專利名稱：一種羊種布魯氏菌重組菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種羊種布魯氏菌重組菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
布魯氏菌病是一種人畜共患的傳染病，也是大動(dòng)物傳染病中僅次于口蹄疫，具 有重要的政治、經(jīng)濟(jì)影響力的疾病，在世界各國(guó)的流行形勢(shì)十分嚴(yán)峻。長(zhǎng)期以來全 球防控布魯氏菌病的策略主要是檢疫-撲殺(發(fā)達(dá)國(guó)家)或免疫接種(發(fā)展中國(guó)家)， 前者通過檢疫撲殺患病的牛、羊、豬等動(dòng)物，耗資巨大、操作困難；后者通過免疫 接種并輔助撲殺措施。但現(xiàn)行的疫苗毒力較強(qiáng)、遺傳背景不清楚，雖然可阻止疾病 在動(dòng)物群中的傳播，但無法分辯患病動(dòng)物體內(nèi)分離得到的菌株是疫苗株還是野生菌 株，使疫苗株簡(jiǎn)單、快速的安全性評(píng)價(jià)成為目前公眾關(guān)注的焦點(diǎn)問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種羊種布魯氏菌的重組菌。
本發(fā)明提供的羊種布魯氏菌的重組菌，是將羊種布魯氏菌("/7/"7h 歷e7W朋w's)基因組中的冷休克蛋白的編碼基因滅活后得到的重組菌。
所述羊種布魯氏菌(5n^//ame//fe"^)可為現(xiàn)有的菌株，如野生株(包括標(biāo) 準(zhǔn)株和強(qiáng)毒株)、疫苗株。
所述冷休克蛋白可為任何羊種布魯氏菌(5n^e//awe//fe"^)的冷休克蛋白， 如為序列1所示的冷休克蛋白。
所述冷休克蛋白的編碼序列為序列表中序列2所示的核苷酸序列。
可通過任何現(xiàn)有滅活方法滅活所述羊種布魯氏菌(5r〃ce^a歷eh'fe/2sA)中 的冷休克蛋白，如缺失基因組中該蛋白的編碼序列、插入外源或內(nèi)源序列、同源重 組、RNA干擾等。
所述同源重組是將DMll的0匪片段導(dǎo)入所述羊種布魯氏菌(5^"^ ^/&"^) 中實(shí)現(xiàn)的；所述DMll的DNA片段，從上游至下游依次為同源臂DM11-1和同源臂 DM11-2;所述同源臂DM11-1和同源臂DM11-2能與所述羊布魯氏菌基因組中的冷休 克蛋白編碼基因的上游序列和下游序列發(fā)生同源重組，滅活所述冷休克蛋白的編碼 基因。
所述同源臂DM11-1和同源臂DM11-2的長(zhǎng)度均為400-600bp。 所述同源臂DM11-1具體可為以羊種布魯氏菌16M (5wce〃a metoe"^ 16M)標(biāo) 準(zhǔn)株的基因組DNA為模板，用如下引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的DNA片段
pWUM381 (上游引物)5， - GGAATTCTGTCACGCTTCCAAGTC -3，； pWUM382 (下游引物)5， - AAGCTTCGTAAGAAATGCAGATTT -3，。 所述同源臂DM11-2具體可為以羊種布魯氏菌16M (份wce〃a me" e"^ 16M)標(biāo) 準(zhǔn)菌株的基因組DNA為模板，用如下引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的DNA片段
p而M383 (上游引物)5， - TTACGAAGCTTGTCCGGTCTGTGCCATG-3，； pWUM384 (下游引物)5， - GGGGTACCGGAAAGAAGCAGATGG -3， 實(shí)驗(yàn)證明，所述重組菌的毒力顯著低于出發(fā)菌株和現(xiàn)行疫苗株，而且免疫保護(hù) 效力與現(xiàn)有疫苗株相當(dāng)。因此，該重組菌可用于開發(fā)羊種布魯氏菌疫苗。 該布魯氏菌疫苗，其活性成分為上述羊種布魯氏菌的重組菌。 本發(fā)明通過對(duì)布魯氏菌基因組中的功能基因進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)冷休克蛋白編碼基 因的滅活使羊種布魯氏菌的毒力顯著降低。本發(fā)明通過將羊種布魯氏菌的冷休克蛋 白的編碼基因滅活，得到了新的菌株，與出發(fā)菌株相比，該新菌株的毒力較小，無 需滅活就可以作為疫苗免疫動(dòng)物。使用本發(fā)明的菌株免疫小鼠，通過PCR技術(shù)檢測(cè) 缺失基因片段的大小鑒定出患病動(dòng)物體內(nèi)分離到的菌株是疫苗菌株還是野生菌株。 本發(fā)明對(duì)布魯氏菌病疫苗的改造、診斷鑒別試劑的研制，開發(fā)布魯氏菌基因缺失標(biāo) 記疫苗，促進(jìn)全球動(dòng)物布魯氏菌病的根除和凈化具有十分重要的意義。
以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。


