果汁中嗜酸耐熱菌的檢測方法及其誘導劑、顯色劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種果汁中嗜酸耐熱菌的檢測方法及其誘導劑、顯色劑。涉及的方法包括誘導培養(yǎng)和顯色檢測，其中誘導培養(yǎng)是利用誘導劑對待檢測果汁樣品進行誘導培養(yǎng)；顯色檢測是利用顯色劑與經誘導培養(yǎng)后的待檢測果汁樣品進行顯色反應，經顯色反應后的反應體系中出現(xiàn)琥珀色化合物，說明待檢測果汁樣品中含有嗜酸耐熱菌。涉及的誘導劑包括香草酸和培養(yǎng)基。涉及的顯色劑包括具有辣根過氧化物酶活性催化活性的DNA酶和雙氧水。本發(fā)明提出的基于DNA酶的快速比色檢測方法，通過構建基于DNA酶的生物傳感的技術，實現(xiàn)對該菌現(xiàn)場快速的定性和定量檢測，具有較高的靈敏性和特異性。
【專利說明】果汁中嗜酸耐熱菌的檢測方法及其誘導劑、顯色劑
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及果汁中有害微生物的檢測技術，具體涉及用于檢測果汁中嗜酸耐熱菌的誘導劑、顯色劑及其應用。
【背景技術】
[0002]嗜酸耐熱菌是一種嗜酸、嗜熱、好氧的芽孢桿菌，是耐熱菌中主要的果汁污染菌，其芽孢能夠經受酸性果汁加工中的巴氏滅菌而存活，當其在條件適宜的時候，又可大量繁殖，引起果汁感官和品質劣變。該菌主要污染蘋果汁、橙汁等濃縮果汁及果汁飲料，產生不良風味物質，致使果汁腐敗變質，可導致生產上的經濟損失。
[0003]目前，果汁中嗜酸耐熱菌檢測方法主要有利用細菌培養(yǎng)而達到不同微生物之間被分離的培養(yǎng)基分離鑒定，根據(jù)不同微生物之間的DNA和RNA序列不同產生的分子生物學檢測方法(如PCR技術、RT-PCR方法)，依據(jù)過氧化物酶催化化學反應帶來的辣根過氧化物酶(HRP)檢測方法，還有依靠高端儀器檢測分離技術的紅外光譜檢測等。
[0004]在上述現(xiàn)有的嗜酸耐熱菌檢測技術中，應用較多的是細菌分離培養(yǎng)和生化鑒定的方法，但該方法存在檢測指標多、操作復雜、耗時、檢測結果滯后等缺點，導致在果汁生產過程中不能及時反饋果汁的污染狀況而采取相應防措施。
[0005]此外，依靠像紅外光譜檢測一類的傳統(tǒng)儀器檢測具有檢測靈敏高，檢測結果穩(wěn)定性好等優(yōu)點，但是大型儀器設備昂貴、需要具備相關知識的專業(yè)技術操作人員、存在檢測成本高昂、檢測結果較慢等缺點，極大限制了大型儀器設備的大規(guī)模應用于現(xiàn)場快速檢測。
【發(fā)明內容】
[0006]本發(fā)明的目的之一在于提供一種果汁中嗜酸耐熱菌的檢測方法，以解決現(xiàn)有的檢測方法存在的檢測速率低、特異性差和成本高的問題。
[0007]為此，本發(fā)明提供的果汁中嗜酸耐熱菌的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0008]誘導培養(yǎng):利用誘導劑對待檢測果汁樣品進行誘導培養(yǎng)；所述誘導劑包括香草酸和培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基為402培養(yǎng)基、YSG培養(yǎng)基、BSSA培養(yǎng)基、BAT培養(yǎng)基或K氏培養(yǎng)基。
[0009]顯色檢測:利用顯色劑與經誘導培養(yǎng)后的待檢測果汁樣品進行顯色反應，經顯色反應后的反應體系中出現(xiàn)琥珀色化合物，說明待檢測果汁樣品中含有嗜酸耐熱菌；所述顯色劑包括DNA酶和雙氧水。
