專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種檢測(cè)雞對(duì)能量的吸收轉(zhuǎn)化能力的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：一種檢測(cè)雞對(duì)能量的吸收轉(zhuǎn)化能力的方法。
背景技術(shù)：
：胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)是一類(lèi)廣泛存在于機(jī)體多種組織中的蛋白多肽，由于結(jié)構(gòu)與胰島素具有同源性而得名。體循環(huán)中的IGF主要由肝細(xì)胞分泌，受來(lái)自于垂體的生長(zhǎng)激素(GH)控制。除這種內(nèi)分泌方式外，哺乳動(dòng)物幾乎所有的組織和細(xì)胞都能以自分泌、旁分泌的形式分泌IGF。IGF系統(tǒng)在促進(jìn)機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育、組織修復(fù)、營(yíng)養(yǎng)代謝及細(xì)胞分化方面有著重要的生物學(xué)作用。IGF蛋白由兩種多肽組成:IGF-1(胰島素樣生長(zhǎng)因子l)和IGF-II(胰島素樣生長(zhǎng)因子2)。二者分別為70和67個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的單鏈蛋白，分子量均是7.5kD，且結(jié)構(gòu)中都含有3個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵。IGF-I和IGF-II均有自己相應(yīng)的受體。IGF-IR(胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體)與胰島素受體很相似，除了能和IGF-I或胰島素1:1的結(jié)合外，IGF-IR還顯示與IGF-II有較高的親和力。目前證實(shí)，配體與IGF-IR的親和力依次為IGF-1>IGF-II〉胰島素。IGF-IIR(胰島素樣生長(zhǎng)因子2受體)則不與胰島素結(jié)合,對(duì)IGF-II的親和力遠(yuǎn)大于IGF-1。95。/。以上的血清IGF，都是和各種IGF結(jié)合蛋白(IGFBP)以結(jié)合形式存在。依據(jù)6種IGFBP對(duì)IGF的影響，人們將其分為刺激性和抑制性蛋白兩大類(lèi)。它們?cè)谘娱L(zhǎng)IGF半衰期、促進(jìn)其跨血管壁運(yùn)輸及調(diào)整IGF與受體結(jié)合等方面，發(fā)揮著對(duì)IGF生物學(xué)功能的重要調(diào)控作用。IGF-I作為一個(gè)重要的有絲分裂原,在機(jī)體中的主要作用是促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)分化。鑒于IGF-I的分泌受到GH的調(diào)節(jié),Daughaday等最早提出，GH對(duì)外周組織上的作用可能是通過(guò)IGF-I來(lái)完成的。體外實(shí)驗(yàn)顯示，GH促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的作用可被IGF-I的抗血清所抑制，其抑制的程度呈劑量依賴。雖然此后的事實(shí)表明，GH具有雙重作用其本身也可促進(jìn)細(xì)胞的增殖?？稍诠趋兰“l(fā)育過(guò)程中，GH經(jīng)由IGF-I介導(dǎo)的效應(yīng)是占主導(dǎo)地位的。目前認(rèn)為，IGF-I的生物學(xué)效應(yīng)有兩種形式,其一，是受到GH調(diào)節(jié)的內(nèi)分泌形式，即短期作用；其二，是以自分泌旁分泌形式刺激細(xì)胞生長(zhǎng)分化的作用，即長(zhǎng)期作用。至于在促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，具體以哪一種形式為主，已經(jīng)很難區(qū)分清楚。二者兼而有之，可能是對(duì)IGF-1作用的最好概括。早期研究顯示，蛋白性營(yíng)養(yǎng)不良的患者，總是伴隨著低水平的IGF-I。