進(jìn) 行陽性苗檢測，結(jié)果見圖3。
[0092] 實施例6.擬南芥轉(zhuǎn)基因陽性苗純合體的篩選
[0093] 將收取到的擬南芥轉(zhuǎn)基因陽性苗的F2的種子按照實施例5中的方法篩選，根據(jù)孟 德爾遺傳與分離定律的理論指導(dǎo)，篩選獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥純合體植株（圖4)。
[0094] 實施例7.轉(zhuǎn)基因擬南芥開花實驗
[0095] 將P35S: :BnYB2/3/4/5/6過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥純合體種子播種于黑色方形小花 盆中，每個花盆中只點播一粒種子。此時記下擬南芥播種的時間。WT和過表達(dá)的每個株系 分別播種10粒種子，將播過種子的血盤放在擬南芥最適合生長的條件下（光照，濕度，溫度 等條件要適宜），在長日照條件下（光照時間16h光照/8h黑暗）。當(dāng)擬南芥第一個花苞開 放時，我們開始統(tǒng)數(shù)擬南芥蓮座葉的葉片數(shù)并且記下此時擬南芥生長的天數(shù)。當(dāng)所有的WT 和過表達(dá)的每個株系植株都統(tǒng)計結(jié)束后，我們計算出擬南芥開花時的平均葉片數(shù)和平均生 長天數(shù)，結(jié)果見圖5和圖6。實驗結(jié)果顯示(^-81^82/3/4/5/6(?353 ::8成82/3/4/5/6)擬南 芥與野生型擬南芥相比較，開花時的天數(shù)均比野生型少，并且開花時的葉片數(shù)也均比野生 型擬南芥少。實驗結(jié)果表明BnYB2/3/4/5/6促進(jìn)擬南芥提前開花。
[0096] 實施例8. BnNF-YB2/3/4/5/6亞細(xì)胞定位實驗
[0097] 將P35S: :BnYB2/3/4/5/6過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥純合體種子，表面消毒處理（先用 70%的酒精，消毒lmin.用無菌水洗滌3-4次，再用30% d的次氯酸鈉消毒處理3min，用無 菌水洗滌4-5次）后點播到含有Hyg(潮霉素）的培養(yǎng)基上，取10-day的幼苗的根做切片 在熒光共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光，結(jié)果見圖7。實驗結(jié)果顯示BnYB2/3/4/5/6均在擬南 芥根尖細(xì)胞的細(xì)胞核中表達(dá)。
[0098] 實施例9.轉(zhuǎn)基因擬南芥根伸長率統(tǒng)計實驗
[0099] 將WT及轉(zhuǎn)基因擬南芥純合體種子，經(jīng)過表面消毒滅菌（將種子放在1. 5ml離心管 中，用自來水浸泡30min,倒掉自來水，在無菌超凈臺下用70%酒精消毒lmin,用滅過菌的 去離子水洗滌3-4次，再用30%的NaclO處理3min，用滅過菌的去離子水洗滌5-6次，將 消過毒的種子點播在l/2MS、l/2MS+75mM NaCl、l/2MS+100mM mannitol處理過的方形培養(yǎng) 皿上。將平板密封，放在4°C冰箱中3天，之后將平板垂直放置在適宜條件下（光照時間、光 照強(qiáng)度、濕度等條件適宜的條件下），在擬南芥種子萌發(fā)出芽尖并方便標(biāo)記的時候標(biāo)出第一 個點，之后每兩天標(biāo)記一次，將兩次標(biāo)記的點連接成線段，共統(tǒng)計5次，然后用單反相機(jī)拍 照，利用Image J軟件統(tǒng)計兩天的伸長率。統(tǒng)計的數(shù)據(jù)利用SigmaPlot作圖，結(jié)果見圖8。 結(jié)果顯示，在空白對照處理下、75mM NaCl處理下及100mM mannitol處理下，過表達(dá)擬南芥 (P35S: :BnYB2/3/4/5/6)與野生型擬南芥相比較，第一個兩天的伸長率有所增加，但不明 顯；第二個兩天、第三個兩天、第四個兩天、第五個兩天時，測定的兩天的伸長率轉(zhuǎn)基因擬南 芥與野生型擬南芥有明顯的增加。