專利名稱：：一種嗜酸乳糖酶bgala及其基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種嗜酸乳糖酶BGALA及其基因、包含該基因的重組載體和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：13-半乳糖苷酶(e-D半乳糖苷半乳糖水解酶，P-D-galactosido_galatohydrolase，EC3.2.1.23)通常被稱為乳糖酶(Lactase)。這種酶能將乳糖水解成為半乳糖和葡萄糖，也具有半乳糖苷的轉(zhuǎn)移作用(張樹政等，酶制劑工業(yè)，科學(xué)出版社，1984，p818819)。乳糖酶存在于植物(尤其在杏、桃、蘋果)、細菌(乳酸菌、大腸桿菌等)、真菌(米曲霉、黑曲霉、硫球曲霉、脆壁酵母、乳結(jié)合酵母、乳酸酵母、熱帶假絲酵母)以及放線菌(天藍鏈霉菌)、動物腸道(特別是乳嬰)中。乳糖則是牛奶和乳清中的主要成分，乳糖約占牛奶干物質(zhì)的30%，但溶解度低，在2(TC水中溶解度僅為20%，而其甜度僅及蔗糖的16%，久貯的乳制品由于乳糖析出，呈砂樣感覺，影響風(fēng)味。此外，許多成人，特別是嬰兒(因人種而異，西歐占28%，亞洲、非洲占6090%)體內(nèi)缺乏乳糖酶，因此他們很難消化牛奶，飲用牛奶后，乳糖到了腸里，被腸道細菌分解發(fā)酵，產(chǎn)生大量二氧化碳氣體，使腸道膨脹，并興奮腸道蠕動，使收縮加強，造成腸鳴和腹瀉，這種疾病稱作乳糖不耐受癥(G.G.伯奇等，酶與食品加工，輕工業(yè)出版社，1991，p93110)。乳糖酶主要用來治療乳糖不耐受癥、處理加工牛乳、乳清等，生產(chǎn)低乳糖牛奶和低乳糖乳制品及減少環(huán)境污染。1.解決乳糖不耐受癥患者食用乳制品的問題(G.G.伯奇等，酶與食品加工，輕工業(yè)出版社，1991，p93110)。由于乳糖不耐受癥患者體內(nèi)缺乏乳糖酶，他們就不能充分利用乳制品中乳糖所提供的能量，乳糖在其體內(nèi)不能被吸收，就成為腸道微生物菌系的能源，這樣就導(dǎo)致乳酸和二氧化碳的形成，它們對腸道有剌激作用，并造成機體脫水進入結(jié)腸，最終會出現(xiàn)腹瀉，同時發(fā)生腸梗塞和脹氣等，造成腸道蠕動加快，還會減少蛋白質(zhì)和無機鹽類的營養(yǎng)吸收。腹瀉還會帶來衛(wèi)生學(xué)方面的問題和造成重復(fù)感染的機會?？赏ㄟ^口服乳糖酶或?qū)⑷樘敲钢苯蛹拥饺橹破分衼斫鉀Q這一問題。在工業(yè)生產(chǎn)中可將乳糖酶加到乳制品中制成低乳糖的乳制品，一方面減輕乳糖不耐受癥的影響，另一方面可提高乳制品的營養(yǎng)。2.改良濃縮乳和濃縮乳清的質(zhì)量。由于乳糖的溶解度低，在低溫下極易從濃縮乳和濃縮乳清中結(jié)晶析出，加入乳糖酶可防止冷凍乳及濃縮乳清中的乳糖結(jié)晶而引起乳酪蛋白的凝固。此外，乳清作為飼料的利用價值很高，但乳糖對家畜的生長有一定限制，使用乳糖酶將乳糖分解為單糖既提高了消化率，同時也消除了乳糖結(jié)晶所產(chǎn)生的操作不便。3.改良冰淇淋的品質(zhì)。在冰淇淋混合物中，如有12%以上的脫脂乳固形物時，貯藏及銷售中會產(chǎn)生乳糖結(jié)晶，此結(jié)晶在口中呈砂樣感，降低了商品價值，如脫脂固形物為16%，用酶分解其50%的乳糖后，在冰箱中放置四個月仍穩(wěn)定，而且，增加了甜味，冰淇淋混合物中的砂糖可減少12%用量。此外，水解乳清或乳糖在三明治、軟飲料和紡織品上漿中都有很大用途，在紡織品上漿中使用水解乳清可省去使用白蛋白，降低生產(chǎn)成本。近年來，利用|3-半乳糖苷酶生產(chǎn)低聚半乳糖也受到重視。因此，乳糖酶在食品工業(yè)生產(chǎn)中的作用日益顯著。但目前乳糖酶并未在食品工業(yè)中得到廣泛應(yīng)用，主要原因是目前乳糖酶的產(chǎn)量較低，銷售價格過高，添加成本昂貴；市場上銷售的乳糖酶主要來源于酵母，此種酶耐熱性差，適用范圍窄，不能滿足食品工業(yè)多方面的需要。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，尋找研制出成本低，產(chǎn)量高，熱穩(wěn)定性強，更適合食品工業(yè)生產(chǎn)的乳糖酶，已成為研究熱點。目前，商品化的乳糖酶主要來源于微生物(相尺孝亮等著，酶應(yīng)用手冊，上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1989，407414)。以大腸桿菌(Escherichiacoli)、黑曲霉(Aspergill體iger)、乳糖發(fā)酵酵母(Kluyveromyceslactis)及臭曲霉(A.foetidus)的變異株為適宜。在研究蛋白質(zhì)合成及遺傳因子抑制的關(guān)系中，廣泛應(yīng)用的大腸桿菌P-半乳糖苷酶是第一個被結(jié)晶的乳糖酶，分子量為850，000Da。從大腸桿菌(E.coli)ML309所產(chǎn)生的乳糖酶，推測其分子量為518，OOODa。大腸桿菌的酶最適pH為7.0，但在Na+存在下最適pH變?yōu)?.6。在乳品及其他食品工業(yè)中獲得有效應(yīng)用的乳糖酶主要是由克魯維斯氏酵母(Kluyveromyceslactis)禾口黑曲毒(Aspergillusniger)中f尋至lj的?？唆斁S其j氏酵母是從牛乳中分離到的，其產(chǎn)生的乳糖酶最適PH與新鮮牛乳的天然pH(6.66.8)相近，主要適用于分解牛乳及脫脂奶粉中的乳糖。該酶在P朋.27.0穩(wěn)定，6.27.0以上或以下酶活迅速下降。