專利名稱：一種檢測(cè)口蹄疫病毒的實(shí)時(shí)熒光rt-hda試劑盒及引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)口蹄疫病毒的實(shí)時(shí)熒光RT-HDA試劑盒及引物，屬于檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
口蹄疫(Foot-and-mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-andnouthdisease virus, FMDV)引起的急性熱性高度接觸性傳染病，主要感染偶蹄獸，患病動(dòng)物的口、舌、唇、蹄、乳房等部位發(fā)生水泡，破潰形成爛斑。人和非偶蹄動(dòng)物也可感染本病，但癥狀較輕。由于豬、牛、羊等主要的家畜均可感染此病，并能形成全球大規(guī)模流行，所以世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)和聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)將該病列為A類動(dòng)物傳染病。在我國(guó)，口蹄疫被列為一類動(dòng)物傳染病。歷史上口蹄疫的暴發(fā)給世界畜牧業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，也嚴(yán)
重的影響了社會(huì)政治、經(jīng)濟(jì)的穩(wěn)定發(fā)展，是名副其實(shí)的“世界政治經(jīng)濟(jì)病”?？谔阋咴谑澜绲姆植家埠軓V，可在國(guó)際間相互傳播形成世界范圍內(nèi)的大流行。至今幾乎世界上所有的國(guó)家或地區(qū)歷史上都曾經(jīng)發(fā)生過口蹄疫。在17 19世紀(jì)，歐洲大陸曾多次發(fā)生和廣泛流行本病。到20世紀(jì)80年代，大洋洲、北美洲已無(wú)口蹄疫疫情，歐洲國(guó)家的疫情也大大減少，而亞洲、非洲和南美洲各國(guó)則是口蹄疫的重疫區(qū)。近年來(lái)，口蹄疫在世界上主要流行于亞洲，其次是非洲、南美洲和歐洲。口蹄疫在我國(guó)流行歷史由來(lái)已久，其特點(diǎn)是在一定地區(qū)一定時(shí)間接連不斷發(fā)生。而且我國(guó)毗鄰的很多周邊國(guó)家和地區(qū)多為口蹄疫流行疫區(qū)，疫病呈周期性暴發(fā)，且反復(fù)不斷。這些因素對(duì)我國(guó)造成嚴(yán)重威脅，發(fā)生口蹄疫大流行的可能性非常大。歷年來(lái)我國(guó)政府和地方各防疫機(jī)構(gòu)都非常關(guān)注口蹄疫的疫情動(dòng)態(tài)，并高度重視口蹄疫的防制工作。隨著加入WT0，我國(guó)從其他國(guó)家進(jìn)口牛肉和豬肉等產(chǎn)品的批次和數(shù)量都急劇上升，所有這些都要求我們能夠提高檢驗(yàn)檢疫技術(shù)水平，力促外貿(mào)工作的順利進(jìn)行并保證人畜及生產(chǎn)的安全?？谔阋卟《揪哂行投嘁鬃兊奶攸c(diǎn)，目前有7個(gè)血清主型，分別為O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和亞洲I型。每一主型又分若干亞型，迄今為止已發(fā)現(xiàn)的亞型有65個(gè)，且仍可能在不同的地區(qū)出現(xiàn)新的變異株和新的亞型。我國(guó)口蹄疫的病毒型主要為0、A型和亞洲I型。動(dòng)物感染一種血清型的病毒后，不產(chǎn)生對(duì)其他型的免疫力，但同型的亞型之間有部分的交叉反應(yīng)。目前口蹄疫的檢測(cè)技術(shù)主要有病毒分離技術(shù)(包括細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物接種兩種方法)、血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)(包括病毒中和試驗(yàn)、間接血凝試驗(yàn)、乳膠凝集試驗(yàn)、免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、免疫熒光抗體試驗(yàn)、免疫熒光電子顯微鏡技術(shù)等)和分子生物學(xué)技術(shù)(包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、核酸探針、核酸序列分析、電聚焦寡核苷酸指紋圖譜法、基因芯片技術(shù)等)。實(shí)際檢測(cè)中，對(duì)肉類食品中低含量的FMD病毒、隱性感染或持續(xù)帶毒宿主進(jìn)行檢測(cè)的方法必須具備高敏感性、高特異性和高準(zhǔn)確性，但傳統(tǒng)的診斷方法不能滿足這一要求。