專利名稱：用于亞歐型口蹄疫病毒檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光pcr引物和探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于流行病學(xué)和食品衛(wèi)生檢測(cè)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及用于亞歐型口 蹄疫病毒檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光PCR引物和探針，以及使用其進(jìn)行檢測(cè)的方法，更具體地說(shuō)，是對(duì) 豬、牛、羊等偶蹄類動(dòng)物及相關(guān)動(dòng)物產(chǎn)品中是否攜帶A、0、C以及Asia 1型口蹄疫病毒進(jìn)行 檢測(cè)的通用實(shí)時(shí)熒光PCR引物和探針，以及使用其進(jìn)行檢測(cè)的方法。
背景技術(shù)：
口 g帝疫(Foot—and—mouth di sease， FMD)是由口蹄疫病毒(Foot_and_mouth disease virus, FMDV)感染引起的偶蹄動(dòng)物共患的急性、熱性、高接觸性傳染病(江鵬斐 等，1999)，同時(shí)也是一種嚴(yán)重的"政治經(jīng)濟(jì)病"，列為0IE規(guī)定的A類傳染病之首，同時(shí)也是 動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品國(guó)際貿(mào)易中重要的檢疫對(duì)象(董志強(qiáng)等，2007)。目前，ELISA及病毒分離 是OIE推薦的檢測(cè)方法，存在操作時(shí)間長(zhǎng)(病毒培養(yǎng)需要4d時(shí)間)、敏感性低(ELISA敏感 性只有70% -80% )等缺點(diǎn)(花群義等，2005)。 熒光PCR(FQ-PCR)技術(shù)是美國(guó)PE (Perkin Elmer)公司1995年研制出來(lái)的一種新 的核酸定量技術(shù)，該方法自產(chǎn)生以來(lái)，不斷發(fā)展完善，特別是隨著TaqMan探針的廣泛使用， 到目前為止該技術(shù)已經(jīng)非常成熟，具有靈敏度高(比普通PCR高100倍以上)、特異性強(qiáng)(在 普通PCR —對(duì)引物的基礎(chǔ)上，中間還設(shè)計(jì)有探針，只有引物和探針均完全配對(duì)，才可能得到 擴(kuò)增，可對(duì)少至2個(gè)核苷酸的序列差異進(jìn)行鑒定，從而保證了反應(yīng)的特異性)、操作安全方 便(無(wú)須凝膠電泳，避免了EB染色對(duì)人體的危害)等優(yōu)點(diǎn)，目前已被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、病毒 等病原體檢測(cè)、腫瘤基因檢測(cè)、免疫分析、基因表達(dá)、突變及其多態(tài)性的研究等多個(gè)領(lǐng)域。
目前，國(guó)內(nèi)外建立了很多FMDV通用型熒光RT-PCR檢測(cè)方法。但現(xiàn)有資料表明作 為RNA病毒，F(xiàn)MDV在復(fù)制過(guò)程中由于缺乏校對(duì)機(jī)制，基因組每復(fù)制一次，就有O. 1_10個(gè)核 苷酸發(fā)生變異(Gu等，2007)。在不同的生存環(huán)境、免疫壓力等條件的誘導(dǎo)下，基因組特別是 結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)核苷酸變異的幾率更高，很難選擇在蛋白編碼區(qū)設(shè)計(jì)引物/探針，建立通 用型熒光RT-PCR檢測(cè)方法。同時(shí)研究表明，F(xiàn)MDV的七個(gè)血清型即0、 A、 C、亞洲1 (Asial) 型、南非1、2、3型(SAT1、 SAT2、 SAT3)可用核酸雜交分成兩群，0、 A、 C和亞洲1型為亞歐 型FMDV，南非1、2、3型為南非型FMDV，群內(nèi)各型核酸同源性達(dá)60X-70X，但兩群之間僅為 25% -40% (盧曾軍，2003)，因此目前還很難設(shè)計(jì)出特異性較高的亞歐型及南非型均通用 的熒光RT-PCR引物與探針。 針對(duì)目前我國(guó)尚無(wú)南非型口蹄疫疫情的現(xiàn)狀，本發(fā)明在對(duì)FMDV大量基因信息進(jìn) 行分析比較的基礎(chǔ)上，選擇亞歐型口蹄疫病毒高度保守的5' -UTR(非翻譯區(qū))設(shè)計(jì)引物和 探針，建立了亞歐型FMDV特異的熒光RT-PCR檢測(cè)方法，從而可大大提高口蹄疫病毒PCR檢 測(cè)方法的通用性，滿足我國(guó)相關(guān)動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品的口蹄疫檢測(cè)及監(jiān)測(cè)需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供用于亞歐型口蹄疫病毒檢測(cè)的熒光PCR引物和探針序列。