最適溫度為3540°C。分子量為135000Da。40。C處理lhr，pH在6.58.5之間穩(wěn)定，即使處理3hr也同樣穩(wěn)定，處理24hrpH78穩(wěn)定。40°C以上就急劇失活。Ca2+、Cu2+、Fe2+可以使酶失活，Mn2+、Mg2+可恢復(fù)Ca2+對酶的抑制，K+單獨存在就可以大大提高酶的熱穩(wěn)定性(謝毅等，復(fù)旦學(xué)報(自然科學(xué)版)，1999，Vol.38，No.5:523-528)。以O(shè)NPG(鄰硝基苯酚-e-D半乳糖苷)為底物，40。C反應(yīng)3min，Km為2.78mmol/L，最大反應(yīng)速度為0.lumol/min，酶的水解產(chǎn)物半乳糖對酶的活性有強烈的抑制作用，值得注意的是，核糖的抑制作用也極為強烈，但其機理尚不清楚(沈為群等，生物工程學(xué)報，1993,9(4):348354;DicksonRCetal.，JournalofBacteriology，1980，142(3):777785)。從黑曲霉所得的乳糖酶pH較低，而且在高溫下有活性。分子量為106000Da，最適溫度60°C，最適pH在3.54.0。精制酶在pH48穩(wěn)定，粗酶在pH2.28穩(wěn)定，以O(shè)NPG和乳糖為底物，Km分別為7.2X10—4M，1.8X10—2M，最大反應(yīng)速度分別為86.7umol/min/mg和121.9umol/min/mg(LEEet.al.，ArchivesofBiochemistryandBiophysics,1970，138:264271;AKASAKIM，etal.，J.Biochem，1976,80:11951200)。酶的穩(wěn)定與激活均不需要金屬離子。Mg2+能抑制活性。螯合劑使酶鈍化，對微量的重金屬離子也不顯示敏感。硝基酚疏基半乳糖苷(半乳糖酸內(nèi)酯)(TANAKA，etal.，J.Biochem,1975,77:241-247)及半乳糖是強抑制劑。從霉菌來的乳糖酶的最大特點是熱穩(wěn)定性高，最適PH值低，這樣在食品工業(yè)上就不容易受到微生物的污染，更具有應(yīng)用價值。目前，被克隆的乳糖酶基因有多種，用于工業(yè)生產(chǎn)的細菌、酵母以及真菌的乳糖酶基因均已被克隆(HaijimeSHIBUYAetal.，Biotech.Biochem.，1995,59(7):1345-1348;IrmaF.DenHerder,etal.，MolGenGenet，1992，238:404-410;HuoKeke.SCIENCEINCHINA(SeriesB)，1995，38(11):1332-1340)。這些乳糖酶基因雖然來源不同，但它們之間卻具有較高的同源性。乳糖酶基因的高效表達主要集中在來源于曲霉的乳糖酶基因上，因為曲霉的乳糖酶熱穩(wěn)定性好，PH低，更適合食品加工的需要。食物進入人的消化道后，在消化過程中需要經(jīng)過不同的pH過程，從pHl.8-5.5的大范圍變化，在胃里還要忍受胃蛋白酶的降解作用。因此，為了能夠在消化道中更加有效的水解奶制品中的乳糖，理想中的乳糖酶應(yīng)具有耐酸、抗蛋白酶的特性，還要在生理溫度和低pH具有高活性。另外，大多數(shù)應(yīng)用于食品工業(yè)的乳糖酶其最適pH為2.5-5.5，它們都是作為片劑或膠囊的形式，使其在腸道中發(fā)揮作用的。這些商品化的酶制劑大都腸衣包被，它們不適于在整個消化道尤其是胃中作用。腸衣包被的方式會增加產(chǎn)品的處理過程和成本。因此，篩選具有更加特異優(yōu)良酶學(xué)性質(zhì)的新型乳糖酶，使其適應(yīng)整個消化道的環(huán)境，作為直接添加的酶制劑，具有更好的應(yīng)用前景。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種能高效應(yīng)用的嗜酸乳糖酶。本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述嗜酸乳糖酶的基因。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。本發(fā)明的另一目的是提供一種制備上述嗜酸乳糖酶的基因工程方法。本發(fā)明的另一目的提供上述嗜酸乳糖酶的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種嗜酸乳糖酶BGALA，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本發(fā)明提供了編碼上述嗜酸乳糖酶基因bgalA。具體地，該基因的基因組序列如SEQIDNO.2所示。其cDNA序列如SEQIDNO.3所示。本發(fā)明還提供了一種制備嗜酸乳糖酶BGALA的方法，包括以下步驟1)用上述重組載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，得重組菌株；2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組乳糖酶表達；以及3)回收并純化所表達的乳糖酶BGALA。本發(fā)明還提供了上述嗜酸乳糖酶BGALA的應(yīng)用。本發(fā)明獲得一種嗜酸乳糖酶BGALA，其最適pH值為1.5，同時在酸性的范圍內(nèi)均具有高的酶活穩(wěn)定性。該酶具有較好蛋白酶抗性。在模擬人工消化道中保持穩(wěn)定并具有較高的乳糖水解率。這些性質(zhì)符合人和動物消化生理特點、pH適應(yīng)范圍，可直接應(yīng)用于乳制品加工或作為口服制品用于治療乳糖不耐受癥。