專利名稱：與棕色棉纖維色澤主效qtl連鎖的分子標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及棉花分子標(biāo)記輔助選擇育種和分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其是一種與棕色棉長(zhǎng)絨和短絨纖維色澤QTL緊密連鎖的SSR標(biāo)記及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
棉花是世界性的重要經(jīng)濟(jì)作物，棉纖維不但是人類日常生活的必需品、紡織工業(yè)的重要原料，也是國(guó)際市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)的重要農(nóng)產(chǎn)品。彩色棉作為專用棉的重要類型之一，其纖維具有天然的棕、綠等顏色。但是，目前已知天然彩色棉品種資源全部屬于棕色和綠色系列， 顏色單調(diào)、纖維品質(zhì)差、色牢度及色飽和度不足成為限制天然彩色棉產(chǎn)業(yè)發(fā)展的技術(shù)瓶頸。 這為彩色棉育種和創(chuàng)新提出了十分緊迫的研究課題。但育種實(shí)踐證明，要解決這些問(wèn)題是十分困難的，究其原因主要是對(duì)彩色棉的遺傳基礎(chǔ)了解不夠，不能采用更有效的育種措施。 因此，搞清楚彩色棉的遺傳規(guī)律和遺傳效應(yīng)，對(duì)指導(dǎo)育種和創(chuàng)新工作非常重要。張秉賢Q000)以棕色纖維種質(zhì)為父本所配制的兩個(gè)雜交組合，所有Fl棉株的纖維均呈灰白色，即為白色與棕色的中間色，將F:棉株按纖維有色(包括中間色和棕色)與白色分成兩類進(jìn)行擴(kuò)檢驗(yàn)結(jié)果表明，有色植株與白色植株之比符合3 1，因而認(rèn)為，主要受一對(duì)顯性基因控制，但表現(xiàn)為不完全顯性；周雁聲等(1998)用白色棉與棕色棉雜交，正反交Fl的纖維均為淺棕色，介于雙親之間，F(xiàn)2分離為棕色、淺棕色與白色，符合1 :2:1 的理論比例，這也說(shuō)明棕色棉的纖維顏色由單基因控制，棕色表現(xiàn)為不完全顯性；李永山 (2002)、耿軍義等(1998)研究表明棕色棉的纖維顏色由單基因控制，棕色表現(xiàn)為不完全顯性，詹少華Q008)認(rèn)為除一對(duì)主效基因外，還存在一些作用較小的“微效基因”。石玉真、杜雄明等000 研究認(rèn)為棕色纖維由一對(duì)主效基因控制，表現(xiàn)為不完全顯性遺傳，棕色相對(duì)白色為顯性，同時(shí)，棕色纖維顯性性狀的表現(xiàn)還受控制短絨色澤的隱性基因的影響；李定國(guó)用(2004)Minoalt色差計(jì)，測(cè)定纖維的色澤，分析纖維色澤的遺傳規(guī)律，結(jié)果表明，棕色纖維是由不完全顯性單基因控制的質(zhì)量性狀。孫東磊O008)以棕色棉為母本與三個(gè)白色棉雜交，其F2棉株按長(zhǎng)纖維棕色(深棕、棕色)與白色(棕白、白色、淺棕)分成兩類，進(jìn)行的 x2檢驗(yàn)結(jié)果表明，在顯著水平白色植株與有色植株之比符合孟德爾9 7的分離規(guī)律，認(rèn)為棕色陸地棉纖維色澤至少受4對(duì)基因控制，長(zhǎng)纖維和短絨棕色的有無(wú)各由1對(duì)顯性基因控制，其纖維色澤類型至少還受2對(duì)微效基因控制，表現(xiàn)出淡棕、棕近白等不同類型。以上研究進(jìn)展基本揭示了棕色棉纖維色澤的遺傳規(guī)律，為我們對(duì)該性狀的QTL定位打下了良好的基礎(chǔ)。棉花QTL定位研究開始于20世紀(jì)90年代初，Reinisch等1994年建立了第一個(gè)詳盡的異源四倍體棉花RFLP圖譜，由此揭開了棉花分子圖譜構(gòu)建和QTL定位研究的序幕。 隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，遺傳圖譜的飽和程度越來(lái)越高，越來(lái)越多的QTL被定位到染色體或連鎖群上，為標(biāo)記輔助選擇及圖位克隆奠定基礎(chǔ)，這些QTL包括皮棉產(chǎn)量及產(chǎn)量構(gòu)成、 纖維品質(zhì)、抗蟲、抗病、農(nóng)藝性狀等。但國(guó)內(nèi)外很少見有彩色棉的農(nóng)藝經(jīng)濟(jì)性狀的QTL定位。