同樣,體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞，在氨基酸濃度只有正常20%的條件下培養(yǎng)，IGF-1的表達(dá)量只有正常對(duì)照的一半。Maiter等觀察到，大鼠經(jīng)過(guò)12h和24h的蛋白限制，血清IGF-1分別下降58%和66%,而肝細(xì)胞表面GH結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量?jī)H減少15%和20%。在補(bǔ)充GH之后，并不能逆轉(zhuǎn)這種低水平IGF-I的狀況。Malmlof等給大鼠注射地塞米松,先造成負(fù)氮平衡,然后再分別給予重組IGF-I或重組GH。他發(fā)現(xiàn)，由地塞米松造成的蛋白合成減少、能量消耗增加及尿氮排出增多的現(xiàn)象可被IGF-I所對(duì)抗，GH則無(wú)此作用。提示IGF-1的合成效應(yīng)是完全獨(dú)立的，并不依賴GH的作用。IGF-I的合成作用明顯不同于胰島素。有證據(jù)表明，IGF-1能顯著改變正常人機(jī)體成分的分布，包括脂肪減少、肌肉比重增高、體重增加等。Gluckman等給禁食48h的動(dòng)物分別補(bǔ)充IGF-1和胰島素，發(fā)現(xiàn)二者均能減低動(dòng)物蛋白的消耗,但只有IGF-I可增加骨骼肌組織的蛋白合成,且IGF-1促進(jìn)肝臟合成的作用明顯要較胰島素強(qiáng)。IGF-1在低濃度[15ug(kgh)]尚未影響到糖代謝時(shí)，就己對(duì)蛋白代謝產(chǎn)生了作用。因此，血清IGF-I水平可以反映機(jī)體氮平衡的變化。目前，血清IGF-I的測(cè)定己被作為了解蛋白能量代謝的一個(gè)指標(biāo)應(yīng)用于臨床。GHIGF-1除能維持人體正常的生長(zhǎng)發(fā)育外,還與脂質(zhì)代謝有關(guān)。1989年，Salomom等發(fā)現(xiàn)GH缺乏的患者,血清膽固醇(TC)水平明顯升高，經(jīng)補(bǔ)充GH之后，血清TC又顯著降低。該研究提示，GH可以調(diào)節(jié)TC的代謝。隨后認(rèn)識(shí)到，這除了GH本身的作用以外，IGF-1的參與可能也是一個(gè)重要原因。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，IGF-I能明顯降低血清TC水平。給健康人補(bǔ)充IGF-I，血漿脂蛋白Lp(a)、TC、甘油三酯均明顯下降。IGF-I對(duì)脂代謝的調(diào)節(jié),可能是其綜合作用的結(jié)果。目前研究最多的是IGF-I和LDL受體的關(guān)系。幾乎所有的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面都有LDL受體，LDL受體的數(shù)量及活性直接影響膽固醇的代謝。Streicher等利用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，將LDL受體啟動(dòng)子的基因?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)胞中，然后分別加入胰島素和IGF-I，通過(guò)Northern雜交和RT-PCR來(lái)檢測(cè)LDL受體轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二者均能增加LDL受體mRNA的表達(dá)。由于IGF-1的結(jié)構(gòu)和胰島素相似，因此有研究顯示，IGF-I激活LDL受體的作用，有部分是通過(guò)胰島素受體完成的。作為一個(gè)生長(zhǎng)因子，IGF-I的合成作用也不容忽視。經(jīng)IGF-1治療之后,循環(huán)中游離脂肪酸增加，說(shuō)明脂溶及脂質(zhì)氧化能力增強(qiáng)。Veldhuis等證實(shí)，IGF-I能夠促進(jìn)外周組織利用LDL膽固醇,這無(wú)疑對(duì)血脂的改善是有益的。當(dāng)然，也不能排除IGF-1經(jīng)過(guò)GH對(duì)肝細(xì)胞合成脂蛋白的抑制作用。最近，Tan等通過(guò)對(duì)肢端肥大癥的研究，提出IGF-IGH可調(diào)節(jié)LDL亞組分的水平及分布，為進(jìn)一步了解脂代謝紊亂的機(jī)制作了有益的補(bǔ)充。