本發(fā)明涉及分子生物學(xué)，具體地說，涉及一種水稻抗稻瘟病重組核酸片段。

背景技術(shù)：

長(zhǎng)期以來，傳統(tǒng)育種的選擇方法主要依賴于田間表現(xiàn)型的評(píng)價(jià)，根據(jù)育種家個(gè)人經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行取舍，其最大的缺點(diǎn)在于耗時(shí)長(zhǎng)，效率較低。要提高選擇的效率，最理想的方法應(yīng)是能夠直接對(duì)基因型進(jìn)行選擇。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記為實(shí)現(xiàn)對(duì)基因型的直接選擇提供了可能。近年來，已開始應(yīng)用分子標(biāo)記輔助選擇方法來改良個(gè)別目標(biāo)性狀，能夠顯著的縮短育種年限。

稻瘟病是水稻最嚴(yán)重的病害之一，全球每年由稻瘟病引起的水稻產(chǎn)量損失占11％～30％，因此稻瘟病及其抗性的研究顯得尤為重要。隨著對(duì)稻瘟病研究的逐步深入，許多水稻抗稻瘟病基因dna片段相繼被定位和克隆。其中，pil及pik簇等位基因定位于水稻第11染色體長(zhǎng)臂近末端區(qū)域(hua等，theoreticalandappliedgenetics.2012,125:1047-1055；li等，molecularbreeding.2007,20:179-188；alok等，functional&integrativegenomics.2012,12:215-228；yuan等，theoreticalandappliedgenetics.2011,122:1017-1028)。

為了提高育種的穩(wěn)定性、縮短育種過程和時(shí)間、有效利用水稻抗性資源，有必要對(duì)水稻在雜交育種中產(chǎn)生的稻瘟病抗性基因重組片段進(jìn)行研究，為能夠高效穩(wěn)定的實(shí)現(xiàn)水稻抗性育種提供有效手段。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種水稻抗稻瘟病重組核酸片段reccr010161及其檢測(cè)引物與應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

第一方面，本發(fā)明提供一種重組核酸片段，其特征在于，其核苷酸序列包含seqidno.1所示331-478bp的序列或其片段、或其變體、或其互補(bǔ)序列。

作為優(yōu)選，其核苷酸序列包含seqidno.1所示的序列或其片段、或其變體、或其互補(bǔ)序列。seqidno.1所示的序列來自于‘瀘香618b’和‘華3418b’基因組區(qū)域交換產(chǎn)生的重組植株。

一般來講，特定核苷酸序列的變體將與該特定核苷酸序列具有至少約70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％或更高的序列同一性，或以上的互補(bǔ)序列。這樣的變體序列包括一個(gè)或多個(gè)核酸殘基的添加、缺失或替換，從而可以導(dǎo)致相應(yīng)的氨基酸殘基的添加、移除或替換。通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的序列比對(duì)程序包括雜交技術(shù)確定序列同一性。實(shí)施方案的核苷酸序列變體與本發(fā)明的序列的差異可以少至1-15個(gè)核苷酸、少至1-10個(gè)(例如6-10個(gè))，少至5個(gè)，少至4、3、2或甚至1個(gè)核苷酸。

第二方面，本發(fā)明提供了用于擴(kuò)增所述重組核酸片段的引物。

所述引物包括本領(lǐng)域技術(shù)人員針對(duì)該擴(kuò)增目標(biāo)可設(shè)計(jì)得到的所有引物。

當(dāng)擴(kuò)增目標(biāo)為seqidno.1所示序列時(shí)，所述引物可選自：

(i)特異性識(shí)別seqidno.1所示序列1-331bp區(qū)域中核苷酸序列的正向引物和特異性識(shí)別seqidno.1所示序列478-766bp區(qū)域中核苷酸序列的反向引物；