采用多環(huán)境下的重復(fù)試驗(yàn)可以減少試驗(yàn)誤差及環(huán)境誤差，采用多個(gè)環(huán)境多個(gè)重復(fù)的平均數(shù)據(jù)可以更加準(zhǔn)確的進(jìn)行QTLs的定位，環(huán)境越多，結(jié)果也就越可靠(沈新蓮，2004)。 為此，本本發(fā)明除了利用棕1 和庫(kù)車T94-4雜交組合的F2群體對(duì)棕色棉進(jìn)行QTL定位和分析外，還利用棕1 和庫(kù)車T94-4雜交組合的RIL群體，在四種環(huán)境下進(jìn)行了棕色棉進(jìn)行 QTL定位，以便于找到與棕色棉纖維緊密相關(guān)的可靠性好、穩(wěn)定性高的QTL，用于分子標(biāo)記輔助育種。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種與棕色棉的長(zhǎng)絨和短絨纖維色澤主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供擴(kuò)增所述分子標(biāo)記的引物，其序列如SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 所示。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種與棕色棉的長(zhǎng)絨和短絨纖維色澤主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記，其為用SEQ ID No. 1和SEQ IDNo. 2所示的引物擴(kuò)增出的23^ρ和500bp 的擴(kuò)增片段。本發(fā)明提供的分子標(biāo)記，通過(guò)下述方法獲得1)以棕色棉材料棕128(母)和白色棉庫(kù)車T94-4(父)為親本，分別構(gòu)建其F2分離群體和重組自交系F8,其中重組自交系種植于四個(gè)不同生態(tài)環(huán)境(2008年河南省安陽(yáng)、 2009年河南安陽(yáng)、2009年湖北省黃梅縣、2009年新疆石河子)。2)通過(guò)已知公布的7000對(duì)棉花SSR引物篩選親本間的多樣性，其方法是首先對(duì)材料DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳后染色對(duì)條帶進(jìn)行識(shí)別。將得到的113對(duì)多態(tài)性引物在兩個(gè)群體中進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。其中在F2群體和重組自交系中均產(chǎn)生114個(gè)清晰可重復(fù)的多態(tài)性位點(diǎn)。3)通過(guò)J0inMap3. 0構(gòu)建連鎖圖譜，F(xiàn)2群體83個(gè)位點(diǎn)共構(gòu)建了 21個(gè)連鎖群，覆蓋 724. 86cM，每個(gè)連鎖群平均4個(gè)標(biāo)記，標(biāo)記間平均距離8. 73cM ；重組自交系(RIL)群體中， 87個(gè)位點(diǎn)構(gòu)建了 27個(gè)連鎖群，共構(gòu)建27個(gè)連鎖群，覆蓋481. 54cM,每個(gè)連鎖群平均3. 2個(gè)標(biāo)記，標(biāo)記間平均距離5. 53cM。4)利用掃描儀對(duì)棉纖維長(zhǎng)絨和短絨掃描成像，利用Photoshopg. 0獲取纖維圖像的RGB(R 紅色；G 綠色；B 藍(lán)色)數(shù)據(jù)，通過(guò)公式計(jì)算顏色系數(shù)P = R/(G+B)，每個(gè)圖像隨機(jī)在不同的位置取10個(gè)P值，求得均值。5)利用 Windows QTL Cartographer 2. 5 軟件的復(fù)合區(qū)間作圖法(Composite Interval Mapping, CIM)，結(jié)合纖維顏色系數(shù)和連鎖圖譜對(duì)纖維色澤QTL進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供所述的引物或分子標(biāo)記在棉花品種纖維色澤早期選擇或品種鑒定中的應(yīng)用。