[0010]所述香草酸和培養(yǎng)基的用量為:1毫升待檢測果汁樣品需使用0.1?0.17克的香草酸和100毫升培養(yǎng)基。
[0011 ] 所述DNA酶包括單鏈核酸序列5’ -GTGGGTAGGGCGGGTTGG-3’、氯化血紅素、氯化鉀或氯化銨、氯化鈉、PH為5的醋酸鈉-醋酸緩沖液。
[0012]所述雙氧水用量為:4mM雙氧水:50 μ L,
[0013]所述DNA酶的組份為:
[0014]0.3 μ M 單鏈核酸序列 5’-GTGGGTAGGGCGGGTTGG-3’:50μ L ；[0015]I μ M氯化血紅素:50 μ L ;
[0016]20mM 氯化鉀溶液:100 μ L ;
[0017]150mM 氯化鈉溶液:100 μ L ;
[0018]pH為5的醋酸鈉-醋酸緩沖液:600 μ L。
[0019]所述誘導培養(yǎng)的條件為:20?60°C，培養(yǎng)13?15個小時。
[0020]所述顯色檢測的條件為:20?30°C、15?45分鐘。
[0021]所述待檢測果汁樣品中的糖度為8?12° Brix。
[0022]進一步，本發(fā)明提供的果汁中嗜酸耐熱菌的檢測方法包括以下步驟:
[0023]( I)制作嗜酸耐熱菌濃度與紫外吸收強度之間的標準曲線:
[0024](2)測定待檢測果汁樣品中嗜酸耐熱菌的含量:包括利用上述誘導劑對待檢測果汁樣品進行誘導培養(yǎng)，利用上述顯色劑與經誘導培養(yǎng)后的待檢測果汁樣品進行顯色反應，檢測顯色反應體系的紫外吸收值，和，從標準曲線上讀取待檢測果汁樣品中嗜酸耐熱菌的含量。
[0025]本發(fā)明的又一目的在于提供一種用于檢測果汁中檢測嗜酸耐熱菌的誘導劑，該誘導劑為上述幾種誘導劑中的一種。
[0026]本發(fā)明的又一目的之一在于提供一種用于檢測果汁中檢測嗜酸耐熱菌的顯色劑，該顯色劑為上述幾種顯色劑的一種。
[0027]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果如下:
[0028]本發(fā)明提出的基于DNA酶(DNAzyme)的快速比色檢測方法，通過構建基于DNA酶(DNAzyme)的生物傳感的技術，實現(xiàn)對該菌現(xiàn)場快速的定性和定量檢測，具有較高的靈敏性和特異性。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0029]圖1為不同菌濃度樣品誘導反應時愈創(chuàng)木酚的代謝曲線；
[0030]圖2為實施例2中不同菌濃度對應的顯色反應結果；
[0031]圖3為實施例2中不同菌濃度菌對應的顯色反應體系的吸光度圖譜；
[0032]圖4為實施例2的標準曲線。
【具體實施方式】
[0033]本發(fā)明所述的DNA酶是指能夠在酸性條件下，催化過氧化氫氧化愈創(chuàng)木酚產生琥珀色化合物四聚愈創(chuàng)木酚的一種酶。
[0034]本發(fā)明所用的單鏈核酸序列5’ -GTGGGTAGGGCGGGTTGG-3’可以形成G四分體結構，在氯化鉀存在條件下，這種G四分體可以結合氯化血紅素形成DNA酶(DNAzyme)。該酶可以催化雙氧水和愈創(chuàng)木酚之間的化學反應。
[0035]本發(fā)明所使用的培養(yǎng)基具體可選用402培養(yǎng)基、YSG培養(yǎng)基、BSSA培養(yǎng)基、BAT培養(yǎng)基、K氏培養(yǎng)基等可用于培養(yǎng)嗜酸耐熱菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基。其中固體培養(yǎng)基用于菌計數(shù)，液體培養(yǎng)基則用于菌的培養(yǎng)代謝。其中402培養(yǎng)基的配方如下:二水合氯化鈣0.25g、七水硫酸鎂0.50g、硫酸銨0.20g、磷酸二氫鉀3.00g、酵母浸提物2.00g、葡萄糖5.0Og ;七水硫酸鋅0.10g、四水氯化錳0.03g、硼酸0.30g、六水氯化亞鈷0.20g、二水氯化銅0.01g、六水合氯化鎳0.02g、鑰酸鈉0.03g ;無菌水IOOOmL ；
