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魚用多效價(jià)活疫苗及其應(yīng)用的制作方法

文檔序號(hào):415203閱讀:247來(lái)源:國(guó)知局

專利名稱::魚用多效價(jià)活疫苗及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
:本發(fā)明涉及疫苗
技術(shù)領(lǐng)域
,特別涉及魚用細(xì)菌性載體活疫苗
技術(shù)領(lǐng)域
,具體是指一種抗遲鈍愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌的載體活疫苗相關(guān)制劑及應(yīng)用。
背景技術(shù)
:鑒于世界人口的不斷增長(zhǎng)及天然漁業(yè)資源的日益枯竭,水產(chǎn)業(yè)作為一種傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè),在近代得到了快速,有效的發(fā)展,并在社會(huì)、經(jīng)濟(jì)和人們生活中突現(xiàn)出其重要地位。據(jù)統(tǒng)計(jì),2002年我國(guó)水產(chǎn)品總量占全球總產(chǎn)量的71%和總產(chǎn)值的49.8%,居世界第一位。據(jù)FAO統(tǒng)計(jì),2004年我國(guó)的水產(chǎn)產(chǎn)品總量達(dá)4750萬(wàn)噸。然而,由于水土資源的有限性,從提高養(yǎng)殖面積來(lái)增加產(chǎn)量難以持續(xù)發(fā)展。因此,規(guī)?;?、集約化、高密度研制模式逐漸成為我國(guó)魚類養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展主流。然而,隨著漁業(yè)養(yǎng)殖的不斷穩(wěn)步發(fā)展,各種病害問題日益突出,對(duì)養(yǎng)殖產(chǎn)量及成長(zhǎng)造成嚴(yán)重影響。在我國(guó),近幾年發(fā)展起來(lái)的海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖和工廠化養(yǎng)殖魚類的突發(fā)性、爆發(fā)性疾病頻繁發(fā)生。目前,我國(guó)的海水養(yǎng)殖平均死亡損失率在30%以上,每年的經(jīng)濟(jì)損失多達(dá)160億元,病害問題已成為制約海水養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的重要因素。針對(duì)各種病害的發(fā)生,以抗生素為代表的化學(xué)療法對(duì)病害的控制和防治曾發(fā)揮了積極作用。但是,這種病害控制措施造成的環(huán)境污染、抗藥病原的大量出現(xiàn)、水產(chǎn)品的藥物殘留等負(fù)面影響日趨嚴(yán)重。在歐盟、美國(guó)和加拿大,以抗生素為主的化學(xué)藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中已逐漸被禁用。其中,根據(jù)歐盟食品安全白皮書的規(guī)定,歐盟國(guó)家禁止使用抗生素藥物的養(yǎng)殖水產(chǎn)品進(jìn)入貿(mào)易市場(chǎng)。日本也開始限制使用多種抗生素藥物用于養(yǎng)殖魚類和蝦類病害的防治。作為世界上的水產(chǎn)養(yǎng)殖大國(guó),我國(guó)的海水養(yǎng)殖品出口量只占到了養(yǎng)殖總量的6%左右,一個(gè)主要的制約因素就是我國(guó)的水產(chǎn)品質(zhì)量安全問題突出,藥物和有害物殘留超標(biāo)嚴(yán)重,成為擴(kuò)大出口的主要障礙。近幾年我國(guó)水產(chǎn)品出口因質(zhì)量安全問題受到歐盟、日本等國(guó)家和地區(qū)的限制。同時(shí),由于病害嚴(yán)重,突發(fā)性強(qiáng),為規(guī)避病害風(fēng)險(xiǎn),生產(chǎn)者普遍提早收獲,造成產(chǎn)品規(guī)格偏小,也影響了出口率和出口價(jià)格。為了增強(qiáng)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的國(guó)際市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力,擴(kuò)大水產(chǎn)養(yǎng)殖的出口創(chuàng)匯,國(guó)家已提出并開始推廣建立無(wú)公害養(yǎng)殖技術(shù)規(guī)范,其中一個(gè)主要技術(shù)指標(biāo)就是禁止使用抗生素藥物,以確保養(yǎng)殖水產(chǎn)品的食品質(zhì)量安全。