本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)從GenBank中獲得口蹄疫病毒(FMDV) 基因組序列，應(yīng)用MegAlign軟件對(duì)上述序列進(jìn)行比較和一致性分析，選擇較為保守的 5' -UTR(非翻譯區(qū))序列，根據(jù)引物和探針的設(shè)計(jì)原則，用軟件Beacon Designer 7. 0在 這些序列的保守區(qū)域篩選到一對(duì)具有通用堿基序列的通用引物，引物對(duì)經(jīng)在線序列BLAST 分析，確定為亞歐型FMDV (包括A、 0、 C以及Asia l型)區(qū)別于南非型FMDV(包括SAT-l、 SAT-2、SAT-3型)的特異性引物對(duì)。在該引物對(duì)的擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)設(shè)定一條通用的熒光TaqMan 探針，報(bào)告熒光染料標(biāo)記在探針的5'端，淬滅熒光染料標(biāo)記在探針的3'端，兩者構(gòu)成能量 轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)，即報(bào)告熒光染料所發(fā)射的熒光可被淬滅熒光染料吸收，當(dāng)二者距離變遠(yuǎn)時(shí)，抑制 作用減弱，報(bào)告熒光染料信號(hào)增強(qiáng)。在擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程中，探針同DNA模板上的目的擴(kuò)增片段 雜交，由于Taq酶具有5'端到3'端的外切酶活性，在擴(kuò)增延伸階段將探針切斷，探針被水 解，從而導(dǎo)致報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)距離變遠(yuǎn)，淬滅熒光染料的抑制作用消失，報(bào)告 熒光信號(hào)得以釋放出來(lái)而被儀器檢測(cè)到，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)亞歐型FMDV的檢測(cè)。
優(yōu)選地，本發(fā)明熒光PCR引物對(duì)擴(kuò)增的靶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示，本發(fā)明的特異性熒光探針針對(duì)該引物對(duì)擴(kuò)增區(qū)域中的GC高含量區(qū)，該探針的 5'端具有報(bào)告熒光染料標(biāo)記，3'端具有淬滅熒光染料標(biāo)記。更優(yōu)選地，本發(fā)明亞歐 型FMDV特異性的正向引物序列為5 ' -TACCACYTTCCGCCTACTTG-3 '，反向引物序列為 5' -GGAAHGACGYAAAACTTAGG-3'，以及該引物對(duì)的正向引物向5'端延伸10個(gè)堿基、反向引 物向3'端延伸10個(gè)堿基所包括的DNA序列區(qū)域內(nèi)得到的引物序列及互補(bǔ)序列；探針序列 為，5' -CGCTGTCTTGGGCACTCCYGTTG-3' ，5'端用報(bào)告熒光染料標(biāo)記，3'端用淬滅熒光染料 標(biāo)記。探針的反向互補(bǔ)序列為5' -CAACRGGAGTGCCCAAGACAGCG-3'以及該探針向5'端延 伸10個(gè)堿基、向3'端延伸10個(gè)堿基區(qū)域內(nèi)得到的探針序列及互補(bǔ)序列。
亞歐型FMDV特異性的PCR引物和探針設(shè)計(jì)完成后，采用在線BLAST分析其序列特 異性。結(jié)果表明亞歐型FMDV特異性的引物和探針設(shè)計(jì)區(qū)域?yàn)閬啔W型FMDV所特有，沒(méi)有發(fā) 現(xiàn)同源或序列一致性生物基因信息，可以保證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)驗(yàn)方案中，引物擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為196bp，探針設(shè)計(jì)于待擴(kuò) 增序列間的高GC含量區(qū)，該探針的5'端用報(bào)告熒光染料HEX標(biāo)記，3'端用淬滅熒光染料 Eclipse標(biāo)記。
亞歐型口蹄疫病毒熒光PCR檢測(cè)采用如下步驟進(jìn)行 1)進(jìn)行A、0、C以及Asia 1型口蹄疫病毒感染樣本RNA的提??； 2)向經(jīng)過(guò)處理的口蹄疫病毒RNA加入權(quán)利要求1所述引物對(duì)和熒光素標(biāo)記探針以
及PCR擴(kuò)增用的dNTP、 PCR緩沖液、MgCl2、 ddH20及反轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶，制備PCR擴(kuò)增反