[0036]已知在添加有香草酸的培養(yǎng)基中，嗜酸耐熱菌可以利用香草酸進行自身代謝活動，產生愈創(chuàng)木酚。
[0037]酸性條件下，過氧化氫在DNAzyme的催化作用下氧化愈創(chuàng)木酚產生琥珀色化合物四聚愈創(chuàng)木酚。該琥珀色化合物四聚愈創(chuàng)木酚可用肉眼觀察，具體通過與空白對照管(空白對照為未添加香草酸導致最終沒有愈創(chuàng)木酚生成)觀察琥珀色。且該琥珀色化合物四聚愈創(chuàng)木酚在波長為420nm處具有較強的紫外可見光吸收峰，且其含量不同紫外吸收強度也不同。
[0038]由此，可通過將含有嗜酸耐熱菌的果汁樣品在適當條件下培養(yǎng)后進行顯色反應，接著判斷反應體系是否產生琥珀色化合物來實現(xiàn)對嗜酸耐熱菌的定量檢測。
[0039]發(fā)明人基于到上述機理，利用DNAzyme技術對果汁中的嗜酸耐熱菌進行快速檢測。
[0040]首先，本發(fā)明人考慮如何才能誘導果汁中的嗜酸耐熱菌產生愈創(chuàng)木酚，設計了不同添加量的香草酸作為誘導劑，促使果汁中的嗜酸耐熱菌在培養(yǎng)中能夠產生愈創(chuàng)木酚而被DNA酶檢測。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)當香草酸添加量小于0.1克(每100毫升培養(yǎng)基中)時，嗜酸耐熱菌能生長繁殖但是沒有愈創(chuàng)木酚產生，得出小于0.1克(每100毫升培養(yǎng)基中)的香草酸不能作為誘導劑添加量被使用；當香草酸添加量大于0.17克(每100毫升培養(yǎng)基中)時，嗜酸耐熱菌不能生長繁殖也不能產生愈創(chuàng)木酚，得出大于0.17克(每100毫升培養(yǎng)基中)的香草酸也不能作為誘導劑添加量被使用；當香草酸添加量在0.1?0.17克(每100毫升培養(yǎng)基中)時，嗜酸耐熱菌能正常生長并產生愈創(chuàng)木酚，可以用于DNA酶檢測。
[0041]為了進一步確定具體誘導嗜酸耐熱菌產生愈創(chuàng)木酚的誘導反應時間，無菌操作將嗜酸耐熱菌(DSM3922，保藏于德國菌種保藏中心)接種到液體402培養(yǎng)基中(IOOmL培養(yǎng)基中含0.17克香草酸作為誘導劑),45°C振蕩培養(yǎng)條件下培養(yǎng),培養(yǎng)過程中每間隔2h,無菌操作取ImL液體培養(yǎng)基，5000rpm離心5min，取上清液，測定在270nm處紫外吸收峰，作出培養(yǎng)時間與愈創(chuàng)木酚產生量的動態(tài)監(jiān)控圖。如圖1所示，在0.17克香草酸作為誘導劑條件下，通過對培養(yǎng)嗜酸耐熱菌產生愈創(chuàng)木酚整個動態(tài)過程進行監(jiān)控，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，當嗜酸耐熱菌培養(yǎng)14h后，不同初始菌濃度的嗜酸耐熱菌產生明顯不同量的愈創(chuàng)木酚，且此時間點(14h)產生的不同量的愈創(chuàng)木酚足以通過顯色反應進行判斷，為此，可以根據(jù)本發(fā)明提供的顯色方法進行不同嗜酸耐熱菌菌濃度的定性定量檢測。另一方面，能夠保證在較短時間內實現(xiàn)對嗜酸耐熱菌的快速檢測，本發(fā)明提供的培養(yǎng)嗜酸耐熱菌14h后檢測，有利于實現(xiàn)這種快速檢測的需求。因此，本發(fā)明選擇13?15h作為監(jiān)測點。
