專利名稱：提取隱藏嗜酸菌胞內(nèi)聚-β-羥基丁酸酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從隱藏嗜酸菌(Acidiphilium cryptum)提取聚-β-羥基丁酸酯(PHB)的方法。

背景技術(shù)：
聚-β-羥基丁酸(poly-β-hydroxybutyrate，簡稱PHB)是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)積累的一種高分子聚合物，是生物降解塑料的重要原料。由于它在具有一般化學(xué)合成塑料特性的同時(shí)，還具有生物可降解性、生物相容性和利用再生資源進(jìn)行生物合成的特性，得到國際生物工程界的廣泛重視。PHB的提取成本是影響其大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的一個(gè)重要因素，因此研究和探索PHB的提取方法，是當(dāng)前迫切需要解決的問題。沈忠耀等報(bào)道目前PHB的提取方法，主要包括次化學(xué)試劑、有機(jī)溶劑法、機(jī)械破碎法以及酶法等。其中機(jī)械破碎法和酶法的提取率比較低，一般低于30％。前兩種提取方法用的比較多，而化學(xué)試劑法中的次氯酸鈉法是目前最常用的方法，其優(yōu)點(diǎn)是簡單、快速，但易引起PHB分子的嚴(yán)重降解。Hahn等對次氯酸鈉法進(jìn)行了改良，用分散的次氯酸鈉溶液/氯仿從菌體中提取PHB，發(fā)現(xiàn)PHB提取率有明顯提高而且摩爾質(zhì)量的下降程度明顯減弱。目前PHB提取方法研究的對象一般是真氧產(chǎn)堿桿菌。


發(fā)明內(nèi)容
為了提高隱藏嗜酸菌(Acidiphilium cryptum)胞內(nèi)聚-β-羥基丁酸酯的提取效率，本發(fā)明做了一系列的研究工作，提供了一個(gè)有效提取該屬菌的PHB方法。
自然界中的隱藏嗜酸菌(Acidiphilium cryptum)一般存在于酸性礦坑水中，與生物浸礦密切相關(guān)。該菌的16S rRNA基因序列己登錄于Genbank，登錄號(hào)為DQ168464。其保藏號(hào)為CCTCC NOM 208056。該菌既可以氧化低價(jià)態(tài)硫獲取能量進(jìn)行自養(yǎng)生長，又可以利用有機(jī)質(zhì)進(jìn)行異養(yǎng)生長。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)該菌異養(yǎng)生長時(shí)，不僅生長迅速，而且胞內(nèi)能產(chǎn)生大量聚合物顆粒，該聚合物經(jīng)紅外和紫外光譜檢測證實(shí)為PHB，具有進(jìn)一步開發(fā)成PHB新型生產(chǎn)菌的潛力。然而，提取隱藏嗜酸菌(Acidiphilium cryptum)胞內(nèi)聚-β-羥基丁酸酯(PHB)的方法的研究工作開展的較少，因此要實(shí)現(xiàn)隱藏嗜酸菌生產(chǎn)PHB的工業(yè)化，對其提取工藝進(jìn)行研究是必不可少的。
隱藏嗜酸菌(Acidiphilium cryptum)胞內(nèi)聚-β-羥基丁酸酯的提取方法，首先對隱藏嗜酸菌進(jìn)行超聲破碎，超聲破碎工作2s，間隔4s，工作10～30次，再用pH為10、體積比為2∶1～1∶2的次氯酸鈉溶液/氯仿抽提，最后在4℃加入乙醇，得沉淀即PHB。
本發(fā)明采用超聲/次氯酸/氯仿提取PHB，胞內(nèi)PHB提取率可以達(dá)到88％。

具體實(shí)施例方式 實(shí)施例1 1.菌種的培養(yǎng)與收集 將Acidiphilium cryptum菌DX1-1菌株培養(yǎng)至對數(shù)生長中期，10000r/min離心10min收集菌體，用無菌水(pH3.0)清洗菌體2次。將沉淀菌泥用20mL無菌水重懸。
2.超聲破碎 將裝有菌液的離心管，放在預(yù)先放有冰塊的燒杯里，按如下程序超聲破碎工作2s，間隔4s，工作10～30次。
3.分散的次氯酸鈉溶液/氯仿提取PHB 超聲破碎后的液體中加入80mL體積比為2∶1～1∶2的次氯酸鈉溶液(pH10)/氯仿，30℃搖床震蕩60min后，8000r/m離心分為三層上層次氯酸鈉溶液，中層未破壁細(xì)胞以及非PHB細(xì)胞物質(zhì)，下層PHB氯仿溶液。抽取氯仿相緩慢加入50mL乙醇，4℃放置30min使充分沉淀。10000r/m離心，棄上清，沉淀乙醇洗滌兩次，60℃干燥。
4.提取結(jié)果的驗(yàn)證 不同提取方法提取隱藏嗜酸菌(Acidiphilium cryptum)菌DX1-1胞內(nèi)PHB的效率 不同方法提取PHB效果驗(yàn)證
超聲/次氯酸納/氯仿提取隱藏嗜酸菌(Acidiphilium cryptum)菌DX1-1胞內(nèi)PHB效果驗(yàn)證 超聲/次氯酸納/氯仿提取PHB效果驗(yàn)證
其中先用超聲破碎(工作2s，間隔4s，工作20次)，再用體積比為1∶1的次氯酸鈉溶液(pH10)/氯仿抽提，最后用乙醇(4℃)沉淀的提取方法最適合Acidiphilium cryptum菌胞內(nèi)PHB的提取。
權(quán)利要求
1.隱藏嗜酸菌胞內(nèi)聚-β-羥基丁酸酯的提取方法，其特征在于首先對隱藏嗜酸菌進(jìn)行超聲破碎，超聲破碎工作2s，間隔4s，工作10～30次，再用pH為10、體積比為2∶1～1∶2的次氯酸鈉溶液/氯仿抽提，最后在4℃加入乙醇，得沉淀即PHB。
全文摘要
提取隱藏嗜酸菌胞內(nèi)聚-β-羥基丁酸酯的方法。本發(fā)明主要包括收集菌體、超聲破碎、氯仿/次氯酸鈉提取、加入乙醇離心得沉淀和干燥。采用本發(fā)明，隱藏嗜酸菌菌胞內(nèi)PHB提取率可以達(dá)到88％，比單獨(dú)次氯酸鈉氯仿提取的方法提高了12％。
文檔編號(hào)C08G63/89GK101343355SQ20081003148
公開日2009年1月14日 申請日期2008年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月16日
發(fā)明者邱冠周, 徐愛玲, 夏金蘭, 宇 楊, 帥 張, 李家洛, 張燕飛, 麗 歷 申請人:中南大學(xué)