應(yīng)液； 3)將裝有PCR擴(kuò)增反應(yīng)液的PCR管置于熒光PCR儀上； 4)根據(jù)探針標(biāo)記的報(bào)告熒光類型，選擇對(duì)應(yīng)的熒光通道，進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，記錄 各檢測(cè)樣本的PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(Ct); 5)根據(jù)各樣本的反應(yīng)Ct值，按照陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)判定待檢樣本中是否存在亞歐型 口蹄疫病毒。 本發(fā)明的引物對(duì)和探針以及相應(yīng)檢測(cè)方法充分利用了熒光PCR技術(shù)的高效擴(kuò)增 性、核酸雜交的良好特異性和熒光檢測(cè)技術(shù)的快速敏感性，反應(yīng)結(jié)束即時(shí)便可根據(jù)擴(kuò)增曲線判定待檢組織病料中是否含有亞歐型口蹄疫病毒。同時(shí)，本發(fā)明中PCR擴(kuò)增所針對(duì)的基 因組區(qū)域，為亞歐型口蹄疫病毒特異性的序列，與南非型口蹄疫病毒無(wú)交叉反應(yīng)，在獲得良 好的特異性同時(shí)，通用性更強(qiáng)。


圖1所示的是含有熒光PCR錨定DNA片斷的重組質(zhì)粒的PCR鑒定結(jié)果。圖中M道 指DL-2000DNA Marker, 1-5道分別均為PCR產(chǎn)物，6道為陰性對(duì)照； 圖2所示的為亞歐型口蹄疫病毒熒光PCR檢測(cè)方法的擴(kuò)增曲線。圖中曲線1-7分
別對(duì)應(yīng)當(dāng)采用的質(zhì)粒模板濃度為1. 9X 107_1. 9X 10拷貝時(shí)的擴(kuò)增情況，曲線8是陰性對(duì) 昭.
， 圖3所示的是亞歐型口蹄疫病毒熒光PCR檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
圖4所示的是亞歐型FMDV熒光RT-PCR檢測(cè)方法的特異性試驗(yàn)結(jié)果。圖中曲線1、 2、3、4分別代表采用C Waldman、01 Manisa、Asial shamir與A22 Mahmatli型FMDV的RNA作 為模板時(shí)的熒光RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果，曲線5、6、7分別代表采用SAT1 RV 11/37、SAT2Eritrea、 SAT3Kenya 11/60型FMDV的RNA作為模板時(shí)的熒光RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果，曲線8為陰性對(duì)照。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅 用于說(shuō)明本發(fā)明而絕不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。除另有說(shuō)明外，本申請(qǐng)中的所有科 技術(shù)語(yǔ)都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。下列實(shí)施例中未注明 具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常采用常規(guī)條件例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建 議的方法。 實(shí)施例1引物和探針的制備
1引物和探針的設(shè)計(jì)和合成 從GenBank中獲得口蹄疫病毒(FMDV)基因組序列，應(yīng)用MegAlign軟件對(duì)上述序 列進(jìn)行比較和一致性分析，選擇較為保守的5' -UTR(非翻譯區(qū))序列，根據(jù)引物和探針的 設(shè)計(jì)原則，用軟件BeaconDesigner 7. 0在這些序列的保守區(qū)域篩選到一對(duì)具有通用堿基 序列的亞歐型口蹄疫病毒通用引物，引物對(duì)經(jīng)在線序列BLAST分析，確定為亞歐型FMDV(包 括A、0、C以及Asia l型)區(qū)別于南非型FMDV(包括SAT-l、SAT-2、SAT-3型)的特異性引 物對(duì)。并在該引物對(duì)的擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)設(shè)定一條通用的熒光TaqMan探針。
引物序列為FMDVU6 (正向)5' -TACCACYTTCCGCCTACTTG-3'FMDVL6(反向)5' -GGAAHGACGYAAAACTTAGG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為196bp ;
所述探針的序列為FMDVP65' -CGCTGTCTTGGGCACTCCYGTTG-3' 該探針的5'端用報(bào)告熒光染料HEX標(biāo)記，3'端用淬滅熒光染料Eclipse標(biāo)記。該 探針的設(shè)計(jì)針對(duì)于所擴(kuò)增序列間的高GC含量區(qū)。
2引物和探針的準(zhǔn)備
引物和探針合成后，引物稀釋為10iimol/L，探針稀釋為20iimol/l，上、下游引物 和探針按照l(shuí) : 1 : l等體積混合后，將引物+探針混合液-2(TC避光保存?zhèn)溆谩?
