巴馬哈森林病毒的實(shí)時(shí)熒光rt-pcr檢測(cè)試劑盒和方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了檢測(cè)巴馬哈森林病毒的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試劑盒和方法，檢測(cè)巴馬哈森林病毒的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試劑盒中包括2×RT-PCR Buffer，25×RT-PCRenzymeMix，上下游引物，探針，所用引物和探針的核酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示；陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照。本發(fā)明提供的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒使用方便，試劑盒所用的試劑少，大大簡(jiǎn)化了操作過(guò)程，減少了在操作過(guò)程的污染，檢測(cè)特異性強(qiáng)，靈敏度高，適用于快速檢測(cè)巴馬哈森林病毒。
【專(zhuān)利說(shuō)明】巴馬哈森林病毒的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒和方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于病毒檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測(cè)巴馬哈森林病毒的實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR檢測(cè)試劑盒和方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 巴馬哈森林病毒（BarmahForestvirus，BFV)屬于甲病毒屬單鏈RNA病毒，1974 年首次從澳大利亞環(huán)紋庫(kù)蚊中分離出，主要傳播媒介是伊蚊屬蚊蟲(chóng)和致倦庫(kù)蚊。BFV感染可 出現(xiàn)發(fā)熱、頭痛及肌肉和關(guān)節(jié)疼痛等癥狀，有時(shí)出疹，通常是在身軀或四肢上。大量的生活 史分析和序列分析證實(shí)該病毒屬于甲病毒屬塞姆利基森林病毒的分支。
[0003] 現(xiàn)在雖然我國(guó)尚未分離到BFV，但鑒于我國(guó)存在有相關(guān)媒介蚊蟲(chóng)，且隨著我國(guó)與世 界其他國(guó)家之間的貿(mào)易、旅游、人員往來(lái)日益頻繁，BFV通過(guò)各種途徑傳入的可能性很大。有 相關(guān)報(bào)道人群中曾檢測(cè)出BFV抗體，如貴州省健康人群BFVIgG抗體陽(yáng)性率為1. 49 %，不明 原因發(fā)熱患者中檢出BFVIgM陽(yáng)性率為1. 96%，提示我國(guó)人群可能存在該病毒的感染。
[0004] 目前，針對(duì)BFV的檢測(cè)方法有血清學(xué)、組織免疫學(xué)檢測(cè)、RT-PCR檢測(cè)方法，但是采 用血清學(xué)或組織免疫學(xué)的檢測(cè)方法，費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，且檢測(cè)靈敏度低，不能滿足通關(guān)要求快速、 高效、安全、低風(fēng)險(xiǎn)的目的；其次，RT-PCR檢測(cè)方法檢測(cè)靈敏度低，易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一組用于檢測(cè)巴馬哈森林病毒的核 酸。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于檢測(cè)巴馬哈森林病毒的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR試 劑盒及其檢測(cè)方法。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0007] -種用于PCR檢測(cè)巴馬哈森林病毒的引物對(duì)，所述引物對(duì)的核苷酸序列如SEQID No.1和SEQIDNo. 2 所示。
[0008] -組用于檢測(cè)巴馬哈森林病毒的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR核酸，該組核酸包括引物對(duì)、探 針和作為陽(yáng)性對(duì)照的擴(kuò)增產(chǎn)物，所述引物對(duì)的核苷酸序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo. 2 所示，所述探針的核苷酸序列如SEQIDNo. 3所示，所述擴(kuò)增產(chǎn)物為包含有如SEQIDNo. 4 所示的核苷酸序列。
[0009] 一種檢測(cè)巴馬哈森林病毒的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試劑盒，該試劑盒包括：
[0010] 2X RT-PCRbuffer；
[0011] 25XRT-PCRenzymeMix；
[0012] 上游引物：核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；
[0013] 下游引物：核苷酸序列如SEQIDNo. 2所示；
[0014] 探針：核苷酸序列如SEQIDNo. 3所示，所述探針的V端連接熒光基團(tuán)，3 ^端 連接淬滅基團(tuán)；
[0015] 陰性對(duì)照：無(wú)核酸酶水；
[0016] 陽(yáng)性對(duì)照：包含有核苷酸序列如SEQIDNo. 4所示的基因。
[0017] 如上所述的試劑盒，優(yōu)選地，所述熒光基團(tuán)為FAM、CY3、HEX中任意一種，所述淬滅 基團(tuán)為BHQl、TAMRA、BHQ2中任意一種。
[0018] -種實(shí)時(shí)突光RT-PCR方法檢測(cè)巴馬哈森林病毒的方法，該方法包括以下步驟：
[0019] (1)從樣品中提取病毒RNA;
[0020] (2)對(duì)提取的RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增；其中，RT-PCR擴(kuò)增時(shí)，反應(yīng)體系采用 上下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 2所示，探針的核苷酸序列如SEQ IDNo. 3 所示；
[0021] (3)收集熒光信號(hào)，選擇上述熒光基團(tuán)的熒光檢測(cè)模式，基線調(diào)整取3?15個(gè)循環(huán) 的熒光信號(hào)，以閾值線剛好超過(guò)正常陰性對(duì)照的最高點(diǎn)設(shè)定閾值線；
[0022] (4)結(jié)果判定：待測(cè)樣品熒光增長(zhǎng)曲線超過(guò)閾值線，并呈現(xiàn)良好的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，則判 斷為陽(yáng)性，如無(wú)典型的擴(kuò)增曲線，判斷為陰性。
