細(xì)菌設(shè)計的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及設(shè)計（工程化，engineering)適用于生物技術(shù)應(yīng)用，包括蛋白、次級 代謝產(chǎn)物（secondarymetabolite)和生物燃料的生產(chǎn)，生物催化，生物治理（生物修復(fù)， bioremediation)，生物轉(zhuǎn)化，生物降解，生物學(xué)控制，藥物開發(fā)，藥物篩選，疫苗，益生菌，生 物傳感器和藥物遞送載體（drugdeliveryvehicle)的細(xì)菌細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)菌在生物技術(shù)的許多方面都找到了應(yīng)用，包括用作生產(chǎn)異源蛋白和肽（包括酶 和治療性抗體）的宿主，作為次級代謝產(chǎn)物或其衍生物的源，作為生物學(xué)控制，生物降解， 生物燃料生產(chǎn)，生物催化和生物治理的試劑和作為益生菌，疫苗組分和藥物遞送體系。
[0003] 天然細(xì)菌菌株對于生物技術(shù)用途并未優(yōu)化。合成生物學(xué)這一新興領(lǐng)域的目標(biāo)之一 是設(shè)計（工程化，engineering)更易于處理和/或更有效的作為生物技術(shù)工具的新型生物。
[0004] -種方法可以稱為"粉碎（ground-up) "方法（例如，見W02008/024129)。這涉及 到只包含那些生長必不可少的基因的最小化的人工細(xì)菌DNA基因組的合成。這然后用于 產(chǎn)生按照需要可以向其增加所需的生物合成路徑，信號傳導(dǎo)途徑或分解代謝功能的裸"框 架"（bare"chassis"）。這種方法目前是不切實際的，因為基因產(chǎn)物和調(diào)控元件會協(xié)同和 串?dāng)_于整個細(xì)胞的環(huán)境中，其方式當(dāng)前還不完全理解并因此不能作為正式模塊進(jìn)行處理。
[0005] 另一種方法稱為"剝離（stripdown) "方法。目前這在鏈霉菌（Streptomyces spp.)有用的次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)中找到了應(yīng)用。此處，不是生長必需的基因和其它遺傳 物質(zhì)將被去除（"剝除（strippedout)"），而逐個重新引入用于選定的生物合成路徑的那 些。例如，Komatsu等（Komatsuetal. (2010)PNAS107(6) :2646-2651)描述了用于編碼 次級代謝產(chǎn)物生物合成的基因的異源表達(dá)的設(shè)計的（工程化，engineered)細(xì)菌的構(gòu)建，這 涉及從工業(yè)微生物阿維鏈霉菌（Streptomycesavermitilis)基因組中系統(tǒng)地刪除非必需 基因。
[0006] 所述"剝離"方法需要識別對于所選條件下存活和/或生長非必要的（和從而代 謝高成本性的以及因此不利的）基因的方法。
[0007] 此外，這種方法將受益于互補功能基因組分析還識別出有利于所提出的生物技術(shù) 應(yīng)用的基因。在后一種情況下，"剝離（stripdown)/增產(chǎn)（rev-up)"方法隨后能用于最小 化由非必要（不利的）基因所引起的代謝負(fù)擔(dān)，同時放大直接或間接有助于所述生物技術(shù) 應(yīng)用的基因（即，有利基因）的有益作用。
[0008]轉(zhuǎn)座子定向插入位點測序（transposondirectedinsertion-sitesequencing) (TraDIS-見Langridgeetal. (2009)GenomeResearch19:2308-2316)最近已經(jīng)被描述 并用于識別：（a)必需基因；(b)有利生長的（但非必需的）基因；（c)在特定條件下不利生 長的基因；和（d)參與對某些條件提供耐受性的基因（"壁龕特異性的（niche-specific)" 必需基因）。類似的技術(shù)已描述于例如，Gawronskietal. (2009)PNAS106:16422-16427; Goodmanetal. (2009)CellHostMicrobe6:279-289；vanOpijnenetal. (2009)Nat. Methods6:767-772和Gallagheretal. (2011)mBio2(1) :e00315-10,并且這種技術(shù)現(xiàn)在 統(tǒng)稱為"Tn-seq"方法。