圖1在畢赤酵母菌中表達的重組乳糖酶的SDS-PAGE分析，其中，1:低分子量蛋白質(zhì)Marker;2:純化的重組乳糖酶。3:脫糖基化的重組乳糖酶。圖2重組乳糖酶BGALA的最適pH。圖3重組乳糖酶BGALA的pH穩(wěn)定性。圖4重組乳糖酶BGALA的最適溫度。圖5重組乳糖酶BGALA的熱穩(wěn)定性。圖6重組乳糖酶BGALA的蛋白酶抗性。圖7重組乳糖酶BGALA在人工胃液中的穩(wěn)定性。圖8重組乳糖酶BGALA在模擬消化道環(huán)境對乳糖的水解。具體實施方式實驗條件1、菌株及載體嗜酸真菌Bisporasp.MEY_1，于2008年5月19日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，100101)，其保藏號為CGMCCNo.2500。2、酶類及其他生化試劑內(nèi)切酶購自TaKaRa公司，連接酶購自Invitrogen公司。底物購自Sigma公司，其它都為國產(chǎn)試劑。3.培養(yǎng)基Bisporasp.MEY-1培養(yǎng)基為馬鈴薯汁培養(yǎng)基1000mL馬鈴薯汁，lOg葡萄糖，25g瓊脂，pH2.5。乳糖酶活性誘導(dǎo)培養(yǎng)基5g戶硫酸銨，lg"磷酸二氫鉀，0.5g"七水合硫酸鎂，O.2gl-1氯化鈣，O.Olgl—1七水合硫酸亞鐵，3g1—1麥麩，and3gl-1豆粕，1.5%瓊脂糖，pH2.5.本發(fā)明中所用到重組遺傳學(xué)技術(shù)均為本領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)。在以下實施例中未作詳細介紹的技術(shù)，均按照以下實驗手冊或文獻中的相關(guān)章節(jié)或部分來進行，包括Sambrook等人MolecularCloning,ALaboratoryManual(第3片反.2001);Kriegler，GeneTransferandExpression:ALaboratoryMaruml(1990);禾口CurrentProtocolsinMolecularBiology(Ausubel等人編，1994)。實施例1嗜酸真菌Bisporasp.MEY-1及其產(chǎn)酶特性將來源于江西某礦的鈾礦廢水樣品經(jīng)馬鈴薯汁培養(yǎng)基培養(yǎng)后，涂布于產(chǎn)酶培養(yǎng)基平板上，3(TC培養(yǎng)56d，在產(chǎn)酶培養(yǎng)基平板可見透明圈產(chǎn)生。證明其具有乳糖酶活性。嗜酸真菌Bisporasp.MEY-l，于2008年5月19日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，100101)，其保藏號為CGMCCNo.2500。實施例2嗜酸真菌Bisporasp.MEY-1乳糖酶編碼基因bgalA的克隆提取嗜酸真菌Bisporasp.MEY-1基因組DNA:將液體培養(yǎng)3天的菌絲體用無菌濾紙過濾放入研缽中，加入2mL提取液，研磨5min，然后將研磨液置于50mL離心管中，65。C水浴鍋裂解20min，每隔10min混勻一次，在4t:下10000rpm離心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去雜蛋白，再取上清加入等體積異丙醇，于室溫靜置5min后，4t:下10000rpm離心10min。棄上清，沉淀用70%的乙醇洗滌兩次，真空干燥，加入適量TE溶解，置于-2(TC備用。根據(jù)乳糖酶基因的保守序列設(shè)計合成了簡并引物BgalAPl:5'-TWYGGNGGNACNAAYTGGGG-3，和BgalAP2:5'-TCNCCNCCNAGRTTNCCNGT-3，，W，Y，N及R分別代表A/T，C/T，A/C/T/G和A/G。以嗜酸真菌Bisporasp.MEY-1總DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應(yīng)參數(shù)為94。C變性3min;然后94。C變性30sec，46。C退火30sec，72。C延伸lmin，32個循環(huán)后72。C保溫10min。得到一約1494bp片段，將該片段回收后與pEASY-T3載體相連測序。根據(jù)測序得到的核甘酸序列，設(shè)計上游和下游各三條TAIL-PCR特異性引物設(shè)計方向為需要擴增的未知區(qū)域方向，sp2的位置設(shè)計在spl的內(nèi)側(cè)，sp3位于sp2的內(nèi)側(cè)。每兩個引物之間的距離沒有嚴格規(guī)定，引物長度一般2230nt，退火溫度在6065°C。并將它們分別命名為uspl，usp2，usp3(上游特異性引物)，dspl，dsp2，dsp3(下游特異性引物)見表l。表1.乳糖酶編碼基因bgalATAIL-PCR特異性引物<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>通過TAIL-PCR得到已知基因序列的側(cè)翼序列，擴增得到產(chǎn)物回收后送三博生物技術(shù)有限公司測序。結(jié)果獲得全長3181bp的基因組序列。實施例3乳糖酶基因的RT-PCR分析提取Bisporasp.MEY-1的總RNA，總RNA的提取方法如下將在麩皮培養(yǎng)基中培養(yǎng)54hr的菌體離心，取濕重100mg，用lmmol/L的磷酸緩沖液(K17.0)洗三次，在液氮中研磨成粉末，加入冰預(yù)冷的600iiL變性液(26mM醋酸鈉，pH4.0、0.5%十二烷基肌氨酸、0.125M|3-巰基乙醇、4M硫氰酸胍)中，然后依次加入60iiL2mol/L醋酸鈉(K14.0)，混勻，加入600iiL酚-氯仿-異戊醇(125:24:1，PH4.7)，劇烈振蕩，在冰上放置15min，4。