(ii)以下第一組引物對(duì)與第二組引物對(duì)的組合，其包含：

(a)第一組引物對(duì)：特異性識(shí)別seqidno.1所示序列第1-331bp區(qū)域中核苷酸序列的正向引物和特異性識(shí)別seqidno.1所示序列第332-477bp區(qū)域中核苷酸序列的反向引物；

(b)第二組引物對(duì)：特異性識(shí)別seqidno.1所示序列第332-477bp區(qū)域中核苷酸序列的正向引物和特異性識(shí)別seqidno.1所示序列第478-766bp區(qū)域中核苷酸序列的反向引物；

(iii)特異性識(shí)別包含seqidno.1所示序列第331位核苷酸的序列的正向引物和特異性識(shí)別包含seqidno.1所示序列第478位核苷酸的序列的反向引物；

(iv)特異性識(shí)別包含seqidno.1所示序列第331位核苷酸的序列的正向引物和特異性識(shí)別seqidno.1所示序列第478-766bp區(qū)域中核苷酸序列的反向引物；

(v)特異性識(shí)別seqidno.1所示序列第1-331bp區(qū)域中核苷酸序列的正向引物和特異性識(shí)別包含seqidno.1所示序列第478位核苷酸的序列的反向引物。

具體而言，本發(fā)明提供用于擴(kuò)增seqidno.1所示序列的引物對(duì)為：5’-tgccgaacggtgaataatgtaa-3’，

和5’-gccttgatctaggagggaatgt-3’。

以及用于檢測(cè)seqidno.1所示序列的測(cè)序引物為：

5’-tgccgaacggtgaataatgtaa-3’，

和5’-gccttgatctaggagggaatgt-3’。

進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供含有前述引物的試劑盒。

第三方面，本發(fā)明提供了所述重組核酸片段在抗稻瘟病水稻育種中的應(yīng)用。

例如，將該片段導(dǎo)入其他水稻植株中，以得到具有抗稻瘟病的水稻植株。

第四方面，本發(fā)明提供了篩選含有所述重組核酸片段的水稻植株的方法。

根據(jù)如前所述的重組核酸片段設(shè)計(jì)特異性引物，以待測(cè)基因組為模板進(jìn)行pcr反應(yīng)，并分析pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的步驟。具體而言，所述引物如前所述。可選擇地，利用sanger測(cè)序法分析pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。

所述方法以待測(cè)樣品基因組dna為模板，利用上述擴(kuò)增引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，然后利用上述測(cè)序引物對(duì)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，若測(cè)序結(jié)果與seqidno.1序列一致或互補(bǔ)，則待測(cè)樣品中含有seqidno.1所示同源重組片段。

通過檢測(cè)確定了待測(cè)樣品中含有seqidno.1所示序列的重組核酸片段，即可確定待測(cè)樣品中包含含有抗性基因的重組核酸片段。

作為優(yōu)選，可利用前述引物或前述試劑盒，檢測(cè)待測(cè)樣品基因組中是否含有權(quán)利要求1所述的重組核酸片段。

可以理解的是，通過所述方法篩選得到的含有本發(fā)明公開的重組核酸片段的水稻植株或其種子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

第五方面，本發(fā)明提供了含有所述重組核酸片段的水稻植株的選育方法，具體為：以‘瀘香618b’為輪回親本，‘華3418b’為供體親本進(jìn)行雜交，將所得到的雜交種與輪回親本‘瀘香618b’進(jìn)行回交，再將所得到的回交種進(jìn)行自交，獲得含有權(quán)利要求1所述重組核酸片段的水稻植株；