IGF-1由其結(jié)構(gòu)與胰島素原(proinsulin)相似，故和胰島素(insulin,INS)、胰島素樣生長(zhǎng)因子II(IGF-II)、松弛素(relaxin)—起被稱(chēng)為INS/IGF/relaxin家族蛋白。IGF-1在血液中大多與IGF-I結(jié)合蛋白(IGFBP)相結(jié)合而以結(jié)合狀態(tài)存在。IGF-I具有許多生理功能，同時(shí)，IGF-I的生理功能的發(fā)揮也受激素、營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)、發(fā)育水平等因素的影響。現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)IGF-I也具有自分泌(autocrine)或旁分泌(paracrine)功能。許多肝外組織細(xì)胞能分泌IGF-I作用于自身或相鄰的組織細(xì)胞,促進(jìn)生長(zhǎng)和分裂。IGF-1在刺激小腸的生長(zhǎng)發(fā)育和功能成熟方面報(bào)道不一致。有報(bào)道認(rèn)為IGF-I能刺激小腸組織生長(zhǎng)發(fā)育。Xu在配方乳中添加IGF-I(440ug/kgbodyweight)飼喂新生仔豬一天后發(fā)現(xiàn),較僅飼喂配方乳的仔豬相比，添加IGF-1組仔豬胰腺組織DNA含量和隱窩細(xì)胞數(shù)量顯著增加。在配方乳中添加IGF-I(3.5mg/kgbodyweight)飼喂新生仔豬，4天后發(fā)現(xiàn)，較僅飼喂配方乳的仔豬相比，IGF-I能顯著增加仔豬小腸重量，小腸絨毛高度和小腸蛋白質(zhì)和DNA含量。也有報(bào)道認(rèn)為，IGF-I能刺激小腸功能的成熟。在配方乳中添加低劑量IGF-I(200ug/kgbodyweight)詞喂新生仔豬發(fā)現(xiàn)，添加IGF-1組仔豬小腸重，小腸長(zhǎng)度，小腸蛋白質(zhì)、DNA含量與僅飼喂配方乳組的仔豬相似，但小腸絨毛刷狀緣二糖酶的活性顯著提高。飼喂rh-IGF-I(lug/day)給新生鼠，3天后發(fā)現(xiàn),rh-IGF-I能顯著提高小鼠小腸絨毛刷狀緣乳糖酶，麥芽糖酶和蔗糖酶的活性，但對(duì)小腸重?zé)o顯著影響。產(chǎn)生這種差異的原因可能是由于IGF-I飼喂量高低所致，低劑量IGF-I能提高小腸絨毛刷狀緣酶的活性,而刺激小腸的組織生長(zhǎng)則需較高劑量的IGF-I。此外，IGF-I在刺激小腸絨毛刷狀緣酶發(fā)育的同時(shí),不同的腸段也顯示出區(qū)域性差異，即IGF-1能顯著剌激小腸前部刷狀緣酶的活性,而對(duì)小腸后部刷狀緣酶的活性影響較小,產(chǎn)生這種差異的原因可能是由于越往腸道后段,IGF-I被降解的可能性越大,從而影響其功能的發(fā)揮。IGF-I的一級(jí)結(jié)構(gòu)由4個(gè)區(qū)域構(gòu)成:B、C、A、D。氨基末端的B區(qū)域和A區(qū)域由一個(gè)較短的連接性的C區(qū)域隔開(kāi)。與胰島素原不同的是,在羧基末端還有一個(gè)D區(qū)域。IGF-I的氨基酸序列在不同的哺乳動(dòng)物脊椎中相當(dāng)保守，這表明它是一種由共同原型基因進(jìn)化而來(lái),且具有重要功能的多肽。雖然成熟的IGF-I是一個(gè)較小的多肽，但在哺乳動(dòng)物中該基因卻相當(dāng)大，基因組DNA為80100kb，由6個(gè)外顯子組成，而成熟的多肽是由外顯子3和4之間的區(qū)域編碼組成。原始的生長(zhǎng)介質(zhì)假說(shuō)認(rèn)為，由垂體分泌的GH刺激合成和釋放IGF-I。IGF-I再進(jìn)一步作用于靶組織而發(fā)揮其促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)的效應(yīng)。后來(lái)發(fā)現(xiàn)肝以外的組織也能產(chǎn)生IGF-I。大鼠經(jīng)GH處理后，肝外組織中的IGF-I濃度在血清IGF-1升高以前就已升高，這一發(fā)現(xiàn)使人們認(rèn)識(shí)到IGF-1可能還以旁分泌或旁分泌的方式作用于局部組織細(xì)胞,局部組織產(chǎn)生的IGF-1在調(diào)節(jié)生長(zhǎng)中相當(dāng)重要。