圖1為DM11-1和DM11-2的PCR擴(kuò)增結(jié)果 圖2為DM11的PCR連接結(jié)果
圖3為重組質(zhì)粒pEX18AP-DM11轉(zhuǎn)化DH5 a后的PCR鑒定結(jié)果
圖4為重組質(zhì)粒pEX18AP-DM11經(jīng)Kpnl和EcoRI雙酶切后產(chǎn)物的PCR鑒定結(jié)果
圖5為重組載體pEX18AP-DM11的構(gòu)建流程圖
圖6為羊種布魯氏菌重組菌BDM11的PCR鑒定結(jié)果
圖7為羊種布魯氏菌重組菌BDM11接種后小鼠脾臟的重量變化曲線
圖8為羊種布魯氏菌重組菌BDMll接種后小鼠脾臟的載菌量變化曲線
圖9為羊種布魯氏菌重組菌BDM11在小鼠體內(nèi)的免疫保護(hù)試驗(yàn)
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。 以下實(shí)施例中所用的菌株和質(zhì)粒如下
羊布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株16M (5^n/ce^a/z ehYe/2sA16M)、羊種布魯氏菌疫苗菌 株M5 (購自中國(guó)獸藥監(jiān)察所菌種室)；pEX18AP質(zhì)粒(構(gòu)建方法參見文獻(xiàn)TungT. Hoang, Gene 1998,212:77-86)。
實(shí)施例1、羊種布魯氏菌重組菌的構(gòu)建
根據(jù)布魯氏菌基因中的冷休克蛋白基因序列(GenBank Accession Number: BMEI0498)，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物， 一對(duì)引物用于擴(kuò)增同源臂DM11-1，另一對(duì)引物用于 擴(kuò)增DM11-2。同源臂DM11-1和同源臂DM11-2連接后形成序列DM11，將序列麗ll 插入pEX18AP質(zhì)粒，得到重組載體pEX18AP-DM11。重組載體pEX18AP-DM11與羊種 布魯氏菌基因組發(fā)生同源重組即可得到滅活冷休克蛋白編碼基因的羊布魯氏菌重 組菌。
一、重組載體pEX18AP-DM11的構(gòu)建 構(gòu)建過程示意圖見圖5。
1、 布魯氏菌基因組的提取
取300ul滅活的羊種布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株16M，加入lml TNE (每升含有l(wèi). 21g Tris，5.84g NaCl,O. 37g EDTA)混勻，10000r/min離心，留沉淀?xiàng)壣锨?。之后加?135ul TNE重懸洗滌后的沉淀。再向其中加入135n 1含2% Triton X-IOO的TNE，混 勻。加30!xl新鮮配制的溶菌酶(5mg/ml)，輕彈試管混勻。37T:水浴孵育30min， 之后加入15ul蛋白酶K (20mg/ml)，渦旋混勻。65。C水浴至少孵育2h。
加入RNAse (使RNAse濃度達(dá)到10ug/ml)，瓊脂糖凝膠電泳鑒定后將提取的 基因組DNA于4'C保存?zhèn)溆谩?br> 2、 PCR擴(kuò)增上游片段DM11-1 (539bp)和下游片段DM11-2 (499bp) 擴(kuò)增上游片段的引物如下
pWUM381 (上游引物)5， - GGAATTCTGTCACGCTTCCAAGTC -3，； pWUM382 (下游引物)5， - AAGCTTCGTAAGAAATGCAGATTT -3'。 上游引物中加入EcoRI酶切位點(diǎn)，下游引物中加入HindIII酶切位點(diǎn)。 擴(kuò)增下游片段的引物如下
pWUM383 (上游弓l物)5' - TTACGAAGCTTGTCCGGTCTGTGCCATG-3';
pWUM384 (下游引物)5， - GGGGTACCGGAAAGAAGCAGATGG -3' 上游引物中加入HindIII酶切位點(diǎn)，下游引物中加入Kpnl酶切位點(diǎn)。
以步驟1得到的基因組DNA為模板，使用上述兩對(duì)引物對(duì)進(jìn)行降落PCR。降落 PCR反應(yīng)的具體條件是先94'C預(yù)變性3min;然后94"C變性45s;退火溫度從65 。C至50'C每降rC運(yùn)行2個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)72。C延伸lmin;最后72。C延伸10 min。 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，見圖1。其中，1: DM11-1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物， 2: DM11-2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，3: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果表明，成功擴(kuò)增出了目的片 段。