實(shí)施例2亞歐型口蹄疫病毒熒光PCR檢測(cè)方法的建立
1病毒RNA的提取 取100 ii L的滅活細(xì)胞毒，加lmL Trizol液，按照Trizol操作說(shuō)明書提取總RNA 后，用20 ii L DEPC處理的滅菌雙蒸水溶解，置_861:冰箱貯存?zhèn)溆谩?
2—步法擴(kuò)增目的基因利用實(shí)施例1制備的引物FMDVU6與FMDVL6對(duì)上述提取的RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。 RT-PCR反應(yīng)體系參照One St印RNA PCRKit說(shuō)明書進(jìn)行。在PTC-200梯度PCR儀(MJ)上 擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?0。C反轉(zhuǎn)錄30min，94。C預(yù)變性5min，94。C變性30s，58。C退火30s，72。C 延伸30s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；72t:補(bǔ)償延伸10min。
3陽(yáng)性質(zhì)粒的構(gòu)建 用Agarose Gel DNA Purification Kit(OMEGA， D2501-01)將上述PCR產(chǎn)物回收 純化，連接到pGEM-T easy載體(Promega， A1360)中并轉(zhuǎn)入JM109大腸埃希氏菌，經(jīng)過(guò)篩 選、PCR鑒定獲得含目的片段的重組質(zhì)粒。通過(guò)北京諾賽基因組研究中心測(cè)序鑒定，證實(shí)目 的基因已正確克隆到載體中，用核酸蛋白測(cè)定儀(NanoDrop， ND-100)測(cè)定質(zhì)粒濃度，換算 成拷貝數(shù)，-2(TC保存?zhèn)溆茫褂们斑M(jìn)行IO倍梯度稀釋。
4熒光PCR反應(yīng)條件與體系的建立與優(yōu)化 以構(gòu)建的含有耙基因的陽(yáng)性質(zhì)粒為DNA模板，建立亞歐型FMDV通用熒光PCR方 法，并對(duì)PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定熒光PCR反應(yīng)體系組成為10倍系列 稀釋的質(zhì)粒DNA1 ii L， 10XPCR buffer(Mg2+free)2. 5ii L， FMDVL6、 FMDVU6 (10 ii mol/L)各 0. 5 ii L，熒光探針FMDVP6 (10 ii mol/L) 0. 5 ii L， MgCl2 (25,1/L) 5 ii L， dNTPs (2. 5,1/ L)2. 5ii L，rTaq DNA聚合酶O. 5 ii L， (1(11120補(bǔ)充至25 ii L。反應(yīng)在iQ 5熒光PCR儀(Bio-Rad) 上進(jìn)行，PCR反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性3min， 94°C變性10s， 52°C退火30s，擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)，每
個(gè)循環(huán)第二步反應(yīng)結(jié)束時(shí)檢測(cè)熒光。
5標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及敏感性測(cè)定 以10倍梯度稀釋(1. 9X 107_1. 9X 10拷貝)的質(zhì)粒DNA為模板，在熒光PCR儀上 檢測(cè)，得到擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線與相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí)根據(jù)測(cè)得的最低拷貝數(shù)評(píng)價(jià)其敏感性。
6特異性試驗(yàn) 提取01 Manisa(. Carrillo C， Tulman ER， Delhon G， LuZ， Carreno A， Vagnozzi A， Kutish GF， Rock DL ComparativeGenomics of Foot_and_Mouth Disease Virus. JOURNAL 0FVIR0L0GY. 2005，79(10) :6487-6504. ) 、 Asial shamir(Freiberg B， H6hlich. B， Haas B， Saalmiiller A， Pfaff E， Marquardt 0. Type-independent detection of foot_and_mouthdisease virus by monoclonal antibodies that bind toamino—terminal residues of capsid protein VP2. J Virol Methods. 2001， 92(2) :199-205.) 