Kerr等認(rèn)為局部產(chǎn)生的IGF-I已足夠維持動(dòng)物的正常生長(zhǎng)。學(xué)者們對(duì)一些組織中IGF-I自分泌或旁分泌的詳細(xì)機(jī)制進(jìn)行了探索。在精巢中存在一個(gè)受促性腺激素(GTH)調(diào)節(jié)的由IGF-I中介的旁分泌環(huán),在卵巢,非優(yōu)勢(shì)濾泡(cohortfollicle)中的IGF-1是由血液循環(huán)系統(tǒng)提供，而優(yōu)勢(shì)濾泡(dominantfollicle)中的IGF-1則是通過(guò)自分泌或旁分泌方式由顆粒細(xì)胞產(chǎn)生，顆粒細(xì)胞以自分泌形式對(duì)顆粒細(xì)胞本身發(fā)生作用或以旁分泌形式作用于膜間質(zhì)細(xì)胞，促使這2種細(xì)胞產(chǎn)生更多的雄性激素(androgen),以滿足顆粒細(xì)胞芳香化的需要。Devol等對(duì)大鼠腳部肌肉的研究表明，在GH缺乏的情況下，增加工作負(fù)荷能誘導(dǎo)肌肉中的IGF-ImRNA水平增加，促進(jìn)肌肉增長(zhǎng)。因此認(rèn)為肌肉中IGF-I基因表達(dá)至少受到2種機(jī)制的調(diào)節(jié),一是受系統(tǒng)GH或其他激素的調(diào)節(jié)，另外還受到未知的局部因子的調(diào)節(jié)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)雞對(duì)能量的吸收轉(zhuǎn)化能力的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明所提供的檢測(cè)雞對(duì)能量的吸收轉(zhuǎn)化能力的方法，是檢測(cè)待測(cè)雞的一號(hào)染色體的第57327644位(chrl:57327644,ChickenMay2006(galGal3)assemblysequences,http:〃genome.ucsc.edu)核苷酸為C還是A，確定雞的基因型，然后通過(guò)基因型確定雞對(duì)能量的吸收轉(zhuǎn)化能力；所述確定雞的基因型的方法為如果待測(cè)雞的一號(hào)染色體的第57327644位核苷酸為A時(shí)，其純合體的基因型為AA;待測(cè)雞的一號(hào)染色體的第57327644位核苷酸為C時(shí)，其純合體的基因型為BB;它們的雜合體基因型為AB。通過(guò)基因型確定雞對(duì)能量的吸收轉(zhuǎn)化能力的方法為所述AA基因型雞對(duì)能量的吸收轉(zhuǎn)化能力優(yōu)于BB基因型雞和AB基因型雞。所述方法中，所述檢測(cè)待測(cè)雞的一號(hào)染色體的第57327644位核苷酸為C還是A的方法是利用PCR方法擴(kuò)增待測(cè)雞基因組中的序列表中序列3的核苷酸片段，并將該擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行單鏈構(gòu)象多態(tài)法檢測(cè)，若得到4條電泳條帶，即為AB基因型，得到分別與所述AB基因型按電泳方向第一條電泳帶和第三條電泳帶具有相同位置(電泳遷移率)的兩條電泳條帶的，為AA基因型；得到與AB基因型按電泳方向第二條電泳帶和第四條電泳帶具有相同位置的(電泳遷移率)兩條電泳條帶的，為BB基因型。所述方法中，所述PCR方法的擴(kuò)增引物對(duì)為具有序列表中序列l(wèi)所述序列的核苷酸和具有序列表中序列2所述序列的核苷酸。所述方法中，所述雞對(duì)能量的吸收轉(zhuǎn)化能力表現(xiàn)為雞的小腸長(zhǎng)度和/或體重。本發(fā)明巧妙地利用PCR-SSCP法檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性(SNPs)，篩選得到了IGF-I基因中具有影響雞對(duì)能量的吸收轉(zhuǎn)化能力的功能的特異性單核苷酸突變位點(diǎn)。