C下10000g離心20min，將上清吸出，加入等體積的異丙醇，-20。C放置30min，4。C下10000g離心10min，棄去上清，沉淀加入lmL冰預(yù)冷的75%乙醇洗滌后，沉淀RNA自然干燥，用Nuclease-free水溶解后備用。利用反轉(zhuǎn)錄酶得到cDNA的一條鏈，然后設(shè)計恰當?shù)囊?P-BgalF:5'-GTCTACGTAATGTTGTTGTCACGCTCTTTCGCGGCCGGT-3'，P-BgalR:5'-CGAGCGGCCGCTCAATACGCCCCAGGCCGTGGGCTATAC-3')擴增cDNA，獲得編碼乳糖酶的cDNA序列，擴增得到產(chǎn)物回收后測序。通過比較乳糖酶bgalA的基因組序列和cDNA序列后發(fā)現(xiàn)該基因有3個內(nèi)含子，cDNA全長3009bp，編碼1002氨基酸。BLAST比對結(jié)果表明，其與Aspergillusphoenicis來源的乳糖酶的序列相似性最高。氨基酸最高相似性為55.5%。證明從Bisporasp.MEY-1中分離克隆得到的編碼乳糖酶的基因為新基因。實施例4重組乳糖酶的制備將表達載體pPIC9進行雙酶切(EcoRI+NotI)，同時將編碼乳糖酶的基因bgalA雙酶切(EcoRI+Notl)，切出編碼成熟乳糖酶的基因片段與表達載體pPIC9連接，獲得含有Bisporasp.MEY-1乳糖酶的基因bgalA的重組質(zhì)粒pPIC-bgalA并轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,獲得重組畢赤酵母菌株GS115/bgalA。取含有重組質(zhì)粒的GS115菌株，接種于400mLBMGY培養(yǎng)液中，30°C250rpm振蕩培養(yǎng)48h后，離心收集菌體。然后于200mLB匪Y培養(yǎng)基重懸，30°C250rpm振蕩培養(yǎng)。誘導(dǎo)48h后，離心收集上清。測定乳糖酶的活力。重組乳糖酶的表達量為0.08U/mL。SDS-PAGE結(jié)果(圖1)表明，重組乳糖酶在畢赤酵母中得到了表達。將培養(yǎng)液10000rpm離心10分鐘除去菌體，取上清液作為粗酶液，將粗酶液置于冰浴中，邊攪拌邊緩慢加入硫酸銨至80%，13000rpm離心20min，取沉淀，用緩沖液重新溶解，得到濃縮酶液，進一步用HPLC(AKTAFPLC，Pharmacia公司)純化。經(jīng)硫酸銨沉淀后上HiTrap—Q—S印harose—XL(AmershamPharmaciaBiotech預(yù)裝柱)陰離子柱。力口樣2mL，先用pH8.O，O.02mol/L的Tris-HCl緩沖溶液洗脫平衡柱子，然后用相同緩沖液配制的00.6mol/LNaCl梯度洗脫10個柱床(約50mL)，流速為5mL/min，分部收集，每管lmL。然后對收集管中的溶液測酶活及蛋白電泳分析。圖l顯示得到了電泳純?nèi)樘敲浮Ｋ磉_的乳糖酶經(jīng)過純化之后，其蛋白質(zhì)的含量達到總蛋白的90%以上。重組乳糖酶的分子量約為160kD，用EndoH酶脫糖基后，其分子量變?yōu)閘lOkD，與其理論分子量相符。實施例5乳糖酶的酶活性測定酶活性測定通過測定水解底物ONPG釋放硝基酚的量進行。反應(yīng)混合物包括100ii1酶稀釋液，250ii10NPG(5mM)禾P150ii1glycine/HCl緩沖液(pH1.5)。混合物在37t:溫育5min，加入1.5ml碳酸鈉溶液(1M)終止反應(yīng)。釋放的硝基酚通過測定A42。光吸收值的方法定量。乳糖酶活性單位定義在一定條件下，每分鐘分解底物生成1Pmol硝基酚所需的酶量為1個活性單位(U)。實施例6重組乳糖酶的酶學(xué)性質(zhì)分析將實施例4所純化的乳糖酶在不同的pH下進行酶促反應(yīng)以測定其最適pH。所用緩沖液為PHI.0-3.5的HCl-Gly緩沖液，pH2.28.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉系列緩沖液及pH8.010.OTris-HCl系列緩沖液。純化的乳糖酶在不同pH的緩沖體系，37。C下測定的pH適性結(jié)果(圖2)表明BGALA的最適pH為1.5。將酶液在不同pH值的緩沖液中于37°C下處理30min，再測定酶活性以研究酶的pH穩(wěn)定性。結(jié)果表明(圖3)，在pHO.510.0之間保持最適pH下酶活的80%以上，這說明此酶具有較好的pH穩(wěn)定性。最適溫度的測定在檸檬酸_磷酸氫二鈉(pH5.0)緩沖體系及不同溫度下進行酶促反應(yīng)。耐溫性測定為在不同溫度下處理30mm，再進行酶活測定。酶反應(yīng)最適溫度測定結(jié)果(圖4)表明，BGALA最適溫度為60°C。酶的熱穩(wěn)定性試驗表明(圖5)，在6(TC下保溫60min，活性沒有損失。在7(TC下保溫20min，剩余酶活性為80%左右。說明此酶具有較好的耐熱性。在乳糖酶溶液中加入0.05mL胰蛋白酶(0.lmg/mL，用pH7.0、Tris-HCl緩沖液配制)，和胃蛋白酶(0.lmg/mL，用pH2.0、甘氨酸-HCl緩沖液配制)于37。C處理60min，稀釋后再測定酶活性。用蛋白酶分別處理60min后，剩余100%的酶活性(圖6)。說明乳糖酶具有較好的抗蛋白酶水解的能力。