為遏制各種環(huán)境因素和養(yǎng)殖密度激增等造成的養(yǎng)殖魚類病害日益嚴(yán)重的發(fā)展趨勢(shì),推進(jìn)海水養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展,世界糧農(nóng)組織結(jié)合發(fā)達(dá)國(guó)家漁業(yè)發(fā)展的成功經(jīng)驗(yàn)(OrmondeP.Fisheriesresources:trendsinproduction,utilizationandtrade.1n:NomuraI(ed.).TheStateofWorldFisheryandAgriculture2002.Rome:FAOInformationDivision,2002,p3p45),倡導(dǎo)“系統(tǒng)管理途徑”(Systemmanagementapproaches,SMA)養(yǎng)殖模式防治各種病害的發(fā)生。這一措施中的一個(gè)主要內(nèi)容就是提倡以疫苗接種為代表的各種免疫防治技術(shù)的應(yīng)用。這些措施的采用將大大減少化學(xué)藥物的使用,既避免了對(duì)環(huán)境的污染,又增加了水產(chǎn)品的消費(fèi)安全性。作為符合環(huán)境友好、可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的經(jīng)濟(jì)有效的疾病控制策略和手段,接種疫苗在現(xiàn)代水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)范中正成為世界各國(guó)研究和開發(fā)的主要前沿和應(yīng)用領(lǐng)域。疫苗具有針對(duì)性強(qiáng)、抗病周期長(zhǎng)、可終身免疫、效果顯著和防治主動(dòng)的特點(diǎn)。以病原菌細(xì)胞滅活體為基礎(chǔ)形式的滅活疫苗(Killvaccine)為水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治提供了有效手段,但滅活疫苗普遍具有給藥不便(注射給藥才具有較好的免疫保護(hù)力)的技術(shù)應(yīng)用缺陷,對(duì)于需要免疫成千上萬(wàn)數(shù)量的魚類養(yǎng)殖業(yè)來(lái)說(shuō)極為不便,給藥成本往往不能為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)所承受。而且,對(duì)于病害發(fā)生嚴(yán)重的魚苗和幼魚則無(wú)法實(shí)施注射給藥,同時(shí),對(duì)許多病害滅活疫苗往往效果不佳或無(wú)效。這一切都給水產(chǎn)養(yǎng)殖病害免疫防治技術(shù)的廣泛應(yīng)用帶來(lái)了阻礙。水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的產(chǎn)業(yè)特點(diǎn)要求病害防治技術(shù)必須經(jīng)濟(jì)、應(yīng)用實(shí)施方便。因此,疫苗產(chǎn)品的開發(fā)除高效價(jià)的技術(shù)要求外,免疫成本必須低廉,不能超出養(yǎng)殖業(yè)的承受能力。減毒活疫苗因具有給藥方便(可浸泡給藥)、免疫效價(jià)高(可減少給藥劑量)、成本低廉、可開發(fā)廣譜疫苗(活菌疫苗往往具有交叉保護(hù)性)的新技術(shù)優(yōu)勢(shì),已成為當(dāng)前國(guó)際上水產(chǎn)養(yǎng)殖用疫苗研究和開發(fā)的熱點(diǎn)和前沿領(lǐng)域。并且構(gòu)建的減毒株具有表達(dá)異源抗原以開發(fā)多效價(jià)疫苗(特別是針對(duì)病毒病害)的潛在價(jià)值,也成為疫苗開發(fā)的國(guó)際前沿和熱點(diǎn)領(lǐng)域。近年來(lái),隨著對(duì)病原基因背景的深入了解及重組DNA技術(shù)的不斷發(fā)展,將編碼某一特定病原體蛋白的外源基因插入無(wú)毒力病毒或者細(xì)菌疫苗株的基因組的某一部位,使其高效表達(dá),但不影響疫苗株的正常生長(zhǎng)與繁殖。用這種重組體作為活疫苗進(jìn)行接種時(shí),病毒或細(xì)菌能產(chǎn)生特定的外源蛋白,并誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。