[0042]本發(fā)明利用顯色劑形成DNA酶的理論依據(jù)(在合適條件下，G富集的DNA堿基序列可以自發(fā)形成G四分體的結構，當存在鉀離子的條件下，鉀離子有助于穩(wěn)定這種G四分體結構。一旦加入氯化血紅素，其將和鉀離子穩(wěn)定的G四分體結合，最終形成氯化血紅素-G-四分體的DNA酶)，通過調控反應緩沖液pH值(如醋酸鈉-醋酸緩沖液)、氯化血紅素和G富集序列的濃度來影響DNAzyme形成和催化反應。從而選擇合適的DNAzyme催化調控愈創(chuàng)木酚-雙氧水反應體系，以利用反應后產生琥珀色化合物的紫外吸收值，判斷DNAzyme在不同條件下催化愈創(chuàng)木酚-雙氧水反應體系的氧化反應效果。
[0043]以下是發(fā)明人提供的具體實施例，以對本發(fā)明的技術方案作進一步解釋說明。[0044]實施例1:
[0045]該實施例是對果汁樣品中嗜酸耐熱菌的定性檢測。
[0046]該實施例的待檢測果汁樣品為夠買于果汁企業(yè)剛加工的糖度為70° Brix濃縮蘋果汁，用無囷水稀釋該果汁至糖度為8-12° Brix。
[0047]誘導劑為:100毫升402培養(yǎng)基+0.17g香草酸。
[0048]誘導培養(yǎng):將I毫升待檢測果汁樣品加入誘導劑中45°C條件下、搖床振蕩培養(yǎng)14h后，用無菌移液管取細菌培養(yǎng)液lmL，5000rpm離心5min，取上清液。
[0049]顯色劑為:DNAzyme與50 μ L的4mM的雙氧水。其中DNAzyme是將50 μ L的0.3 μ M單鏈核酸序列(5’ -GTGGGTAGGGCGGGTTGG-3’ )(購買于生工生物工程(上海)股份有限公司)、50 μ L的I μ M氯化血紅素、100 μ L的20mM氯化鉀溶液、100 μ L的150mM氯化鈉溶液添加到600 μ L的25mM醋酸鈉-醋酸緩沖液(pH5.0)中，孵育30min，形成DNAzyme。
[0050]顯色反應:50μ L獲得的上清液與顯色劑反應15min。之后通過肉眼觀察反應體系顏色變化，通過與空白對照管對比，發(fā)現(xiàn)反應體系中有琥珀色化合物生成，說明果汁中含有嗜酸耐熱菌。
[0051]實施例2:
[0052]該實施例是對果汁樣品中嗜酸耐熱菌的定量檢測。
[0053]該實施例的待檢測果汁樣品、誘導劑、顯色劑與實施例1相同。
[0054]制作嗜酸耐熱菌濃度與紫外吸收強度之間的標準曲線:
[0055]( I)準備試驗菌種樣品
[0056]無菌操作，將嗜酸耐熱菌(DSM3922，保藏于德國菌種保藏中心)菌株接種到三角瓶中，45°C條件下，上搖床振蕩培養(yǎng)24h，作為試驗菌種樣品。
[0057](2)制備初始菌懸液
[0058]無菌操作,將(I)步驟中獲得的試驗菌種樣品5000rpm離心5min,棄去上清液后，用IOmL無菌水混勻菌體，作為菌懸液。
[0059]無菌操作,移取菌懸液ImL,放入裝有9mL無菌水的試管中，使菌液充分振蕩混勻，使微生物細胞分散，靜置20~30s，即成10」稀釋液；再用ImL無菌吸管，吸取KT1稀釋液ImL,移入裝有9mL無菌水的試管中，吹吸3次，讓菌液混合均勻，即成10_2稀釋液；再換一支無菌吸管，吸取10_2稀釋液lmL，移入裝有9mL無菌水的試管中，也吹吸3次，即成10_3稀釋液；以此類推，連續(xù)稀釋，制成lO'lO'lO'lO'lO'lO—9等一系列稀釋菌液。再用三支Iml無菌吸管分別吸取10_4、10_5、和10_6的稀釋菌懸液各1ml，對號放入編好號的無菌平皿中，每個平皿放0.2ml。最后，將平板倒置于45°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，計算出菌懸液濃度為108cfu/mL，10_8稀釋菌液為初始菌懸液。