3、 DM11片段的獲得
通過PCR擴(kuò)增將上游片段DM11-1和下游片段DM11-2連接，得到片段即為DM11 片段。PCR擴(kuò)增所用的引物如下
pWUM381 (上游引物)5， - GGAATTCTGTCACGCTTCCAAGTC -3， pWUM384 (下游引物)5， -GGGGTACCGGAAAGAAGCAGATGG -3， PCR擴(kuò)增體系
DM11-l片斷1ul
DMll-2片斷1ul
dNTP (2.5 mM)1ul
Taq酶2ul
lOXTaq buffer5ul
pWUM381 (20pmol/ul)1ul
pWUM384 (20pmol/u 1)1ul
雙蒸水補(bǔ)足至50 ul38 ul擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，見圖2。結(jié)果表明，成功獲得了將DM11-1和DM11-2 連接的DM11片段。
4、 pEX18AP-DM11質(zhì)粒的構(gòu)建
提取含有AMP抗性基因、SacB基因以及含有多克隆位點(diǎn)的pEX18AP質(zhì)粒。將經(jīng) EcoRI和Kpnl雙酶切后的pEX18AP質(zhì)粒與步驟3得到的DM11片段連接。將得到的 重組質(zhì)粒命名為pEX18AP-DMl 1 。
用pEX18AP-DMll轉(zhuǎn)化到DH5a大腸桿菌，然后進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑取陽性菌 株的單菌落進(jìn)行搖菌培養(yǎng)，先進(jìn)行PCR鑒定，鑒定引物如下
pWUM381 (上游引物)5， - GGAATTCTGTCACGCTTCCAAGTC -3， pWUM384 (下游引物)5， - GGGGTACCGGAAAGAAGCAGATGG -3， 結(jié)果見圖3。圖3中，1:陽性菌株的PCR產(chǎn)物，2、 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。 然后提取質(zhì)粒并進(jìn)行EcoRI和KpnI雙酶切鑒定。酶切鑒定的結(jié)果見圖4。圖4 中，1、 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；2、重組質(zhì)粒pEX18AP-DM11雙酶切產(chǎn)物的PCR結(jié)果。 將得到的含有重組質(zhì)粒菌株增殖，保存在-8(TC備用。 二、滅活冷休克蛋白編碼基因的布魯氏重組菌株獲得
在含有20mlTSB液體培養(yǎng)基的離心管中接種羊布魯氏菌16M標(biāo)準(zhǔn)菌株20 ul， 37r培養(yǎng)24小時(shí)后，離心菌體并用預(yù)冷的三蒸水懸浮并轉(zhuǎn)入預(yù)冷的1.5ml離心管 中，繼續(xù)離心洗滌3-4次。然后，加入適量的冷三蒸水懸浮菌液，取87ul菌液和 3ul質(zhì)粒(pEX18AP-DM11)加入lram的電極杯，將電極杯放入BIORAD電穿孔儀中，調(diào) 整儀器至Agr程序后，按Pulse鈕進(jìn)行電擊。査詢電擊參數(shù)為2. 22KV。電擊后， 向電極杯中加入lml SOC培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)入1.5ml離心管，室溫下靜置10rain，置于37 r搖床復(fù)蘇12-18h。將轉(zhuǎn)化復(fù)蘇后的菌液涂布于TSB+Amp (100ug/ul) 。 5-8天后 長(zhǎng)出單個(gè)菌落。挑取單菌落至TSB液體培養(yǎng)基(無抗生素)37'C增殖48h，再將該 菌液稀釋10-IOO倍后，取100ul涂布于含有5%蔗糖的TSA平板培養(yǎng)基。經(jīng)過3-5 天后長(zhǎng)出單菌落，將此菌落進(jìn)行PCR鑒定，陽性菌株即為滅活冷休克蛋白編碼基因 的羊種布魯氏菌的重組菌，將其命名為羊布魯氏菌重組菌BDMll。 PCR鑒定用的引物如下
pWUM381 (上游弓l物)5' -GGAATTCTGTCACGCTTCCAAGTC -3' pWUM384 (下游引物)5， -GGGGTACCGGAAAGAAGCAGATGG -3，。 羊種布魯氏菌重組菌株BDMll的PCR鑒定見圖6。圖6中，1、 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)； 2、羊種布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株16M的PCR產(chǎn)物；3、重組菌BDMll的PCR產(chǎn)物。
結(jié)果表明，獲得了通過雙交換滅活冷休克蛋白編碼基因的羊種布魯氏菌BDM11 。 實(shí)施例2、滅活冷休克蛋白的布魯氏菌重組菌的鑒定