其中，所述雜交種、回交種和自交種需分別利用分子標(biāo)記和水稻全基因組育種芯片進(jìn)行前景選擇和背景選擇。

所述分子標(biāo)記為pic11id17、pic11s122和pic11s166中的一種或多種。

具體而言，所述選育方法包括以下步驟：1)將輪回親本與供體植物進(jìn)行雜交，將所得到的雜交種與輪回親本進(jìn)行回交，獲得回交一代，利用正向選擇標(biāo)記pic11id17和負(fù)向選擇標(biāo)記pic11s122、pic11s166對(duì)其進(jìn)行抗稻瘟病基因組片段的單側(cè)同源重組片段篩選，并利用水稻全基因組育種芯片，例如rice6k，對(duì)其進(jìn)行背景選擇；2)選擇背景回復(fù)較好的重組單株(此世代背景回復(fù)值超過75％)與輪回親本再次進(jìn)行回交，獲得回交二代，利用正向選擇標(biāo)記pic11id17對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，選擇含有抗稻瘟病基因組片段的重組單株，然后利用水 稻全基因組育種芯片，例如rice6k，對(duì)其進(jìn)行背景選擇；3)選擇背景回復(fù)好的重組單株(此世代背景回復(fù)值超過87.5％)與輪回親本又一次進(jìn)行回交，獲得回交三代，利用正向選擇標(biāo)記pic11id17和負(fù)向標(biāo)記pic11s122、pic11s166對(duì)其進(jìn)行抗稻瘟病基因組片段的另一側(cè)同源重組片段篩選，并利用水稻全基因組育種芯片，例如rice60k，對(duì)其進(jìn)行背景選擇；以及4)選擇導(dǎo)入片段小，且背景回復(fù)好的重組單株(背景回復(fù)值超過93.75％)，將選中的重組單株自交一次，獲得自交種，利用正向選擇標(biāo)記pic11id17對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，并利用水稻全基因組育種芯片，例如rice60k，對(duì)其進(jìn)行背景選擇，最終獲得含抗稻瘟病基因組重組核酸片段純合且背景回復(fù)(背景回復(fù)值超過99％)的水稻植株。

其中，利用分子標(biāo)記進(jìn)行前景選擇時(shí)采用的擴(kuò)增引物如下：

擴(kuò)增分子標(biāo)記pic11id17的引物對(duì)，其包括：

正向引物：5’-gtactggaggatcaggactgg-3’，

反向引物：5’-ctgttgccttgtgactgtgag-3’；

擴(kuò)增分子標(biāo)記pic11s122的引物對(duì)，其包括：

正向引物：5’-tacgaccgtgacatgtcctt-3’，

反向引物：5’-attaaccaccatgctcacca-3’；以及

擴(kuò)增分子標(biāo)記pic11s166的引物對(duì)，其包括：

正向引物：5’-ttagcccctctctctctcca-3’，

反向引物：5’-gccagatctagcagaggtga-3’。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明通過全基因組選擇育種技術(shù)選育得到并提供了一種稻瘟病抗性基因的重組核酸片段，本發(fā)明提供的重組核酸片段與稻瘟病抗性緊密相關(guān)，可作為抗性資源應(yīng)用于其他品種的培育。

本發(fā)明提供一種基于全基因組選擇育種技術(shù)選育含有抗稻瘟病基因組重組核酸片段的水稻植株的方法，該方法具有快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的優(yōu)勢(shì)，僅通過五世代轉(zhuǎn)育，即可僅將目標(biāo)基因組片段導(dǎo)入受體材 料，并同時(shí)實(shí)現(xiàn)背景的回復(fù)。

在上述基礎(chǔ)上，本發(fā)明通過以‘瀘香618b’為輪回親本，‘華3418b’為供體親本進(jìn)行雜交、回交與自交得具有稻瘟病抗性的重組植株，并得到了一種具有稻瘟病抗性的重組核酸片段。