、 A22 Mahmatli (Klein J， Hussain M， Ahmad M， Norma皿P， Afzal M， Alexandersen S.Geneticcharacterisation of the recent foot_and_mouth disease virus subtypeA/IRN/2005. Virol J，2007，15(4) :122)、C Waldman(Carrillo C，TulmanER， Delhon G， Lu Z， Carreno A， Vagnozzi A， Kutish GF， Rock DL Comparative Genomicsof Foot-and-Mouth Disease Virus. J0URNAL0F VIROLOGY. 2005，79 (10) :6487-6504.)、 SAT1RV 11/37(Carrillo C， Tulman ER， Delhon G， Lu Z， Carreno A， Vagnozzi A， Kutish GF，Rock DL High throughput sequencing and comparativegenomics of foot_and_mouth disease virus.Dev Biol (Basel). 2006，126 :23_30)、 SAT2Eritrea(Bronsvoort BM， Radford AD， Tanya VN， Nfon C， Kitching RP， Morgan KL Molecular epidemiology offoot_and_mouth disease viruses in the Adamawa province of Cameroon. J Clin Microbiol. 2004,42(5) :2186-2196) 、 SAT3Kenya 11/60 (CarrilloC， Tulman ER， Delhon G， Lu Z， Carreno A， Vagnozzi A， KutishGF， Rock DL. Comparative Genomics of Foot-and-Mouth Disease Virus. JOURNAL OF VIROLOGY. 2005，79 (10) :6487-6504.)等 病毒株的RNA作為模板，以DEPC處理的ddH20為模板作陰性對(duì)照，進(jìn)行亞歐型FMDV熒光 RT-PCR檢測(cè)方法的特異性試驗(yàn)。反應(yīng)體系為10X0ne st印RNA PCR Buffer 2. 5 y L， dNTP (lOmmol/L) 2. 5 ii L， MgCl2 (25,1/L) 5 ii L， RNA酶抑制劑(40U/ ii L) 0. 5 ii L， AMV RTaseXL(5U/ii L)0. 5ii L， AMV—0ptimized Taq (5U/ii L) 0. 5 ii L， FMDVU6、 FMDVL6 (10 ii mol/ L)各0. 5 ii L，熒光探針FMDVP6 (10 ii mol/L) 0. 5 ii L， RNA模板2 ii L， ddH20補(bǔ)充至25 ii L。反 應(yīng)程序?yàn)?0。C反轉(zhuǎn)錄30min，95。C預(yù)變性3min，95。C變性15s，52。C退火30s，擴(kuò)增45個(gè)循 環(huán)。 7實(shí)驗(yàn)結(jié)果 以重組的質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，1 %瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示特異性條帶大 小為196bp，與引物的預(yù)設(shè)擴(kuò)增片段大小相符。 使用質(zhì)粒DNA制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。以10倍梯度稀釋的質(zhì)粒為模板，對(duì)應(yīng)濃度為 1. 9X 107-19拷貝，以獲得的CT值為y軸，對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為x軸，儀器自動(dòng) 生成標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴(kuò)增效率為99%，相關(guān)系數(shù)為0. 998，標(biāo)準(zhǔn)方程為y = -3. 346x+42. 717。由 擴(kuò)增曲線可知，熒光PCR的檢測(cè)靈敏度為19個(gè)拷貝。根據(jù)檢測(cè)出的最低拷貝數(shù)我們?cè)O(shè)立檢 測(cè)結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)，在陰性無(wú)Ct值的前提下，待檢樣品Ct值在38以下為陽(yáng)性，38-45為可 疑，需加大模板量重新進(jìn)行檢測(cè)，無(wú)Ct值的樣品為陰性。 將建立的亞歐型口蹄疫病毒熒光PCR檢測(cè)方法進(jìn)行特異性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，口蹄疫 01Manisa、Asial shamir、A22Mahmatli、C Waldman等亞歐型分離株都有擴(kuò)增，Ct值分別為 32. 84,33. 88,31. 49,33. 20。而SAT1RV 11/37、SAT2Eritrea、SAT3Kenya 11/60與陰性對(duì)照 都沒(méi)有擴(kuò)增，體現(xiàn)了本方法良好的特異性。 實(shí)施例3亞歐型口蹄疫病毒熒光PCR檢測(cè)方法的應(yīng)用