本發(fā)明的方法利用設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增具有該突變位點(diǎn)的片段后，用單鏈構(gòu)象多態(tài)方法進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)，可以快速簡(jiǎn)便的通過(guò)鑒定雞對(duì)能量吸收轉(zhuǎn)化能力緊密相關(guān)的多態(tài)性位點(diǎn)造成的不同基因型，確定不同基因型雞對(duì)能量吸收轉(zhuǎn)化的能力高低，進(jìn)而確定其影響的生長(zhǎng)性狀。本發(fā)明的方法通過(guò)檢測(cè)雞小腸平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)，增強(qiáng)能量的吸收與轉(zhuǎn)化能力，從而可以輔助篩選生長(zhǎng)速度提高的等生長(zhǎng)狀況較好的雞，這對(duì)于雞的育種具有重要意義，也對(duì)于進(jìn)一步研究雞的生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)理具有重要意義。雞作為人類(lèi)發(fā)育的極好動(dòng)物模型，本發(fā)明對(duì)于研究人類(lèi)的生長(zhǎng)發(fā)育也具有重要意義。圖1為IGF-I基因啟動(dòng)子部分序列PCR產(chǎn)物圖2為突變檢測(cè)SSCP結(jié)果圖具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中提到的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、檢測(cè)雞對(duì)能量轉(zhuǎn)化吸收能力的方法的建立及其效果驗(yàn)證1、模板材料準(zhǔn)備CAU資源家系采用F2設(shè)計(jì)，由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)建立。親本(P)有277只雞，其中，A系為法國(guó)明星肉雞，15S43早，B系為農(nóng)大褐殼蛋雞，21S70孚，C系為中國(guó)泰和絲羽烏骨雞，11S117早。親本基本按照公母比例1:7，正反交產(chǎn)生Fl代。Fl代共有公雞929只，母雞890只，具體分布于21個(gè)AC(ASXC早)家系，7個(gè)CA(C$XA早)家系，以及21個(gè)BC(B$XC早)家系，11個(gè)CB(C$XB早)家系。Fl代留種選配原則是親本每個(gè)公雞家系留一只公雞作為種用。種用母雞也盡量散布于各個(gè)家系中，其外貌表現(xiàn)豐富。Fl代避免半同胞交配，選配公母比例為1:5，橫交產(chǎn)生最終的分離群體F2代。F2代組成情況為24個(gè)AC家系，9個(gè)CA家系，21個(gè)BC家系，9個(gè)CB家系，共有ACAC2049只、CACA702只、BCBC2506只、CBCB1239只，合計(jì)F26496只。下述實(shí)驗(yàn)從上述CAU資源家系A(chǔ)$XC早、CSXA早的肉雞正反交交配組合中挑選出各4個(gè)混合家系，F(xiàn)2代個(gè)體545只作為實(shí)驗(yàn)材料。將選用的實(shí)驗(yàn)材料雞分別于屠宰前和屠宰后記錄一些生長(zhǎng)、屠體相關(guān)的生產(chǎn)性狀。這些性狀有活體重、屠體重、全凈膛重、半凈膛重、屠宰率、半凈膛率、全凈膛率、胸肉重，腿肉重、頭頸重、頸爪重、翅重、心臟重、肝臟重、腹脂重、肌胃重、腺胃重、胸肉率、腿肉率、頭頸率、頸爪率、翅率、心臟率、肝率、腹脂率、肌胃率、腺胃率、睪丸重、胸角寬、頸圍、小腸長(zhǎng)度；1、3、6、9、12周齡體重等。分別取上述實(shí)驗(yàn)材料雞的血，分別提取基因組DNA，具體方法如下所示1)取20ul新鮮血液，加ACD抗凝，加入600y1組織DNA提取液(1MTrisCl(pH8.0)，0.5MEDTA(pH8.0)，5MNaCl，20ug/mlRNA酶，腦SDS)，加入蛋白酶k至終濃度為100-200ng/ml，混勻55。C消化直至溶液中不再有粘稠的團(tuán)塊；2)將步驟l)得到的溶液冷卻至室溫，加入等體積苯酚，反復(fù)顛倒離心管，直至兩相混合形成乳濁液，12,000rpm，室溫離心10min;取上清，再用與上清液等體積的氯仿抽提1次，取上清加1/10體積NaAc溶液(3M，pH5.2)和2倍體積無(wú)水乙醇沉淀DNA;3)將步驟2)沉淀得到的DNA挑出放到一1.5ml離心管中，用體積百分含量為70%乙醇溶液洗兩次，將DNA干燥(注意不能太干)，溶于適量TE(含10mMTrisC1,lmMEDTA，pH8.0,經(jīng)高壓滅菌的溶液。