專利名稱：：植物轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的方法，此方法在抑制農(nóng)桿菌誘導的壞死的試劑存在的情況下進行轉(zhuǎn)化和/或使用不誘導壞死的農(nóng)桿菌菌株進行轉(zhuǎn)化。將外源遺傳物質(zhì)導入植物的第一種方法并且仍是最廣泛使用的方法之一是利用農(nóng)桿菌屬種類的天然轉(zhuǎn)化系統(tǒng)、使用其中T-DNA包含目的基因的重組Ti(誘導腫瘤的)或Ri(誘導根的)質(zhì)粒。目的基因通過與用于天然系統(tǒng)以整合癌基因或冠癭堿生物合成基因的相同機制摻入植物遺傳物質(zhì)中。盡管農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化對于那些在野外由農(nóng)桿菌天然侵染和轉(zhuǎn)化形成腫瘤和/或發(fā)根的植物有效，但對于其它植物并不是很有效。例如，已知禾本科(Gramineae)成員如玉米在暴露于農(nóng)桿菌時不形成腫瘤并且已普遍證明它極不易受農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化。Ishida等在《自然生物技術(shù)》(1996)14745-750已報道了使用帶有“超級雙元”載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化來自特定玉米株系(A188)及其雜種的胚，但這些結(jié)果的重復性以及此系統(tǒng)用于其它玉米株系和/或使用帶有其它載體的農(nóng)桿菌的適用性還不清楚。還有用頂端分生組織作為靶組織進行玉米的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的報道，但與例如胚發(fā)生愈傷組織相比，作為靶組織的頂端分生組織的低效率使得此方法不夠理想。甚至一些在野外對農(nóng)桿菌侵染和腫瘤形成易感的雙子葉植物如葡萄、大豆或胡椒也已證明難于在實驗室中轉(zhuǎn)化，因為優(yōu)選的轉(zhuǎn)化和再生靶組織看來對暴露于農(nóng)桿菌反應(yīng)很弱。對農(nóng)桿菌侵染和腫瘤形成的抗性機制缺乏理解看來是設(shè)計解決方案時的障礙，甚至也是適當評估在抵抗農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的植物如禾本科中農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化問題的障礙?，F(xiàn)已驚人地發(fā)現(xiàn)農(nóng)桿菌能在植物細胞，特別是禾本科如玉米中誘導凋亡性壞死。已發(fā)現(xiàn)篩選和產(chǎn)生具有較低誘導壞死能力的農(nóng)桿菌的方法和在轉(zhuǎn)化細胞中抑制壞死反應(yīng)的方法。在暴露于農(nóng)桿菌之后禾本科細胞培養(yǎng)物中可見到的壞死是細胞通過信號轉(zhuǎn)導機制導致其自身死亡的程序性細胞死亡。它不同于被動的細胞死亡，即它是涉及膜完整性瓦解和隨后引起溶解的膨脹的壞死，正如細胞暴露于各種毒素時可見到的。經(jīng)歷程序性細胞死亡的細胞表現(xiàn)出特征性形態(tài)變化和DNA片段化，這些特征結(jié)合起來限定了凋亡的過程并通過涉及從頭基因表達的機制產(chǎn)生。所描述的動物細胞中凋亡的定性特征是皺縮、形成器官的組織中細胞與細胞間接觸的丟失、核和染色質(zhì)凝聚、DNA片段化(DNA“梯狀”)以及核和膜空泡形成。我們已證明農(nóng)桿菌與玉米或小麥組織的共培養(yǎng)導致與動物細胞中凋亡極其相似的過程，其中細胞死亡的特征在于DNA斷裂為寡核小體片段以及所定義的形態(tài)變化。在暴露于農(nóng)桿菌的玉米細胞中，Ca2+增加DNA片段化的強度而Zn2+具有相反的效應(yīng)，這與這些二價陽離子在動物細胞凋亡過程中對負責DNA斷裂的內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的效應(yīng)一致。此片段化也通過加入放線菌酮得到減弱，這是此過程需要從頭基因表達的證據(jù)。對暴露于農(nóng)桿菌應(yīng)答的程序性細胞死亡尚未見報道。已進一步發(fā)現(xiàn)在禾本科植物中觀察到的這種農(nóng)桿菌誘導的壞死(AIN)可通過使用AIN抑制劑諸如硝酸銀的化合物或者在要轉(zhuǎn)化的細胞中穩(wěn)定結(jié)合或暫時起作用的抑制AIN的核苷酸序列而得到抑制。通過篩選一系列農(nóng)桿菌樣品還發(fā)現(xiàn)農(nóng)桿菌菌株誘導壞死的能力不同，因此可篩選出適于轉(zhuǎn)化抗性植物如禾本科植物的菌株。因此，本發(fā)明包括以下幾個實施方案1.用目的基因轉(zhuǎn)化植物細胞的方法，包括將該植物細胞在抑制AIN的條件下(如存在AIN抑制劑或熱擊處理)暴露于農(nóng)桿菌，其中上述農(nóng)桿菌包含一種或多種含有一種或多種目的基因的質(zhì)粒。1.1.在前面方法的一個實施方案中，AIN抑制劑是化學抑制劑。化合物抑制劑優(yōu)選地選自乙烯抑制劑(如2，5-降冰片二烯、降冰片烯、硫代硫酸銀和硝酸銀)、乙烯合成抑制劑[如氨基乙氧基乙烯基甘氨酸(AVG)、鈷鹽、乙酰水楊酸或水楊酸]、赤霉素拮抗劑[如脫落酸(ABA)]和磷酸酶抑制劑(如岡田酸)的化合物。最優(yōu)選地，化學抑制劑是乙烯抑制劑；優(yōu)選地，化學抑制劑是硝酸銀。蛋白和肽也可作用為化學抑制劑。例子是天然存在的蛋白如DAD-1、凋亡的桿狀病毒抑制劑(IAP)、桿狀病毒p35或與能激發(fā)凋亡的半胱氨酸水解酯類似的合成肽。化學抑制劑適當?shù)匾杂行舛却嬖?，例如對于硝酸銀以0.1-20mg/l，優(yōu)選地1-10mg/l。1.2.1在此方法的可選實施方案中，AIN抑制劑是核苷酸序列。抑制AIN的核苷酸序列可直接抑制AIN或通過編碼可編碼AIN抑制蛋白的抑制AIN的mRNA來抑制AIN。例如，它可以是反義寡核苷酸或編碼反義mRNA的基因，它們對于編碼壞死相關(guān)酶(如蛋白酶、激酶或磷酸酶)或調(diào)節(jié)蛋白的基因是反義的。選擇性地，它可以包含在能在植物中表達的啟動子控制下的、能抑制凋亡的基因的編碼區(qū)，如在能在植物中表達的啟動子控制下的哺乳動物bcl-1基因的編碼區(qū)、來自桿狀病毒的凋亡抑制基因如p35或pIAP的編碼區(qū)或者能抑制植物中疾病反應(yīng)的基因如nahG、dad-1或mlo。表達AIN抑制蛋白的抑制AIN的核苷酸序列可通過制備編碼相同蛋白的合成核苷酸序列但使用宿主植物偏愛的密碼子并避免可影響宿主植物中最佳表達的核苷酸序列如聚腺苷酸化信號或編碼區(qū)內(nèi)部的剪切位點來選擇性地使之適應(yīng)在宿主植物中的表達，例如與US5,380,831或US5,610,042中所述的方法相類似。1.2.2抑制AIN的核苷酸序列可穩(wěn)定地整合入要轉(zhuǎn)化植物的基因組中或者可以僅僅是暫時，例如在細胞暴露于農(nóng)桿菌時或其左右存在并起作用。暫時表達可例如使用農(nóng)桿菌侵染系統(tǒng)獲得，其中T-DNA帶有一前一后兩個雙生病毒從而使帶有抑制AIN的核苷酸序列的病毒復制子可在細胞中復制。在此系統(tǒng)中，病毒典型地不整合入植物基因組中但將復制至高拷貝數(shù)并提供高水平的暫時表達。然后，這樣產(chǎn)生的對壞死有抗性的細胞可用帶有包含目的基因的Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，該質(zhì)粒將整合入基因組中，而病毒將通過再生得到稀釋并且不會傳遞給種子。因此受侵染植物的后代被目的基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)化而沒有被抑制AIN的核苷酸序列穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。選擇性地，可以通過將短的抑制AIN的寡核苷酸序列如反義序列導入植物而獲得暫時表達。1.3在另一可選實施方案中，AIN通過在與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)之前對要轉(zhuǎn)化的植物組織進行熱擊處理而得到減弱或受到抑制。熱擊處理在40-50℃，優(yōu)選地在42-48℃進行，45℃對于玉米是優(yōu)選的溫度。處理持續(xù)2-10分鐘并且優(yōu)選4-8分鐘。2.制備可育的、包含通過上面的方法1得到的轉(zhuǎn)化植物組織的轉(zhuǎn)基因植物，并再生這樣轉(zhuǎn)化的組織的方法。優(yōu)選地，組織選自未成熟胚或胚發(fā)生愈傷組織如玉米I型愈傷組織。當組織是未成熟胚時，方法優(yōu)選地進一步包含在暴露于農(nóng)桿菌之前或之后將胚置于愈傷誘導培養(yǎng)基上并從獲得的胚發(fā)生愈傷組織再生植物。優(yōu)選地，目的基因(或其中之一)是選擇性的或可評估的標記，允許篩選或鑒定轉(zhuǎn)化的細胞、轉(zhuǎn)化的組織和/或再生的轉(zhuǎn)化植物。3.在植物或其組織或細胞的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的方法或制備可育的轉(zhuǎn)基因植物的方法如根據(jù)上面1或2所述的方法中，AIN抑制劑如AIN的化學抑制劑(例如乙烯抑制劑如硝酸銀)或抑制AIN的核苷酸序列(例如編碼抑制AIN的mRNA或蛋白的序列)的用途。4.通過上面2的方法制備的轉(zhuǎn)基因植物或其種子或后代。5.包含抑制AIN的異源來源核苷酸序列如合成的核苷酸序列或來自不同生物物種的基因組的核苷酸序列的植物、植物組織或植物細胞。6.例如用于禾本科植物轉(zhuǎn)化的植物細胞或組織的培養(yǎng)物，包含a)AIN的化學抑制劑，b)包含含有目的基因的質(zhì)粒的農(nóng)桿菌，以及c)水和必需鹽類?；瘜W抑制劑適當?shù)匾砸种茐乃赖臐舛却嬖?。