目前,這種能針對(duì)多種病毒病害的多效價(jià)疫苗也已成為疫苗開發(fā)的國(guó)際前沿和熱點(diǎn)領(lǐng)域。其中,利用高效信號(hào)肽分泌表達(dá)外源病原蛋白已成為多效價(jià)疫苗開發(fā)中的一種重要技術(shù)手段,并且該技術(shù)已在大腸桿菌及沙門氏菌的疫苗開發(fā)中得到了成功應(yīng)用(GentschevI,etal.TheE.colia-hemolysinsecretionsystemanditsuseinvaccinedevelopment.TrendsMicrobiol,2002(10):39-45及RussmannHjetal.DeliveryofepitopesbytheSalmonellatypeIIIsecretionsystemforvaccinedevelopment.Science,1998(281):565-568),但在遲鈍愛德華氏菌疫苗的研制中還未見相關(guān)技術(shù)應(yīng)用的報(bào)道。愛德華氏菌屬是導(dǎo)致淡水、海水養(yǎng)殖魚類細(xì)菌性疾病的一類常見的病原體,具體分為遲純愛德華氏菌(Edwardsiellatarda),魚愛德華氏菌(Edwardsiellaictaluri)和??茞鄣氯A氏菌(Edwardsiellahoshinae)。由其引起的魚類出血性敗血癥統(tǒng)稱為愛德華氏菌病(Edwardsiellosis)。該病傳播面積廣,無(wú)明顯季節(jié)性,感染率及死亡率高,危害的種類多,有鯉魚,羅非魚,鰻鱺,鯔魚,鮭魚,鱒魚,鲆鰈等大多數(shù)具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的魚種。此外,遲鈍愛德華氏菌還感染貝類、爬行類、兩棲類、鳥類、哺乳類。值得注意,遲鈍愛德華氏菌還是一種重要的人畜共患病原菌,它是愛德華氏菌屬中唯一感染人類的成員。目前,我國(guó)養(yǎng)殖魚類愛德華氏菌病病害比較嚴(yán)重的病原體主要為遲鈍愛德華氏菌,并有存在病原體向人體轉(zhuǎn)移的巨大威脅。美國(guó)專利有利用利福平篩選得到野生毒株的自然減毒突變體作為減毒活疫苗的報(bào)道(EvansJJ,Klesius,PHandShoemakerCA2006ModifiedIiveEdwardsiellatardavaccineforaquaticanimals;UnitedStatesPatent7067122)。目前在我國(guó)尚無(wú)該病害的有效防治措施。淡水、海水養(yǎng)殖業(yè)需要更有效的魚用疫苗,尤其是能同時(shí)抵抗多種病原菌侵害多效價(jià)魚用活疫苗。這樣的多效價(jià)魚用活疫苗具有非常重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種賦予疫苗株抗遲鈍愛德華氏菌和抗嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)多效價(jià)抗性的重組載體,具有多效價(jià)抗性的載體活疫苗及它們的應(yīng)用。本發(fā)明的重組載體或多效價(jià)活疫苗設(shè)計(jì)獨(dú)特巧妙,與傳統(tǒng)疫苗相比具有免疫保護(hù)效果更好的特點(diǎn),使用簡(jiǎn)便、安全、費(fèi)用低廉,為防治養(yǎng)殖魚類的疾病提供一種安全、有效、經(jīng)濟(jì)的疫苗,有實(shí)際的商業(yè)開發(fā)應(yīng)用價(jià)值,適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。本
發(fā)明內(nèi)容之一是一種重組表達(dá)載體,其特征在于,包含編碼操作性相連的遲鈍愛德華氏菌鐵誘導(dǎo)性啟動(dòng)子dps、遲鈍愛德華氏菌Tat信號(hào)肽編碼序列和嗜水氣單胞菌3-磷酸甘油醛脫氫酶編碼序列。實(shí)施方式之一中,所述重組表達(dá)載體是以pUTt為起始載體構(gòu)建而成。實(shí)施方式之一中,所述遲鈍愛德華氏菌Tat信號(hào)肽是氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的二甲基亞砜還原酶A亞基信號(hào)肽。實(shí)施方式之一中,二甲基亞砜還原酶A亞基信號(hào)肽的編碼序列如SEQIDN0:2所/Jnο實(shí)施方式之一中,所述嗜水氣單胞菌3-磷酸甘油醛脫氫酶的氨基酸序列如GenbankHQ697336所不。