[0009] 現(xiàn)在本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，TraDIS能夠適于為細(xì)菌生物設(shè)計（生物工程， bioengineering)目的明確地識別出不利的和有利的基因的問題提供非常巧妙的解決方 案。這通過使用活化轉(zhuǎn)座子（TnA)而實現(xiàn)。這些轉(zhuǎn)座子包括啟動子從而使轉(zhuǎn)座子在合適的 插入位點插入到細(xì)菌DNA中增加了插入位點處或接近基因的轉(zhuǎn)錄。因此采用1^的誘變產(chǎn) 生插入失活的突變體（其中所述！^破壞了基因表達(dá)，通常在插入到編碼區(qū)中之后）以及 插入活化的突變體（通常在轉(zhuǎn)座子已插入到基因的上游，從而使所述啟動子驅(qū)動所述基因 高水平的轉(zhuǎn)錄（以及因此產(chǎn)生更高水平的表達(dá)）。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 根據(jù)本發(fā)明，提供了生產(chǎn)在選擇的生長條件下表現(xiàn)出改善的存活和/或生長的突 變體細(xì)菌的方法，所述方法包括以下步驟：
[0011] a)通過采用活化轉(zhuǎn)座子（TnA)的轉(zhuǎn)座子誘變生產(chǎn)突變體細(xì)菌集合，其中所述、包 含能夠增加其插入位點或附近的基因轉(zhuǎn)錄的啟動子；
[0012] b)由所述突變體集合在所選擇的生長條件下和在一種或多種參照條件下生長細(xì) 菌以產(chǎn)生兩種以上測試培養(yǎng)物；和
[0013] c)比較測試培養(yǎng)物之間的!^插入的分布以識別出在所選擇的生長條件下不利于 生長和/或存活的第一類基因和在所選擇的生長條件下有利于生長和/或存活的第二類基 因。
[0014] 通常情況下，與第一類的（不利的）基因相關(guān)的TnA插入發(fā)生于編碼區(qū)（從而使 所述基因被!^插入失活）或所述編碼區(qū)外部但是在所述編碼序列的互補DNA鏈上（導(dǎo)致 反義RNA的產(chǎn)生或啟動子活性破壞），然而與第二類的（有利的）基因相關(guān)的!^插入?yún)s定 向發(fā)生于所述編碼區(qū)的上游，由此所述1^的啟動子驅(qū)動所述基因的升高的轉(zhuǎn)錄（從而進(jìn) 行表達(dá)）。
[0015] 這種方法可以進(jìn)一步包括以下步驟：提供設(shè)計的（工程化的，engineered)突變體 細(xì)菌，其中至少一種所述不利基因被去除或破壞和/或至少一種所述有利基因過表達(dá)，從 而使所述突變體細(xì)菌表現(xiàn)出在所選擇的生長條件下改善的存活和/或生長。在這些實施方 式中，多種所述不利基因可以去除或破壞同時多種有利基因過表達(dá)。
[0016] 按照這種方式，可以設(shè)計（工程化，engineer)或選擇顯著更好地適于所選生長條 件（從而適于所述生物技術(shù)用途）的突變體細(xì)菌。
[0017] 在這些實施方式中，所述方法可以進(jìn)一步包括分離和培養(yǎng)所述設(shè)計的（工程化 的，engineered)突變體細(xì)菌并隨后將其進(jìn)行再一輪的誘變，培養(yǎng)和比較（如以上步驟(a)-(c)中定義），并可以可選地進(jìn)一步包括以下步驟：提供第二輪設(shè)計的（工程化的， engineered)突變體細(xì)菌，其中至少一種所述另外的不利基因被去除或破壞和/或至少一 種所述另外的有利基因過表達(dá)，從而使所述突變體細(xì)菌在所選擇的生長條件下相對于所述 第一輪誘變之后產(chǎn)生的所述設(shè)計的（工程化的，engineered)突變體細(xì)菌表現(xiàn)出進(jìn)一步改 善的存活和/或生長。
[0018] 因此，本發(fā)明的方法優(yōu)選是重復(fù)的，并還可以包括另外輪的誘變和重復(fù)實施步驟 (a)至（c)(如上所定義）以提供在所述環(huán)境挑戰(zhàn)存在下相對于前一輪的設(shè)計的突變體細(xì)菌 表現(xiàn)出更進(jìn)一步改善的存活和/或生長的第三，第四，第五（或更多）輪突變體細(xì)菌。
[0019] 在這些實施方式中，每一輪期間采用的選擇的生長條件可以是相同或不同的。
[0020] 本發(fā)明的其它方面和優(yōu)選實施方式定義和描述于以下陳述的其它權(quán)利要求中。
【具體實施方式】
[0021] 本文提及的所有出版物，專利，專利申請和其它參考文獻(xiàn)出于所有目的以其全文 結(jié)合于本文中作為參考，就好像每個單獨出版物，專利或?qū)＠暾垖ｉT地且各自地指出以 其全部引述的內(nèi)容結(jié)合于本文中作為參考。
[0022] 宙義和一般優(yōu)詵