1組織病料RNA的提取 在無(wú)菌環(huán)境中，將采集的動(dòng)物機(jī)體組織(如舌、鼻、蹄水泡皮)置乳缽中，剪碎，加 滅菌石英砂研磨。其它機(jī)體組織(如淋巴結(jié)、扁桃體等)除去包膜和其它結(jié)締組織，選取 內(nèi)部實(shí)質(zhì)部分，置乳缽中，剪碎，加滅菌石英砂研磨。再加0.01mol/L PBS(pH7.6-7.8)或 MEM(pH7. 6-7. 8)制成1 : 5的懸液。-20。C至-3(TC凍融2次，3000r/min離心10min，取上 清液提取總RNA。液體樣品，如水泡液和0P液直接用于提取總RNA。進(jìn)行組合子病料RNA 提取的同時(shí)，應(yīng)設(shè)立細(xì)胞培養(yǎng)亞歐型口蹄疫病毒作為陽(yáng)性對(duì)照，未感染口蹄疫的動(dòng)物相關(guān) 組織作為陰性對(duì)照。 組織病料總RNA提取具體按照如下步驟進(jìn)行
1. 1取500 ii L組織樣品研磨上清液置1. 5ml印pendorf管中，加等量(500 y L)三氯甲烷，快速振蕩數(shù)秒，8000r/min， 4°C ，離心5min。細(xì)胞毒、水泡液、陽(yáng)性樣品不經(jīng)此步處理。 1.2取上清液200iiL置1.5ml印pendorf管中，加入1000 y LTRIzoL，反復(fù)混勻，冰上放置5min。取陽(yáng)性對(duì)照樣品(50-200 ii L均可)，同時(shí)提RNA。 1. 3加200 ii L三氯甲烷，小心蓋上帽蓋，用力搖動(dòng)印pendorf管15秒，室溫放置5min。 1. 411000r/min，4。C，離心15min，可見分為三層，上層水相含RNA。 1. 5轉(zhuǎn)移水相至一新印pendorf管，加入等量異丙醇(約500 y L)，混勻，室溫放置
15min。 1. 611000r/min，4t:，離心10min，離心后在印pendorf管邊和底部可見有膠樣RNA沉淀。 1. 7洗RNA :棄上清，加1000ii L 75%乙醇(使用前用RNase FreedH20加無(wú)水乙醇配置而成)洗滌沉淀，重復(fù)一次，10000r/min， 4°C ，離心5min。 1. 8室溫充分干燥RNA沉淀。力n 10 ii L RNase Free dH20，即可用于PCR擴(kuò)增?？?br> 以-2(TC保存?zhèn)溆谩?2樣品檢測(cè)步驟 亞歐型口蹄疫病毒熒光RT-PCR檢測(cè)的反應(yīng)體系為10X0ne st印RNAPCRBuffer 2.5iiL， dNTP (10mmol/L) 2. 5 ii L， MgCl2 (25mmol/L) 5 ii L， RNA酶抑制劑(40U/ii L)O. 5ii L， AMV RTase XL (5U/ii L) 0. 5 ii L， AMV—Optimized Taq (5U/ii L) 0. 5 ii L， FMDVU6、FMDVL6 (10 ii mol/L)各0. 5 y L，熒光探針FMDVP6 (10 y mol/L) 0. 5 y L，上述提取的組織病料RNA模板2 ii L， ddH20補(bǔ)充至25 y L。試驗(yàn)同時(shí)設(shè)立以DEPC處理的ddH20為模板作空白對(duì)照。將上述各PCR反應(yīng)管放于熒光PCR儀上，選擇HEX通道采集熒光信號(hào)。
反應(yīng)程序?yàn)?0。C反轉(zhuǎn)錄30min，95。C預(yù)變性3min，95。C變性15s，52。C退火30s，擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束采集熒光信號(hào)。
3結(jié)果判定 反應(yīng)結(jié)束后，儀器將自動(dòng)給出每個(gè)樣品的Ct值。記錄Ct值，分析檢測(cè)結(jié)果。
3. 1試驗(yàn)成立判定 只有陽(yáng)性對(duì)照有擴(kuò)增曲線，而且Ct《38 ;同時(shí)陰性對(duì)照及空白對(duì)照無(wú)擴(kuò)增曲線或者擴(kuò)增曲線Ct > 45的，才可判定本次試驗(yàn)成立，否則本次試驗(yàn)無(wú)效。
3. 2陽(yáng)性判定 如果樣品的PCR擴(kuò)增曲線Ct《38，則表明樣品中攜帶亞歐型口蹄疫病毒。