實(shí)施方式之一中,所述嗜水氣單胞菌3-磷酸甘油醛脫氫酶的編碼序列如SEQIDNO:3所示實(shí)施方式之一中,所述遲鈍愛德華氏菌鐵誘導(dǎo)性啟動(dòng)子dps序列如SEQIDNO:4所示。本發(fā)明的內(nèi)容還包括一種含有本發(fā)明的重組表達(dá)載體的遲鈍愛德華氏菌多效價(jià)活疫苗株。實(shí)施方式之一中,所述多效價(jià)活疫苗株為遲鈍愛德華氏菌EIBAV12090301,其保藏號(hào)為:CCTCCN0:M2012324。本發(fā)明的內(nèi)容還包括本發(fā)明重組載體或本發(fā)明疫苗株用于制造魚用藥物的用途,所述藥物用于防治遲鈍愛德華氏菌和/或嗜水氣單胞菌感染。本發(fā)明的有益效果包括但不限于1.本發(fā)明的遲鈍愛德華氏菌多效價(jià)載體活疫苗株是在減毒活疫苗的基礎(chǔ)上構(gòu)建的表達(dá)異源蛋白的載體活疫苗,相對(duì)于其野生毒株EIB202具有明顯的低毒性,免疫效果顯著,可有效地保護(hù)魚類免受遲鈍愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌的侵害,具有非常好的水產(chǎn)養(yǎng)殖中愛德華氏菌病和嗜水氣單胞菌病的防治效果;2.本發(fā)明的遲鈍愛德華氏菌載體活疫苗株的遺傳背景清楚,減毒機(jī)理明確,易于區(qū)分疫苗株與野生株,便于對(duì)環(huán)境進(jìn)行監(jiān)控,提高疫苗的環(huán)境安全性和可控性,有實(shí)際的商業(yè)開發(fā)應(yīng)用價(jià)值;3.本發(fā)明的遲鈍愛德華氏菌載體活疫苗株為載體活疫苗的商業(yè)化進(jìn)程提供了現(xiàn)實(shí)的開發(fā)和應(yīng)用前景。圖1是本發(fā)明重組載體實(shí)施方式之一pUTt-Pdps-ssDmsA-GapA的結(jié)構(gòu)圖譜。其中,rrnBTlT2為強(qiáng)終止子,GapA表示嗜水氣單胞菌3-磷酸甘油醛脫氫酶編碼區(qū),ssDmsA為二甲基亞砜還原酶A亞基(DmsA)信號(hào)肽編碼區(qū),Pdps為dps啟動(dòng)子,pBR322_origin為復(fù)制區(qū),Ampr為編碼氨芐青霉素抗性基因區(qū),EcoR1、BamH1、HindIII為對(duì)應(yīng)的酶切位點(diǎn)。圖2是Westernblotting法檢測(cè)本發(fā)明實(shí)施例中構(gòu)建的E.tardaWED::pUTt-Pdps-ssDmsA-GapA菌株胞質(zhì)、周質(zhì)、胞外組分GapA定位情況。圖3是本發(fā)明疫苗株實(shí)施方式之一DmsA-GA對(duì)大菱鲆(Scophtalmusmaximus)的免疫保護(hù)率,以遲鈍愛德華氏菌WEB疫苗株或無(wú)菌生理鹽水為對(duì)照。其中,A:免疫4周后用遲鈍愛德華氏菌EIB202和嗜水氣單胞菌LSA34聯(lián)合攻毒,計(jì)算攻毒后18天內(nèi)累計(jì)死亡率:免疫4周后用遲鈍愛德華氏菌EIB202攻毒,計(jì)算攻毒后18天內(nèi)累計(jì)死亡率;C:免疫4周后用嗜水氣單胞菌LSA34攻毒,計(jì)算攻毒后18天內(nèi)累計(jì)死亡率。具體實(shí)施例方式本發(fā)明構(gòu)建了一種重組表達(dá)載體,其特征在于,包含編碼操作性相連的遲鈍愛德華氏菌鐵誘導(dǎo)性啟動(dòng)子dps(簡(jiǎn)稱Pdps)、遲鈍愛德華氏菌Tat信號(hào)肽編碼序列和嗜水氣單胞菌3-磷酸甘油醛脫氫酶(GapA)編碼序列對(duì)于用來(lái)構(gòu)建本發(fā)明重組表達(dá)載體的起始載體,本發(fā)明沒有特別限制,只要能夠在在遲鈍愛德華氏菌內(nèi)存活和/或復(fù)制即可。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)轉(zhuǎn)化的對(duì)象和轉(zhuǎn)化目的,例如是為表達(dá)、擴(kuò)增還是整合到基因組等,依照現(xiàn)有技術(shù)的教導(dǎo)做出合適的選擇。例如,可以選用質(zhì)粒載體,例如后文實(shí)施例所用的pUTt質(zhì)粒。遲鈍愛德華氏菌鐵誘導(dǎo)性啟動(dòng)子dps,在此簡(jiǎn)稱Pdps,控制目的基因的啟動(dòng)表達(dá)。本發(fā)明實(shí)施方式之一中,遲鈍愛德華氏菌Pdps來(lái)自保藏號(hào)CCTCCN0:M208068的遲鈍愛德華氏菌EIB202,其序列如SEQIDN0:4所示。本發(fā)明選用高效的遲鈍愛德華氏菌Tat信號(hào)肽構(gòu)建本發(fā)明的重組載體。