本發(fā)明改良的受體材料為‘瀘香618b’，為具有中低直鏈淀粉含量的香型不育系‘瀘香618a’配套的保持系。利用上述方法，可以在保留‘瀘香618b’原有優(yōu)點(diǎn)的情況下大幅度提高其稻瘟病抗性。進(jìn)一步的，通過配組實(shí)現(xiàn)雜交種稻瘟病抗性的大幅度提高。本發(fā)明提供的基因組重組核酸片段與稻瘟病抗性緊密相關(guān)，可作為抗性資源應(yīng)用于其他品種的培育。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中cr010161水稻rice60k全基因組育種芯片檢測(cè)結(jié)果；其中，橫坐標(biāo)數(shù)字所指示方框依次表示水稻12條染色體，縱坐標(biāo)數(shù)字為水稻基因組上的物理位置[以兆堿基(mb)為單位]，灰色線條代表受體親本‘瀘香618b’基因型，黑色線條代表供體親本‘華3418b’基因型，白色線條代表兩親本基因型一致即無多態(tài)性區(qū)段。圖中第11號(hào)染色體黑色線條顯示區(qū)段即為導(dǎo)入的抗稻瘟病基因組重組核酸片段reccr010161。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中reccr010161上游同源重組片段測(cè)序比對(duì)結(jié)果；圖中所示星號(hào)代表比對(duì)結(jié)果中相同堿基，圖中cr010161為獲得的新品系，t004為受體親本‘瀘香618b’，r002為供體親本‘華3418b’。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中reccr010161上游同源重組片段的結(jié)構(gòu)圖；其中，上方堿基為供體‘華3418b’的snp或indel標(biāo)記，下方堿基為受體‘瀘香618b’的snp或indel標(biāo)記?；疑珔^(qū)段為來源于‘瀘香618b’基因組區(qū)段，黑色區(qū)段為來源于‘華3418b’基因組區(qū)段，白色區(qū)段為同源重組區(qū)段，橫坐標(biāo)為片段長(zhǎng)度，以堿基對(duì)數(shù)目(bp) 為單位。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例3中cr010161稻瘟病抗性室內(nèi)鑒定結(jié)果；圖中所示葉片依次為：(a)稻瘟病感病品種麗江新團(tuán)黑谷；(b)原品種‘瀘香618b’；(c)改良新品系cr010161；(d)稻瘟病抗病品種谷梅4號(hào)。

具體實(shí)施方式

提供以下定義和方法用以更好地界定本發(fā)明以及在本發(fā)明實(shí)踐中指導(dǎo)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員。除非另作說明，術(shù)語(yǔ)按照相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員的常規(guī)用法理解。

如本文所用，“核苷酸序列”包括涉及單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，并且除非另有限制，核苷酸序列以5’至3’方向從左向右書寫，包括具有天然核苷酸基本性質(zhì)的已知類似物(例如，肽核酸)，所述類似物以與天然存在的核苷酸類似的方式與單鏈核酸雜交。

在一些實(shí)施方案中，可以對(duì)本發(fā)明的核苷酸序列進(jìn)行改變，以進(jìn)行保守氨基酸替換。在某些實(shí)施方案中，可以依照單子葉密碼子偏好性對(duì)本發(fā)明的核苷酸序列進(jìn)行不改變氨基酸序列的替換，例如可以用單子葉植物偏好的密碼子替換編碼同一氨基酸序列的密碼子，而不改變?cè)摵塑账嵝蛄兴幋a的氨基酸序列。

具體地，本發(fā)明涉及對(duì)seqidno.1進(jìn)一步優(yōu)化所得的核苷酸序列。該方法的更多細(xì)節(jié)描述于murray等(1989)nucleicacidsres.17:477-498。優(yōu)化核苷酸序列可用于提高抗稻瘟病基因組重組核酸片段在水稻中的表達(dá)。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及seqidno.1所示序列的變體。一般來講，特定核苷酸序列的變體將與該特定核苷酸序列具有至少約70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％或更高的序列同一性，或以上的互補(bǔ)序列。這樣的變體序列包括一個(gè)或多個(gè)核酸殘基的添加、缺失或替換，從而可以導(dǎo)致 相應(yīng)的氨基酸殘基的添加、移除或替換。通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的序列比對(duì)程序包括雜交技術(shù)確定序列同一性。實(shí)施方案的核苷酸序列變體與本發(fā)明的序列的差異可以少至1-15個(gè)核苷酸、少至1-10個(gè)(例如6-10個(gè))，少至5個(gè)，少至4、3、2或甚至1個(gè)核苷酸。