化學抑制劑優(yōu)選地選自乙烯抑制劑(如2，5-降冰片二烯、降冰片烯、硫代硫酸銀和硝酸銀)、乙烯合成抑制劑[如氨基乙氧基乙烯基甘氨酸(AVG)、鈷鹽、乙酰水楊酸或水楊酸]、赤霉素拮抗劑[如脫落酸(ABA)]和磷酸酶抑制劑(如岡田酸)的組中的化合物。最優(yōu)選地，化學抑制劑是硝酸銀，例如以0.1-20mg/l濃度，優(yōu)選1-10mg/l。必需鹽類的最佳組成和濃度為本領(lǐng)域人員所知并可在一定程度上依賴于細胞或組織的物種、類型和發(fā)育階段而變化，但一般來說將培養(yǎng)基中離子和營養(yǎng)物的濃度(如硝酸鹽、鉀離子、磷酸鹽、鈣離子、鎂離子、鈉離子和氯離子的濃度)維持在植物細胞和農(nóng)桿菌能很好耐受的水平。培養(yǎng)基可選擇性地進一步包含適當?shù)臓I養(yǎng)物質(zhì)(例如，糖如蔗糖)、維生素、氨基酸、激素和植物細胞或組織培養(yǎng)領(lǐng)域已知的其它成分(如2，4-D)。植物優(yōu)選地是禾本科植物如玉米。細胞或組織優(yōu)選地包含胚發(fā)生愈傷組織如I型或II型愈傷組織。7.轉(zhuǎn)化禾本科植物的全能細胞的方法，包括將全能細胞的群體或包含全能細胞的組織暴露于包含一種或多種含有一種或多種目的基因的質(zhì)粒的農(nóng)桿菌，其中農(nóng)桿菌是在暴露期間和足以完成上述細胞轉(zhuǎn)化的濃度下不在上述群體中誘導高水平壞死的菌株。組織優(yōu)選地是非頂端分生組織，例如優(yōu)選地是未分化的組織如平板接種的合子胚或胚發(fā)生愈傷組織，優(yōu)選地是起始期(如從起始培養(yǎng)基上平板接種起最多28天，優(yōu)選地最多14天)的胚發(fā)生愈傷組織或可連續(xù)繁殖的胚發(fā)生愈傷組織如I型或II型愈傷組織。8.測定農(nóng)桿菌菌株用于轉(zhuǎn)化禾本科植物的可再生細胞的適用性的方法，包括將上述植物的再生細胞群體暴露于農(nóng)桿菌菌株，并觀察或測定上述細胞群體中的壞死量。9.已經(jīng)遺傳修飾以減弱或消除農(nóng)桿菌壞死因子表達的農(nóng)桿菌菌株或這樣的修飾菌株的衍生物。農(nóng)桿菌壞死因子是在能在玉米胚中誘導壞死如程序性細胞死亡的濃縮上清中觀察到的熱不穩(wěn)定因子。農(nóng)桿菌和玉米細胞之間的不相容性可能涉及一些遺傳成分。本發(fā)明描述了三個來自農(nóng)桿菌參與玉米組織細胞死亡反應(yīng)的基因。它們是通過篩選農(nóng)桿菌的BAC文庫而得到鑒定的。發(fā)現(xiàn)3個獨立的引起細胞死亡的BAC并表現(xiàn)出與xylA-xylB、virB1和acvB的同源性。可能所報道的基因僅僅是決定農(nóng)桿菌與玉米組織間不相容性的基因的亞群。用于本發(fā)明方法的植物細胞優(yōu)選地來自在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化時不產(chǎn)生菌癭或發(fā)根的植物物種或變種。植物物種優(yōu)選地是禾本科(Gramineae)的成員，最優(yōu)選地是玉米或小麥，特別是玉米。植物細胞優(yōu)選地是全能細胞，即能自身再生成植物、優(yōu)選地可育植物的細胞。全能細胞存在于如未成熟胚和胚發(fā)生愈傷組織中。靶組織優(yōu)選地是非頂端分生組織。更優(yōu)選地，靶組織包含未分化的組織如平板接種的合子胚或胚發(fā)生愈傷組織。胚發(fā)生愈傷組織可以是愈傷組織起始期(如從在起始培養(yǎng)基上放置未成熟胚起最多28天，優(yōu)選地最多14天的時期)與胚結(jié)合的或者可以是能連續(xù)繁殖的胚發(fā)生愈傷組織如I型或II型愈傷組織。玉米I型愈傷組織是包含用于本發(fā)明的全能細胞的優(yōu)選組織。農(nóng)桿菌優(yōu)選地選自根瘤農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌。農(nóng)桿菌菌株優(yōu)選地是根瘤農(nóng)桿菌菌株，最優(yōu)選地是利用胭脂氨酸的菌株。當農(nóng)桿菌菌株是發(fā)根農(nóng)桿菌菌株時，它優(yōu)選地是利用農(nóng)桿氨酸和甘露氨酸的菌株。最優(yōu)選地，農(nóng)桿菌是不在禾本科植物中誘導壞死的農(nóng)桿菌如選自根瘤農(nóng)桿菌菌株A和B的農(nóng)桿菌。農(nóng)桿菌菌株A和B已根據(jù)布達佩斯條約于1997年5月2日分別在ATCC指定號55964和55965下保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)12301ParklawnDrive，Rockville，Maryland20852，美國。目的基因優(yōu)選地是除草劑抗性、疾病抗性或昆蟲抗性基因或者選擇性或可評估的標記基因，并包含植物可用的啟動子、編碼區(qū)和3’終止區(qū)。除草劑抗性基因包括對咪唑啉酮或磺酰脲除草劑有抗性的AHAS基因、對bialaphos和glufosinate有抗性的pat或bar基因、對草甘膦有抗性的EPSP合酶基因等。疾病抗性基因包括抗生素合成酶基因如pyrolnitrin合成酶基因、植物來源的抗性基因等。昆蟲抗性基因包括來自蘇云金芽孢桿菌的殺昆蟲蛋白基因。選擇性標記包括除草劑抗性基因和抗生素(如潮霉素或卡那霉素)抗性基因以及陽性選擇性標記如甘露糖磷酸異構(gòu)酶基因?？稍u估的標記包括易于分析的酶的基因如gus基因和cat基因。質(zhì)?？砂嘤谝环N目的基因和/或農(nóng)桿菌可包含帶有不同目的基因的不同質(zhì)粒。此處所用的術(shù)語農(nóng)桿菌誘導的壞死(AIN)是指任何農(nóng)桿菌介導的植物細胞死亡，但特別包括農(nóng)桿菌誘導的程序性細胞死亡。實施例實施例1暴露于農(nóng)桿菌的玉米中壞死的作用機制a.農(nóng)桿菌存在的情況下玉米而非煙草中壞死的證明已證明玉米的胚發(fā)生愈傷組織和胚對于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化是特別困難的組織。下面的實驗使用玉米自交系(ZeamaysL.)HE/89和這里定名為原種1的株系。玉米株系HE/89的易碎胚發(fā)生愈傷組織由GunterDonn提供。HE/89在Mórocz，S.，Donn，G.，Németh，J.和Dudits，D.(1990)Theor.Appl.Genet.80721-726中描述。原種1是與B73相關(guān)的Novartis所有的原種系。原種1的懸浮培養(yǎng)物從選自未成熟胚的易碎胚發(fā)生愈傷組織起始。HE/89株系在補加500mg/lBacto胰蛋白胨、30g/l蔗糖和0.5mg/l2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)的修飾液體N6培養(yǎng)基(N6M)中生長。原種1系在補加30g/l蔗糖和2mg/l2，4-D的N6液體培養(yǎng)基(2N63S)(Chu等，1975)中生長。在補加2mg/l2，4-D和蔗糖(30g/l)的Murashige和Skoog培養(yǎng)基(M53S)中生長的煙草細胞系NT-1用作農(nóng)桿菌易感的對照。懸浮培養(yǎng)物于旋轉(zhuǎn)搖床上(120rpm)保持在液體培養(yǎng)基中并且每7天傳代一次。細菌于28℃在YP培養(yǎng)基(5g/L酵母提取物、10g/l蛋白胨、5g/lNaCl，pH6.8)中生長24小時。細菌經(jīng)離心并在適當?shù)闹参锱囵B(yǎng)基中重新懸浮。為接種原種1、HE/89和N/T-1植物細胞，細菌分別重新懸浮于2N63SM、N6M和MS3S液體培養(yǎng)基中。在接種玉米胚發(fā)生愈傷組織后不久，許多細胞發(fā)生壞死(表1)。甚至在將處理的胚發(fā)生愈傷組織轉(zhuǎn)移到不含細菌、含氨噻肟頭孢霉素的培養(yǎng)基之后仍可觀察到壞死。將玉米細胞與非常稀的農(nóng)桿菌培養(yǎng)物共培養(yǎng)很短的時間就足以誘導玉米自交原種1的壞死反應(yīng)或生長的抑制。對于HE/89胚發(fā)生愈傷組織，短時間的共培養(yǎng)可在一定程序上減弱壞死，但不能完全防止壞死。在對照實驗中，氨噻肟頭孢霉素不引起玉米組織壞死。因此，看來壞死效應(yīng)是農(nóng)桿菌與玉米愈傷組織之間相互作用的結(jié)果。作為對照，NT1煙草細胞也接種了農(nóng)桿菌但未觀察到壞死。表1植物懸浮細胞與LBA4404的共培保存在液體培養(yǎng)基中的HE/89玉米和其特有的原種自交玉米的易碎的胚發(fā)生愈傷組織在轉(zhuǎn)移到含氨噻肟頭孢霉素的培養(yǎng)基中之前與農(nóng)桿菌一起培養(yǎng)10分鐘、1小時、24小時或48小時。將指示為最佳密度(OD＝600nm)的50μl細菌加入含1ml添加細胞體積的10ml組織培養(yǎng)基中。如果培養(yǎng)物要培養(yǎng)超過兩天，就洗去細菌并將植物細胞重新懸浮于補加氨噻肟頭孢霉素(250mg/l)的相同培養(yǎng)基中。壞死的存在或缺乏在接種后2、4和7天進行評估并且壞死的相對強度如下表示+，幾乎不形成壞死；++，弱壞死；+++，強壞死；++++，非常強壞死。b.程序性細胞死亡的證據(jù)為測定玉米組織中由農(nóng)桿菌誘導的細胞死亡的機制，從用農(nóng)桿菌接種后24或48小時收獲的植物懸浮細胞提取基因組DNA。暴露于農(nóng)桿菌在兩個玉米株系中引起具有核小體間片段化模式特征的DNA片段化，這認為是程序性細胞死亡的早期標志。單獨保存在培養(yǎng)基中的對照玉米細胞和煙草細胞在這些條件下未表現(xiàn)出DNA片段化。用大腸桿菌或高壓滅菌的農(nóng)桿菌細胞接種玉米細胞不引起DNA片段化。更進一步地，經(jīng)歷程序性細胞死亡的玉米細胞不誘導新鮮玉米胚發(fā)生組織的細胞死亡。農(nóng)桿菌誘導DNA片段化的進一步證據(jù)通過研究對Zn2+和Ca2+的敏感性過程來獲得。在HE/89細胞系中，Ca2+增加DNA梯狀的強度而相反Zn2+顯著地減弱基因組的片段化。這些特征與這些二價陽離子在動物系統(tǒng)凋亡過程中對負責DNA斷裂的內(nèi)源核酸內(nèi)切酶的效應(yīng)完全一致。