3. 3陰性判定 如果樣品無(wú)擴(kuò)增曲線或者擴(kuò)增曲線Ct ^45，則表明樣品中不攜帶亞歐型口蹄疫病毒。 3. 4可疑判定 如果38 < Ct < 45，判為可疑，可以加大模板量5_10倍再重復(fù)擴(kuò)增，如果重復(fù)試驗(yàn)的Ct <45，則判定樣品中攜帶亞歐型口蹄疫病毒。 按照上述方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的14份口蹄疫可疑樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果檢出陽(yáng)性2份，均為河北某肉牛飼養(yǎng)場(chǎng)送檢的牛O-P液。該結(jié)果與采用國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室提供的 口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體檢測(cè)ELIS試劑盒(FMDV-NSP-I-ELISA Kit)、按照試劑盒說(shuō)明、 對(duì)相關(guān)牛的血清進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果(待檢動(dòng)物非結(jié)構(gòu)蛋白檢測(cè)為陽(yáng)性，表明為感染動(dòng)物)相一致。 序列表 〈110〉中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)植物檢疫研究所 〈 120>用于亞歐型口蹄疫病毒檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光PCR弓I物和探針 〈130>KHP08112986. 5 〈160>4 〈170>PatentIn version 3. 5
〈210>1
〈211>1096
〈212>DNA 〈213>Foot_and mouth disease virus
〈400〉 1ttg腿gggggcgctegggtctcacccctegcatgccaacgacagtccctgcgttgcact60ccacacttecgtctgtgcgtacgcgggacccgatggactetcgttcacccacctecagct120ggactcacggcaccgcgtggccattttegctggattgtgcggacg^caccgcttgcgca180cctcgcgtgaccggttegtectctteccactttccgcctecttggtcgttagcgctgtct240tgggcactcctgttgggggccgttcgacgctccacgggctcccccgtgtg3C3皿ctecg300gtgatggggccgcttcgcgcgggctgatcgcctggtgtgcttcggctgtcacccgaagcc360cgcctttcaccccccccccccteagtttteccgtcgttcccgacgte^aggg郷t雄420cacaagcttgacaccgtctttcccgacgtt腿gggatgt皿CC3C皿gCttecteccgc■ctttcccggcgtt雄gggatgteaccacaagattteccttcacccggaagtea皿cggc540aacttcacacagttttgcccgttttcatgag^atgggacgtctgcgcacga皿cgcgcc600gtcgcttgagtctecgcaggtttccccaac660cgtgcaacttgaaactccgcctggtctttccaggtctegaggggtg織ctttgtectgt720gtttgactccacgctcggtccactggcgagtgttegteacagcactgttgcttcgtegcg780gccgtggg皿ctcctccttggteac皿ggacccacggggcC皿皿gCC3C840gtcctcacggacccatcatgtgtgcaacccC3gC3CggC3actttectgtgaaacccact■tteaggtgacactgatectggtectcaaacggcte郷atgcccttcagg960teccccgaggteacacgcgacactcgggatctg卿郷ggactggggcttcttteaaag1020cgcccagttttetgcctgaateggtg紅gg郷ccggracctttccttt1080tecaaccactgatttt1096 〈210>2 〈211>20 〈212>DNA 〈213>人工序列
〈400>2
taccacyttc cgcctacttg〈210>3〈211>20〈212>DNA〈213>人工序列〈400>3gg朋hgacgy朋朋cttagg〈210>4〈211>23〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉4cgctgtcttg ggcactccyg ttg
權(quán)利要求
一種用于亞歐型口蹄疫病毒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的引物對(duì)，其特征在于，所述的引物對(duì)特異性擴(kuò)增口蹄疫病毒基因組5′-UTR序列的保守區(qū)域。
2. 如權(quán)利要求1所述的引物對(duì)，其特征在于，該引物對(duì)擴(kuò)增的靶基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1所示。
3. 如權(quán)利要求1所述的引物對(duì)，其特征在于，所述引物對(duì)的核苷酸序列為正向引物5' -TACCACYTTCCGCCTACTTG-3'，或該序列向5'端延伸10個(gè)堿基所包括的DNA序列區(qū)域內(nèi) 得到的引物序列；反向引物5' -GGAAHGACGYAAAACTTAGG-3'，或該序列向3'端延伸10個(gè)堿基所包括的 DNA序列區(qū)域內(nèi)得到的引物序列。