試驗(yàn)動(dòng)物4-6周齡SPF級(jí)BALB/C雌鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有 限公司，許可證編號(hào)為SCXK(京)2007-0001。
一、毒力鑒定
將小鼠隨機(jī)分為三組，每組30只。具體接種方案如下
第一組(試驗(yàn)組)接種實(shí)施例l制備的羊種布魯氏菌重組菌BDMll，每只小
鼠腹腔接種劑量O. lml，內(nèi)含107細(xì)菌。
第二組(對(duì)照組l):接種羊種布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株16M，每只小鼠腹腔接種劑 量O. lml，內(nèi)含107細(xì)菌。
第三組(對(duì)照組2):接種羊種布魯氏菌疫苗菌株M5，每只小鼠腹腔接種劑量 0. lml，內(nèi)含107細(xì)菌。
分別于接種后第l、 2、 3、 4、 5和10周從每組小鼠中選5只，進(jìn)行脾臟大小、 脾臟載菌量檢測(cè)評(píng)價(jià)。
脾臟重量隨時(shí)間的變化見圖7。其中，野生株表示接種羊種布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株 16M的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Vac M5表示接種羊種布魯氏菌疫苗菌株M5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，BDM11 表示接種實(shí)施例1制備的羊種布魯氏菌重組菌BDM11的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果表明，羊種 布魯氏菌重組菌BDMll接種后，小鼠的脾臟與對(duì)照組1和2相比在感染早期腫大顯 著，但后期迅速下降。脾臟載菌量隨時(shí)間的變化見圖8。結(jié)果表明，羊種布魯氏菌 重組菌BDM11接種后，小鼠的脾臟載菌量與接種羊種布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株16M (對(duì)照 組l)或接種羊種布魯氏菌疫苗菌株M5 (對(duì)照組2)的小鼠相比有顯著降低，表明 該羊種布魯氏菌重組菌BDMll的毒力極低。
血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明，接種羊種布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株16M、接種羊種布魯氏菌疫 苗菌株M5或接種羊種布魯氏菌重組菌BDM11的小鼠血清通過布魯氏菌虎紅平板凝 集試驗(yàn)抗原(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制造，批號(hào)200801)檢測(cè)時(shí)，均能夠在2分鐘內(nèi) 出現(xiàn)明顯的凝集反應(yīng)，通過試管凝集試驗(yàn)抗原(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制造，批號(hào) 200603)檢測(cè)到的抗體效價(jià)達(dá)到1:100以上。
二、疫苗效力評(píng)價(jià)
將上述健康小鼠隨機(jī)分為三組，每組5只。三組小鼠分別注射羊種布魯氏菌重 組菌株BDMll、羊種布魯氏菌疫苗菌株M5和PBS，具體如下
第一組(試驗(yàn)組)接種實(shí)施例l制備的羊種布魯氏菌重組菌株BDMll，每只 小鼠腹腔接種劑量O. lml，內(nèi)含107細(xì)菌。
第二組(疫苗對(duì)照組)接種羊種布魯氏菌疫苗菌株M5，每只小鼠腹腔接種劑 量O. lml，內(nèi)含107細(xì)菌。
第三組(空白對(duì)照組)接種0.01M pH7.2磷酸鹽緩沖液(PBS)，每只小鼠 腹腔接種劑量O. lml。
上述三組小鼠接種8周后，用羊種布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)株16M進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)，攻
毒后兩周剖殺小鼠并采血，取脾臟稱重量并計(jì)算脾臟載菌量變化，評(píng)價(jià)免疫效力。 實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，脾臟的平均載菌量變化結(jié)果如圖9所示。圖中，對(duì)照組表示空白