重組乳糖酶對金屬離子和化學(xué)試劑的抗性測定通過在反應(yīng)體系中加入不同濃度的各種化學(xué)試劑，再檢測其活性的方法進行。結(jié)果表明(表2)，P-巰基乙醇，SDS，高濃度Mn2+強烈抑制該酶活性；EDTA和高濃度Pb2+—定程度抑制；然而牛奶中存在的各種離子如Ca2+，Cr3+，Cu2+，F(xiàn)e3+等對酶活性沒有影響，或輕微激活.表2.各種金屬離子對重組乳糖酶的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實施例7重組乳糖酶在人工胃液中的穩(wěn)定性重組乳糖酶在人工胃液(SGF，0.2Mglycine/HCl中包含2.Omgml—1NaCl和3.2mgml—1胃蛋白酶)中的穩(wěn)定性通過以下方法檢測純化的重組乳糖酶(1Uml—1)在不同pH(l.5，2.0，3.0，4.O，or5.0，用HC1或NaOH調(diào)整)的SGF中溫育37°C，60min。測定殘余乳糖酶活性。不添加胃蛋白酶的人工胃液(SGF-NPEP)同時進行檢測。結(jié)果表明(圖7)，重組乳糖酶BGALA在pHl-5的人工胃液中活性沒有損失，表現(xiàn)了較強的穩(wěn)定性。作為對照的米曲霉(A.oryzae)乳糖酶在pH1.5_3.0的SGF中沒有酶活性。實施例8重組乳糖酶在人工模擬消化道中對牛奶中乳糖的降解模擬消化道緩沖液是在10ml牛奶中加入2.Omgml—1NaCl，和O.2M甘氨酸及3.2mgm"胃蛋白酶。利用NaOH或HCl調(diào)整各步的pH。模擬的pH環(huán)境及時間變化如下pH1.9，20分鐘;pH5.5，10分鐘;pH4.6，10分鐘;pH3.8，10分鐘;pH2.8，20分鐘;pH1.9，40分鐘。初始溶液中(PH1.9)分別添加50U和100U重組乳糖酶，各步驟置于37t:震蕩(220rpm)溫育后，取500ii1反應(yīng)液轉(zhuǎn)入50ml試劑瓶中，添加250y120%醋酸鉛及250y1K2C204/Na2HP04(3g草酸鉀，7g磷酸氫二鈉溶于100ml水)，再置于黑暗環(huán)境30分鐘，使蛋白沉淀。稀釋20倍，其葡萄糖含量用試劑盒測定。乳糖水解率用生成的葡萄糖與牛奶中乳糖總量的比值來表示。結(jié)果表明(圖8)，添加100U乳糖酶處理后各步驟乳糖水解率分別是46.0X、36.8%、42.6%、46.1%、58.8%85.8%。商品化的米曲霉乳糖酶作為對照，其最終水解率為3.5%。重組BGALA在食糜消化過程中對牛奶乳糖的水解率最高達86X，具有較好的應(yīng)用前景。序列表〈110〉中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所〈120〉一種嗜酸乳糖酶BGALA及其基因和應(yīng)用〈160>3〈210>1〈211>1002〈212>PRT〈213>嗜酸真菌(Bisporasp.MEY-1)〈400>1MLLSRSFAAGVVGCLTISSLAASIGPKVTNLKIREQDRLQDIVTWDNYTLLVRGERILFY60SGEFHPFRLPVASLYLDVFQKIKALGYTGVSFYVDWALLEGTPGVYDDSGIFNLQPFFDA120ASEAGIYLVARPGPYI廳ASGGGFPGWLQLVNGTLRALDAPYLDATSLYTAKVGEAIAK180駆TEGGPIILLQPENEYIPPNNVLTQTDREYFAYVEKQFRDAGVVVPTIINDASGKGIF240APGSGLGAVDIYGFDQYPLGFDCANPYIWPAGDLQTDYREIHLDFSPTTPQAIPEFQGGS300FDPWGGPGFNACAILLNEEFERVFYKNNFAAGLTIFNIYMTYGGT麗GNLGHPGGYTSYD360YGAVIKEDRTVTREKYSEAKLEAVFVKTSLAYYTATPQNMSIAGQFVNTDEISVTQSVGE420YGTNFYFIRHTNYSSLASTSYMLTVPTSRGNVTIPQLGGTLTLNGRDSKISVTDYKLGRI■亂YSSSDIFTWQEFDGRTVVLLYGGAGETHELAFTGNLPPQPSCTGNPVVKDKDGYTII540HWSVTPERQMVDFGYLTIYLLWRNDAYNYWSIEMPAAAPLGNFTSLTKTSV頂KAGYLMR600TASVSGDILYLTGDVNATTPLEIISGASFEGTKAIYFNGKPLSFERTSYGTFISTVEFSP660PSISVPNLSKLDWKSIDSLPEIQPDYSDAAWPSCDKPYTNDTYRALTTPTSLYSSDYGFV720TGTLLYRGHFIATGKETTFFIETEGGFAFGHSVWLNSTYIGSWTGIAADQTYNQTFTLPS780LTAGKAYVFTIVIDTMGLSENYNIPDDAMKQPRGILDYQLAGRPQSAITWKMTGNLGGFN840YADKARGPLNEGGLYAERQGFYLPNPPSYSWPSSSPMTGFNSSGVRFYTASFTLDUHGY900DIPLSFTFTNASTTPYRAQLYVNGYQFGKYVNNIGPQKAFPVPEGILNYHGT麗VALTLW960AQDEGGAKVDGLALTVDLVALSGIETVVNSPMPGYSPRPGAY1002〈210>2〈211>3181〈212>DNA〈213>嗜酸真菌(Bisporasp.MEY-1)〈400>2atgttettgtcacgctctttcgcggccggtgtegttggctgcctcacgatatccagcctt60