本發(fā)明還涉及包含seqidno.1所示序列中特定位點(diǎn)的序列或其片段或其變體或其互補(bǔ)序列，例如，包含seqidno.1所示序列的331-478位核苷酸的序列或其片段或其變體或其互補(bǔ)序列。根據(jù)包含上述特定位點(diǎn)的片段，能夠特異性地鑒定出相應(yīng)的seqidno.1所示序列。進(jìn)一步地，通過鑒定出含有seqidno.1所示序列的重組核酸片段，即可確定待測(cè)樣品中包含含有抗性基因的重組核酸片段。

如本文所用，“水稻”是任何水稻植株并包括可以與水稻育種的所有植物品種。如本文所用，“植株”或“植物”，包括整株植物、植物細(xì)胞、植物器官、植物原生質(zhì)體、植物可以從中再生的植物細(xì)胞組織培養(yǎng)物、植物愈傷組織、植物叢和植物或植物部分中完整的植物細(xì)胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果實(shí)、莖桿、根、根尖、花藥等。

在本發(fā)明的方法可以適用于任何需要選育的水稻品種。也就是說，可以將任何缺少某種有利性狀的優(yōu)良品種(即綜合性狀較好，預(yù)計(jì)有發(fā)展前途的品種)用作輪回親本。用另一具有該受體所缺少的有利性狀的品種作為供體親本，并且所提供的有利性狀最好是顯性單基因控制的。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，采用水稻‘瀘香618b’作為輪回親本，采用已被證實(shí)具有良好的稻瘟病抗性的水稻‘華3418b’作為供體。

在本發(fā)明所提供的重組植株的選育方法中，利用分子標(biāo)記對(duì)重組植株進(jìn)行前景選擇。前景選擇的可靠性主要取決于標(biāo)記與目標(biāo)基因間連鎖的緊密程度，為提高選擇的準(zhǔn)確率，一般同時(shí)用兩側(cè)相鄰的兩個(gè)標(biāo)記對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行跟蹤選擇。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，采用的前景選擇標(biāo)記包括正向選擇標(biāo)記和負(fù)向選擇標(biāo)記。在具體實(shí)施方案中，經(jīng)優(yōu)化篩選使用的正 向前景選擇標(biāo)記是與目標(biāo)基因組片段緊密連鎖的標(biāo)記pic11id17，負(fù)向選擇標(biāo)記是位于目標(biāo)片段上游的標(biāo)記pic11s122，以及位于目標(biāo)片段下游的標(biāo)記pic11s166。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，利用上述前景選擇標(biāo)記進(jìn)行同源重組的檢測(cè)時(shí)，一側(cè)或單側(cè)同源重組的判斷標(biāo)準(zhǔn)是pic11id17檢出與‘華3418b’相同帶型，且pic11s122或pic11s166檢出與‘瀘香618b’相同帶型；兩側(cè)或雙側(cè)同源重組的判斷標(biāo)準(zhǔn)是pic11id17檢出與‘華3418b’相同帶型，且pic11s122和pic11s166檢出與‘瀘香618b’相同帶型。

在本發(fā)明中，可以使用任何一種可利用的芯片進(jìn)行本發(fā)明所提供的育種方法中的背景選擇。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以采用本發(fā)明人在中國(guó)專利申請(qǐng)cn102747138a中公開的水稻全基因組育種芯片rice6k，或者在pct國(guó)際申請(qǐng)wo/2014/121419中公開的水稻全基因組育種芯片rice60k。這兩份申請(qǐng)文件中的全部?jī)?nèi)容整體并入本文作為參考。

以下實(shí)施例僅用于說明而非限制本發(fā)明范圍的目的。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。

