FX35S GFP R ;⑶所用驗證引 物為BnNF-YB3yz FX35S GFP R;(D)所用驗證引物為35S GFP FXBnNF-YB5yz R;(G)所用 驗證引物為 35S GFP FXBnNF-YB6P R;M:DL 2000Marker
[0028] 圖4. 35S: :BnNF-YB2/3/4/5/6轉基因擬南芥純合體及野生型擬南芥生長形態(tài)
[0029] A、B、C、D、E分別是BnNF-YB2/3/4/5/6轉基因擬南芥純合體及野生型擬南芥生長 形態(tài)，A、B、C、D中第1棵是野生型擬南芥，后面的3棵是轉基因的3個株系，E中的第1棵 是野生型擬南芥，后面的4棵是轉基因的4個株系
[0030] 圖5. BnNF-YB2/3/4/5/6轉基因擬南芥純合體及野生型擬南芥開花時的天數(shù)
[0031] 圖6. BnNF-YB2/3/4/5/6轉基因擬南芥純合體及野生型擬南芥開花時的葉片數(shù)
[0032] 圖7. 35S: :BnNF-YB2/3/4/5/6-GFP在擬南芥根尖細胞中的定位
[0033]A列：在熒光激發(fā)光下的圖片；B列：在可見光下的圖片；C列是A和B合在一起的 圖片
[0034] 圖8. BnNF-YB2/3/4/5/6擬南芥純合體根伸長率
[0035] 圖9. BnNF-YB2/3/4/5/6擬南芥純合體在對照、不同濃度的鹽，不同濃度的甘露醇 及不同濃度的ABA處理下總根長統(tǒng)計圖
[0036] 每組從左到右依次為野生擬南芥、BnNF-YB2/3/4/5/6擬南芥。
[0037] 圖10. BnNF-YB2/3/4/5/6擬南芥純合體在對照、不同濃度的鹽，不同濃度的甘露 醇及不同濃度的ABA處理下總根尖數(shù)統(tǒng)計圖
[0038] 每組從左到右依次為野生擬南芥、BnNF-YB2/3/4/5/6擬南芥。
【具體實施方式】
[0039] 實施例1.高保真PCR擴增BnNF-YB2/3/4/5/6目的基因
[0040] 取甘藍型油菜葉期幼嫩的葉片，參照OMEGA plant RNA提取試劑盒說明書提取植 物總RNA，用TaKaRa反轉錄試劑盒兩步法反轉錄得到cDNA模板。BnNF-YB2/3/4/5/6分別以 以下引物進行高保真PCR擴增，結果如圖1。所得BnNF-YB2基因cDNA序列如SEQ ID NO. 1 所示，BnNF-YB3基因cDNA序列如SEQ ID NO. 2所示，BnNF-YB4基因cDNA序列如SEQ ID NO. 3所示，BnNF-YB5基因cDNA序列如SEQ ID NO. 4所示，BnNF-YB6基因基因cDNA序列如 SEQ ID NO. 5 所示。
[0041] BnNF-YB2-F:CATGCCATGGGGGATTCCGACAAGG
[0042] BnF-YB2-R:ACTAGTAGTTCTAGTCCTACCGGAGCCAG
[0043] BnNF-YB3 - F:CATGCCATGGGAGATTCCGACAGAGATTC
[0044] BnNF-YB3-R:ACTAGTACTCCTTCCTCCACTGTGGCCG
[0045] BnNF-YB4 - F:CATGCCATGGCGGATTCCGACAACG
[0046] BnNF-YB4 - R:ACTAGTATTTATCCCACTTCCACCGTACAC
[0047] BnNF-YB5 - F:CATGCCATGGCGGATTCCGATAACG
[0048] BnNF-YB5-R:ACTAGTATTCATCCCACTCCCACCGTAC
[0049] BnNF-YB6 - F:CATGCCATGGCGGATTCCGACAACG
[0050] BnNF-YB6 - R:ACTAGTATCAGCACGTGCGGACCCG
[0051] 進行高保真PCR擴增，獲得目的基因片段。
[0052] 注："C I CATGG"和"A I CTAGT"分別為限制性酶切位點Nco I和Spe I。
[0053] 高保真PCR擴增體系（Total 50. 0 y L)和反應程序如下：
[0054]
[0055] 反應程序：
[0056]
[0057] 其后，擴增出的條帶進行1%的瓊脂糖凝膠電泳回收目的條帶；利用快速瓊脂糖 凝膠DNA回收試劑盒純化目的基因。
[0058] 由于用此高保真酶擴增獲得的產物末端為平末端，所以要用平末端的克隆載 體。pEASY-Blunt Cloning vector是一種高效的平末端的克隆載體，依據(jù)pEASY-Blunt Cloning Kit 使用說明書，分別將獲得的 BnNF-YB2/BnNF-YB3/BnNF-YB4/BnNF-YB5/ BnNF_YB6連接到pEASY-Blunt Cloning vector上。然后轉化大腸桿菌TransTl，進行測序 分析。