gccgcctccatcggaccteactcaagattcg3g皿C3gg3tcgtctecag120gacattgteagccgcagcctccctcctcct3CC皿3CCCCtctttgatetggcatctg皿180ttttctccaggtg織tgggactcttggtgcg郷cgagcgcatcctctt240ctectctggtgaatttcaccccttccgcttgcccgttgcctcgctctetctcgacgtgtt300ccag皿皿tc皿ggctttgggctecaccggcgtgtccttctetgttgactgggctctcct360tg皿ggcacgcccggcgtgtacgatgactcaggcatcttcaaccttcaacccttcttcga420tgctgcatcgg郷ctgg皿tctecctcgtcgcgcgcccgggcccgtetetcaacgccga■ggcttcgggaggtggctttcctggatggctacagctcgtcaatggcaccctgcgcgcctt540agatgctccctecctcgacgccacaagcttatecaccgca皿3gtCgg3gaggccatcgc600C皿g皿CC3gatcacggagggtggacc皿taattttgctcC3gCC3g皿3acg皿tetet660tccgccteat皿cgtgttgatcgggagtectttgcatecg720gttccgcgatgccggagttgtggtgccgaccatcatcaacgacgcgagcgg咖ggggat780tttcgctccgggcagcggctteggcgragtagacatctecgggttcgatcaatetccgct840gggctttgattgtg卿gtttctgctttttatctetcatcteactcgcat■3C3ggCgCg3atccctecatatggcccgctggcgaccttcccgcgagatc960cacctggatttcagtccgac朋cgccgc皿gctettcctgagtttcaaggcggctcgttc1020gacccgtgggg郷gccggggttcaatgcgtgtgccatccttcte皿cgaggagtttgag1080agggttttctateag朋c皿tttcgctgctggactcaccattttcaatetctetetggte1140agtgctccgcteteaggtcatttecgaatctetgctgatgatttgttgatagacttetgg1200cgg皿c朋actggggc皿tcttggccatccgggcggctetacatcgtecgactecggcgc1260cgteatc^ag皿gaccggaccgtgacgcgcg皿朋gtec3gcgaggc皿agctggaggc1320ggtttttgtgaagacatccctagcgtactecacggcgactcctcagaacatgtcaattgc1380gggccagttcgtc皿tecggatga^tetcggtcacgc皿agcgtgggagagtecgggac1440caatttctectttetccggcctcctcattegcatctecgagttecatgct150011caccgtgccg3CC3gC3g3ggc皿tgtgacaatccctcaactcggcggtectcttecgct1560咖tgggcgggattcg朋gatttccgttecggactec皿3cttggccggatteacatgct1620ctactcctccagtgacatcttcacgtggcaggtcggactgtcgtattect1680ttetggcggcgcggggg腿cccacgagctcgcctttectggteatcttcC3CC3C皿CC1740ttcgtgcactgg朋3CCC3gtcgtg朋ggatecacgatcatccactggag1800tgtgacgccgtggtcgatttcggctacctcactetctecctgctctggag1860gaatgatgcatateactectggtcgattg3aatgcccgccgctgccccatteggcaactt1920cacctcgttg3CC朋朋Cgtcggtgatcatg皿ggctggttecctcatgcgcacggc皿g1980tgtttctggggacattttgttgatgtcaatgc皿c皿cccctctggaaat2040cattegcggagcttcctttgagctetetecttcaacggcaagcccctttc2100gttcgagcggacgagttecggcacttttetctcgacggtegaattctcaccaccttcaat2160atcggtgcca朋tttgagca朋ttggattggattcactec2220gccggattectctgatgcggcttggccgtcttgtgac皿gccgtatecca2280tcgagccctgcatccctttettcttccgattetggtttcgtgacgggtec2340cctctteteccgaggccactttetcgcgacaccacattcttcatcgagac2400卿郷tggttttgcgttcggccactccgtctggctcaatagcacctetettggctcctg2460gacgggtetcgctgctgatc3g3catec皿ccaaacgttcacccteccttctctcacggc2520cggcaaggcgtacgtcttcaccatcgtcatcgateccatgggcctgagcg2580cattcccgacg3CgCC3tg3agcaaccccgtggcatcctcgactaccaactcgcaggtcg2640tccccaatccgcaattacatgg皿gatgactggcaatcttggcggtttcaactacgccga2700C朋3gC3CgCggccctctca3tg皿ggCggcctetatgccg皿cgcc皿gggttttetct2760ccccaatccgccctcctectcttggccatccagtegcccctcaactcctc2820cggtgtgcgcttttetacggcttcttttecccttgattteccccacggctacgacattcc2880tctcagcttcacgtttacaaacgcttctecaacccctteccgtgcacagttgtecgtcaa2940cggcteccagttcgg朋agttetcggtccatccccgttcc3000tg朋gg朋ttctgaattetcatggtecg皿ttgggttgcgttgacgttetgggCgC3gg33060tg郷gcggtgc腿ggtggacgggttggcctteacagtggatttegtcgcgctgagtgg3120朋ttg3g3C3gtggte皿ctcacctetgcc郷gtetegcccacggcctggggcgtettg3180a3181〈210>3〈211>3009〈212>DNA〈213>嗜酸真菌(Bisporasp.MEY-1)〈400>3atgttattgtcacgctctttcgcggccggtgtegttggctgcctcacgatatccagcctt60gccgcctccatcggaccteaagttecaaacctcaagattcgagaacaggatcgtctecag120gacattgtgacatgggacaactecacactcttggtgcgaggcgagcgcatcctcttctec180tctggtgaatttcaccccttccgcttgcccgttgcctcgctctetctcgacgtgttccag24012朋朋tc朋ggctttgggctecaccggcgtgtccttctetgttgactgggctctccttgaa300ggcacgcccggcgtgtecgatgactcaggcatcttcaaccttcaacccttcttcgatgct360gcatcggaggctggaatctecctcgtcgcgcgcccgggcccgtetetcaacgccgaggct420tcggg郷tggctttcctggatggctecagctcgtcaatggcaccctgcgcgccttegat■gctccctecctcgacgccacaagcttetecaccgc皿皿gtcgg卿ggccatcgccaag540朋CC3g3tC3cgg郷gtggttgctccagcatetettccg600ccteateacgtgttgacacagactgatcgggagtectttgcatecgttga660cgcgatgccggagttgtggtgccgaccatcatc^cgacgcgagcggc皿ggggattttc720gctccgggcagcggctteggcgcagtegacatctecgggttcgatcaatetccgctgggc780tttgattgcgcgaatccctecatetggcccgctggcgacctteccgcgag840atccacctggatttcagtccgac皿cgccgcaagctettcctgagtttcaaggcggctcg■ttcgacccgtgggg郷gccggggtt咖tgcgtgtgccatccttcteaa960g卿gggtttcaatttcgctgctggactcaccattttcaatetctetetg1020cttetggcggaacaaactggggcaatcttggccatccgggcggctetecatcgtacgac1080tecggcgccgteatc朋3ga3g3CCgg3CCgtgacgcgcgcgaggcaaag1140ctgg郷cggtttttgtgaagacatccctegcgtectecacggcgactcc1200tcaattgcgggccagttcgtc皿tecggatga皿tetcggtC3CgC皿3gcgtggg卿g1260tecgggaccaatttctactttatccggcataccaactectcctcattegcatctacgagt1320tecatgctcaccgtgccgacC3gC3g3ggCtccctcaactcggcggtect1380cttecgcteaatgggcgggattcgaagatttccgttecggtggccggatt1440aacatgctctactcctccagtgacatcttc3CgtggC皿g皿tttgacggtcggactgtc1500gtattectttatggcggcgcggggg咖cccacgagctcgcctttectggteatcttcca1560ccacaaccttcgtgcactggaaacccagtcgtg皿gg3C3皿gatggatecacgatcatc1620cactggagtgtgacgccggagtcgatttcggctecctcactetctecctg1680ctctggaggataactectggtcgattg^atgcccgccgctgccccatte1740ggcaacttcacctcgttgacc皿皿cgtcggtgatcatga郷ctggttecctcatgcgc1800acggcaagtgtttctggggacattttgtetctg織ggtgatgtcaatgc皿c朋cccct1860Ctgg3朋tC3ttegcggagcttcctttgaggggacte皿gctetatecttc皿cggc皿g1920cccctttcgttcgagcggacgagttecggcacttttetctcgacggtegaattctcacca1980ccttcaatetcggtgcca皿ttggattgga皿tccateg3ttcactecca2040gagattcagccggattactctgatgcggcttggccgtcttgtgac皿gccgtetaccaat2100gacacatatcgagccctgactccctttettcttccgattetggtttcgtg2160acgggteccctcttetaccgaggccactttatcgcgactgcacattcttc22203tCg3g3C3g朋ggtggttttgcgttcggccactccgtctggctc皿tegcacctetett2280ggctcctggacgggtetcgctgctgatcagaaacgttcacccteccttct2340ctcacggccggc皿ggcgtecgtcttcaccatcgtcatcgateccatgggcctgagcg朋2400ttcccgacgacgccatg皿gcaaccccgtggcatcctcgacteccaactc2460gcaggtcgtccccaatccgc朋ttecatgg皿gatgactggcaatcttggcggtttcaac2520tecgccgaca朋gcacgcggccctctcaatg皿ggcggcctetetgccgaacgcc皿ggg258013ttttetctccccaatccgccctcctectctaactcctccggtgtgcgcttttetecggctgacattcctctcagcttcacgtttecaaactecgtcaacggcteccagttcggaaagteccccgttcctgaaggaattctgaattetcatgcgraggatg郷gcggtgc朋aggtggacctgagtggaattgagacagtggteaactcagcgtattgatggccatccagtegccccatgacaggcttc2640tcttttecccttgattteccccacggctec2700gcttctecaacccctteccgtgcacagttg2760gtgaacaatetcggtccacaaaaggctttc2820ggtecgaattgggttgcgttgacgttetgg2880gggttggcctteacagtggatttegtcgcg2940cctetgccagggtetegcccacggcctggg30003009權(quán)利要求一種嗜酸乳糖酶BGALA，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.—種嗜酸乳糖酶基因bgalA，其特征在于，編碼權(quán)利要求l所述的嗜酸乳糖酶BGALA。3.如權(quán)利要求2所述的嗜酸乳糖酶基因bgalA，其特征在于，其堿基序列如SEQIDNO.2所示。4.如權(quán)利要求2所述的嗜酸乳糖酶基因bgalA，其特征在于，其堿基序列如SEQIDNO.3所示。5.包含權(quán)利要求2、3或4所述嗜酸乳糖酶基因bgalA的重組載體。6.包含權(quán)利要求2、3或4所述嗜酸乳糖酶基因bgalA的重組載體pPIC-bgalA。7.包含權(quán)利要求2、3或4所述嗜酸乳糖酶基因bgalA的重組菌株。8.如權(quán)利要求7的重組菌株，其特征在于，所述菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌。9.一種制備嗜酸乳糖酶BGALA的方法，其特征在于，包括以下步驟1)用權(quán)利要求5的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，得重組菌株；2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組乳糖酶BGALA表達；以及3)回收并純化所表達的乳糖酶BGALA。10.權(quán)利要求1所述乳糖酶BGALA的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種嗜酸乳糖酶BGALA及其基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種來源于嗜酸雙孢菌屬Bisporasp.的乳糖酶BGALA，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，且本發(fā)明提供了編碼上述乳糖酶的基因組和cDNA編碼基因bgalA。本發(fā)明獲得一種嗜酸乳糖酶，其最適pH值為1.5，同時在酸性環(huán)境中均保持有高的酶活性，其具有較好的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，抗蛋白酶水解。且該酶在模擬消化道環(huán)境中可以高效水解牛奶中的乳糖。這些性質(zhì)使其能用來治療乳糖不耐受癥及用于乳品工業(yè)，處理加工牛乳、乳清等。文檔編號C12N15/56GK101768578SQ20081022478公開日2010年7月7日申請日期2008年12月26日優(yōu)先權(quán)日2008年12月26日發(fā)明者史秀云,姚斌,孟昆,楊培龍,柏映國,王亞茹,王慧,石鵬君,羅會穎,袁鐵錚申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所