所述信號(hào)肽的作用在于介導(dǎo)所述3-磷酸甘油醛脫氫酶(GapA)的分泌和細(xì)胞定位。本發(fā)明實(shí)施方式之一選用遲鈍愛德華氏菌雙精氨酸運(yùn)輸系統(tǒng)底物二甲基亞砜還原酶A亞基(DmsA)信號(hào)肽(簡(jiǎn)稱ssDmsA)構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pUTt-Pdps-ssDmsA-GapA。用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化遲鈍愛德華氏菌構(gòu)建得到本發(fā)明的載體活疫苗株。實(shí)施方式之一中,用該載體轉(zhuǎn)化減毒遲鈍愛德華氏菌毒株WED,得到多效價(jià)載體活疫苗,以E.tardaffED::pUTt-Pdps-ssDmsA-GapA表示,簡(jiǎn)寫為DmsA-GA0據(jù)信,嗜水氣單胞菌3-磷酸甘油醛脫氫酶(GapA)對(duì)魚類具有良好的免疫保護(hù)效果。本發(fā)明實(shí)施方式之一中,采用嗜水氣單胞菌LSA34的3-磷酸甘油醛脫氫酶(GapA),其氨基酸序列如GenebankHQ697336所示。本發(fā)明中,“操作性相連”的序列包括與感興趣的基因毗連或相距一定距離的表達(dá)調(diào)控序列,該操作性連接方式使得所述調(diào)控序列能夠控制感興趣基因的表達(dá),使得其中宿主細(xì)胞內(nèi)得以轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。本發(fā)明重組載體的構(gòu)建采用常規(guī)重組技術(shù)。例如,方法之一包括克隆出具有酶切位點(diǎn)的3-磷酸甘油醛脫氫酶的核苷酸序列;酶切3-磷酸甘油醛脫氫酶編碼核酸和起始載體;連接酶切的編碼3-磷酸甘油醛脫氫酶編碼核酸和載體,構(gòu)成中間質(zhì)粒;構(gòu)建具有酶切位點(diǎn)的啟動(dòng)子-信號(hào)肽融合基因;酶切啟動(dòng)子-信號(hào)肽融合基因和含3-磷酸甘油醛脫氫酶編碼核酸的中間質(zhì)粒;連接酶切的啟動(dòng)子-信號(hào)肽融合基因和含3-磷酸甘油醛脫氫酶編碼序列的載體,得到本發(fā)明的重組表達(dá)載體。構(gòu)建方法沒有順序依賴性??梢韵葘?-磷酸甘油醛脫氫酶的編碼核酸構(gòu)建入載體,再將啟動(dòng)子-信號(hào)肽融合基因構(gòu)建入載體。也可以先把啟動(dòng)子-信號(hào)肽的融合基因構(gòu)建入載體,再將3-磷酸甘油醛脫氫酶的編碼核酸構(gòu)建入載體。還可以先將啟動(dòng)子-信號(hào)肽融合基因與3-磷酸甘油醛脫氫酶的編碼核酸連接,然后將此連接產(chǎn)物構(gòu)建入載體。這些過程本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)其掌握的技術(shù)結(jié)合合適的酶切位點(diǎn)即可完成。本發(fā)明還提供一種遲鈍愛德華氏菌多效價(jià)活疫苗株,其中含有本發(fā)明的重組表達(dá)載體。本發(fā)明的“多效價(jià)”活疫苗能夠提供對(duì)多種魚類致病菌的對(duì)免疫保護(hù)功效,尤其是對(duì)于鈍愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌感染的免疫保護(hù)。本發(fā)明實(shí)施方式之一是命名為遲鈍愛德華氏菌EIBAV12090301的多效價(jià)載體活疫苗株,已于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏,保藏編號(hào)為CCTCCN0:M2012324。本發(fā)明的內(nèi)容還包括采用本發(fā)明重組載體或本發(fā)明多效價(jià)疫苗防治遲鈍愛德華氏菌和/或嗜水氣單胞菌感染的方法以及該方法所用的藥物。實(shí)施方式之一中,本發(fā)明提供了一種遲鈍愛德華氏菌多效價(jià)載體活疫苗株的制劑,其中包含本發(fā)明遲鈍愛德華氏菌多效價(jià)載體活疫苗株和在藥理上可接受的載體。實(shí)施方式之一,所述載體活疫苗株的菌體細(xì)胞濃度數(shù)量級(jí)為IO2109CFU/ml,或者IO6109CFU/ml。實(shí)施方式之一中,所述載體是無(wú)菌生理鹽水,例如NaC19g/L,pH為7.2的生理鹽水。本發(fā)明的內(nèi)容還包括采用本發(fā)明遲鈍愛德華氏菌多效價(jià)載體、活疫苗株或本發(fā)明多效價(jià)載體活疫苗株制劑防治養(yǎng)殖魚類的遲鈍愛德華氏菌病和嗜水氣單胞菌病中的方法。