梯狀的強度也因為放線菌酮的加入而降低，這是凋亡過程需要從頭基因表達的證據(jù)。這些結(jié)果表明農(nóng)桿菌與玉米細胞的接觸是導致玉米組織細胞死亡的原因。凋亡過程中的DNA片段化也通過與核小體單位上暴露的烴基反應(yīng)的試劑在原位得到檢測。用LBA4404接種來自Lancaster家系的特有原種系的12天齡玉米胚并平板接種在補加草滅畏(chlramben)的DG4培養(yǎng)基上。Koziel，M.G.等，1993生物/技術(shù)11194-200。凋亡細胞可通過用TACS-1試劑盒(Trevigen公司)原位染色來檢測，這包括使用與可檢測標記結(jié)合的dNTP，通過克列諾酶末端標記DNA片段，給出表明基因組片段化的黑色不溶沉淀。Cullivier，O.，Pirianov，G.，Kleuser，B.，Vanek，P.G.，Coso，O.A.，Gutking，J.S.和Spiegel，S.(1996)自然381，800-803。胚在3.7％的甲醛溶液中浸泡并按制造商所描述的操作。為在原位檢測基因組DNA斷裂，用TACS-1試劑盒處理固定的胚。固定的橫切片先用蛋白酶K在室溫處理5分鐘然后將其浸入2％過氧化氫5分鐘以去除內(nèi)源的過氧化物酶。用克列諾緩沖液簡單清洗之后，將組織與能將外源修飾的脫氧核苷酸摻入斷裂片段5’末端的克列諾酶一起在37℃溫育1小時。出現(xiàn)在單獨細胞中的指示凋亡的黑色不溶性沉淀可用顯微鏡檢測。農(nóng)桿菌處理的細胞在48小時暴露后變黑并且形狀扭曲。單獨保持在培養(yǎng)基中或用大腸桿菌接種的對照胚在這些條件下未表現(xiàn)任何沉淀。還發(fā)現(xiàn)并非所有玉米組織對農(nóng)桿菌侵染有相似反應(yīng)莖保持不變相反胚發(fā)生壞死。用不帶有病原質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌株(菌株A136和LBA4402)，也觀察到DNA片段化，表明引起程序性細胞死亡的因子與質(zhì)粒無關(guān)。當玉米胚與來自誘導細胞死亡的農(nóng)桿菌(菌株LBA4404)的20倍濃縮上清一起培養(yǎng)20分鐘時，也可觀察到程序性細胞死亡，但當胚與用相同方法從大腸桿菌制備的上清接觸時無此現(xiàn)象。如果濃縮的農(nóng)桿菌上清在接種前于100℃加熱20分鐘，程序性細胞死亡也不會發(fā)生。玉米胚發(fā)生愈傷組織經(jīng)常含有明顯活著的細胞區(qū)域以及壞死的其它區(qū)域。甚至在其中反應(yīng)區(qū)之外的細胞同時暴露于刺激物的情況下也僅有有限區(qū)域死亡的這一事實說明，在控制的形成器官的組織中單獨細胞對不同刺激物反應(yīng)的情況存在暫時或永久的差異。在形成器官的組織中，經(jīng)歷程序性細胞死亡的細胞數(shù)與總質(zhì)量相比可能很小并且該過程可能是不同期的。在給定區(qū)域或組織中的一個或一些細胞的PCD誘導可能激發(fā)如動物細胞中觀察到的周圍細胞的迅速死亡，后者細胞可能不表現(xiàn)程序性細胞死亡的表型但仍然走向死亡。實施例2抑制農(nóng)桿菌誘導的程序性細胞死亡用于制備農(nóng)桿菌接種的組織未成熟胚(長1.2-2.2毫米)在傳粉后14-15天從表面無菌的、溫室生長的谷穗上無菌切除，并將其盾片朝上平板接種到愈傷誘導培養(yǎng)基2DG4+5mg/l草滅畏(2DG4-5Chl)中。2DG4培養(yǎng)基是修改為含有20mg/l蔗糖的Duncan的培養(yǎng)基。有愈傷反應(yīng)的胚未成熟胚按上述的方法滅菌并平板接種到愈傷誘導培養(yǎng)基(2DG4-5Ch1)上培養(yǎng)1到7天。獲得的組織用作接種的樣品。幼I型愈傷組織平板接種于愈傷誘導培養(yǎng)基(2DG4+5草滅畏)上7天到20天的胚產(chǎn)生了愈傷組織。這些愈傷組織是對于所用的自交玉米典型的I型愈傷組織，它們是緊密而相對組織較好的細胞簇。將得到的胚發(fā)生愈傷組織從胚上切下并轉(zhuǎn)移到愈傷保持培養(yǎng)基2DG4+0.5mg/l(2，4-二氯苯氧)乙酸(2，4-D)上，并用作用于接種的樣品。I型愈傷組織通過上述方法獲得的I型愈傷組織可保存在保持培養(yǎng)基上(2DG4+2，4D0.5mg/l)并且每2周傳代一次。農(nóng)桿菌菌株根瘤農(nóng)桿菌LBA4404(pAL4404，pSB1)用于這些實驗中。pAL4404是去毒的輔助質(zhì)粒。pSB1是含有與pGIGUP同源的區(qū)域和來自pTiBo542毒性區(qū)域的15.2KbKpnI片段的廣譜宿主范圍質(zhì)粒(Ishida等，1996；由根瘤農(nóng)桿菌介導的玉米(ZeamaysL)的高效轉(zhuǎn)化，自然生物技術(shù)14，745-750)。通過電穿孔將質(zhì)粒pGIGUP導入LBA4404(pAL4404，pSB1)中導致pGIGUP和pSB1的共整合。此質(zhì)粒的T-DNA含有由遍在蛋白啟動子驅(qū)動的、提供膦絲菌素抗性的植物可表達的PAT基因和由Gelvin啟動子驅(qū)動的、在編碼序列的N-端密碼子中帶有內(nèi)含子的GUS基因。這個內(nèi)含子-GUS基因在植物細胞而不在農(nóng)桿菌中表達GUS活性。細菌生長農(nóng)桿菌在補加50ml/l壯觀霉素和10mg/l四環(huán)素的YP培養(yǎng)基(5g/l酵母提取物、10g/l蛋白胨、5g/lNaCl、15g/l瓊脂，pH6.8)中生長3天。細菌用接種環(huán)收集并以109-5×109細胞/ml密度范圍懸浮于N6液體培養(yǎng)基中。農(nóng)桿菌也可以從YP培養(yǎng)基的過夜培養(yǎng)物收集并重新懸浮于N6液體培養(yǎng)基中。存在或缺乏硝酸銀時的共培養(yǎng)按上述方法制備的玉米組織用農(nóng)桿菌接種。將玉米組織浸泡在細菌懸浮液中5-10分鐘，然后平板接種到有或無硝酸銀(1-10mg/l)的培養(yǎng)基上。組織也可用5μl109-5×109細胞/ml農(nóng)桿菌懸浮液滴劑接種于組織頂部。接種后，將玉米組織在有或無硝酸銀(1-10mg/l)的培養(yǎng)基中于25℃黑暗中培養(yǎng)。接種后2或3天，將組織轉(zhuǎn)移到補加氨噻肟頭孢霉素(250mg/l)的有或無硝酸銀的相同培養(yǎng)基中。結(jié)果玉米胚和玉米胚發(fā)生愈傷組織對農(nóng)桿菌的敏感性。當玉米胚平板接種到愈傷誘導培養(yǎng)基上時，可從玉米胚發(fā)育出胚發(fā)生愈傷組織。當來自胚的細胞系保持在含有2，4-D的培養(yǎng)基中時可維持高度胚發(fā)生能力。對此胚發(fā)生愈傷組織和來自玉米自交系的胚對農(nóng)桿菌LBA4404的敏感性進行評估。在農(nóng)桿菌和玉米組織共培養(yǎng)后觀察到組織的明顯變褐。用不帶有其病原質(zhì)粒的LBA4402，也可觀察到此反應(yīng)。與大腸桿菌共培養(yǎng)并經(jīng)歷相同步驟的對照胚和胚發(fā)生愈傷組織未表現(xiàn)細胞死亡或顯著變褐。因此，看來細胞死亡是玉米細胞和農(nóng)桿菌之間相互作用的結(jié)果?？磥砼邔r(nóng)桿菌比胚發(fā)生愈傷組織更敏感。109細胞/ml濃度足以誘導細胞死亡。而且，短時間的暴露(5分鐘)足以誘導此反應(yīng)。對在共培養(yǎng)培養(yǎng)基和愈傷誘導培養(yǎng)基中加入硝酸銀的效應(yīng)進行測定。加入硝酸銀可使健康組織得以恢復(表2和3)。約50％平板接種于含硝酸銀的培養(yǎng)基中的胚能產(chǎn)生胚發(fā)生愈傷組織。將胚在用農(nóng)桿菌接種之前平板接種到愈傷誘導培養(yǎng)基上至少2天可獲得最佳效應(yīng)。發(fā)現(xiàn)這兩個因子的結(jié)合顯著防止與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后的玉米胚發(fā)生愈傷組織的壞死。胚發(fā)生愈傷組織變褐的減弱與農(nóng)桿菌接種后愈傷組織誘發(fā)和組織的存活相關(guān)。約80％未經(jīng)農(nóng)桿菌處理的對照胚發(fā)生胚發(fā)生愈傷組織。用農(nóng)桿菌接種的I型愈傷組織，也觀察到硝酸銀的效應(yīng)(表3)?？磥碛仔≈晗祵r(nóng)桿菌接種更有抗性并且用硝酸銀預處理改善了健康組織的恢復。為證實共培養(yǎng)過程中硝酸銀的存在不降低農(nóng)桿菌的毒性，用109細胞/ml濃度的LBA4404(GIGUP)接種煙草葉片。觀察到煙草葉中的GUS活性沒有顯著下降。表2用LBA4404接種玉米胚用農(nóng)桿菌LBA4404(GIGUP)(109細胞/ml)接種胚和有胚發(fā)生愈傷反應(yīng)的胚?；九囵B(yǎng)基是2DG4+5草滅畏(2DG4)。所有處理對約80-100個胚進行并重復兩次。愈傷組織誘發(fā)在接種后兩周評估。<實施例3通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化未成熟合子胚并用膦絲菌素、潮霉素或甘露糖作為選擇試劑分離轉(zhuǎn)化的愈傷組織。未成熟胚在自花傳粉后大約10到14天獲得。未成熟合子胚從含有能誘導和支持胚發(fā)生愈傷組織形成的培養(yǎng)基的不同平板中以每板約25個未成熟胚的比例分化出來。按實施例2中所述在平板上或液體中用帶有包含選擇性標記基因的Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌接種。通過一系列實驗，發(fā)展用于未成熟胚的最佳條件。在一個最佳條件中，未成熟胚在用農(nóng)桿菌接種之前或接種后立即平板接種到含有硝酸銀(10mg/l)的愈傷誘導培養(yǎng)基上。每個平板上放置約25個未成熟胚。接種后16到72小時，將來成熟胚轉(zhuǎn)移到含有硝酸銀和氨噻肟頭孢霉素的愈傷誘導培養(yǎng)基中。轉(zhuǎn)化細胞的選擇如下進行a.PPT抗性標記用帶有含有在T-DNA區(qū)編碼膦絲菌素抗性基因的質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌株進行轉(zhuǎn)化。