常規(guī)的PCR技術(shù)雖然提高了檢測(cè)的靈敏度和特異性，但也有費(fèi)時(shí)、易污染、擴(kuò)增后需電泳檢測(cè)和每次檢測(cè)的樣品數(shù)量少等缺點(diǎn)。近幾年發(fā)展起來(lái)的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR將PCR與熒光檢測(cè)相結(jié)合，具有操作簡(jiǎn)便、結(jié)果直觀、敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，已逐漸成為病原體檢測(cè)的重要方法。但是，熒光PCR儀造價(jià)不菲，儀器和試劑檢測(cè)成本過高使得這一檢測(cè)技術(shù)始終局限于條件比較好的實(shí)驗(yàn)室中，難以在基層推廣應(yīng)用。近年來(lái)，分子診斷技術(shù)日新月異，產(chǎn)生了多種新型分子擴(kuò)增技術(shù)，推動(dòng)著分子診斷技術(shù)向操作簡(jiǎn)單、儀器要求不高的方向發(fā)展。其中，依賴解旋酶恒溫基因擴(kuò)增技術(shù)(Helicase-Dependent Isothermal Amplification,HDA)是 2004 年 BioHelix 的研究人員模擬動(dòng)物體內(nèi)DNA的復(fù)制機(jī)制發(fā)明的一種新的體外恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)利用DNA雙鏈解旋酶打開雙鏈DNA，同時(shí)在單鏈結(jié)合蛋白(SSB)和DNA聚合酶的作用下，擴(kuò)增靶片段，實(shí)現(xiàn)目的基因的體外擴(kuò)增。此外，實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)病原技術(shù)是近些 年來(lái)應(yīng)用越來(lái)越廣泛的一種檢測(cè)方法。使用SyberGreen熒光染料，結(jié)合溶解曲線的分析，可對(duì)熒光PCR進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測(cè)。若將熒光定量方法與HDA技術(shù)結(jié)合，建立實(shí)時(shí)熒光RT-HDA方法，則能將兩種技術(shù)的優(yōu)勢(shì)發(fā)揮至最大。實(shí)時(shí)熒光RT-HDA技術(shù)的優(yōu)勢(shì)I. HDA技術(shù)與普通PCR技術(shù)相比，具有很多優(yōu)勢(shì)。HDA技術(shù)的引物設(shè)計(jì)比較簡(jiǎn)單易學(xué)，由于是恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，不論檢測(cè)何種病原均可使用同一種反應(yīng)溫度，因此，即可在同一條件下分管同時(shí)檢測(cè)不同的病原，也可建立多重HDA方法同時(shí)檢測(cè)多種病原，不需要特意將不同擴(kuò)增片段的退火溫度設(shè)計(jì)成一樣。此外，由于體系中使用了耐高溫的BstDNA擴(kuò)增酶，使得HDA技術(shù)具有更高的特異性和敏感性。HDA技術(shù)與其他恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)相比，是一種真正的恒溫?cái)U(kuò)增方法，完全不需95°C變性，因而，該技術(shù)不需要PCR儀，操作簡(jiǎn)單方便，非常適合基層檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)快速診斷。2.本發(fā)明使用EvaGreen作為實(shí)時(shí)定量HDA方法中的DNA結(jié)合染料。EvaGreen是一種可結(jié)合于雙鏈DNA小溝中的熒光染料，與雙鏈DNA結(jié)合后，其熒光大大增強(qiáng)，這一性質(zhì)使其用于擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)非常理想。該染料的諸多優(yōu)點(diǎn)使它遠(yuǎn)勝于目前常用的SYBRGreen I。除了有相似的光譜特性，EvaGreen有三個(gè)主要特點(diǎn)使它區(qū)別于SYBRGreenI :①EvaGreen對(duì)PCR的抑制性遠(yuǎn)小于SYBRGreen I，因此，使用EvaGreen進(jìn)行的qPCR實(shí)驗(yàn)可以使用快速PCR步驟。同時(shí)，EvaGreen在實(shí)驗(yàn)中可以使用較高的濃度，從而獲得遠(yuǎn)強(qiáng)于SYBRGreen I的擴(kuò)增信號(hào)。