具體而言，是用SEQ IDNo. 1和SEQ ID No. 2所示的引物對(duì)棉花品種或棉花雜交后代的幼苗的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，若擴(kuò)增出238bp和500bp的片段，表明其纖維色澤為棕色。通過(guò)利用棕色棉棕128與白色棉庫(kù)車T94-4的F2 (簡(jiǎn)稱ZKF2)群體和重組自交系 (RIL)群體對(duì)棕色棉纖維的長(zhǎng)絨和短絨色澤QTL進(jìn)行多群體多環(huán)境定位分析發(fā)現(xiàn)，棕色棉長(zhǎng)絨和短絨纖維色澤QTL均與SSR標(biāo)記NAU1043緊密連鎖，而且在多環(huán)境下均能穩(wěn)定檢測(cè)到?？梢杂糜谧厣奚珴傻姆肿訕?biāo)記早期選擇和育種。
本發(fā)明提供的棕色棉特征標(biāo)記NAU1043在深棕色、淺棕色和白色棉材料中的帶型具有明顯的差異，在不同纖維色澤品種或及其彩色棉后代選育中，在苗期就可以進(jìn)行分子標(biāo)記選擇深棕色或棕色植株類型。而且，沒(méi)有必要構(gòu)建F2或重組自交系，進(jìn)行QTL的再分析，大大提高了選擇效率和準(zhǔn)確度。


圖1為本發(fā)明F2群體和重組自交系(RIL)群體部分分子標(biāo)記連鎖圖譜以及QTL定位。圖中，ASF2群體部分分子標(biāo)記連鎖圖譜以及QTL定位；B為重組自交系(RIL)群體部分分子標(biāo)記連鎖圖譜以及QTL定位。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1以棕色棉材料棕128 (母)(來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所中期庫(kù))和白色棉庫(kù)車T94-4 (父)(來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所中期庫(kù))為親本，分別構(gòu)建300個(gè)單株的 F2分離群體和沈0個(gè)家系的重組自交系F8,其中重組自交系種植于四個(gè)不同生態(tài)環(huán)境(2008 年河南省安陽(yáng)、2009年河南安陽(yáng)、2009年湖北省黃梅縣、2009年新疆石河子)。實(shí)施例2通過(guò)已知公布的7000對(duì)棉花SSR引物篩選親本間的多樣性，其方法是首先對(duì)棕 128和庫(kù)車T94-4兩個(gè)親本的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)在PTC-100型PCR儀上進(jìn)行， 反應(yīng)體系 10 μ 1，包括 1 μ 110XPCR 緩沖液(含 15mmol/L Mg2+)，50ng 模板 DNA，0. 5mmol/ LdNTPs,0. 5U Taq酶，0. 5ymol/L 3'和5'引物。反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性3min ;94°C 45s， 55°C 45s, 72°C 45s, 30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5min，4°C保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)，凝膠電泳在DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀上進(jìn)行，恒壓150V，電泳lh，銀染觀察并照相，篩選得到113對(duì)多態(tài)性豐富的引物。將得到的113對(duì)多態(tài)性引物在兩個(gè)群體中進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)(PCR體系同上)，其中在F2群體和重組自交系中均產(chǎn)生114個(gè)清晰可重復(fù)的多態(tài)性位點(diǎn)。實(shí)施例3通過(guò)J0inMap3. 0構(gòu)建連鎖圖譜，F(xiàn)2群體83個(gè)位點(diǎn)共構(gòu)建了 21個(gè)連鎖群，覆蓋 724. 86cM,每個(gè)連鎖群平均4個(gè)標(biāo)記，標(biāo)記間平均距離8. 73cM ；重組自交系(RIL)群體中， 87個(gè)位點(diǎn)構(gòu)建了 27個(gè)連鎖群，共構(gòu)建27個(gè)連鎖群，覆蓋481. 