通過在接種后2到20天使用3mg/L濃度的膦絲菌素并維持共2-12周在體外選擇轉(zhuǎn)化細胞。這樣獲得的胚發(fā)生愈傷組織在存在或缺乏膦絲菌素的標準再生培養(yǎng)基中再生。所有植物通過氯酚紅(CR)測試檢測其對PPT的抗性。此分析利用pH敏感指示染料顯示哪些細胞在PPT存在時生長。生長的細胞在培養(yǎng)基中產(chǎn)生pH變化并使指示劑氯酚紅變黃(由紅)。表達PPT抗性基因的植物在此測試中可容易地得到鑒定。CR測試陽性的植物通過PCR分析PAT基因的存在。PCR測試陽性的植物通過Southern印跡分析。b.潮霉素抗性標記用帶有包含在T-DNA區(qū)編碼潮霉素抗性基因(hpt，潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶)的質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌株進行轉(zhuǎn)化。通過在接種后2到20天使用3mg/L濃度的潮霉素并維持共2-12周選擇轉(zhuǎn)化細胞。這樣獲得的胚發(fā)生愈傷組織在存在或缺乏選擇性試劑的再生標準培養(yǎng)基中再生。測試所有植物對潮霉素的抗性。表達潮霉素抗性基因的植物可在此則試中容易地得到鑒定。此測試陽性的植物通過PCR分析hpt基因的存在。PCR測試陽性的植物通過Southern印跡分析。c.使用甘露糖的陽性選擇用帶有含有在T-DNA區(qū)編碼甘露糖耐受性基因(甘露糖磷酸異構(gòu)酶)的質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌株進行轉(zhuǎn)化。甘露糖用于在體外篩選轉(zhuǎn)化細胞。此選擇可在接種后2到20天用1g/L低濃度進行并維持共2-12周。這樣獲得的胚發(fā)生愈傷組織可在存在或缺乏甘露糖的標準再生培養(yǎng)基上再生。所有植物通過氯酚紅(CR)測試檢測其對甘露糖的耐受性。此分析利用pH敏感的指示劑染料顯示哪些細胞在甘露糖存在時生長。生長的細胞在培養(yǎng)基中產(chǎn)生pH變化并使指示劑氯酚紅由紅變黃。表達甘露糖耐受性的植物可在此測試驗中容易地得到鑒定。CR測試陽性的植物通過PCR分析甘露糖基因的存在。PCR測試陽性的植物通過Southern印跡分析。實施例4用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化來自未成熟合子胚的愈傷組織并用磷絲菌素、潮霉素和甘露聚糖作為選擇性試劑分離轉(zhuǎn)化的愈傷組織用常規(guī)培養(yǎng)技術(shù)從未成熟合子胚獲得I型愈傷組織。在用農(nóng)桿菌接種之前或之后將約15塊I型愈傷組織放置于含有硝酸銀的保持培養(yǎng)基上。接種可按實施例2中所述的進行。接種后約16-72小時將愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有硝酸銀和氨噻肟頭孢霉素的標準培養(yǎng)基上。篩選可在轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基上后立即或在1到20天后進行。然后將愈傷組織在選擇中傳代培養(yǎng)約2至12周，之后將存活和生長的細胞轉(zhuǎn)移到標準再生培養(yǎng)基上以產(chǎn)生植物。對于用膦絲菌素抗性、潮霉素抗性基因或甘露糖磷酸異構(gòu)酶基因轉(zhuǎn)化的細胞，按前面實施例中所述的進行選擇。實施例5通過用農(nóng)桿菌接種轉(zhuǎn)化玉米的I型愈傷組織并用膦絲菌素、潮霉素和甘露糖作為選擇性試劑分離轉(zhuǎn)化的愈傷組織愈傷組織來自平板接種的原種表型的未成熟胚。培養(yǎng)物在保持培養(yǎng)基(2DG4+0.5mg/l2，4-D)上一月兩次傳代并且將傳代后2-3天的細胞團置于2DG4培養(yǎng)基上。在用農(nóng)桿菌接種之后或之前，將細胞團置于含有硝酸銀的2DG4培養(yǎng)基上。用農(nóng)桿菌接種可按實施例2中所述的進行。接種后16到72小時，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有氨噻肟頭孢霉素和硝酸銀的新鮮保持培養(yǎng)基上。愈傷組織用選擇性試劑在選擇中傳代培養(yǎng)總共約2-12周，之后將存活和生長的細胞轉(zhuǎn)移到標準再生培養(yǎng)基上以產(chǎn)生植物。對于膦絲菌素抗性、潮霉素抗性基因或甘露糖異構(gòu)酶基因轉(zhuǎn)化的細胞，按前面實施例中所述的進行篩選。實施例6熱擊處理防止農(nóng)桿菌激發(fā)的凋亡未成熟胚玉米自交系在溫室中生長。未成熟胚(長0.8-2.2mm)在傳粉后8到15天之間(依賴于環(huán)境因素)從表面無菌的谷穗上無菌切除。將胚盾片朝上平板接種于愈傷誘導培養(yǎng)基上。對于大多數(shù)自交系，將胚接種于LS培養(yǎng)基(Linsmaier和Skoog，植物生理學.18100-127，1965)上。將CG00526的胚放在2DG4+5gmg/l草滅畏(2DG4-5Chl)上。2DG4培養(yǎng)基是修改為含有20mg/l蔗糖的Duncan培養(yǎng)基(Koziel等，生物/技術(shù)11194-200，1993)。I型愈傷組織未成熟胚如上所述滅菌并平板接種于愈傷誘導培養(yǎng)基(2DG4-5Chl)上并在其中培養(yǎng)1到7天。平板接種于愈傷誘導培養(yǎng)基(2DG4+5Chl)上7到20天的胚產(chǎn)生了愈傷組織。這些愈傷組織是典型的I型愈傷組織。I型愈傷組織是相對組織較好的細胞的緊密的簇。將所得的胚發(fā)生愈傷組織從胚上切下并轉(zhuǎn)移到愈傷保持培養(yǎng)基2DG4+0.5mg/l2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)上并用于接種。通過上述方法獲得的I型愈傷組織可在保持愈傷組織培養(yǎng)基(2DG4+2，4D0.5mg/l)上保存并大約每2周傳代培養(yǎng)一次。農(nóng)桿菌所用菌株是根瘤農(nóng)桿菌LBA4404(pAL4404，pSB1)。pAL4404是去毒的輔助質(zhì)粒(Ooms等，715-29，1982)。pSB1是含有與pGIGUP同源的區(qū)域和來自pTiBo542毒性區(qū)的15.2kbkpnI片段的廣譜宿主范圍質(zhì)粒(Ishida等，自然生物技術(shù)14，745-750，1996)。通過電穿孔將質(zhì)粒pGIGUP導入LBA4404(pAL4404，pSB1)中導致pGIGUP和pSB1的共整合。pGIGUP含有由玉米遍在蛋白啟動子驅(qū)動的、提供膦絲菌素抗性的、可在植物中表達的膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)基因(Christensen等，植物分子生物學，18675-689，1992)。它還含有由來自章魚氨酸和甘露氨酸合酶基因的嵌合啟動子驅(qū)動的、在編碼序列的N-端密碼子中帶有內(nèi)含子的、用于β-葡糖醛酸酶表達的基因(GUS)(章魚氨酸合酶啟動子上游活化序列與甘露氨酸合酶啟動子結(jié)構(gòu)域的三聚體，Ni等，植物雜志，7661-676，1995)。此內(nèi)含子-GUS基因在植物細胞但不在農(nóng)桿菌中表達GUS活性。農(nóng)桿菌在補加50mg/l壯觀霉素和10mg/l四環(huán)素的YP培養(yǎng)基(5g/l酵母提取物、10g/l蛋白胨、5g/lNaCl瓊脂，pH6.8)中生長3天。細菌用接種環(huán)收集并以109-5×109細胞/ml密度范圍懸浮于N6液體培養(yǎng)基中。選擇性地，從YP培養(yǎng)基中的過夜培養(yǎng)物收集農(nóng)桿菌并將其重新懸浮于N6液體培養(yǎng)基中。它也可在農(nóng)桿菌誘導培養(yǎng)基[AIM；K2HPO4，10.5g；KH2PO4，4.5g(NH4)2SO4，1.0g；NaCitrate·2H2O，0.5g；MgSO4H2O(1M)，1.0ml；葡萄糖，2.0g；甘油，5.0ml；MES(10mM)；乙酰丁香酮(50-100μm)；pH5.6)中預誘導4到6小時。組織的熱擊處理共培養(yǎng)前，將玉米組織置于裝有N6液體培養(yǎng)基的離心管中并在水浴中于45℃培養(yǎng)4分鐘。然后用如上所述制備的農(nóng)桿菌懸浮液替換培養(yǎng)基。于室溫5分鐘后，將組織平板接種于適當?shù)墓腆w培養(yǎng)基上。共接種后3天，將組織用X-Glu染色以檢測GUS活性或平板接種于含有氨噻肟頭孢霉素(250mg/l)的培養(yǎng)基上。然后測試玉米組織以檢測表明農(nóng)桿菌接種后組織存活百分率的愈傷反應(yīng)。共培養(yǎng)按上述方法制備的玉米組織用農(nóng)桿菌接種。將它們浸泡于細菌懸浮液中5-10分鐘并然后平板接種于固體培養(yǎng)基上。接種之后，玉米組織于25℃黑暗中培養(yǎng)。接種后2或3天，將組織轉(zhuǎn)移到補加氨噻肟頭孢霉素(250mg/l)的相同培養(yǎng)基上。原位檢測DNA片段化將胚浸泡于3.7％甲醛溶液中并按照制造商(Trevigen公司)所描述的操作。為在原位檢測基因組DNA的斷裂，用TACS-1試劑盒處理固定的胚(Cullivier等，自然381800-803，1996)。固定的橫切片先用蛋白酶K于室溫處理5分鐘然后將其浸入2％過氫化氫5分鐘以去除內(nèi)源的過氧化物酶。用克列諾緩沖液簡單清洗之后，將組織與能將外源修飾的脫氧核苷酸摻入斷裂片段5’末端的克列諾酶于37℃培養(yǎng)1小時。出現(xiàn)在單獨細胞中指示凋亡的黑色不溶沉淀可用顯微鏡檢測。結(jié)果農(nóng)桿菌與玉米組織共培養(yǎng)之后觀察到嚴重的變褐現(xiàn)象并且109細胞/ml濃度可誘導細胞死亡。看來胚對農(nóng)桿菌比胚發(fā)生愈傷組織更敏感。胚和I型愈傷組織經(jīng)熱擊然后用109細胞/ml濃度的農(nóng)桿菌進行接種。共培養(yǎng)3天后并培養(yǎng)一周之后，對組織進行測試。