[0023] 如上所述的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法檢測(cè)巴馬哈森林病毒的方法，優(yōu)選地，所述步驟 (2)中熒光RT-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系具體如下：
[0024]IXRT-PCRBuffer,
[0025] IXRT-PCREnzymeMix,
[0026] 上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；
[0027] 下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 2所示；
[0028] 探針的核苷酸序列如SEQIDNo. 3所示，
[0029] 其中，所述探針的5 '端連接熒光基團(tuán)，3 '端連接淬滅基團(tuán)；上下游引物和探針 濃度分別為〇. 01?1μM樣品RNA;同時(shí)設(shè)置無(wú)核酸酶水為陰性對(duì)照。
[0030] 如上所述實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法檢測(cè)巴馬哈森林病毒的方法，優(yōu)選地，上下游引物 濃度為400nmol/L，探針的終濃度為200nmol/L。
[0031] 如上所述的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法檢測(cè)巴馬哈森林病毒的方法，優(yōu)選地，所述步驟 ⑵中熒光RT-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?br> [0032]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于PCR檢測(cè)巴馬哈森林病毒的引物對(duì)，其特征在于，所述引物對(duì)的核苷酸序 列如 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 所示。
2. -組用于檢測(cè)巴馬哈森林病毒的實(shí)時(shí)突光定量RT-PCR核酸，其特征在于，該組核酸 包括引物對(duì)、探針和作為陽(yáng)性對(duì)照的擴(kuò)增產(chǎn)物，所述引物對(duì)的核苷酸序列如SEQ ID No. 1和 SEQ ID No. 2所示，所述探針的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示，所述擴(kuò)增產(chǎn)物為包含有如 SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列。
3. -種檢測(cè)巴馬哈森林病毒的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括： 2. RT-PCR buffer ； 25XRT-PCRenzymeMix ； 上游引物：核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示； 下游引物：核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示； 探針：核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示，所述探針5 '端連接熒光基團(tuán)，3 '端連接淬 滅基團(tuán)； 陰性對(duì)照：無(wú)核酸酶水； 陽(yáng)性對(duì)照：包含有核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示的基因。
4. 如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述熒光基團(tuán)為FAM、CY3、HEX中任意一 種，所述淬滅基團(tuán)為BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一種。
5. -種實(shí)時(shí)突光RT-PCR方法檢測(cè)巴馬哈森林病毒的方法，其特征在于，該方法包括以 下步驟： (1) 從樣品中提取病毒RNA ; (2) 對(duì)提取的RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增，其中，RT-PCR擴(kuò)增時(shí)，反應(yīng)體系中，采用 上下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示，探針的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示；同時(shí)設(shè)置無(wú)核酸酶水為陰性對(duì)照； (3) 收集突光信號(hào)； (4) 結(jié)果判定：待測(cè)樣品熒光增長(zhǎng)曲線超過(guò)閾值線，并呈現(xiàn)良好的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，則判斷為 陽(yáng)性，如無(wú)典型的擴(kuò)增曲線，判斷為陰性。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟（2)中熒光RT-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體 系具體如下：1 XRT-PCR Buffer，IXRT-PCR Enzyme Mix，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示；探針的核苷酸序列如SEQ ID No. 3 所示，所述探針的5'端連接熒光基團(tuán)，3'端連接淬滅基團(tuán)；上下游引物和探針濃度分別 為0. 01?I ii M，樣品RNA ;同時(shí)設(shè)置無(wú)核酸酶水為陰性對(duì)照。
7. 如權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述上下游引物濃度為400nmol/L，探 針的終濃度為200nmol/L。
8. 如權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述步驟（2)中熒光RT-PCR擴(kuò)增的反 應(yīng)程序?yàn)椋?br> 9.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟（3)收集熒光信號(hào)包括，選擇上述 熒光基團(tuán)的熒光檢測(cè)模式，基線調(diào)整取3?15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)，以閾值線剛好超過(guò)正常 陰性對(duì)照的最高點(diǎn)設(shè)定閾值線。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104357583SQ201410602378
【公開(kāi)日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月31日
【發(fā)明者】孫肖紅, 白紅巖, 馬愛(ài)敏, 劉麗娟, 劉夢(mèng)瑩 申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院