高壓滅菌條件為1.034X105Pa,20min)或滅菌雙蒸水中。2、PCR與單鏈構(gòu)象多態(tài)法(SSCP)檢測(cè)功能性突變位點(diǎn)1)PCR擴(kuò)增設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增IGF-I基因啟動(dòng)子部分序列(序列表中序列3的核苷酸序列)，引物序列如下所示-5'…CCCTTTTTTGCCTGCTAACC….3'(序歹J表中序歹iJ1);5'…TGCCTTCTCTCTCTCTCCCT.…3'(序歹U表中序歹U2)。分別以步驟l中得到的545只實(shí)驗(yàn)材料雞的基因組基因?yàn)槟０?，用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件先94。C，5分鐘；94°C，30秒，62°C，30秒，72°C，30秒，共30個(gè)循環(huán)；最后72'C，IO分鐘。結(jié)果表明，以上述545只實(shí)驗(yàn)材料雞的基因組基因?yàn)槟０寰鶖U(kuò)增得到171bp長(zhǎng)度的DNA片段。部分PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖l所示；圖1中泳道1一3為部分PCR擴(kuò)增得到的171bp長(zhǎng)度的DNA片段電泳結(jié)果，泳道4為分子量Marker。2)單鏈構(gòu)象多態(tài)法(SSCP)檢測(cè)突變位點(diǎn)將步驟l)獲得的PCR產(chǎn)物，進(jìn)行SSCP分析，具體方法如下所述A、非變性聚丙烯酰胺凝膠制作及電泳①清洗制膠用的玻璃板并用蒸餾水沖洗干凈，烘干后，用0.8%瓊脂糖封閉玻璃板和膠條間的縫隙。②在100ml燒杯內(nèi)加入質(zhì)量百分濃度為30%丙烯酰胺溶液10.0ml，2.5ml的體積百分濃度為50%甘油溶液，5XTBE(Tris堿54g,硼酸27.5g，0.5MEDTA(pH8.0)20ml，加水至1L)5ml，質(zhì)量百分濃度為10。/。過(guò)硫酸銨溶液0.175ml，四甲基二乙胺(TEMED)8ul，加入純水7.325ml，混合后迅速灌膠。③當(dāng)澆灌至離玻璃板上沿0.1cm時(shí)停止灌膠，插入梳子，室溫聚合半小時(shí)，多余的丙烯酰胺4度保存。隨時(shí)觀察凝膠聚合情況，并補(bǔ)加丙烯酰胺。④凝膠聚合好后，向電泳槽加入1XTBE，用注射器沖洗加樣孔。(D預(yù)電泳10分鐘，同時(shí)準(zhǔn)備點(diǎn)樣。⑥分別取lul步驟1)獲得的PCR產(chǎn)物置于PCR管中，加5ul變性Buffer,離心混勻，98度變性10分鐘。⑦迅速冰浴10分鐘，用微量注射器點(diǎn)樣。⑧打開(kāi)電源，150伏，電泳14-16小時(shí)。B、硝酸銀染色①步驟A所述電泳結(jié)束后關(guān)上電泳儀，放出電泳液，小心取下凝膠，置于體積百分濃度為70%乙醇溶液(乙醇用完可以回收)中，水浴震蕩器緩慢搖勻固定10-15分鐘。②用去離子水洗膠2遍，每次2分鐘，洗去乙醇。③用200ml染色液(NH3'H202ml;3.6%NaOH4.2ml;20%AgN033.6ml;加去離子水至200ml)染色30分鐘。④去離子水洗膠3遍，每次2分鐘，洗去多余的染色液。用200ml顯色液(1%檸檬酸鈉lml;甲醛100ul;加去離子水至200ml)顯色，約10-30分鐘，當(dāng)DNA帶的強(qiáng)度合適時(shí)，倒掉顯色液。⑥去離子水洗掉多余的顯色液，保鮮膜將膠封好，掃描照相。結(jié)果表明，非變性聚丙烯酰胺凝膠得到三種類(lèi)型的電泳圖譜(部分圖譜如圖2所示)，即三種基因型。