通過計數(shù)從接種存活下來的組織數(shù)對由熱擊預處理賦予的保護水平進行定量。所有用農(nóng)桿菌接種的胚在熱擊預處理之后表現(xiàn)愈傷組織的發(fā)生而相反從未經(jīng)熱擊的胚中沒有愈傷組織出現(xiàn)(表4)。表4胚用109細胞/ml的農(nóng)桿菌LBA4404(pGIGUP)接種然后平板接種于愈傷誘導培養(yǎng)基上?；九囵B(yǎng)基是2DG4+5Chl(2DG4)。所有處理對約80到100個胚進行并重復兩次。愈傷組織誘發(fā)在接種兩周后評估。</tables>在愈傷組織中觀察到與熱擊處理相同的有益效應(yīng)(表5)。表5用109細胞/ml農(nóng)桿菌LBA4404(pGIGUP)接種I型愈傷組織。所用的基本培養(yǎng)基是2DG4+0.52，4D(2DG4)。所有實驗對約1000塊I型愈傷組織進行。組織存活在接種2周后評估。熱擊處理后觀察到的保護作用看來與熱擊有關(guān)，因為可通過RT-PCR擴增到主要熱擊蛋白。在經(jīng)受熱擊處理的胚中未檢測到DNA片段化。來自不同玉米株系的胚用在AIM溶液中誘導的經(jīng)過或未經(jīng)過熱擊預處理的農(nóng)桿菌菌株LBA4404接種。共培養(yǎng)3天之后，對胚進行GUS活性染色。結(jié)果在表6中表示?？磥頍釗纛A處理在暫時表達中具有有益的效應(yīng)。表6-未經(jīng)熱擊HS熱擊*GUS百分率是基于大小約為50個未成熟胚的樣本。**GUS率是基于0-5級(0＝無GUS染色，1＝1-5點/胚，2＝5-15點，3＝15-30點，4＝～25％胚表面GUS染色，5＝～50％胚表面GUS染色)。實施例7小麥的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化切下來成熟合子胚(0.75mm到1.25mm)并將其平板接種到基于MS含3mg/l2，4-D、300mg/l谷氨酰胺、150mg/l天冬酰胺和3％蔗糖的培養(yǎng)基(3MS3S)上，在用農(nóng)桿菌接種前培養(yǎng)0，3，4，5，6，7，8或21天。到第21天時，外植體產(chǎn)生胚發(fā)生物質(zhì)稱為3周齡愈傷組織。共培養(yǎng)按實施例6中所述的用農(nóng)桿菌接種小麥組織。將小麥組織浸泡于細菌懸浮液中5-10分鐘然后平板接種到固體培養(yǎng)基。接種之后，將小麥組織于25℃黑暗中培養(yǎng)。接種2或3天后，將組織轉(zhuǎn)移到補加氨噻肟頭孢霉素(250mg/l)的相同培養(yǎng)基上。外植體不經(jīng)預處理就進行接種或者它們于42-48℃熱擊4-8分鐘。熱擊處理在接種前進行。胚可以在3MSinf中或含有100mMAS液體的AIM中進行熱擊而相反愈傷組織是“干”熱擊。接種外植體可以離心管中或平板上進行接種。當在離心管中接種時，將1ml農(nóng)桿菌溶液移入管中，用手指旋轉(zhuǎn)或搖動并使其靜置5-15分鐘。然后將農(nóng)桿菌溶液和外植體材料倒在含100mMAS的2MS3S平板上并用一次性窄頭移液管去除液體。當接種在平板上進行時，將農(nóng)桿菌直接移到外植體上并在5-15分鐘后去除。胚經(jīng)過整理從而使胚軸與培養(yǎng)基相接觸。愈傷組織誘發(fā)、篩選和再生胚在含有抗生素的愈傷組織誘導培養(yǎng)基(3MS3S)中生長3周。將胚發(fā)生愈傷組織切開并置于含有5mg/lGA3和1mg/lNAA以及選擇試劑和抗生素的MS3S(非2，4D)上2周，然后將其轉(zhuǎn)移到含有抗生素和更高濃度篩選試劑的MS3S上約4周。然后在保持與上一步相同的選擇試劑濃度的情況下，將胚轉(zhuǎn)移到含有1/2MS鹽和0.5mg/lNAA的品紅盒。對于愈傷組織，篩選和再生系統(tǒng)是相同的，除了愈傷組織在胚平板接種后僅生長最多6周，也就是說，愈傷組織接種3周，在篩選和再生開始前共培養(yǎng)和生長最多3周。結(jié)果按實施例6中所述的方法研究用農(nóng)桿菌接種的胚中DNA的片段化。經(jīng)熱擊預處理的胚中未檢測到DNA片段化。在農(nóng)桿菌接種前的熱擊預處理能防止凋亡發(fā)生。實施例8通過p35和iap抑制玉米細胞中農(nóng)桿菌誘導的凋亡用于biolistic轉(zhuǎn)化的載體用于通過biolistic裝置轉(zhuǎn)化玉米的載體都是pUC的衍生物。pUbiPAT包含由玉米遍在蛋白啟動子(Christensen等，1992)驅(qū)動的、提供膦絲菌素(PPT)抗性的、編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶的植物可表達的bar基因。p35，iap和dad-1的編碼區(qū)克隆在玉米金屬硫蛋白樣基因啟動子(MTL)的控制之下(deFramond，1991)。p35和iap由LoisMiller(喬治亞大學，Athens，喬治亞)提供。將包括編碼區(qū)的p35PstI-EcoRI片段從pHSP35VI+切下(Chem和Miller，1994)，克隆入pBluescript(Stratagene，Lajolla，加利福尼亞)的相應(yīng)位點，然后作為PstI-Asp718片段克隆入pMTL的相應(yīng)位點。pMTL含有MTL啟動子和CaMV35S終止子。包含來自pHSCpIAPVL+(Clem和Miller，1994)的iap編碼區(qū)的SalI-SpeI片段克隆入pMTL的XhoI-SpeI位點。將dad-1的編碼序列作為來自擬南芥cDNA克隆12T7(密歇根大學)的SalI-XbaI片段進行克隆。用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的載體將由MTL啟動子驅(qū)動的p35、iap和dad-1的編碼區(qū)克隆入超級雙元載體pSB11邊界序列之間。在編碼序列的N-端密碼子中含有內(nèi)含子的β-葡糖醛酸酶基因(GUS)由來自章魚氨酸和甘露氨酸合酶基因的嵌合啟動子驅(qū)動(mas；章魚氨酸合酶啟動子上游活化序列與甘露氨酸合酶啟動子區(qū)的三聚體；Ni等，1995)。將在植物細胞中但不在農(nóng)桿菌中表達GUS活性的Mas-Gus克隆入pSB11中以獲得pMasGUS。然后將這些載體通過電穿孔用0.2cmBio-Rad公司小容器以2kV/cm場強、600Ohms電阻和25μF電容導入LBA4404(pAL4404，pSB1)中。pSB1是含有與pSB11同源的區(qū)域和來自pTiBo542毒性區(qū)的15.2kbKpnI片段的廣譜宿主范圍質(zhì)粒(Ishida等，1996)。通過電穿孔將質(zhì)粒pSB11導入LBA4404(pAL4404，pSB1)導致pSB11和pSB1的共整合。用農(nóng)桿菌接種玉米胚在傳粉后12到15天無菌切下未成熟胚(0.8到2.5mm)并將其盾片向上平板接種于愈傷誘導培養(yǎng)基(2DG4+5草滅畏；Duncan等，1985)上。胚用109細胞/ml密度的農(nóng)桿菌接種5分鐘然后在愈傷誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天。然后將組織轉(zhuǎn)移到補加氨噻肟頭孢霉素(250mg/l)的相同培養(yǎng)基上。組織的存活在接種2周后評估。I型愈傷組織的起始平板接種于愈傷誘導培養(yǎng)基7到20天的胚產(chǎn)生了愈傷組織。這些愈傷組織是典型I型愈傷組織，它們是相對組織較好的細胞的緊密簇(Suttie等，1994)。將所得的胚發(fā)生愈傷組織從胚上切下并轉(zhuǎn)移到愈傷保持培養(yǎng)基2DG4+0.5mg/l(2，4-二氯苯氧)乙酸(2，4-D)上。通過上述方法獲得的I型愈傷組織可在保持培養(yǎng)基(2DG4+2，4D0.5mg/l)上保存并且大約每2周傳代培養(yǎng)一次。I型愈傷組織用于農(nóng)桿菌的接種實驗和通過biolistic裝置進行的轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化實驗按DuPontBielistic手冊中所描述的將質(zhì)粒DNA沉淀在0.3到1μm金微載體上。每50μl微粒載體使用2μg抗凋亡基因和2μgpUbiPAT。用PDS-1000/Hebiolistic裝置(DuPont公司)轟擊每個平板上的16塊I型愈傷組織。將組織置于停止屏層8cm下的層上并使用帶有650psi值破裂板的10×10μm不銹鋼屏。轟擊之后，將組織于25℃黑暗中培養(yǎng)一天，然后轉(zhuǎn)移到愈傷保持培養(yǎng)基2DG4+0.5mg/l2，4-D上。10天后，將組織轉(zhuǎn)移到補加100mg/lPPT的相同培養(yǎng)基上。六到八周后，將組織轉(zhuǎn)移到含40mg/lPPT的培養(yǎng)基上。然后將一些組織用于接種實驗并將其中一些轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基(含有3％蔗糖、0.25mg/lancymitol和5mg/l激動素的Murashige和Skoog培養(yǎng)基)上，每天16小時光照。轉(zhuǎn)化的植物使用氯酚紅(CR)分析測試PPT抗性來進行鑒定(Cramer等，1993)，然后通過PCR證實。用農(nóng)桿菌接種轉(zhuǎn)基因I型愈傷組織按上述方法獲得的轉(zhuǎn)基因I型組織用農(nóng)桿菌接種。將玉米組織浸泡于細菌懸浮液中5-10分鐘。接種后，將玉米組織于25℃在2DG4+0.5mg/l2，4-D中避光培養(yǎng)。接種后2或3天，將組織轉(zhuǎn)移到補加氨噻肟頭孢霉素(250mg/l)的相同培養(yǎng)基上。轉(zhuǎn)基因物質(zhì)的分析用Isoquick試劑盒(Microprobre公司，CA)從100mg愈傷組織中提取基因組DNA并將其重新懸浮于20μl水中。1μl用于PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)在用1×PCR緩沖液、0.5單位AmpliTaq酶、200μM每種dNTP、0.2μM每種引物的25μl反應(yīng)中Perkin-Elmer熱循環(huán)儀上進行。