本發(fā)明中所使用的水稻植株材料信息均可參見中國(guó)水稻品種及其系譜數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ricedata.cn/variety/index.htm)。

本發(fā)明中所提到的水稻基因組物理位置均參照水稻日本晴基因組msu/tigr注釋第6.1版(http://rice.plantbiology.msu.edu/)。

實(shí)施例1選育導(dǎo)入抗稻瘟病基因組片段的重組植株

本實(shí)施例中使用的材料為水稻‘瀘香618b’及水稻‘華3418b’。

水稻‘華3418b’具有良好的稻瘟病抗性，并推測(cè)可能是第11號(hào)染色體的pil及pik簇等位基因所在區(qū)域?qū)υ摬牧系牡疚敛】剐云鸬搅岁P(guān)鍵作用。

在重組植株的選育過程中，利用分子標(biāo)記對(duì)重組植株進(jìn)行前景選擇，對(duì)所采用的前景選擇分子標(biāo)記進(jìn)行了篩選。參照水稻日 本晴基因組msu/tigr注釋第6.1版，下載第11染色體27,155,000至28,495,000dna序列。使用ssrlocator軟件對(duì)上述序列中的ssr位點(diǎn)進(jìn)行掃描。利用primerpremier3.0軟件對(duì)尋找出的ssr位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，共設(shè)計(jì)引物385對(duì)。通過pcr的方法，篩選上述引物對(duì)在‘華3418b’及‘瀘香618b’中的多態(tài)性，最終挑選出在兩份材料中具有多態(tài)性、擴(kuò)增效率高的前景選擇分子標(biāo)記，分別是正向選擇標(biāo)記pic11id17和負(fù)向選擇標(biāo)記pic11s122、pic11s166。用于pcr擴(kuò)增上述分子標(biāo)記的具體引物信息見表1。

表1前景選擇分子標(biāo)記引物信息

將水稻‘華3418b’中前述基因所在的基因組片段導(dǎo)入到水稻‘瀘香618b’中，具體過程如下：

以‘瀘香618b’為輪回親本，‘華3418b’為供體親本進(jìn)行雜交，將所得到的雜交種與輪回親本‘瀘香618b’進(jìn)行回交，獲得bc1f1種子，育苗后利用正向選擇標(biāo)記pic11id17和負(fù)向選擇標(biāo)記pic11s122、pic11s166進(jìn)行重組單株選擇，篩選出9個(gè)在目標(biāo)基因組dna片段一側(cè)同源重組的單株，即pic11id17檢出與‘華3418b’相同帶型，且pic11s122或pic11s166檢出與‘瀘香618b’相同帶型，并利用水稻全基因組育種芯片rice6k(cn102747138a)對(duì)其進(jìn)行背景選擇(yu等,plantbiotechnologyjournal.2014,12:28-37)。

在篩選出的9個(gè)單側(cè)同源重組單株中比較芯片結(jié)果，選擇背景回復(fù)最好的重組單株(此世代背景回復(fù)值超過75％)，使其與輪回親本‘瀘香618b’再次進(jìn)行回交，獲得bc2f1種子，育苗后利用正向選擇標(biāo)記pic11id17對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，選擇含有目標(biāo)基因組片 段的重組單株，即pic11id17檢出與‘華3418b’相同帶型，利用水稻全基因組育種芯片rice6k對(duì)其進(jìn)行背景選擇。

選擇背景回復(fù)較好的單株(此世代背景回復(fù)值超過87.5％)，使其與輪回親本‘瀘香618b’又一次進(jìn)行回交，獲得bc3f1種子，育苗后利用正向選擇標(biāo)記pic11id17和負(fù)向標(biāo)記pic11s122、pic11s166對(duì)收獲的種子進(jìn)行目標(biāo)基因組片段另一側(cè)同源重組片段的篩選，獲得8個(gè)在目標(biāo)片段兩側(cè)重組的單株，即pic11id17檢出與‘華3418b’相同帶型，且pic11s122和pic11s166檢出與‘瀘香618b’相同帶型。