實(shí)施方式之一中,所述遲鈍愛德華氏菌載體活疫苗株或所述制劑通過注射方式給藥,其中菌體細(xì)胞濃度數(shù)量級(jí)為IO2109CFU/ml,或者IO6109CFU/ml。為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容,特舉以下實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)理解,以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而非用于限定本申請(qǐng)的保護(hù)范圍。實(shí)施例材料與方法pUTt質(zhì)粒發(fā)表于XiaoY,LiuQ,ChenH,ZhangY.AstableplasmidsystemforheterologousantigenexpressioninattenuatedVibrioanguillarum.Vaccine.2011,29(40):6986-6993。申請(qǐng)人保證從本申請(qǐng)申請(qǐng)日起二十年內(nèi)向公眾按需要發(fā)放該生物材料。EscherichiacoliToplOF,購(gòu)自Invitrogen。E.coliBL21(GapA)菌株發(fā)表于X.Li,H.Wu,M.Zhang,S.Liang,J.Xiao,Q.Wang,Q.LiuandY.Zhang.Secretedglyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenaseasabroadspectrumvaccinecandidateagainstmicrobialinfectioninaquaculture.LettApplMicrobiol,2011,54:1-9。申請(qǐng)人保證從本申請(qǐng)申請(qǐng)日起二十年內(nèi)向公眾按需要發(fā)放該生物材料。遲鈍愛德華氏菌毒株EIB202:已于2008年5月I日提交武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏,保藏號(hào)為CCTCCN0:M208068。該菌株的相關(guān)記載另可見于“IsolationandidentificationoffishpathogenEdwardsiellatardafrommaricultureinChina,,,肖婧凡等,《AquacultureResearch》,Vol.40,2009。嗜水氣單胞菌LSA34:已于2009年6月10日提交武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏,保藏號(hào)為CCTCCN0:M209124。該菌株的相關(guān)記載另可見于中國(guó)專利公開CN101659958(申請(qǐng)?zhí)朇N200910054113.9)。遲鈍愛德華氏菌減毒株WED:已于2010年10月24日提交武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏,保藏號(hào)為CCTCCN0:M2010278o該菌株的相關(guān)記載另可見于中國(guó)專利申請(qǐng)公開CN101974472A。遲鈍愛德華氏菌載EIBAV12090301:已于2012年9月3日提交武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏,保藏號(hào)為CCTCCN0:M2012324o培養(yǎng)基與生理鹽水組成LB液體培養(yǎng)基胰蛋白胨(Difco)10g/L,酵母浸出物(Merck)5g/L,NaC15g/L,ρΗ7·5LB斜面培養(yǎng)基胰蛋白胨(Difco)10g/L,酵母浸出物(Merck)5g/L,NaC15g/L,瓊脂18g/L,pH7.5,氨芐青霉素100μg/ml;種子培養(yǎng)基胰蛋白胨(Difco)10g/L,酵母浸出物(Merck)5g/L,NaC15g/L,pH7.5,氨節(jié)青霉素100μg/ml;發(fā)酵培養(yǎng)基胰蛋白胨(Difco)10g/L,酵母浸出物(Merck)5g/L,NaC15g/L,ρΗ6·8,氨節(jié)青霉素100μg/ml;生理鹽水NaC19g/L,pH7.2,121°C滅菌20分鐘。