[0060](3)不同菌濃度樣品制備
[0061]無菌操作移取初始菌懸液lmL，放入裝有9mL無菌水的試管中，使菌液充分振蕩混勻，使微生物細胞分散，靜置20~30s，即成KT1稀釋液；再用ImL無菌吸管，吸取KT1稀釋液lmL，移入裝有9mL無菌水的試管中，吹吸3次，讓菌液混合均勻，即成10_2稀釋液；再換一支無菌吸管，吸取10_2稀釋液lmL，移入裝有9mL無菌水的試管中，也吹吸3次，即成10_3稀釋液；以此類推，連續(xù)稀釋，制成10_4、10_5、10' 10' 10_8、?ο-9等一系列稀釋菌液。得到105cfu/mL、104cfu/mL、103cfu/mL> 102cfu/mL 菌濃度。分別編好號，備用。[0062](4)誘導反應
[0063]用ImL 無菌吸管分別吸取 105cfu/mL、104cfu/mL、103cfu/mL、102cfu/mL 等一系列稀釋菌液各lmL，分別添加到裝有等量誘導劑的三角瓶中，在45°C條件下，進行該菌搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)14h。
[0064](5)顯色反應
[0065]取50 μ L經誘導反應后的嗜酸酸耐熱菌離心上清液添加到顯色劑中，孵育45min，觀察不同菌濃度樣品的顏色變化。如圖2所示，不同初始濃度的嗜酸耐熱菌最終在DNAzyme反應體系中產生明顯區(qū)別于空白對照的琥珀色，且不同濃度的初始加入菌濃度的嗜酸耐熱菌產生顏色不一樣。
[0066](6)吸光度檢測
[0067]檢測不同菌濃度樣品顯色反應體系的吸光度值，檢測結果如圖3所示。
[0068]以該實施例步驟(I)中不同濃度的嗜酸耐熱菌為橫坐標，其相應的顯色反應體系紫外吸收值為縱坐標，制作標準曲線，如圖4所示。
[0069]檢測實施例1中的顯色反應體系的吸光度，利用該吸光度在圖4所示標準曲線上查取待檢測果汁樣品中菌的含量為112cfu/mL。
[0070]對比例:
[0071]該對比例是采用傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)分離方法對實施例1中的果汁樣品進行檢測。
[0072](I)初始果汁實際樣品的液體培養(yǎng)
[0073]在無菌操作條件下，用無菌移液管移取ImL果汁樣品，加入液體402培養(yǎng)基中，在45°C條件下，上搖床振蕩培養(yǎng)18h后，5000rpm離心5min，棄去上清液，此時用IOmL無菌水稀釋管內菌體，制成菌懸液備用。
[0074](2)菌懸液固體培養(yǎng)
[0075]無菌操作移取初始菌懸液lmL，放入裝有9mL無菌水的試管中，使菌液充分振蕩混勻，使微生物細胞分散，靜置20?30s，即成KT1稀釋液；再用ImL無菌吸管，吸取KT1稀釋液lmL，移入裝有9mL無菌水的試管中，吹吸3次，讓菌液混合均勻，即成10_2稀釋液；再換一支無菌吸管，吸取10_2稀釋液lmL，移入裝有9mL無菌水的試管中，也吹吸3次，即成10_3稀釋液；以此類推，連續(xù)稀釋，制成lO'lO'lO'lO'lO'lO—9等一系列稀釋菌液。再用三支Iml無菌吸管分別吸取10_4、10_5、和10_6的稀釋菌懸液各1ml，對號放入編好號的無菌平皿中，每個平皿放0.2ml。最后，將平板倒置于45°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，觀察平板中的菌落形態(tài)特征。
