專利名稱：一種捕獲核酸片段的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程及分子生物學領域，更具體地說，涉及一種捕獲核酸片段的方法。
背景技術：
隨著第二代高通量測序技術的出現(xiàn)和發(fā)展，目前，科學家們已經(jīng)能夠對很多生物物種的基因組進行常規(guī)的從頭測序，并對這些物種的基因組中的重要部分進行再測序。但是，在廣泛應用的第二代高通量測序技術的成功使用過程中存在一個主要瓶頸即如何快速有效的將散落于基因組、線粒體和/或其他形式的DNA中的特定區(qū)域的核酸片段選擇性的捕獲出來。選擇性捕獲并富集來自生物物種的基因組、線粒體和/或其他形式的DNA的特定區(qū)域具有廣泛的應用。
現(xiàn)有技術中主要是通過微陣列技術捕獲特定區(qū)域的核酸片段，方法如下1)在微陣列芯片上通過化學合成直接生成與目的片段互補的DNA片段；2)利用帶T7 promoter的引物對步驟I)所得的DNA片段進行PCR擴增，然后對PCR產(chǎn)物進行逆轉錄，轉錄體系中加入了帶有生物素標記的dUTP，生成帶有生物素標記的RNA片段(捕獲探針)；3)將片段化后的基因組DNA與帶有生物素標記的RNA片段混合孵育，使得目的DNA片段與RNA結合，提取純化得到目的DNA片段。該方法中，帶有生物素標記的RNA片段的生物素標記是在逆轉錄過程中通過帶生物素標記的dUTP引入的，生物素標記的數(shù)量和位置是隨機的，捕獲探針的均一性不好，可能導致獲得的捕獲探針中的部分探針上的生物素標記過多和/或位置不當，影響其與基因組DNA的雜交，進而導致對目的DNA片段的捕獲效果不佳；此外，本方案在制備捕獲探針的過程中需要在芯片上化學合成與目的片段互補的DNA片段，生產(chǎn)成本高。因此，需要一種新的捕獲核酸片段的方法，能夠避免因為捕獲探針的均一性差而導致的捕獲效果不佳的現(xiàn)象的發(fā)生，并降低捕獲核酸片段的成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的捕獲核酸片段的方法，旨在解決現(xiàn)有技術中因為捕獲探針的均一性差而導致捕獲效果不佳的問題。為了實現(xiàn)發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種捕獲核酸片段的方法，包括以下步驟
A.以含待捕獲核酸片段的核酸分子為原料，利用生物素標記的擴增引物或接頭元件制備生物素標記的捕獲探針；
B.使生物素標記的捕獲探針與待捕獲核酸片段庫雜交，利用含鏈霉親和素或親和素標記的固相載體捕獲所述待捕獲核酸片段。其中，所述步驟B可包括以下步驟
B01.利用含鏈霉親和素或親和素標記的固相載體捕獲步驟A中的生物素標記的捕獲探針，得固定在固相載體上的捕獲探針；
B02.使固定在固相載體上的捕獲探針與待捕獲核酸片段庫雜交得第一次雜交產(chǎn)物，分離純化第一次雜交產(chǎn)物得含固相載體的第一產(chǎn)物；
B03.使步驟B02得到的產(chǎn)物變性，得第一次捕獲產(chǎn)物。進一步的，在所述步驟B03之后還可包括以下步驟
B04.利用在步驟BOl中得到的固定在固相載體上的捕獲探針與步驟B03所得的第一次捕獲產(chǎn)物雜交得第二次雜交產(chǎn)物，分離純化第二次雜交產(chǎn)物得含固相載體的第二產(chǎn)物；
B05.使步驟B04得到的產(chǎn)物變性，得第二次捕獲產(chǎn)物。上述任一方案中，所述步驟B中的雜交是在周期性震動中進行的。上述任一方案中，所述含待捕獲核酸片段的核酸分子為克隆載體庫。其中，所述步驟A可有多種實現(xiàn)方式。 在一種實施方案中，所述步驟A可包括以下步驟
A01.使用限制性酶將克隆載體庫中的待捕獲核酸片段酶切下來，從而獲得DNA模板； A02.片段化DNA模板，得DNA模板片段化產(chǎn)物；
A03. DNA模板片段化產(chǎn)物與生物素標記的接頭元件連接，得生物素標記的捕獲探針。在另一種實施方案中，所述步驟A可包括以下步驟
All.使用限制性酶將克隆載體庫中的待捕獲核酸片段酶切下來，從而獲得DNA模板； A12.片段化DNA模板，得DNA模板片段化產(chǎn)物；
A13. DNA模板片段化產(chǎn)物與接頭元件連接，得含接頭的DNA模板片段；
A14.利用生物素標記的擴增引物對步驟A13的產(chǎn)物進行PCR擴增，得生物素標記的捕獲探針。在另一種實施方案中，所述步驟A包括以下步驟
A21.片段化含待捕獲核酸片段的核酸分子，得片段化產(chǎn)物；
A22.片段化產(chǎn)物與接頭元件連接，得含接頭的核酸片段；
A23.利用生物素標記的擴增引物對步驟A22的產(chǎn)物進行PCR擴增，得生物素標記的捕獲探針。在另一種實施方案中，所述步驟A包括以下步驟
A31.片段化含待捕獲核酸片段的核酸分子，得片段化產(chǎn)物；
A32.片段化產(chǎn)物與生物素標記的接頭元件連接，得生物素標記的捕獲探針。上述方案中，所述步驟A13或A22中的接頭元件可為分叉接頭。上述任一方案中，所述步驟A之前還可包括步驟