以下例實(shí)施例中,除非特別說(shuō)明,所涉方法、操作或步驟皆按照本領(lǐng)域常識(shí)、常規(guī)中常用條件下?lián)?,例如《分子克隆?shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(NewYork:ColdSpringHarborLaboratorePress,1989)中所述或廠商推薦的條件或流程。實(shí)施例1重組表達(dá)載體的構(gòu)建構(gòu)建重組表達(dá)載體pUTt-Pdps-ssDmsA-GapA。(一)PCR擴(kuò)增獲得所需基因片段以遲鈍愛德華氏菌EIB202的基因組為模版,利用下列擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR獲得Pdps-ssDmsA融合片段。Pdps-ssDmsA-PlCCGGAATTCGCCGCATCAGCGCTGAAAAAAAC,SEQIDNO:5Pdps-ssDmsA-P2CTGTTTTTTTTCATTCTGCATGCTCTCCTTGG,SEQIDNO:6Pdps-ssDmsA-P3GGAGAGCATGCAGAATGAAAAAAAACAGTCGG,SEQIDNO:7Pdps-ssDmsA-P4CGGGATCCCTTATTCTGCGCGGGCGTAG,SEQIDNO:8下劃線所示為酶切位點(diǎn)。首先分別用Pdps-ssDmsA-Pl和Pdps-ssDmsA_P2,Pdps-ssDmsA_P3和Pdps-ssDmsA_P4擴(kuò)增獲得OverlapPCR所需的上下游片段Pdps,ssDmsA。回收各片段后,利用OverlapPCR技術(shù)米用Pdps-ssDmsA-Pl和Pdps-ssDmsA_P4獲得Pdps-ssDmsA融合片段。以嗜水氣單胞菌LSA34的基因組為模版,利用擴(kuò)增引物GapA-F和GapA-R擴(kuò)增得至IJGapA片段。權(quán)利要求1.一種重組表達(dá)載體,其特征在于,包含編碼操作性相連的遲鈍愛德華氏菌鐵誘導(dǎo)性啟動(dòng)子dps、遲鈍愛德華氏菌Tat信號(hào)肽編碼序列和嗜水氣單胞菌3-磷酸甘油醛脫氫酶編碼序列。2.如權(quán)利要求1所述的重組表達(dá)載體,是以PUTt為起始載體構(gòu)建而成。3.如權(quán)利要求1所述的重組表達(dá)載體,所述遲鈍愛德華氏菌Tat信號(hào)肽是氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的二甲基亞砜還原酶A亞基信號(hào)肽。4.如權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體,二甲基亞砜還原酶A亞基信號(hào)肽的編碼序列如SEQIDNO:2所示。5.如權(quán)利要求1所述的重組表達(dá)載體,所述嗜水氣單胞菌3-磷酸甘油醛脫氫酶的氨基酸序列如GenbankHQ697336所不。6.如權(quán)利要求1所述的重組表達(dá)載體,所述嗜水氣單胞菌3-磷酸甘油醛脫氫酶的編碼序列如SEQIDN0:3所示。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組表達(dá)載體,其特征在于,所述遲鈍愛德華氏菌鐵誘導(dǎo)性啟動(dòng)子dps序列如SEQIDN0:4所示。8.—種遲鈍愛德華氏菌多效價(jià)活疫苗株,含有以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的重組表達(dá)載體。9.如權(quán)利要求8所述的疫苗株,命名為遲鈍愛德華氏菌EIBAV12090301,其保藏號(hào)為CCTCCN0:M2012324。10.權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述重組表達(dá)載體或權(quán)利要求8或9所述疫苗株用于制造魚用藥物的用途,所述藥物用于防治遲鈍愛德華氏菌和/或嗜水氣單胞菌感染。全文摘要本發(fā)明涉及一種魚用多效價(jià)活疫苗及其應(yīng)用。所述疫苗包含一種重組表達(dá)載體,其特征在于,包含編碼操作性相連的遲鈍愛德華氏菌鐵誘導(dǎo)性啟動(dòng)子dps、遲鈍愛德華氏菌Tat信號(hào)肽編碼序列和嗜水氣單胞菌3-磷酸甘油醛脫氫酶編碼序列。文檔編號(hào)C12N1/21GK103014051SQ20121049231公開日2013年4月3日申請(qǐng)日期2012年11月27日優(yōu)先權(quán)日2012年11月27日發(fā)明者王啟要,王亞敏,劉琴,吳海珍,肖婧凡,張?jiān)d申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)