[0076](3)結果判定
[0077]平皿中有單菌落出現(xiàn)且出現(xiàn)菌落較大，邊緣光滑，突起，粘稠，易挑起，呈拉絲狀的菌落特征，判斷出果汁中含有嗜酸耐熱菌，與實施例1的檢測結果一致。
【權利要求】
1.果汁中嗜酸耐熱菌的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: 誘導培養(yǎng):利用誘導劑對待檢測果汁樣品進行誘導培養(yǎng)；所述誘導劑包括香草酸和培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基為402培養(yǎng)基、YSG培養(yǎng)基、BSSA培養(yǎng)基、BAT培養(yǎng)基或K氏培養(yǎng)基。 顯色檢測:利用顯色劑與經誘導培養(yǎng)后的待檢測果汁樣品進行顯色反應，當反應體系中出現(xiàn)琥珀色化合物時說明待檢測果汁樣品中含有嗜酸耐熱菌；所述顯色劑包括DNA酶和雙氧水。
2.如權利要求1所述的果汁中嗜酸耐熱菌的檢測方法，其特征在于，所述香草酸和培養(yǎng)基的用量為:1毫升待檢測果汁樣品需使用0.1~0.17克的香草酸和100毫升培養(yǎng)基。
3.如權利要求1所述的果汁中嗜酸耐熱菌的檢測方法，其特征在于，所述DNA酶包括單鏈核酸序列5’ -GTGGGTAGGGCGGGTTGG-3’、氯化血紅素、氯化鉀或氯化銨、氯化鈉、pH為5的醋酸鈉-醋酸緩沖液。
4.如權利要求1所述的果汁中嗜酸耐熱菌的檢測方法，其特征在于， 所述雙氧水用量為:4mM雙氧水:50μ L， 所述DNA酶的組份為:
0.3 μ M 單鏈核酸序列 5’ -GTGGGTAGGGCGGGTTGG-3’:50μ L ； I μΜ氯化血紅素:50yL ; 20mM氯化鉀溶液:100yL ; 150mM氯化鈉溶液=IOOyL ； pH為5的醋酸鈉-醋酸緩沖液:600 μ L。
5.如權利要求1所述的果汁中嗜酸耐熱菌的檢測方法，其特征在于，所述誘導培養(yǎng)的條件為:20~60°C，培養(yǎng)13~15個小時。
6.如權利要求1所述的果汁中嗜酸耐熱菌的檢測方法，其特征在于，所述顯色檢測的條件為:20~30°C、15~45分鐘。
7.如權利要求1所述的果汁中嗜酸耐熱菌的檢測方法，其特征在于，所述待檢測果汁樣品中的糖度為8~12° Brix。
8.果汁中嗜酸耐熱菌的檢測方法，其特征在于，方法包括以下步驟: (O制作嗜酸耐熱菌濃度與紫外吸收強度之間的標準曲線: (2)測定待檢測果汁樣品中嗜酸耐熱菌的含`量:包括利用權利要求1或2所述的誘導劑對待檢測果汁樣品進行誘導培養(yǎng)，利用權利要求1、3或4所述的顯色劑與經誘導培養(yǎng)后的待檢測果汁樣品進行顯色反應，檢測顯色反應體系的紫外吸收值，和，從標準曲線上讀取待檢測果汁樣品中嗜酸耐熱菌的含量。
9.一種用于檢測果汁中檢測嗜酸耐熱菌的誘導劑，其特征在于，該誘導劑為權利要求1和2所述誘導劑中的一種。
10.一種用于檢測果汁中檢測嗜酸耐熱菌的顯色劑，其特征在于，該顯色劑為權利要求`1、3和4所述顯色劑中的一種。
【文檔編號】G01N33/52GK103487571SQ201310456069
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月28日 優(yōu)先權日:2013年9月28日
【發(fā)明者】王建龍, 劉濤, 岳田利, 袁亞紅, 李忠宏, 張道宏, 劉偉 申請人:西北農林科技大學