為檢測組織中pat基因的存在，用PAT引物以55℃的退火溫度進行PCR反應(yīng)。對于轉(zhuǎn)基因組織中iap、p35和dad-1基因的檢測，用于每個反應(yīng)的引物是P和I、P和35、P和D，退火溫度分別是55℃、55℃、48℃。PAT15′-TGTCTCCGGAGAGGAGACC-3′(SEQIDNO1)PAT25′-CCAACATCATGCCATCCACC-3′(SEQIDNO2)MTL(P)5′AGGTGTCCATGGTGCTCAAG-3′(SEQIDNO3)iap(I)5′ACAATCGAACCGCACACGTC-3′(SEQIDNO4)p35(35)5′CCAGGTAGCAGTCGTTGTGT-3′(SEQIDNO5)dad-1(D)5′CCTTGTTTCCTTTGTTCACT-3′(SEQIDNO6)p35和iap的RT-PCR用Tripure分離試劑(BoehringerMannheim公司)從轉(zhuǎn)基因愈傷提取總RNA，用無RNA酶的DNA酶處理，取0.5μg使用高級RT-PCR(Clothech公司)和oligo-dT引物進行cDNA合成。第二鏈合成之后，此反應(yīng)的二十分之一用作TaqDNA聚合酶PCR反應(yīng)的模板。用于RT-PCR的p35引物是5’-GGTCCTATACGAAGCGTTAC-3’(SEQ1DNO7)和5’-CCACGTAGCAGTCGTTGTGT-3’(SEQ1DNO8)擴增300bp轉(zhuǎn)錄本。用于RT-PCR的iap引物是5’-CATGTCTGACTTGCGATTGG-3’(SEQ1DNO9)和5’-ACAATCGAACCGCACACGTC-3’(SEQ1DNO10)擴增248bp轉(zhuǎn)錄本。為排除基因組DNA的污染，平行進行其中不加逆轉(zhuǎn)錄酶的對照cDNA反應(yīng)。結(jié)果大多數(shù)胚和胚發(fā)生愈傷組織不能在農(nóng)桿菌接種后存活。短時間的暴露(5分鐘)是以誘導此反應(yīng)。與大腸桿菌共培養(yǎng)并經(jīng)歷相同步驟的組織未表現(xiàn)出任何損傷。將p35、iap和dad-1克隆入植物表達盒中T-DNA邊界序列之間。由于這些抗凋亡基因由T-DNA攜帶，因此在接種時它們將轉(zhuǎn)遞到玉米細胞中。用有或無細胞死亡抑制基因(括號中)的農(nóng)桿菌LBA4404(109細胞/ml)接種玉米組織。共培養(yǎng)之后，測試玉米胚或I型愈傷組織以對組織存活進行定量，作為通過表達抗凋亡基因賦予的保護水平的指示。所有實驗對約50到80個玉米外植體進行并重復兩次。在接種后3天將組織轉(zhuǎn)移到含有氨噻肟頭孢霉素的相同培養(yǎng)基中。農(nóng)桿菌的效應(yīng)在接種后兩周評估。結(jié)果分別表示于表7和表8中。表7(胚)表8(I型愈傷組織)約80％的胚在未用農(nóng)桿菌處理時產(chǎn)生胚發(fā)生愈傷組織。約25％的用帶有p35或iap基因的農(nóng)桿菌處理的胚產(chǎn)生胚發(fā)生愈傷組織而相反用不帶這些基因的農(nóng)桿菌接種的胚僅有3％表現(xiàn)愈傷組織發(fā)生。在用帶有p35或iap基因的農(nóng)桿菌接種I型愈傷組織時，觀察到類似效應(yīng)(表2)。dad-1在任何系統(tǒng)中只賦予低水平的保護?？磥韕35和iap的暫時表達在一定程度上減弱組織的變褐但不完全抑制此現(xiàn)象。這可以用T-DNA向玉米細胞轉(zhuǎn)移的低效率來解釋。如通過GUS的暫時表達所判斷的，看來靶組織沒有均勻轉(zhuǎn)化。這可以是極少細胞是T-DNA受體的證據(jù)。從用含有p35或iap的農(nóng)桿菌接種的胚產(chǎn)生的胚發(fā)生愈傷組織的結(jié)構(gòu)不象對照組那樣緊密。這可以通過只有接受了帶有抗凋亡基因的T-DNA的細胞才能存活以及單獨的轉(zhuǎn)化細胞不必然將信號傳遞給相鄰細胞的事實來解釋。這種組織生長的類型可作為細胞死亡抑制基因非常有效地挽救死亡細胞但它們的短期表達不能提供對農(nóng)桿菌影響的完全保護的證據(jù)。轉(zhuǎn)基因p35、iap和dad-1的胚發(fā)生愈傷組織是使用微粒轟擊將受控于植物可表達的啟動子的上述基因轉(zhuǎn)移入I型愈傷組織得到的。構(gòu)建體與bar基因一起轟擊，組織在PPT上選擇并且這些愈傷組織的轉(zhuǎn)化狀態(tài)通過PCR首先證實(表9)。表9然后對獨立的情況分析對農(nóng)桿菌接種的敏感性。用農(nóng)桿菌LBA4404(109細胞/ml)接種愈傷組織。測試兩個獨立的轉(zhuǎn)基因愈傷系。所有處理重復兩次。將組織在接種3天后轉(zhuǎn)移到含有氨噻肟頭孢霉素的相同培養(yǎng)基上。玉米組織的存活在用農(nóng)桿菌接種后兩周評估(表10)。表10轉(zhuǎn)基因p35和iap的胚發(fā)生愈傷組織用農(nóng)桿菌接種時不表現(xiàn)細胞死亡而相反在共培養(yǎng)之后的對照組織中可觀察到嚴重變褐現(xiàn)象。dad-1基因的存在延遲了凋亡的發(fā)生但不阻止細胞死亡，iap和p35也是這樣。結(jié)果在幾個獨立實驗中是可重復的。當用寡核小體DNA片段電泳測定時，p35和iap的保護效應(yīng)也是明顯的。看來，dad-1的效應(yīng)當在組織中穩(wěn)定表達時更為明顯。在抗凋亡基因的表達與細胞死亡的消失之間有明顯的聯(lián)系。如通過反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)判斷的，p35和iap基因在轉(zhuǎn)基因愈傷中表達。對照都是陰性的。實施例9篩選和鑒定不誘導玉米細胞中細胞死亡的農(nóng)桿菌菌株用一組40個野生型農(nóng)桿菌菌株測試已深入研究的玉米株系(A188)和特有的原種系(原種2)的胚發(fā)生愈傷組織和胚對不同農(nóng)桿菌菌株的敏感性。首先測試這些菌株與A188和原種2胚發(fā)生愈傷組織和胚的相容性。其中，40個菌株中的6個不完全阻止玉米組織的生長，并且進一步對平板接種到愈傷誘導培養(yǎng)基上的原種2胚進行測試并以109細胞/ml濃度接種。在接種后2周評估愈傷的發(fā)生并表示為有反應(yīng)的胚的百分比。還測試了這些菌株對平板接種于不含激素培養(yǎng)基上的煙草葉片的毒性，并且應(yīng)當指出菌株誘導玉米細胞中程序性細胞死亡的能力與毒性無關(guān)。表11中的百分比描述了有腫瘤的葉片數(shù)目。表11非致死菌株的毒性比較好的I型愈傷組織。農(nóng)桿菌菌株A和B已在布達佩斯條約下于1997年5月2日分別以ATCC指定號55964和55965保藏于ATCC。實施例10農(nóng)桿菌基因在玉米細胞中激發(fā)凋亡為鑒定玉米胚發(fā)生組織中決定細胞死亡反應(yīng)的遺傳因子，用約100-200kb的農(nóng)桿菌基因組DNA片段構(gòu)建BAC文庫(細菌人工染色體)。將文庫導入大腸桿菌中。為檢查這樣的背景是否適于BAC文庫的篩選，用只含有BIBAC載體的大腸桿菌接種玉米胚。發(fā)現(xiàn)大腸桿菌不誘導特征性凋亡反應(yīng)。假定農(nóng)桿菌的基因組大小與大腸桿菌(4.6×106bp)完全相同，估計約25到30個含有150-200kb插入片段的BAC克隆足以覆蓋農(nóng)桿菌完整基因組。為測試在大腸桿菌中制備的BAC文庫是否是農(nóng)桿菌基因組的確定代表，用農(nóng)桿菌染色體探針(chvD)與相對較大數(shù)目的克隆(200)雜交。在測試的200個克隆中，5個與chvD探針發(fā)生反應(yīng)(數(shù)據(jù)未表示)。一個挑戰(zhàn)是，來自農(nóng)桿菌的遺傳成分可能在大腸桿菌中是沉默的。而且，來自植物和/或農(nóng)桿菌的其它因子可能是這樣的克隆表達必需的。因此，BAC載體也包含農(nóng)桿菌中有功能的復制起點并能在這樣的方案中容易地轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌中。細菌生長農(nóng)桿菌當需要時在補加100mg/l卡那霉素的YP培養(yǎng)基(5g/l酵母提取物、10g/l蛋白胨、5g/lNaCl、15g/l瓊脂，pH6.8)中生長3天。細菌用接種環(huán)采集并以109-5×109細胞/ml范圍的密度懸浮于N0液體培養(yǎng)基中。農(nóng)桿菌也可以從YP培養(yǎng)基中的過夜培養(yǎng)物收集并重新懸浮于N6液體培養(yǎng)基中。大腸桿菌DH10B在LB培養(yǎng)基(1％Bacto-胰化蛋白胨、0.5％Bacto酵母提取物、170mMNaCl，pH7.0)中生長。轉(zhuǎn)化之后在SOC溶液(2％Bacto胰蛋白胨、0.5％Bacto酵母提取物、10mMNaCl、2.5mMKCl、10mMMgCl2、10mMMgSO4、20mM葡萄糖，pH7.0)中生長。從農(nóng)桿菌制備基因組DNALBA4404菌株用于文庫的構(gòu)建。所用的方案、材料和試劑來自Imbed試劑盒(Biolabs公司，美國)。4×10ml農(nóng)桿菌培養(yǎng)物于28℃生長過夜。收獲前一小時，加入180mg/ml氯霉素以排列染色體。將細胞在800g于4℃離心15分鐘并使沉淀在空氣中干燥。細胞在包埋于瓊脂糖之前于0.5ml細胞懸浮溶液(10mMTris-HCl、20mMNaCl、10mMEDTA，pH7.2)中預保溫到42℃。將農(nóng)桿菌細胞包埋在瓊脂糖桿中以進行細胞壁的降解和去蛋白作用從而避免DNA斷裂。為將細胞包埋于瓊脂糖桿中，將細胞與冷卻至42℃等體積的ddH2O中的1％低熔點瓊脂糖混合然后使之在凝膠注射模中硬化。在瓊脂糖固化后，將填料轉(zhuǎn)移到3體積的溶菌酶溶液(1mg/ml溶菌酶、10mMTris-HCl、50mMNaCl、10mMEDTA、0.2％脫膠氧膽酸鈉、0.5％N-月桂肌氨酸，pH7.2)中并于37℃輕微搖動下培養(yǎng)2小時。去除溶菌酶溶液并將桿用3ml清洗溶液洗二次，每次15分鐘。