較高濃度的EvaGreen也消除了 “染料重分布”的缺陷，使EvaGreen既可用于多重PCR,也可用于高分辨率(高清晰)熔解曲線分析(HRM)。②EvaGreen的穩(wěn)定性極強(qiáng)。在正常的儲(chǔ)存、操作和PCR過程中不會(huì)被破壞。在緩沖溶液中的染料可以安全的儲(chǔ)存在室溫或冰箱里，也可以反復(fù)凍融。與之相反，SYBRGreen I不穩(wěn)定而且降解后對(duì)PCR的抑制性更強(qiáng)。③EvaGreen降低了細(xì)胞膜透性，因而比SYBRGreen I更加安全。獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室的測(cè)試結(jié)果顯示，EvaGreen既沒有誘變性也沒有細(xì)胞毒性，更符合生物安全要求。3.將EvaGreen熒光染料加入HDA反應(yīng)體系，建立實(shí)時(shí)熒光HDA技術(shù)，利用S型擴(kuò)增曲線結(jié)合溶解曲線分析，可對(duì)特定病原核酸進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光HDA的反應(yīng)程序設(shè)定簡(jiǎn)單、操作方便快捷，不僅進(jìn)一步提高原有HDA方法的靈敏度，還能對(duì)檢測(cè)過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，可在更短的時(shí)間內(nèi)得知樣本的檢測(cè)結(jié)果。使用標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，還可對(duì)樣品進(jìn)行定量檢測(cè)?？傊?，與同類新型PCR技術(shù)相比，實(shí)時(shí)熒光HDA技術(shù)更簡(jiǎn)單高效，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速診斷、高通量、操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、自動(dòng)化程度高、易標(biāo)準(zhǔn)化操作和試驗(yàn)的生物安全性高等突出優(yōu)點(diǎn)，靈敏度比普通PCR靈敏度高100倍以上，能夠最大限度的避免交叉污染，是一種嶄新的基因擴(kuò)增方法，極具應(yīng)用價(jià)值和市場(chǎng)前景。目前，國(guó)際上對(duì)于實(shí)時(shí)熒光HDA技術(shù)的研究尚處于起步階段，國(guó)內(nèi)外還沒有關(guān)于實(shí)時(shí)熒光HDA檢測(cè)動(dòng)物病毒的研究。我們將首次建立起快速檢測(cè)口蹄疫病毒的實(shí)時(shí)熒光HDA技術(shù)。該項(xiàng)研究成果將成為動(dòng)物疫病分子診斷領(lǐng)域的突破性技術(shù)，是動(dòng)物流感檢疫技術(shù)體系的進(jìn)一步完善和發(fā)展。HDA技術(shù)的建立將真正實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單、便捷的臨床和實(shí)驗(yàn)室診斷，適用于基層檢疫，可全面提升口岸檢疫的檢測(cè)能力，縮短檢疫時(shí)間，真正實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)，為我國(guó)口蹄疫的有效防制作出重大貢獻(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供一組作為引物使用的、檢測(cè)口蹄疫病毒的寡核苷酸序列。 本發(fā)明要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是提供一種特異、靈敏、高效的檢測(cè)口蹄疫病毒的試劑盒。為解決第一個(gè)技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一組檢測(cè)口蹄疫病毒的引物，為序列表SEQ ID No : I和SEQ ID No :2所示的寡核苷酸序列，詳見表I。表I.引物序列
名稱~ 序列(5’-3’)序列表編號(hào)~
引物 I ATCTATGCAGGTAGCCCCMCTGACACSEQ ID No. I~