[0023] 當(dāng)在本文中使用時以及除非另外明確指出，否則以下術(shù)語預(yù)想具有以下含義（除 了所述術(shù)語在本領(lǐng)域內(nèi)可能具有的任何更寬（或更窄）的含義之外）：
[0024] 除非上下文另有所需，本文中單數(shù)的使用應(yīng)理解為包括復(fù)數(shù)，反之亦然。涉及實體 使用的術(shù)語"一個"或"一種"應(yīng)該理解為是指一種或多種所述實體。同樣，術(shù)語"一個"（或 "一種""一種或多種"，和"至少一種"在本文可互換使用。
[0025] 正如本文所用的，術(shù)語"包含"或其變體如"包括"或"包括了"，應(yīng)該理解為是指 包含任何所述的整數(shù)（例如，特征，要素，特性，屬性，方法/過程步驟或限制）或整數(shù)的組 (例如，特征，要素，特性，性質(zhì)，方法/過程步驟或限制），但并不排除任何其它整數(shù)或整數(shù) 的組。因此，正如本文所用的，術(shù)語"包括"是包含性的或開放式的，并且并不排除另外的， 未列舉的整數(shù)或方法/過程步驟。
[0026] 所述術(shù)語"基因"是描述由占據(jù)染色體或質(zhì)粒中的特定位置并決定生物中具體特 性或特性的組的DNA序列構(gòu)成的遺傳單元的術(shù)語?；蚩梢酝ㄟ^指定構(gòu)成蛋白或蛋白部分 (結(jié)構(gòu)基因）的多肽鏈；或編碼RNA分子；或通過指定構(gòu)成影響或以任何方式調(diào)節(jié)其它基因 的操作或抑制這種操作（例如，通過以順式作用）的結(jié)構(gòu)實體的核酸決定生物特性；或通過 其它尚未定義的機理影響表型。
[0027] 所述術(shù)語"基因組DNA"是本文中用于定義染色體DNA有別于染色體外維持的質(zhì)粒 DNA的本領(lǐng)域術(shù)語。
[0028] 所述術(shù)語"基因組"是本文中用于定義生物體整個遺傳互補的本領(lǐng)域術(shù)語，因此包 括染色體，質(zhì)粒，噬菌體和任何其它起到遺傳物質(zhì)作用的DNA或RNA。
[0029] 所述術(shù)語"革蘭氏陽性細(xì)菌"是定義基于某些細(xì)胞壁染色特性一起分組的特定類 細(xì)菌的本領(lǐng)域術(shù)語。
[0030] 所述術(shù)語"低G+C革蘭氏陽性細(xì)菌"是基于所述DNA中堿基的組成定義所述 革蘭氏陽性中進(jìn)化相關(guān)細(xì)菌的特定子類類型的本領(lǐng)域術(shù)語。所述子類包括鏈球菌屬 (Streptococcusspp.)，葡萄球菌屬(Staphylococcusspp.)，李斯特菌屬(Listeria spp.)，芽孢桿菌（Bacillusspp.)，梭狀芽孢桿菌屬（Clostridiumspp.)，腸球菌屬 (Enterococcusspp.)和乳酸桿菌（Lactobacillusspp. ) 〇
[0031] 所述術(shù)語"高G+C革蘭氏陽性細(xì)菌"是基于所述DNA中堿基的組成定義所述 革蘭氏陽性中進(jìn)化相關(guān)細(xì)菌的特定子類類型的本領(lǐng)域術(shù)語。所述子類包括放線菌綱 (actinomycetes)(放線菌類（actinobacteria))包括放線菌屬（Actinomycesspp.)，節(jié)桿 菌屬（Arthrobacterspp.)，棒狀桿菌屬（Corynebacteriumspp.)，弗蘭克氏菌屬（Frankia spp.)，微球菌屬（Micrococcusspp.)，小單抱菌屬（Micromonosporaspp.)，分支桿菌屬 (Mycobacteriumspp.)，諾卡氏菌屬（Nocardiaspp.)，丙酸桿菌屬（Propionibactoria spp.)和鏈霉菌屬（Streptomycesspp. ) 〇
[0032] 所述術(shù)語"革蘭氏陰性細(xì)菌"是定義基于某些細(xì)胞壁染色特性一起分組的特定類 細(xì)菌的本領(lǐng)域術(shù)語。革蘭氏陰性細(xì)菌屬的實例包括克雷伯氏菌屬（Klebsiella)，不動桿 菌屬（Acinetobacter)，埃希氏菌屬（Escherichia)，假單胞菌屬（Pseudomona)，腸桿菌屬 (Enterobacter)和奈瑟菌屬（Neisseria)。
[0033] 牛長備件的詵擇
[0034] 本發(fā)明的方法允許設(shè)計在選擇的生長條件下表現(xiàn)出改善的存活和/或生長的突 變體細(xì)菌，并涉及相對一種或多種參考條件，在選擇的生長條件下檢測TnA插入的分布和/ 或頻率的差異。
[0035] 所述生長條件根據(jù)所述最終生產(chǎn)的設(shè)計細(xì)菌的所需生物技術(shù)應(yīng)用進(jìn)行選擇：任何 條件都