然后將桿在3ml蛋白酶K溶液(1mg/ml蛋白酶K、100mMEDTA、1％N-月桂肌氨酸、0.2％脫氧膽酸鈉，pH8.0)中于42℃輕微搖動下培養(yǎng)20小時。通過吸出去除蛋白酶K溶液并將桿逆著5ml清洗溶液(20mMTris-HCl、50mMEDTA，pH8.0)透析兩次15分鐘，然后用3mlPMSF溶液(20mMTris-HCl、50mMEDTA、1mM苯甲基磺酰氟、pH8.0)透析1小時，再用清洗溶液洗兩次。然后將桿用5ml貯存液(2mMTris-HCl、5mMEDTA，pH8.0)洗兩次再將其重新裝入凝膠注射模中。用刀片切下1mm長的樣品(10-20ml)并逆著NotI限制性內(nèi)切酶緩沖液(Biolab公司，美國)于4℃透析30分鐘。用新鮮緩沖液代替限制性內(nèi)切酶緩沖液并用20單位的NtoI酶(Biolab公司，美國)于37℃進行過夜溫育。農(nóng)桿菌DNA的部分消化通過使用稀有切割酶NotI來完成。假定農(nóng)桿菌基因組的G/C含量為60％，理論上全部消化之后NotI產(chǎn)生長18kb的片段(結(jié)果來自對不同農(nóng)桿菌基因的分析)。然后用切去頭部的移液管上樣等分樣品。通過脈沖電場凝膠(PFG)電泳，用Bio-RadCHEFMapper以6V/cm于14℃在0.5×TBE中的1％瓊脂糖凝膠中分離DNA32小時。凝膠在1mg/mlEtBrddH2O浴中染色20分鐘并且將含有對應(yīng)于100-200kb的片段的瓊脂糖薄片從凝膠上切下。將瓊脂糖薄片逆著TE于4℃透析兩次1小時并用瓊脂糖緩沖液(Biolabs公司，美國)于4℃透析兩次1小時，于65℃融化10分鐘并用每100mg一單位的瓊脂糖酶(Biolabs公司，美國)消化。用DyNAQuant200(Hoefer公司，美國)通過熒光測定估計DNA濃度。BIBAC載體的制備BIBAC載體由CarolM.Hamilton博士(康奈爾大學，Ithaca)惠贈(Hamilton等，美國國家科學院院報93，9975-9979，1996)。BIBAC設(shè)計為在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中復制并也包含允許在蔗糖培養(yǎng)基上直接選擇克隆的插入片段的sacBII基因。BIBAC載體還帶有使每個細胞上至300kb的插入片段的一或兩個拷貝穩(wěn)定保持的F-因子游離基因的起點(Shizuya等，美國國家科學院院報89，8794-1992)。用WizardPlusMaxiprep試劑盒(Promega公司，美國)分離質(zhì)粒。在異丙醇沉淀之前進行酚-氯仿抽提。質(zhì)粒用NotI消化并用1單位蝦堿性磷酸酶(BoerhingerMannheim公司)于37℃去磷酸化1小時。連接在40ml體系中于17℃進行過夜，其中150ng農(nóng)桿菌DNA與17ng切開的載體(按分子比10∶1估計的過量載體)及400單位T4DNA連接酶(Boerhinger公司)一起溫育。在轉(zhuǎn)化前，連接反應(yīng)在Micro-Collodion袋中(Sartorius公司，德國)逆著TE和1/10TE于4℃透析2小時。用pBAC文庫轉(zhuǎn)化DH10B感受態(tài)大腸桿菌DH10B細胞(F-，recA1；EletroMax，Gibco-BRL，美國)的轉(zhuǎn)化通過使用下列設(shè)置電壓2.5kV、電容25mF和電阻200W在帶有GenePulgerTM(Bio-Rad公司，美國)的預冷的GenePulser容器(Bio-Rad公司，美國)中電穿孔來進行。將25ml感受態(tài)細胞與1ml連接溶液混合用于每次電穿孔。電穿孔之后，將細胞轉(zhuǎn)移到0.5mlSOC溶液中并在旋轉(zhuǎn)輪里于37℃溫育45分鐘。細胞的150ml等分試樣平板接種于含有卡那霉素(40mg/ml)和蔗糖(5％)的LB培養(yǎng)基。BACDNA的分離和BAC克隆DNA插入片段大小的測定BAC克隆在連續(xù)搖動下于10ml含卡那霉素(50mg/ml)的LB中生長過夜。按照有下列修改的堿裂解方法(Sambrook等，1989)提取DNA在重新懸浮溶液中加入30mg/mlRNAase并且在異丙醇沉淀之前進行一次酚-氯仿純化。核酸沉淀溶解于50mlddH2O中。用Bio-RadCHEFMapper以6V/cm于14℃在0.5×TBE中的1％瓊脂糖凝膠上通過PFG電泳32小時分離DNA。用農(nóng)桿菌接種玉米胚在傳粉12到15天后無菌切下未成熟胚(0.8到2.5mm)并將其盾片朝上平板接種于愈傷誘導培養(yǎng)基(2DG4+5草滅畏)(Duncan的含有葡萄糖的“D”培養(yǎng)基N6大量、B5小量、MS鐵、20g/l蔗糖、5mg/l草滅畏、8g/l純化瓊脂、G4添加劑和10mg/l葡萄糖，pH5.8)(Duncan等，1985)。細菌細胞重新懸浮于2N63SM(3.97g/lN6鹽，N6維生素、30g/l蔗糖、2mg/l2，4-D、8g/l純化瓊脂，pH5.8)中。胚與109細胞/ml密度的農(nóng)桿菌或大腸桿菌培養(yǎng)5分鐘，然后在愈傷誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天。然后將組織轉(zhuǎn)移到補加氨噻肟頭孢霉素(250mg/l)的相同培養(yǎng)基上。組織的存活在接種后2周評估。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化按前面所述的(Wen-Jun和Forde，核酸研究208385，1989)用GenePluserTM(Bio-Rad公司，美國)以10kV/cm(2.00KV)場強、25mF電容和600Ω電阻在0.2cm電穿孔池(Bio-RadLaboratoriesLtd.，美國)中進行。用于biolistic轉(zhuǎn)化的載體用于通過biolistic裝置轉(zhuǎn)化玉米的載體都是PUC的衍生物。pMTL是含有玉米金屬硫蛋白樣基因啟動子(MT-L)的植物轉(zhuǎn)化載體(deFramond，1991)。以BAC克隆為模板，用下列引物5’-GGAGAGGCGGTGTTAGTT-3’(SEQIDNO11)；5’-CATCATCGCATTCGAGAG-3’(SEQIDNO12)通過聚合酶鏈式反應(yīng)從菌株A擴增virB1的編碼區(qū)。PCR反應(yīng)在25μl含有1×PCR緩沖液、0.5單位AmpliTaq酶、200μM每種dNTP、0.2μM每種引物的反應(yīng)體系中于55℃在Perkin-Elmer熱循環(huán)器里進行。將PCR產(chǎn)物首先克隆入用于TA克隆的PCR2.1載體中(Invitrogen公司，圣地亞哥，美國)。然后用Xbal-Spel雙酶切切割，再將其以正義和反義方向克隆入pMTL載體的Xbal位點中分別產(chǎn)生pMTL-virB1和pMTL-virB1as。類似地，將從菌株A擴增的PCR產(chǎn)物以正義和反義方向克隆入pMTL分別產(chǎn)生pMTL-virB1A和pMTL-virB1Aas。將acvB克隆入pTMLsense和pMTLantisense的XbaI-XhoI位點中，產(chǎn)生pMTL-acvB和pMTL-acvBas。pGUS含有在編碼序列的N-端密碼子中帶有內(nèi)含子的β-葡糖醛酸酶基因并由來自章魚氨酸和甘露氨酸合酶基因的嵌合啟動子驅(qū)動(章魚氨酸合酶啟動子上游活化序列與甘露氨酸合酶啟動子區(qū)的三聚體)(Ni等，1995)。玉米懸浮細胞玉米變種BlackMexicanSweet(BMS)的懸浮培養(yǎng)物在N6培養(yǎng)基(Chu等，1975)中維持并補加30g/l蔗糖和2mg/l2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)(2N63S)。用于轟擊實驗的玉米細胞懸浮液取自3天的快速生長培養(yǎng)物。在轟擊前，將約0.5ml填充體積的細胞在7cm濾紙(Whatman公司，N04)上真空過濾。轟擊前將平板接種的細胞在含有120g/蔗糖的phytagar-固化的2N6培養(yǎng)基上于25℃保持4小時。植物細胞的轟擊用上面沉淀有質(zhì)?；旌衔锏慕鹞⒘＾Z擊組織。pGUS質(zhì)粒DNA用作暫時表達研究中的內(nèi)對照。對于共轉(zhuǎn)化實驗，金顆粒帶有等量的全部質(zhì)粒DNA(每一靶平板0.5μg每種質(zhì)粒DNA)。將適量每種DNA混合于10μl總體積中并用50μm2.5MCaCl2和20μl0.1M不含亞精胺的堿基將其沉淀在50μl0.3μm的金微粒(60mg/ml)上。微粒轟擊PDS-1000Hebiolistic裝置(Dupont公司)中使用1100psi破裂板進行，樣品置于停止屏層下8cm處。暫時表達分析用GUS-發(fā)光試劑盒(Tropix公司)通過化學發(fā)光分析測定β-葡糖醛酸酶活性。β-葡糖醛酸酶活性表示為用分析發(fā)光2001型光度儀于25℃測定共10秒鐘的光單位。菌落雜交將生長一天的BAC克隆轉(zhuǎn)移到尼龍濾膜上(Hybond-N，AmershamLifeSciences公司，UK)用于與放射性標記的來自農(nóng)桿菌的探針雜交。DNA探針用Pharmacia公司的寡標記試劑盒以[α-32P]dCTP標記。chvG探針和virD1探針對應(yīng)于PCR擴增片段。文庫濾膜于65°在雜交溶液中預雜交兩小時(5×SSPE、5×Denhardt’s溶液、0.5％SDS、0.1mg/ml鮭精DNA)。雜交于65℃在同樣的溶液中進行過夜。濾膜于65℃在1×SSC，0.1％SDS中洗15分鐘，然后于65℃在0.1×SSC、0.1％SDS中溫育15分鐘。將濾膜簡單吸干，并使用增感屏使膠片于-70℃曝光過夜。為進行PCR擴增，將一接種環(huán)的LBA4404重新懸浮于ddH2O中，于95℃加熱15分鐘，離心并取1ml以下列條件進行PCR反應(yīng)95℃5分鐘，然后以95℃45秒、55℃45秒及72℃45秒進行30個循環(huán)。結(jié)果約20個玉米胚用來自BAC文庫的一個克隆接種并平板接種到愈傷誘導培養(yǎng)基上。