引物 11 TGTCACCCCTCTAGACCTGGAAAGACCSEQ ID No. 2注胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)。其中序列引物I和引物II分別為檢測(cè)口蹄疫病毒的正義引物和反義引物。為解決第二個(gè)技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種檢測(cè)口蹄疫病毒的實(shí)時(shí)熒光RT-HDA試劑盒，保存于_20°C，由以下試劑組成(I)TriZol 裂解液；(2) RT-HDA 反應(yīng)液，其包括1XHDA 緩沖液、3. 5mM MgSO4,40mM NaCl、0. 21mMdNTP、IOOnM 引物 I、100nM 引物 II ;其中，IXHDA緩沖液由10XHDA緩沖液稀釋制備而成，所述10XHDA緩沖液包括IOmmoI/L KCl、20mmol/L Tris-Cl (pH 8. 8，25°C );引物 I 的核苷酸序列如序列表 SEQ IDNO: I所示，引物II的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: 2所示；(3)酶混合物，其包括DNA解旋酶、Bst DNA擴(kuò)增酶和反轉(zhuǎn)錄酶，其中，所述DNA解旋酶10 μ g, Bst DNA擴(kuò)增酶1000U,反轉(zhuǎn)錄酶優(yōu)選為ThermoScript反轉(zhuǎn)錄酶，100U ；(4)突光染料包括 EvaGreen Dye 和 Rox Reference Dye ；(5 )無(wú)RNA酶的滅菌純化水；(6)陰性對(duì)照無(wú)核酸滅菌水；(7)陽(yáng)性對(duì)照為體外轉(zhuǎn)錄的非感染性RNA片段?；厥諄喼轎型口蹄疫病毒Asial/l/YZ/CHA/06株5’UTR基因的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，長(zhǎng)度為1094bp，與pMD_T20載體(購(gòu)自TAKARA公司)進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化TOPlO感受態(tài)細(xì)胞，堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)PCR和酶切鑒定后獲得陽(yáng)性重組質(zhì)粒，命名為PMD-T20-FMDV-5U。以純化的質(zhì)粒為模板，將質(zhì)粒線性化之后，用 Promega 公司的 Ribo MAXTM Large Scale RNA Production System_SP6 試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄；將體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用DNase除去其中的DNA模板再經(jīng)TRIZOL提取RNA進(jìn)行測(cè)定后，即得到制備口蹄疫病毒陽(yáng)性對(duì)照品所需的RNA陽(yáng)性對(duì)照品母液；口蹄疫病毒亞洲I型Asial/l/YZ/CHA/06株5’ UTR基因片段如序列表中SEQ IDNO 3所示。本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)口蹄疫病毒的實(shí)時(shí)熒光RT-HDA方法，包括如下步驟I)提取樣品RNA;2)對(duì)提取的樣品RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-HDA擴(kuò)增弓丨物序列為①5，-ATCTATGCAGGTAGCCCCAACTGACAC-3 ’·②5， -TGTCACCCCTCTAGACCTGGAAAGACC-3’反應(yīng)條件第一步66°C，5s；65°C，lmin55s (收集熒光)；40 60 個(gè)循環(huán)；第二步溶解曲線分析，使用熒光PCR儀默認(rèn)程序。3)結(jié)果分析條件設(shè)定，讀取檢測(cè)結(jié)果。閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過正常陰性對(duì)照品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)。不同儀器可根據(jù)儀器噪音情況進(jìn)行調(diào)整。①質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，陰性對(duì)照無(wú)Ct值并且無(wú)擴(kuò)增曲線。②陽(yáng)性對(duì)照的Ct值應(yīng)彡35. 0，并出現(xiàn)特定的S型擴(kuò)增曲線，且溶解曲線出現(xiàn)單一峰值，并且單一峰在退火溫度附近。如陰性對(duì)照和陽(yáng)性條件不滿足以上條件，此次實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。③結(jié)果描述及判定陽(yáng)性Ct值彡35. O,并出現(xiàn)特定的S型擴(kuò)增曲線，且溶解曲線出現(xiàn)單一峰值，并且單一峰在退火溫度附近，表示樣本中存在口蹄疫病毒；陰性無(wú)Ct值并且無(wú)擴(kuò)增曲線，表明樣品中無(wú)口蹄疫病毒。