1.Cloningofprovira!-eel!junctionfragmentandunoccupiedintegrationsite.PoultSci69:2017-2026MochizukiT，KamimuraS(I9S4)InheritanceofvitaminCcontentanditsrelationtoothercharactersincrossesbetween》/andvarietiesoftomatoes.EucarpiaTomatoWorkingGroup,SynopsisIXmeeting22-24May,Wageningen，theNetherlands,pp8-13MustilliAC3FenziF,CilientoR，AlfanoFBowlerC(1999)Phenotypeofthetomato/ugAiscausedbyamutationinthetomatohomologofi)￡￡77QL47EW.PlantCell11:145-157NelsonJC(I_997)QGENE:softwareformarker-basedgenomicanalysisandbreeding.MolBreed3:229.235PetersJL，vanTuinenA，AdamseP,KendrickRE，KoornneefM(1989)Highpigmentmutantsoftomatoexhibithighsensitivityforphytochromea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