共培養(yǎng)后，將胚轉(zhuǎn)移到補加250mg/ml氨噻肟頭孢霉素的相同培養(yǎng)基上。然后檢測胚以評估由重組細菌造成的損傷。在篩選的160個克隆中鑒定了4個獨立的BAC克隆(BAC1、BAC2、BAC3、BAC4)。為進一步定位決定玉米組織細胞死亡的BAC克隆上的區(qū)域，將來自BAC克隆的HindIII片段亞克隆入bluescript載體中。在玉米組織中測試這些克隆中的每一個以測定哪一個保留了引起細胞死亡的能力。通過使用亞克隆和寡核苷酸測定DNA序列。BAC1-2、BAC2-2的序列和BAC3-2分別表現(xiàn)與virB1、xylA-xylB和acvB同源。BAC-4與BAC3-2相同。將帶有acvB(BAC3和BAC4)、virB1(BAC1)和xylA-xyl-B(BAC2)的BAC克隆導入菌株A產(chǎn)生菌株A(acvB)、A(virB1)和A(xylA)。這些菌株用于接種玉米組織。以LBA4404接種的組織表現(xiàn)典型的細胞死亡模式而相反用菌株A侵染未引起這些癥狀。A(acvB)、A(virB1)和A(xylA)在不同水平上誘導細胞死亡，A(acvB)是誘導死亡水平最強的一個。因此這些基因的存在改變了菌株A與玉米的相互作用并導致玉米組織對侵染更為敏感(表12)。表12在Southern分析中，用帶有xylA或acvB的片段在中度嚴格條件下探測來自農(nóng)桿菌菌株A136、LBA4404、LBA4402、A和B的HindIII消化的基因組DNA。xylA的同源片段在所有測試的菌株中都存在。發(fā)現(xiàn)與acvB雜交的序列存在于在玉米細胞中誘導細胞死亡的LBA4404、LBA4402和A136中。令人感興趣的是，農(nóng)桿菌菌株A和B中缺乏acvB。因此acvB的分布是有限的。正如以前所報道的，acvB存在于相對較少的農(nóng)桿菌菌株中(Wirawan等，生物科學、生物技術(shù)與生化化學6044-49，1993)。xylA和acvB不由Ti質(zhì)粒攜帶，這是因為它們存在于Ti清除的菌株LBA4402上。為測定玉米細胞中acvB和virB1的表達是否是致死的，將這些基因克隆入植物表達載體中并與表達β-葡糖醛酸酶(GUS)的載體pGUS共轉(zhuǎn)化。如果測試基因是致死的，那么GUS活性將減弱或消除(Mindrinos等，1994)。將兩個基因的編碼區(qū)以正義和反義方向亞克隆入含有MTL啟動子的植物表達載體中并與載體pGUS一起biolitistically轉(zhuǎn)移入玉米細胞中。30小時后評估玉米細胞中的GUS活性。結(jié)果在表13中表示。當virB1與pGUS共轟擊時，GUS活性下降約兩倍。用acvB和pGUS共轟擊的玉米細胞持續(xù)表現(xiàn)GUS活性35倍的下降。這表明玉米細胞中acvB的高水平表達是有害的。表13質(zhì)粒構(gòu)建體通過biolistic裝置轉(zhuǎn)移入玉米細胞中。培養(yǎng)30小時后，將組織勻漿并測定GUS活性。活性以光單位/μg蛋白表示。分析了獨立的轟擊，并且數(shù)據(jù)用五次重復的平均值±標準差來表示。<p>序列表(1)基本信息(i)申請人(A)名稱NOVARTISAG(B)街道Schwarzwaldallee215(C)城市Basel(E)國家瑞士(F)郵政編號(ZIP)4058(G)電話+41613241111(H)電傳+41613227532(ii)發(fā)明名稱植物轉(zhuǎn)化方法(iii)序列數(shù)10(iv)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機IBMPC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentInRelease#1.0，Version#1.25(EPO)(2)關(guān)于SEQIDNO1的信息(i)序列特征(A)長度19個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(iii)反義無(vii)直接來源(B)克隆PAT1(xi)序列描述SEQIDNO1TGTCTCCGGAGAGGAGACC(2)關(guān)于SEQIDNO2的信息(i)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(iii)反義無(vii)直接來源(B)克隆PAT2(xi)序列描述SEQIDNO2CCAACATCATGCCATCCACC(2)關(guān)于SEQIDNO3的信息(i)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(iii)反義無(vii)直接來源(B)克隆MTL(P)(xi)序列描述SEQIDNO3AGGTGTCCATGGTGCTCAAG(2)關(guān)于SEQIDNO4的信息(i)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(iii)反義無(vii)直接來源(B)克隆iap(I)(xi)序列描述SEQIDNO4ACAATCGAACCGCACACGTC(2)關(guān)于SEQIDNO5的信息(i)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(iii)反義無(vii)直接來源(B)克隆p35(35)(xi)序列描述SEQIDNO5CCAGGTAGCAGTCGTTGTGT(2)關(guān)于SEQIDNO6的信息(i)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(iii)反義無(vii)直接來源(B)克隆dad-1(D)(xi)序列描述SEQIDNO6CCTTGTTTCCTTTGTTCACT(2)關(guān)于SEQIDNO7的信息(i)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(iii)反義無(xi)序列描述SEQIDNO7GGTCCTATACGAAGCGTTAC(2)關(guān)于SEQIDNO8的信息(i)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(iii)反義無(xi)序列描述SEQIDNO8CCACGTAGCAGTCGTTGTGT(2)關(guān)于SEQIDNO9的信息(i)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(iii)反義無(xi)序列描述SEQIDNO9CATGTCTGACTTGCGATTGG(2)關(guān)于SEQIDNO10的信息(i)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(iii)反義無(xi)序列描述SEQIDNO10ACAATCGAACCGCACACGTC(2)關(guān)于SEQIDNO11的信息(i)序列特征(A)長度18個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(iii)反義無(xi)序列描述SEQIDNO11GGAGAGGCGGTGTTAGTT(2)關(guān)于SEQIDNO12的信息(i)序列特征(A)長度18個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(iii)反義無(xi)序列描述SEQIDNO12CATCATCGCATTCGAGAG權(quán)利要求1.用目的基因轉(zhuǎn)化植物的方法，包括將該植物細胞在抑制農(nóng)桿菌誘導的壞死(AIN)的條件下暴露于農(nóng)桿菌，其中所述農(nóng)桿菌包含含有上述目的基因的載體。2.權(quán)利要求1的方法，包括在熱擊處理后將上述植物細胞暴露于農(nóng)桿菌。3.權(quán)利要求1的方法，包括在抑制農(nóng)桿菌誘導的壞死(AIN)的試劑存在的情況下將上述植物細胞暴露于農(nóng)桿菌。4.權(quán)利要求3的方法，其中抑制AIN的試劑是化學抑制劑。5.權(quán)利要求4的方法，其中化學抑制劑是選自乙烯抑制劑、乙烯合成抑制劑、赤霉素拮抗劑和磷酸酶抑制劑的化合物。6.權(quán)利要求3的方法，其中抑制AIN的試劑是核苷酸序列。7.權(quán)利要求6的方法，其中核苷酸序列編碼抑制AIN的mRNA或蛋白。8.通過將組織在抑制農(nóng)桿菌誘導的壞死(AIN)的條件下暴露于農(nóng)桿菌并再生轉(zhuǎn)化的組織來制備可育的、含有轉(zhuǎn)化植物組織的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中所述農(nóng)桿菌包含含有目的基因的載體。9.包含抑制AIN的異源來源的核苷酸序列的植物、植物組織或植物細胞。10.一種植物細胞或組織培養(yǎng)基，包含a)AIN的化學抑制劑；b)包含含有目的基因的質(zhì)粒的農(nóng)桿菌，以及c)水和必需鹽類。11.轉(zhuǎn)化禾本科植物全能細胞的方法，包括將上述全能細胞群體暴露于包含含有目的基因的質(zhì)粒的農(nóng)桿菌，其中農(nóng)桿菌是在暴露期間和足以完成上述細胞轉(zhuǎn)化的濃度下不在上述群體中誘導高水平壞死的菌株。12.測定農(nóng)桿菌菌株用于轉(zhuǎn)化禾本科植物的可再生細胞的適用性的方法，包括將上述植物的可再生細胞的群體暴露于農(nóng)桿菌菌株并觀察上述細胞群體中的壞死。13.經(jīng)遺傳修飾以減弱或消除農(nóng)桿菌壞死因子表達的農(nóng)桿菌菌株或這樣的修飾菌株的衍生物。全文摘要本發(fā)明提供用能抑制農(nóng)桿菌誘導的壞死的條件對植物、特別是禾本科植物進行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的改進方法。文檔編號C12N15/82GK1258316SQ98805629公開日2000年6月28日申請日期1998年5月29日優(yōu)先權(quán)日1997年6月2日發(fā)明者G·漢森申請人:諾瓦提斯公司