本發(fā)明中發(fā)明人以實(shí)時(shí)熒光RT-HDA對(duì)模板進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證了該方法的特異性。本發(fā)明以通過對(duì)陽(yáng)性對(duì)照提取RNA進(jìn)行系列稀釋的模板檢測(cè)，開展了敏感性實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，最低可以檢測(cè)到10拷貝/反應(yīng)的RNA模板量，具有較高的靈敏度。用該方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室采集保存的20份牛場(chǎng)OP液、10份可疑組織病料和2份口蹄疫病毒培養(yǎng)液進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法是一種特異、靈敏、高效的檢測(cè)方法。這項(xiàng)技術(shù)在口蹄疫病毒的監(jiān)控和診斷中都具有極大的應(yīng)用前景，尤其對(duì)于基層養(yǎng)殖場(chǎng)或者實(shí)驗(yàn)條件不能滿足檢驗(yàn)檢疫要求的地區(qū)或?qū)嶒?yàn)室。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是首次將新型恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)結(jié)合熒光染料方法建立的實(shí)時(shí)熒光RT-HDA應(yīng)用于口蹄疫病毒的檢測(cè)中，與FMDV現(xiàn)有的檢測(cè)方法相比①HDA檢測(cè)方法更快、更便捷，安全可靠。傳統(tǒng)的病毒分離和血清學(xué)方法耗時(shí)較長(zhǎng)，且存在生物安全危險(xiǎn)性；HDA方法模仿體內(nèi)天然的復(fù)制機(jī)制，安全性高，且反應(yīng)快速，最多僅需2h即可完成檢測(cè)；②與熒光PCR相比，程序設(shè)定更簡(jiǎn)單，不需要摸索退火溫度等反應(yīng)條件，從技術(shù)層面上講更便于掌握和操作。且通過反應(yīng)條件的優(yōu)化，實(shí)時(shí)熒光RT-HDA方法最低可檢測(cè)至10個(gè)拷貝/反應(yīng)的病毒核酸。該方法還對(duì)實(shí)驗(yàn)室采集保存的20份牛場(chǎng)OP液、10份可疑組織病料和2份口蹄疫病毒培養(yǎng)液進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)MDV實(shí)時(shí)熒光RT-HDA方法是一種特異、靈敏、高效的檢測(cè)方法。這項(xiàng)技術(shù)在口蹄疫病毒的監(jiān)控和診斷中都具有極大的應(yīng)用前景，是一種極具推廣應(yīng)用價(jià)值的診斷工具。下面結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，凡依照本發(fā)明公開內(nèi)容所做的任何本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。


圖I為FMDV實(shí)時(shí)熒光RT-HDA反應(yīng)體系優(yōu)化后，得到的擴(kuò)增曲線圖IA和溶解曲線分析圖IB ;其中，I :陽(yáng)性對(duì)照；2 :陰性對(duì)照；圖2為檢測(cè)口蹄疫病毒的實(shí)時(shí)熒光RT-HDA檢測(cè)試劑盒的特異性試驗(yàn)結(jié)果；其中，圖2A為擴(kuò)增曲線圖，圖2B為溶解曲線分析圖；1 : 口蹄疫病毒亞洲I型；2 : 口蹄疫病毒O型；3 :藍(lán)舌病病毒核酸；4 :牛病毒性腹瀉/粘膜病病毒核酸；5 :牛雞傳染性鼻氣管炎病毒； 6 :陰性對(duì)照；圖3為檢測(cè)口蹄疫病毒的實(shí)時(shí)熒光RT-HDA檢測(cè)試劑盒的靈敏性檢測(cè)結(jié)果；其中，圖3A為擴(kuò)增曲線圖，圖3B為溶解曲線分析圖；1 8 :IO8-L O拷貝/微升(依次作10倍梯度稀釋)9:陰性對(duì)照。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所用口蹄疫病毒亞洲I型、口蹄疫病毒O型、牛病毒性腹瀉/粘膜病病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒和藍(lán)舌病病毒，均為北京出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心保存。