從圖中結(jié)果可以得知，第二個兩天、第三個兩天、第四個 兩天、第五個兩天內(nèi)擬南芥根生長的速率比第一個兩天里的生長快，伸長率隨時間有遞增 的趨勢。在75mM NaCl處理下，與空白處理相比較，野生型擬南芥根生長受到抑制，而過表 達(dá)擬南芥根生長不但沒有受到抑制，根伸長率較野生型增加，促進(jìn)了擬南芥根的伸長，實驗 結(jié)果表明Bn-YB2/3/4/5/6提高了擬南芥的耐鹽性。在lOOmM mannitol處理下，對野生型 擬南芥根伸長率影響不明顯；而過表達(dá)擬南芥根伸長率較野生型擬南芥增加，這一實驗結(jié) 果表明Bn-YB2/3/4/5/6提高了擬南芥抗旱性。
[0100] 實施例10.根系掃描實驗
[0101] 將WT及轉(zhuǎn)基因擬南芥純合體種子，經(jīng)過表面消毒滅菌（將種子放在1. 5ml離心 管中，用自來水浸泡30min，倒掉自來水，在無菌超凈臺下用70%酒精消毒lmin，用滅過菌 的去離子水洗滌3-4次，再用30%的NaclO處理3min，用滅過菌的去離子水洗滌5-6次， 將消過毒的種子點播在 l/2MS、l/2MS+75mM Nacl、l/2MS+100mM Nacl 1/2MS+0. luM ABA、 l/2MS+50mM mannitol、l/2MS+100mM mannitol處理過的方形培養(yǎng)皿上。將平板密封，放 在4°C冰箱中3天，之后將平板垂直放置在適宜條件下（光照時間、光照強(qiáng)度、濕度等條件 適宜的條件下），到擬南芥生長至20天時用根系掃描儀掃描擬南芥不同生理條件處理下的 根系。統(tǒng)計的數(shù)據(jù)利用SigmaPlot作圖，結(jié)果見圖9和圖10。圖9和圖10分別是在空白、 75mM Nacl、100mM Nacl、0? luMABA、50mM mannitol 及 100mM mannitol 處理下，擬南芥總根 長（主根和側(cè)根長之和）及跟分支數(shù)，結(jié)果見圖9-10。
[0102] 圖9結(jié)果顯示，在空白處理下，過表達(dá)擬南芥與野生型擬南芥相比較，總根長增 加。在75mM Nacl和lOOmM Nacl脅迫處理下，與空白處理相比較，擬南芥根生長受到 抑制，擬南芥總根長變短；而過表達(dá)擬南芥與野生型擬南芥相比較總根長增加，并且隨 著鹽濃度的增加，轉(zhuǎn)基因擬南芥比野生型擬南芥根總長受到的抑制小，這進(jìn)一步說明了 Bn_YB2/3/4/5/6提高了擬南芥的耐鹽性。在50mM mannitol及100mM mannitol處理下，與 空白處理相比較，擬南芥總根長增加。并且隨著mannitol濃度的增加，過表達(dá)擬南芥總根 長比野生型擬南芥總根長增加，實驗結(jié)果進(jìn)一步說明Bn-YB2/3/4/5/6提高了擬南芥抗旱 性。在O.luM ABA處理下，與空白處理相比較，擬南芥總根長較少；而過表達(dá)擬南芥與野生 型擬南芥相比較總根長明顯增加。
[0103] 圖10結(jié)果顯示，在空白處理下，過表達(dá)擬南芥與野生型擬南芥相比較，擬南芥根 分支數(shù)（根尖總數(shù)）增加。在75mM Nacl和lOOmM Nacl脅迫處理下，與空白處理相比 較，擬南芥根生長受到抑制，擬南芥根分支數(shù)變少；而過表達(dá)擬南芥與野生型擬南芥相比 較根分支數(shù)明顯增加，并且隨著鹽濃度的增加，轉(zhuǎn)基因擬南芥比野生型擬南芥根分支數(shù)增 加的多，轉(zhuǎn)基因擬南芥根系更為發(fā)達(dá)，這進(jìn)一步說明了 Bn-YB2/3/4/5/6提高了擬南芥的 耐鹽性。在50mM mannitol處理下，與空白處理相比較，野生型擬南芥根分支數(shù)增加；在 100mM mannitol處理下，與空白處理相比較，野生型擬南芥根分支數(shù)減少；在高濃度的甘露 醇處理下，過表達(dá)擬南芥與野生型擬南芥相比較，根分支數(shù)明顯增加，實驗結(jié)果進(jìn)一步說明 Bn-YB2/3/4/5/6提高了擬南芥的耐旱性。在0. luM ABA處理下，與空白處理相比較，野生型 擬南芥根分支數(shù)減少；在〇. luM ABA處理下，過表達(dá)擬南芥與野生型擬南芥相比較根分支 數(shù)明顯增加。