利用水稻全基因組育種芯片rice60k(wo/2014/121419)對(duì)上述8個(gè)雙側(cè)交換單株進(jìn)行背景和目標(biāo)片段選擇(chen等，molecularplant.2014,7:541-553)，篩選到導(dǎo)入目標(biāo)片段較小，且背景回復(fù)好的目標(biāo)單株一個(gè)(此世代背景回復(fù)值超過93.75％)。

將選中的單株自交一次，獲得bc3f2，育苗后利用正向選擇標(biāo)記pic11id17對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，選擇含有目標(biāo)基因組片段的單株，即pic11id17檢出與‘華3418b’相同帶型，利用水稻全基因組育種芯片rice60k對(duì)其進(jìn)行背景選擇。

最終獲得目標(biāo)片段純合，且背景回復(fù)(背景回復(fù)值超過99％)的株系一個(gè)，命名為cr010161。芯片檢測(cè)結(jié)果見圖1。

實(shí)施例2導(dǎo)入稻瘟病抗性基因組片段后同源重組片段的確定

為了確定導(dǎo)入的稻瘟病抗性基因組片段大小，對(duì)‘瀘香618b’導(dǎo)入片段的純合單株進(jìn)行了目標(biāo)基因組片段兩側(cè)同源重組片段的測(cè)序。將cr010161所含的抗稻瘟病基因組重組核酸片段命名為reccr010161。

通過水稻全基因組育種芯片rice60k檢測(cè)結(jié)果初步確定，reccr010161位于snp標(biāo)記r1127353173ag下游。

同時(shí)，使用miseq測(cè)序技術(shù)對(duì)‘瀘香618b’、‘華3418b’和cr010161三個(gè)樣本進(jìn)行全基因組測(cè)序。使用truseqnanodnaltkit(illumina)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)建立，使用libraryquantificationkit–universal(kapabiosystems)試劑盒進(jìn)行定量，使用miseq v2reagentkit(illumina)試劑盒進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。使用miseq臺(tái)式測(cè)序儀(illumina)進(jìn)行檢測(cè)。具體步驟及方法參見各試劑盒及測(cè)序儀使用說明書。

根據(jù)前述snp芯片及miseq測(cè)序結(jié)果，將reccr010161上游同源重組片段定位在第11染色體的27353218bp到27354367bp區(qū)間。

在此基礎(chǔ)上，參照水稻日本晴基因組msu/tigr注釋第6.1版，下載對(duì)應(yīng)區(qū)段dna序列。使用primerpremier5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增及測(cè)序引物，設(shè)計(jì)要求為引物長(zhǎng)22nt左右、gc含量40-60％且沒有錯(cuò)配。

以受體親本‘瀘香618b’和供體親本‘華3418b’為對(duì)照，對(duì)reccr010161上游同源重組片段設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，使用高保真酶kodfxneo(toyobo)進(jìn)行擴(kuò)增，使用兩步法或三步法尋找最佳擴(kuò)增條件，確保擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)中顯示為單一明亮條帶。其中確定的上游同源重組片段擴(kuò)增引物反應(yīng)條件為：94℃2min；98℃10sec，60℃30sec，68℃60sec，37個(gè)循環(huán)；20℃1min。由此，最終篩選出一對(duì)擴(kuò)增引物用于上游同源重組片段的擴(kuò)增。

另外，以擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，利用sanger測(cè)序法進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)實(shí)際測(cè)序效果，最終篩選出2條測(cè)序引物用于上游同源重組片段的測(cè)序。具體的擴(kuò)增引物及測(cè)序引物序列見表2，測(cè)序結(jié)果見圖2。

reccr010161上游同源重組片段測(cè)序長(zhǎng)度為766bp(seqidno:1)。1-331bp為受體‘瀘香618b’的基因組區(qū)段，與供體‘華3418b’比較，存在2個(gè)snp，2個(gè)indel。332-477bp這一146bp區(qū)段為同源重組區(qū)段。478-766bp為供體‘華3418b’基因組片段，與受體‘瀘香618b’比較，存在4個(gè)snp。