實(shí)施例I :HDA引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)Genbank中登錄的口蹄疫病毒基因序列，用DNAMAN軟件進(jìn)行比對(duì)分析，選擇FMDV-5’ UTR基因高度保守的區(qū)域，使用在線軟件Primer3 (http://frodo. wi. mit. edu/)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并結(jié)合01igo6. O軟件對(duì)引物進(jìn)行分析評(píng)價(jià)，設(shè)計(jì)出針對(duì)口蹄疫病毒的通用型引物。引物序列同表I。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。實(shí)施例2 口蹄疫病毒RNA的提取使用RNA提取試劑提取口蹄疫病毒RNA。具體操作如下①取η個(gè)I. 5mL滅菌Eppendorf管，其中η為待檢樣品數(shù)、一管陽(yáng)性對(duì)照及一管陰性對(duì)照之和，對(duì)每個(gè)管進(jìn)行編號(hào)標(biāo)記。②每管加入600μ L TRIZOL裂解液，然后分別加入待測(cè)樣本、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照各200 μ L，一份樣本換用一個(gè)吸頭；再加入200 μ L三氯甲烷，混勻器上震蕩混勻5s。于4°C條件下，12000r/min 離心 15min。③取與①中相同數(shù)量的I. 5mL滅菌Eppendorf管，加入500 μ L異丙醇(_20°C預(yù)冷)，對(duì)每個(gè)管進(jìn)行編號(hào)。吸取5. 3. 2離心后各管中的上清液轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中，上清液至少吸取500 μ L，注意不要吸出中間層，顛倒混勻。④于4°C條件下，12000r/min離心15min (Eppendorf管開口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置)。輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，吸干液體，不同樣品應(yīng)在吸水紙不同地方吸干。加入600 μ L 75%乙醇，顛倒洗滌。⑤于4°C條件下，12000r/min離心IOmin (Eppendorf管開口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置)。輕輕倒去上清液，倒置于吸水紙上，吸干液體，不同樣品應(yīng)在吸水紙不同地方吸干。⑥4000r/min離心10s，將管壁上的殘余液體甩到管底部，用微量加樣器盡量將其吸干，一份樣本換用一個(gè)吸頭，吸頭不要碰到有沉淀一面，室溫干燥3min。不宜過于干燥，以免RNA不溶。⑦加入11 μ L DEPC水，輕輕混勻，溶解管壁上的RNA，2000r/min離心5s，冰上保存?zhèn)溆?。提取的RNA須在2h內(nèi)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增或放置于_70°C冰箱備用。實(shí)施例3 :實(shí)時(shí)熒光RT-HDA的建立 一、對(duì)引物濃度、MgSO4濃度和NaCl濃度分別進(jìn)行了優(yōu)化，建立了實(shí)時(shí)熒光RT-HDA的反應(yīng)體系。按照實(shí)施例2方法獲得口蹄疫病毒RNA，模板濃度約為IO4拷貝/微升，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-HDA，優(yōu)化反應(yīng)體系。對(duì)各成分的優(yōu)化范圍見表2，反應(yīng)體系見表3，所用引物序列見表I。表2 FMDV RT-HDA反應(yīng)體系中各成分的優(yōu)化范圍
權(quán)利要求
1.一組檢測(cè)口蹄疫病毒的引物，其特征在于，該引物序列如序列表SEQ ID NO :1至SEQID NO 2所示，其中SEQ ID NO 1為檢測(cè)口蹄疫病毒的引物I，SEQ ID NO 2為檢測(cè)口蹄疫病毒的引物II。