54cM,每個(gè)連鎖群平均3. 2個(gè)標(biāo)記，標(biāo)記間平均距離5. 53cM。實(shí)施例4利用掃描儀對(duì)棉纖維長(zhǎng)絨和短絨掃描成像，利用Ph0t0sh0p9. 0獲取纖維圖像的 RGB(R 紅色；G 綠色；B 藍(lán)色)數(shù)據(jù)，通過(guò)公式計(jì)算顏色系數(shù)P = R/(G+B)，每個(gè)圖像隨機(jī)在不同的位置取10個(gè)P值，求得均值。利用Windows QTL Cartographer 2. 5 軟件的復(fù)合區(qū)間作圖法(Composite Interval Mapping, CIM)，結(jié)合纖維顏色系數(shù)和連鎖圖譜對(duì)纖維色澤QTL進(jìn)行檢測(cè)。在棕128與庫(kù)車T94-4組合的F2群體中檢測(cè)到5個(gè)長(zhǎng)絨色澤的QTL，4個(gè)短絨色澤的QTL，分別位于不同的連鎖群上，其中長(zhǎng)絨色澤QTL qLCF2-7-l在標(biāo)記NAU1043與GH302 之間，與標(biāo)記NAU1043的遺傳距離為2.01，其加性效應(yīng)為4.86%，顯性效應(yīng)為-3.12%， 解釋表型變異的27. 37%。增效基因來(lái)自棕128，為長(zhǎng)絨色澤的主效QTL。短絨色澤QTL qFCF2-7-l同樣位于標(biāo)記NAU1043與GH302之間，與標(biāo)記NAU1043的遺傳距離為2. 01，其加性效應(yīng)為6. 450%，顯性效應(yīng)為-2. 98%，解釋表型變異的47. 46% (表1)。增效基因來(lái)自棕128，為短絨色澤的主效QTL。表1復(fù)合區(qū)間作圖法定位ZKF2群體纖維色澤的QTL
權(quán)利要求
1.一種與棕色棉長(zhǎng)絨和短絨纖維色澤主效QTL連鎖的分子標(biāo)記的引物，其序列如SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 所示。
2.一種與棕色棉長(zhǎng)絨和短絨纖維色澤主效QTL連鎖的分子標(biāo)記，其特征在于，其為用權(quán)利要求1所述的引物擴(kuò)增出的238bp和500bp的擴(kuò)增片段。
3.權(quán)利要求1所述的引物或權(quán)利要求2所述的分子標(biāo)記在棉花品種纖維色澤早期選擇或品種鑒定中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，用權(quán)利要求1所述的引物對(duì)棉花品種或棉花的雜交后代的幼苗的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，若擴(kuò)增出238bp和500bp的片段，表明其纖維色澤為棕色。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種與棕色棉長(zhǎng)絨和短絨纖維色澤主效QTL連鎖的分子標(biāo)記，其為用SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物擴(kuò)增出的238bp和500bp的擴(kuò)增片段。該分子標(biāo)記可應(yīng)用于棕色棉花品種纖維色澤早期選擇或品種鑒定。本發(fā)明提供的分子標(biāo)記與棕色棉長(zhǎng)絨和短絨纖維色澤QTL均緊密連鎖，而且在多環(huán)境下均能被穩(wěn)定的檢測(cè)到。同時(shí)，本發(fā)明的分子標(biāo)記能提供更高的分子標(biāo)記輔助選擇的效率。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102321619SQ20111003112
公開日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2011年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月28日
發(fā)明者何守樸, 馮鴻杰, 周忠麗, 孫君靈, 孫杰, 杜雄明, 潘兆娥, 賈銀華 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所