將這三種基因型的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序表明，雞的一號(hào)染色體的第57327644位(chrl:57327644，ChickenMay2006(galGal3)assemblysequences,http:〃genome.ucsc.edu)核苷酸(自序列表中序列3的5'端第64位核苷酸)具有A/C變異，是一個(gè)多態(tài)性突變位點(diǎn)，即雞的一號(hào)染色體的第57327644位(chrl:57327644)核苷酸為C或A;當(dāng)雞的一號(hào)染色體的第57327644位(chrl:57327644)核苷酸為A時(shí)，該基因由A等位基因控制，當(dāng)位于雞的一號(hào)染色體的57327644位(chrl:57327644)核苷酸為C時(shí)，該基因由B等位基因控制，這兩個(gè)等位基因可組成三種基因型純和體AA、BB，雜和體AB;即當(dāng)雞的一號(hào)染色體的第57327644位(chrl:57327644)核苷酸是A時(shí)，其純合型雞的基因型為AA;當(dāng)雞的一號(hào)染色體的第57327644位(chrl:57327644)核苷酸是C時(shí)，其純合型雞的基因型為BB;其雜合型雞的基因型為AB。非變性聚丙烯酰胺凝膠得到三種基因型的電泳圖譜分別為一、擴(kuò)增產(chǎn)物非變性聚丙烯酰胺電泳得到4條電泳條帶，將其各條帶進(jìn)行純化測(cè)序表明，該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物包含一號(hào)染色體的57327644位(chrl:57327644)核苷酸(自序列表中序列3的5'端第64位核苷酸)為A和C兩種情況，即為AB基因型；二、擴(kuò)增產(chǎn)物非變性聚丙烯酰胺電泳得到分別與AB基因型按電泳方向第一條電泳帶和第三條電泳帶具有相同遷移率(即相同的遷移距離)的兩條電泳條帶，經(jīng)測(cè)序表明，該擴(kuò)增產(chǎn)物只有一號(hào)染色體的57327644位(chrl:57327644)核苷酸為A的一種情況，即為AA基因型；三、擴(kuò)增產(chǎn)物非變性聚丙烯酰胺電泳得到分別與AB基因型按電泳方向第二條電泳帶和第四條電泳帶具有相同遷移率(即相同的遷移距離)的兩條電泳條帶，經(jīng)測(cè)序表明，該擴(kuò)增產(chǎn)物只有一號(hào)染色體的第57327644位(chrl:57327644)核苷酸為B的一種情況，即為BB基因型。經(jīng)上述PCR和SSCP檢測(cè)表明，步驟1中所述545只實(shí)驗(yàn)材料雞中，有69只AA基因型雞，206只BB基因型雞和270只AB基因型雞。3、檢測(cè)雞對(duì)能量轉(zhuǎn)化吸收能力的方法的建立及其效果驗(yàn)證將步驟2檢測(cè)得到的CAU資源家系F2代個(gè)體545只雞的基因型結(jié)果與步驟1檢測(cè)記錄的它們的各項(xiàng)生產(chǎn)形狀共檢測(cè)，然后與所記錄的生產(chǎn)性狀相聯(lián)系，進(jìn)行方差分析。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果如表1和表2所示，結(jié)果表明，該突變位點(diǎn)多態(tài)性形成的基因型類(lèi)別與一些小腸長(zhǎng)度，生長(zhǎng)屠體性狀(6、9、12周齡體重)相關(guān)顯著，在所有相關(guān)顯著的生產(chǎn)性狀中，AA型個(gè)體的性狀均值都比BB型個(gè)體的均值要高(AA基因型在6、9、12周齡體重及小腸長(zhǎng)度都大于BB基因型個(gè)體)，AA型與BB、AB型差異顯著，BB與AB型差異不顯著。因此可以通過(guò)上述方法檢測(cè)待測(cè)雞一號(hào)染色體的第57327644位(chrl:57327644)核苷酸(自序列表中序列3的5'端第64位核苷酸)的A/C變異導(dǎo)致的三種不同基因型，通過(guò)基因型判斷雞個(gè)體之間小腸吸收能力的差異，也可以進(jìn)一步推斷不同基因型生長(zhǎng)水平的差異。表l.突變'<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注1基因型欄中n值不同由于數(shù)據(jù)的丟失；2.