2.一種檢測(cè)口蹄疫病毒的實(shí)時(shí)熒光RT-HDA試劑盒，其特征在于，由以下組分組成 (1)TriZol 裂解液； (2)RT-HDA反應(yīng)液，其包括HDA緩沖液、MgS04、NaCl、dNTP、引物I、引物II ;其中，所述引物I的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: I所示，引物II的核苷酸序列如序列表SEQ IDN0:2所示； (3)酶混合物，其包括DNA解旋酶，BstDNA擴(kuò)增酶和反轉(zhuǎn)錄酶； (4)突光染料包括EvaGreenDye 和 Rox Reference Dye ； (5)無(wú)RNA酶的滅菌純化水； (6)陰性對(duì)照無(wú)核酸滅菌水； (7)陽(yáng)性對(duì)照為體外轉(zhuǎn)錄的非感染性RNA片段，其對(duì)應(yīng)的DNA序列為序列表SEQIDNo. 3所示的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的實(shí)時(shí)熒光RT-HDA試劑盒，其特征在于所述反轉(zhuǎn)錄酶為ThermoScript 反轉(zhuǎn)錄酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的實(shí)時(shí)熒光RT-HDA試劑盒，其特征在于所述RT-HDA反應(yīng)液為 IXHDA 緩沖液、3. 5mM MgSO4,40mM NaCl、0. 21mM dNTP、100nM 引物 I 和 IOOnM 引物 II。
5.一種檢測(cè)口蹄疫病毒的實(shí)時(shí)熒光RT-HDA方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)提取樣品RNA； (2)對(duì)提取的樣品RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-HDA擴(kuò)增； (3)反應(yīng)條件 第一步66°C，5s ；65°C，lmin55s (收集熒光)；40 60個(gè)循環(huán)； 第二步溶解曲線分析，使用熒光PCR儀默認(rèn)程序； (4)結(jié)果描述及判定 ①質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，陰性對(duì)照無(wú)Ct值并且無(wú)擴(kuò)增曲線； ②陽(yáng)性對(duì)照的Ct值應(yīng)<35. O,并出現(xiàn)特定的S型擴(kuò)增曲線，且溶解曲線出現(xiàn)單一峰值，并且單一峰在退火溫度附近。如陰性對(duì)照和陽(yáng)性條件不滿足以上條件，此次實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效； ③結(jié)果描述及判定 陽(yáng)性Ct值< 35.0，并出現(xiàn)特定的S型擴(kuò)增曲線，且溶解曲線出現(xiàn)單一峰值，并且單一峰在退火溫度附近，表示樣本中存在口蹄疫病毒； 陰性無(wú)Ct值并且無(wú)擴(kuò)增曲線，表明樣品中無(wú)口蹄疫病毒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)口蹄疫病毒的實(shí)時(shí)熒光RT-HDA試劑盒及引物。一組檢測(cè)口蹄疫病毒的引物，為序列表SEQ ID No1和序列表SEQ ID No2所示的寡核苷酸序列。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是首次將新型恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)HDA應(yīng)用于口蹄疫病毒的檢測(cè)中，與FMDV現(xiàn)有的檢測(cè)方法相比①HDA檢測(cè)方法更快、更便捷，安全可靠。傳統(tǒng)的病毒分離和血清學(xué)方法耗時(shí)較長(zhǎng)，且存在生物安全危險(xiǎn)性；HDA方法模仿體內(nèi)天然的復(fù)制機(jī)制，安全性高，且反應(yīng)快速，最多僅需2h即可完成檢測(cè)；②與熒光PCR相比，程序設(shè)定更簡(jiǎn)單，不需要摸索退火溫度等反應(yīng)條件，從技術(shù)層面上講更便于掌握和操作。且通過反應(yīng)條件的優(yōu)化，實(shí)時(shí)熒光RT-HDA方法最低可檢測(cè)至10個(gè)拷貝/反應(yīng)的病毒核酸。這項(xiàng)技術(shù)在口蹄疫病毒的監(jiān)控和診斷中都具有極大的應(yīng)用前景，是一種極具推廣應(yīng)用價(jià)值的診斷工具。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102876814SQ20121042081
公開日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2012年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月29日
發(fā)明者蒲靜, 高志強(qiáng), 張鶴曉, 谷強(qiáng), 喬彩霞, 劉環(huán), 張偉, 汪琳 申請(qǐng)人:中華人民共和國(guó)北京出入境檢驗(yàn)檢疫局