[0059]目的基因與 pEASY-Blunt Cloning vector 鏈接：
[0060]
[0061] 25°C，15min。
[0062] 實施例2.含目的基因表達載體的構建
[0063]分別將含有目的基因（BnNF-YB2、BnNF-YB3、BnNF-YB4、BnNF-YB5 和 BnNF-YB6)的 pEASY-Blunt Cloning vector 及表達載體 Binary vector pCAMBIA-1302 用限制性內切酶 Spe I和Nco I進行雙酶切。
[0064] 雙酶切體系（20. 0 y L)如下：
[0065]
[0066] 37°C酶切3h，加入2. 2 y L 10X loading buffer，1 %瓊脂糖凝膠電泳，回收純化 酶切后的目的 DNA 片段（BnNF-YB2、BnNF-YB3、BnNF-YB4、BnNF-YB5、BnNF-YB6 和 Binary vector pCAMBIA-1302,見圖 2)。
[0067]分別將限制酶切獲得的 BnNF-YB2、BnNF-YB3、BnNF-YB4、BnNF-YB5、BnNF-YB6DNA 片段與Binary vector pCAMBIA-1302DNA片段用T4連接酶進行連接。T4連接酶連接體系 (25. 0 y L)：
[0068]
[0069]
[0070] 16°C，過夜。
[0071] 取10 y L連接液轉化大腸桿菌TransTl，進行測序驗證。驗證后，提取重組質 粒，-20 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0072] 實施例3.電轉化法轉化表達載體到根癌農桿菌
[0073] 1.將0. 1cm電轉杯在70%的酒精溶液中浸泡一天，然后在超凈臺中用70%的酒精 溶液吹打清洗6~7次，再用無菌水吹打清洗3~4次，之后將其放在超凈臺中吹干（3~ 5h);
[0074] 2.將吹干的電轉杯蓋好蓋子，于_20°C放置20min ;
[0075] 3.將冷凍的電轉杯置于冰上，在潔凈臺中，分別加入10 yL質粒和40 yL根癌農桿 菌EHA105感受態(tài)；
[0076] 4.將電轉化儀調至"Agr"檔，進行電轉化；
[0077] 5.從電轉杯中取出轉化后的農桿菌至新的無菌的1. 5mL離心管中，加入600 yL YEP培養(yǎng)基，30°C，200rpm，恢復培養(yǎng)3~4h ;
[0078] 6. 5000rpm離心lmin，然后棄去400 y L上清，再重懸菌液，并將菌液涂布于 YEP (含有50mg ? L tan和50mg ? L :Str)固體培養(yǎng)基上，30°C，正置培養(yǎng)30min，其后倒置培 養(yǎng)2d至出現(xiàn)單克??；
[0079] 7.分別挑取若干單克隆于含有l(wèi)mL YEP (含有50mg ? L kan和50mg ? L Str)液 體培養(yǎng)基的1. 5mL離心管中，30°C，200rpm，培養(yǎng)2d;
[0080] 8.分別取2. 0 y L作為模板，做菌液PCR，進行驗證；
[0081] 9.選取含有目的條帶的菌液進行擴大培養(yǎng)，提質粒，再次轉化大腸，進行測序驗 證。將測序驗證正確的農桿菌菌液在終濃度為30%甘油，_80°C保存?zhèn)溆谩?br>[0082] 實施例4?由農桿菌介導的蘸花法（FloralDipping)轉化擬南芥
[0083] 蘸花法轉化擬南芥主要參考已經發(fā)表的文獻：徐光碩，饒勇強，陳雁，張椿雨， 孟金陵：用in planta方法轉化甘藍型油菜?作物學報2004, 30:1-5.
[0084] 實施例5.擬南芥轉基因陽性苗的篩選
[0085] 1.準備：無菌水、無菌槍頭（規(guī)格為lmL)、無菌牙簽、70%酒精溶液、30%次氯酸鈉 溶液，MS+Hyg+Cef固體培養(yǎng)基（平板，Hyg濃度為25mg ? L \ Cef濃度為100mg ? L》；
[0086] 2.取適量帶篩選的擬南芥種子與10mL離心管中，用無菌水浸泡30min ;
[0087] 3.在超凈臺中，用70%的酒精溶液處理擬南芥種子lmin，然后用無菌水沖洗3~ 5次；
[0088] 4.用30%次氯酸鈉溶液處理lOmin，然后用無菌水沖洗4~7次；
[0089] 5.用無菌槍頭將處理好的種子點播到MS+Hyg+Cef平板上，再用無菌牙簽將種子 均勻的散布在平板上，然后封好平板，4°C放置2d ;
[0090] 6.長日照（16-h light/8-h dark)，22~24°C培養(yǎng)9~15d，選取長勢較好的擬南 芥（真葉葉面積大且根系較長），并將其移栽到基質中，22~24°C繼續(xù)培養(yǎng)。
[0091] 7.待到擬南芥長勢穩(wěn)定后，依據(jù)2. 1. 2. 4基因組提取方法提取其的基因組DNA，