圖3為reccr010161上游同源重組片段的結(jié)構(gòu)圖。上方堿基為供體‘華3418b’的snp或indel標(biāo)記，下方堿基為受體‘瀘香618b’的snp或indel標(biāo)記。灰色區(qū)段為來源于‘瀘香618b’基因組 區(qū)段，黑色區(qū)段為來源于‘華3418b’基因組區(qū)段，白色區(qū)段為同源重組區(qū)段。橫坐標(biāo)為片段長(zhǎng)度，以堿基對(duì)數(shù)目(bp)為單位。

表2抗稻瘟病基因組重組核酸片段擴(kuò)增及測(cè)序引物信息

實(shí)施例3‘瀘香618b’導(dǎo)入抗稻瘟病基因組片段后的抗性鑒定

為了鑒定抗性效果，對(duì)本申請(qǐng)選育的新品系cr010161、輪回親本‘瀘香618b’、稻瘟病抗病品種谷梅4號(hào)(作為陽(yáng)性對(duì)照)，以及稻瘟病感病品種麗江新團(tuán)黑谷(作為陰性對(duì)照)進(jìn)行室內(nèi)種植，將其培養(yǎng)至3-4葉期后采用如下方法進(jìn)行鑒定：

選取2015年從宜昌稻瘟病病葉上分離的m15bb-1-1、m15bb-1-2、m15bb-2-1、m15bb-3-1、m15bb-4-1、m15bb-5-1、m15bb-6-1，共7個(gè)稻瘟病菌株作為接種菌株。菌株采用高粱粒法-20℃保存，使用前將保存的高粱粒取出至馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(pda)平板活化(pda：去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂粉15g，蒸餾水定容至1l)，28℃光照培養(yǎng)5天后取直徑5mm的新鮮菌絲塊轉(zhuǎn)接至高粱粒培養(yǎng)基中(高粱粒500g加入1.5l蒸餾水，煮至沸騰后濾去液體，將高粱粒撈出裝入250ml三角瓶，100ml/瓶，濕熱滅菌20分鐘)，10塊/瓶，接菌2天后每天將高粱粒搖散，28℃黑暗培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿高粱粒。然后將高粱粒攤在無菌紗布上，蓋上無菌的潮濕紗布，在25℃，rh≥95％，12h光照條件下培養(yǎng)4-5天至大量孢子產(chǎn)生，用無菌水(含0.02％吐溫20)洗下孢子，等孢子量混合接種菌株，調(diào)整濃度至5×10⁵個(gè)/ml。

用混合分生孢子懸浮液噴霧接種cr010161、‘瀘香618b’、谷梅4號(hào)及麗江新團(tuán)黑谷，接種三個(gè)重復(fù)。接種后罩上透明罩子， 28℃黑暗培養(yǎng)24h，然后16h光照培養(yǎng)5天后調(diào)查。

調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)為0級(jí)(高抗，hr)：沒有癥狀；1級(jí)(抗，r)：很小的褐色病斑；2級(jí)(中抗，mr)：直徑約為1mm的褐色病斑；3級(jí)(ms，中感)：直接約為2-3mm的帶圓形病斑，中央灰白色，邊緣褐色；4級(jí)(感，s)：長(zhǎng)約1-3cm的橢圓形病斑，中央灰白色，邊緣褐色；5級(jí)(高感，hs)：長(zhǎng)且寬的大橢圓形病斑，病斑融合成片，至葉片枯死。其中0-2級(jí)為抗病，3-5級(jí)為感病。接種結(jié)果見表3和圖4。

表3接種稻瘟菌后的抗性表現(xiàn)

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。