【主權(quán)項】
1. 油菜 NF-YB 基因家族中的五個成員 BnNF-YB2/BnNF-YB3/BnNF-YB4/BnNF-YB5/ BnNF-YB6基因在促進(jìn)植物提前開花、增加根伸長率、提高植物抗逆性中的應(yīng)用；其中所述 的 BnNF-YB2 基因 cDNA 序列如 SEQ ID NO. 1 所示，BnNF-YB3 基因 cDNA 序列如 SEQ ID NO. 2 所示，BnNF-YB4基因cDNA序列如SEQ ID NO. 3所示，BnNF-YB5基因cDNA序列如SEQ ID NO. 4所示，BnNF-YB6基因基因cDNA序列如SEQ ID NO. 5所示。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的抗逆性為抗干旱和/或抗鹽。3. 含有油菜 NF-YB 基因家族中的五個成員 BnNF-YB2/BnNF-YB3/BnNF-YB4/BnNF-YB5/ BnNF-YB6基因的重組表達(dá)載體在促進(jìn)植物提前開花、增加根伸長率、提高植物抗逆性中的 應(yīng)用；其中所述的BnNF-YB2基因cDNA序列如SEQ ID NO. 1所示，BnNF-YB3基因cDNA序列 如 SEQ ID NO. 2 所示，BnNF-YB4 基因 cDNA 序列如 SEQ ID NO. 3 所示，BnNF-YB5 基因 cDNA 序列如SEQ ID NO. 4所示，BnNF-YB6基因基因cDNA序列如SEQ ID NO. 5所示。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的抗逆性為抗干旱和/或抗鹽。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的重組表達(dá)載體為將所述的 BnNF-YB2/BnNF-YB3/BnNF-YB4/BnNF-YB5/BnNF-YB6 基因分別插入在表達(dá)載體 Binary vector pCAMBIA-1302的Nco I和Spe I兩個酶切位之間所得。
【專利摘要】本發(fā)明公開了油菜NF-YB基因家族基因的應(yīng)用。油菜NF-YB基因家族中的五個成員BnNF-YB2/BnNF-YB3/BnNF-YB4/BnNF-YB5/BnNF-YB6基因在促進(jìn)植物提前開花、增加根伸長率、提高植物抗逆性中的應(yīng)用。我們實驗研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)BnNF-YB2/3/4/5/6不僅參與植物光周期花期調(diào)控，均能促進(jìn)擬南芥提前開花，在植物抗逆境途徑中也發(fā)揮著正調(diào)控作用。過表達(dá)的擬南芥比野生型的擬南芥根的伸長率增加。在鹽及干旱脅迫處理下，與野生型擬南芥相比，過表達(dá)擬南芥根伸長率仍然增加。這為培育耐鹽、耐干旱的油菜新品種提供了一定的理論基礎(chǔ)和依據(jù)。
【IPC分類】A01H5/00, C12N15/29, C12N15/82
【公開號】CN105063060
【申請?zhí)枴緾N201510417212
【發(fā)明人】梁明祥, 付蕊欣, 殷祥貞
【申請人】南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年11月18日
【申請日】2015年7月15日