上角標(biāo)字母不同表示同一性狀不同基因型之間均值差異顯著(PO.05)<160〉3<210>1〈211〉20<212>DNA<213〉人工序列〈220>〈223〉<400〉1cccttttttgcctgctaacc20<210〉2<211〉20〈212〉DNA<213>人工序列<220>〈223〉<400>2tgccttctctctctctccct20<210>3〈211〉172<212〉DNA〈213〉原雞(Gallusgallus)<220〉〈221>misc-feature〈222〉(64)<223〉n=a或c<400〉3cccttttttgcctgctaacccctcagtcactaattcacattcttttaaaggggaaaaaat60atgnttctgtgctctagttttaaaatgcaaaggtatgatgttatttgtcaccatgcccaa120aaaagtccttactcggtaactttgccagaagagggagagagagagaaggc17權(quán)利要求1、一種檢測(cè)雞對(duì)能量的吸收轉(zhuǎn)化能力的方法，是檢測(cè)待測(cè)雞的一號(hào)染色體的第57327644位核苷酸為C還是A，確定雞的基因型，然后通過(guò)基因型確定雞對(duì)能量的吸收轉(zhuǎn)化能力；所述確定雞的基因型的方法為如果位于待測(cè)雞的一號(hào)染色體的第57327644位核苷酸為A時(shí)，其純合體的基因型為AA；待測(cè)雞的一號(hào)染色體的第57327644位核苷酸為C時(shí)，其純合體的基因型為BB；它們的雜合體基因型為AB；通過(guò)基因型確定雞繁殖力的方法為所述AA基因型雞對(duì)能量的吸收轉(zhuǎn)化能力優(yōu)于BB基因型雞和AB基因型雞。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述檢測(cè)待測(cè)雞的一號(hào)染色體的第57327644位核苷酸為C還是A的方法是利用PCR方法擴(kuò)增待測(cè)雞基因組中的核苷酸序列為序列表中序列3的核苷酸片段，并將該擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行單鏈構(gòu)象多態(tài)法檢測(cè)，若得到4條電泳條帶，即為AB基因型，得到分別與所述AB基因型的結(jié)果按電泳方向第一條電泳帶和第三條電泳帶具有相同電泳遷移率的兩條電泳條帶的，為AA基因型；得到與AB基因型的結(jié)果按電泳方向第二條電泳帶和第四條電泳帶具有相同電泳遷移率的兩條電泳條帶的，為BB基因型。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR方法的擴(kuò)增引物對(duì)為具有序列表中序列1所述序列的核苷酸和具有序列表中序列2所述序列的核苷酸。4、根據(jù)權(quán)利要求1一3中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述雞對(duì)能量的吸收轉(zhuǎn)化能力為雞的小腸長(zhǎng)度和/或體重。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)雞對(duì)能量的吸收轉(zhuǎn)化能力的方法。該方法是檢測(cè)待測(cè)雞的一號(hào)染色體的57327644位核苷酸為C還是A，確定雞的基因型，然后通過(guò)基因型確定雞對(duì)能量的吸收轉(zhuǎn)化能力；如果待測(cè)雞的一號(hào)染色體的57327644位核苷酸為A時(shí)，其純合體的基因型為AA；待測(cè)雞的一號(hào)染色體的57327644位核苷酸為C時(shí)，其純合體的基因型為BB；它們的雜合體基因型為AB；所述AA基因型雞對(duì)能量的吸收轉(zhuǎn)化能力優(yōu)于BB基因型雞和AB基因型雞。本發(fā)明的方法利用篩選得到的IGF-I基因中影響雞對(duì)能量吸收轉(zhuǎn)化能力的功能的單核苷酸突變位點(diǎn)，可以快速簡(jiǎn)便的確定不同基因型雞個(gè)體對(duì)能量吸收轉(zhuǎn)化的能力高低，進(jìn)而輔助篩選生長(zhǎng)性狀。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101338339SQ20081011835公開(kāi)日2009年1月7日申請(qǐng)日期2008年8月13日優(yōu)先權(quán)日2008年8月13日發(fā)明者寧李,鄧學(xué)梅,顏炳學(xué)申請(qǐng)人:寧李