4. 一種用于亞歐型口蹄疫病毒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的熒光素探針，其特征在于所述 探針特異性針對(duì)于權(quán)利要求1 3任一所述引物對(duì)擴(kuò)增區(qū)域中的GC高含量區(qū)，該探針的5' 端具有報(bào)告熒光染料標(biāo)記，3'端具有淬滅熒光染料標(biāo)記。
5. 如權(quán)利要求4所述的熒光素探針，其特征在于，該述針的核苷酸序列為 5' -CGCTGTCTTGGGCACTCCYGTTG-3'，或該序列向5'端延伸10個(gè)堿基、向3'端延伸10個(gè) 堿基區(qū)域內(nèi)得到的探針序列，該探針的5'端具有報(bào)告熒光染料HEX標(biāo)記，3'端具有淬滅熒 光染料Eclipse標(biāo)記。
6. —種對(duì)亞歐型口蹄疫病毒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，該方法包括下列步驟1) 提取口蹄疫病毒感染樣本RNA ;2) 向經(jīng)過(guò)處理的口蹄疫病毒RNA權(quán)利要求1 3任一所述引物對(duì)和權(quán)利要求4或5所 述熒光素探針以及PCR擴(kuò)增用的dNTP、 PCR緩沖液、MgCl2、 ddH20及反轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶， 制備PCR擴(kuò)增反應(yīng)液；3) 將裝有PCR擴(kuò)增反應(yīng)液的PCR管置于熒光PCR儀上；4) 根據(jù)探針標(biāo)記的報(bào)告熒光類型，選擇對(duì)應(yīng)的熒光通道，進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，記錄各檢 測(cè)樣本的PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)Ct ;5) 根據(jù)各樣本的反應(yīng)Ct值，按照陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)判定待檢樣本中是否存在亞歐型口蹄 疫病毒。
7. 如權(quán)利要求6所述的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，其中熒光PCR擴(kuò)增條件為5(TC反轉(zhuǎn) 錄30min，95。C預(yù)變性3min，94。C變性10s，52。C退火30s，擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)。
8. 如權(quán)利要求6或7所述的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，其中所述的亞歐型口蹄疫病毒判 定標(biāo)準(zhǔn)為如果擴(kuò)增曲線的Ct值〈30，判定待檢樣品中含有亞歐型口蹄疫病毒，否則該樣 本不含亞歐型口蹄疫病毒。
9. 含有權(quán)利要求1 3任一所述引物對(duì)和權(quán)利要求4或5所述探針的檢測(cè)試劑盒。
10. 權(quán)利要求1 3任一所述引物對(duì)和權(quán)利要求4或5所述探針在制備用于檢測(cè)及鑒 定口蹄疫的試劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于亞歐型口蹄疫病毒檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光PCR引物和探針，所述的引物對(duì)能特異性擴(kuò)增口蹄疫病毒基因組5′-UTR序列的保守區(qū)域，所述探針特異性針對(duì)于該引物對(duì)擴(kuò)增區(qū)域中的GC高含量區(qū)，其5′端具有報(bào)告熒光染料標(biāo)記，3′端具有淬滅熒光染料標(biāo)記。本發(fā)明充分利用了熒光PCR技術(shù)的高效擴(kuò)增性、核酸雜交的良好特異性和熒光檢測(cè)技術(shù)的快速敏感性，反應(yīng)結(jié)束即時(shí)便可根據(jù)擴(kuò)增曲線判定待檢組織病料中是否含有亞歐型口蹄疫病毒，本發(fā)明中PCR擴(kuò)增所針對(duì)的基因組區(qū)域，為亞歐型口蹄疫病毒特異性的序列，與南非型口蹄疫病毒無(wú)交叉反應(yīng)，在獲得良好的特異性同時(shí)，通用性更強(qiáng)。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101724711SQ20081022534
公開日2010年6月9日 申請(qǐng)日期2008年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月30日
發(fā)明者吳紹強(qiáng), 林祥梅, 梅琳, 韓雪清 申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院