對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，M5表示疫苗對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，BDM11表示接種實(shí)施例l制備 的羊種布魯氏菌的重組菌株BDMll的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。小鼠體內(nèi)攻毒結(jié)果表明，冷休克蛋 白編碼基因缺失的羊種布魯氏菌的重組菌株BDMll的毒力較小，無需滅活就可以作 為疫苗免疫動(dòng)物，且免疫保護(hù)效力與現(xiàn)行疫苗菌株M5相當(dāng)。
<160〉 2
<210〉 1
<211〉 83
<212〉 PRT 〈213>人工序列
〈400〉 1
Met Lys Arg Arg Arg Gin Gly Lys Gly Thr Asp Pro Met Ala Gin Thr 15 10 15
Gly Gin Val Lys Phe Phe Asn Thr Glu Lys Gly Phe Gly Phe lie Lys 20 25 30
Pro Asp Asp Gly Gly Ala Asp lie Phe Val His lie Ser Ala Val Gin 35 40 45
Ala Ser Gly Leu Pro Gly Leu Ala Asp Asn Gin Lys Val Ser Tyr Glu 50 55 60
Thr Glu Pro Asp Arg Arg Gly Lys Gly Pro Lys Ala Val Asn lie Thr 65 70 75 80
lie Thr Gly
<210〉 2
<211〉 252
〈212〉 DNA <213〉人工序列
<400> 2
atgaagcggc ggcgccaagg aaaaggaacg gatcccatgg cacagaccgg acaggtcaaa 60
ttcttcaaca ccgaaaaagg tttcggtttc atcaagcccg atgatggcgg cgcggacatc 120
ttcgtgcata tttctgcagt tcaggcttct ggcctgccag gccttgctga caatcagaag 180
gtttcctatg aaacggaacc agatcgtcgt ggaaaaggcc ccaaggccgt gaacatcacc 240
altaccggct ga 25權(quán)利要求
1、羊種布魯氏菌的重組菌，是將羊種布魯氏菌(Brucella melitensis)中的冷休克蛋白的編碼基因滅活得到的菌株。
2、 如權(quán)利要求l所述的重組菌，其特征在于所述冷休克蛋白是由序列表中 的序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。
3、 如權(quán)利要求1或2所述的重組菌，其特征在于所述滅活是通過同源重組 實(shí)現(xiàn)的。
4、 如權(quán)利要求3所述的重組菌，其特征在于所述同源重組是將DNA片段DM11 導(dǎo)入所述羊種布魯氏菌(^Y/ce72s/77eh'fe/ w^)實(shí)現(xiàn)的；所述DNA片段DM11從上 游至下游依次為同源臂DM11-1和同源臂DM11-2;所述同源臂DM11-1和同源臂 DM11-2能與所述羊種布魯氏菌基因組中的冷休克蛋白編碼基因的上游序列和下游 序列發(fā)生同源重組，滅活所述冷休克蛋白的編碼基因。
5、 如權(quán)利要求4所述的重組菌，其特征在于所述同源臂DM11-l和同源臂 DM11-2的長(zhǎng)度均為400-600bp。
6、 權(quán)利要求1至5中任一所述重組菌在制備布魯氏菌疫苗中的應(yīng)用。
7、 一種布魯氏菌疫苗，其活性成分為權(quán)利要求1至5中任一所述的羊種布魯 氏菌重組菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種羊種布魯氏菌的重組菌。本發(fā)明提供的羊種布魯氏菌的重組疫苗菌，是將羊種布魯氏菌(Brucella melitensis)中的冷休克蛋白的編碼基因滅活得到的菌株。與出發(fā)菌株相比，本發(fā)明得到的菌株的毒力比現(xiàn)行疫苗M5小，無需滅活就可以作為疫苗免疫動(dòng)物。使用本發(fā)明的菌株免疫小鼠，通過PCR方法可以鑒定出患病動(dòng)物體內(nèi)分離到的菌株是疫苗菌株還是野生菌株。本發(fā)明對(duì)布魯氏菌病疫苗的改造、診斷鑒別試劑的研制，開發(fā)布魯氏菌基因缺失標(biāo)記疫苗和配套的鑒別診斷試劑，促進(jìn)全球動(dòng)物布魯氏菌病的根除和凈化具有十分重要的意義。
文檔編號(hào)C12N1/21GK101386832SQ200810224819
公開日2009年3月18日 申請(qǐng)日期2008年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月22日
發(fā)明者婕 任, 劉文娟, 劉文曉, 吳清民, 張興林, 張春燕, 娜 李, 羽 楊, 牛建蕊, 真 王 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)