A00.以基因組DNA為模板，利用用于特異性擴增待捕獲核酸片段的引物對進行PCR擴增，得含待捕獲核酸片段的核酸分子。其中，所述用于特異性擴增待捕獲核酸片段的引物對包括SEQ ID NO: I和SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7 和 SEQ IDN0:8、SEQ ID N0:9和 SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11和 SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13和 SEQID NO:14、SEQ ID NO:15 和 SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17 和 SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20中的至少一對。由上可知，本發(fā)明的方法通過生物素標記的擴增引物或接頭元件制備生物素標記的捕獲探針，所得的捕獲探針的生物素標記的數(shù)量和位置均相同，均一性好，然后基于上述捕獲探針從待捕獲核酸片段庫中對待捕獲核酸片段進行捕獲，能夠避免因為捕獲探針的均一性差而導致的捕獲效果不佳的現(xiàn)象的發(fā)生。此外，本發(fā)明的方法因為降低了捕獲探針的制備成本，進而降低了捕獲核酸片段的成本。


圖I是本發(fā)明一個實施例中捕獲探針捕獲所待捕獲核酸片段的流程示意圖。圖2是本發(fā)明另一個實施例中捕獲探針捕獲所待捕獲核酸片段的流程示意圖。圖3是本發(fā)明一具體實施例中在不同雜交時間條件下，第一次和第二次捕獲的準確率圖。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對 本發(fā)明進行進一步詳細說明。一種捕獲核酸片段的方法，包括以下步驟
A.以含待捕獲核酸片段的核酸分子為原料，利用生物素標記的擴增引物或接頭元件制備生物素標記的捕獲探針；
B.使生物素標記的捕獲探針與待捕獲核酸片段庫雜交，利用含鏈霉親和素或親和素標記的固相載體捕獲所述待捕獲核酸片段。本發(fā)明的方法通過生物素標記的擴增引物或接頭元件制備生物素標記的捕獲探針，所得的捕獲探針的生物素標記的數(shù)量和位置均相同，均一性好，然后基于上述生物素標記的捕獲探針從待捕獲核酸片段庫中對待捕獲核酸片段進行捕獲，能夠避免因為捕獲探針的均一性差而導致的捕獲效果不佳的現(xiàn)象的發(fā)生。此外，本發(fā)明的方法因為降低了捕獲探針的制備成本，進而降低了捕獲核酸片段的成本。需要說明的是，所述待捕獲核酸片段可以是基因組DNA、線粒體DNA、質(zhì)?；騌NA上的一段或多段序列；所述含待捕獲核酸片段的核酸分子可以是克隆載體、克隆載體庫或PCR擴增產(chǎn)物；上述一段或多段序列可被預先構建在克隆載體或克隆載體庫上，上述一段或多段序列也可被包含在PCR擴增產(chǎn)物中，該PCR擴增產(chǎn)物是利用相應的PCR引物從基因組DNA、線粒體DNA、質(zhì)粒或RNA上擴增獲得的。所述生物素標記的擴增弓I物或接頭元件上的生物素標記的位置和數(shù)量均是確定的。所述生物素標記的擴增引物或接頭元件均可通過人工合成的方式獲得。所述生物素標記的接頭元件為核酸分子，用于連接，可采用多種結構，包括但不限于平末纟而接頭、關出末纟而接頭、分叉接頭和含3;環(huán)結構的接頭，上述各種結構的接頭具體已在中國專利CN201110222952. 4中公開，在這里通過引用的形式全部引入。優(yōu)選的，所述生物素標記的接頭元件為生物素標記的分叉接頭，所述生物素標記的分叉接頭為含生物素標記的雙鏈核酸分子，所述生物素標記的分叉接頭包括分叉區(qū)和互補區(qū)。其中，所述生物素標記的分叉接頭的互補區(qū)可含有單核苷酸突出末端，所述單核苷酸為T，所述單核苷酸突出末端位于其所在核酸鏈的3’末端。本方案既可避免接頭自連現(xiàn)象的出現(xiàn)，還可以與含有A突出末端的核酸鏈特異性連接，提高連接效率。其中，所述生物素標記的分叉接頭的互補區(qū)可含有雙脫氧核苷酸，所述雙脫氧核苷酸位于其所在核酸鏈的3’末端，此時雙脫氧核苷酸所在核酸鏈的互補鏈的5’端含有磷酸基團。本方案可避免接頭自連現(xiàn)象的出現(xiàn)。其中，所述生物素標記的分叉接頭的互補區(qū)可含有無磷酸核苷酸，所述無磷酸核苷酸位于其所在核酸鏈的5’末端。本方案同樣可避免接頭自連現(xiàn)象的出現(xiàn)。其中，所述生物素標記的分叉接頭的生物素標記位于分叉區(qū)；進一步的，所述生物素標記位于分叉接頭的末端，更優(yōu)選的，所述生物素標記位于其所在核酸鏈的5’末端。所述擴增引物，用于擴增以制備捕獲探針。所述擴增引物的3’端可與待捕獲核酸片段互補，所述擴增引物的3’端還可與接頭元件互補。所述待捕獲核酸片段庫是含有待捕獲核酸片段的核酸分子集合，可以是基因組DNA、線粒體DNA、質(zhì)?；騌NA，也可以是基因組DNA、線粒體DNA、質(zhì)?；騌NA的片段化產(chǎn)物，還可以是基因組DNA、線粒體DNA、質(zhì)?；騌NA的片段化產(chǎn)物與接頭元件連接之后的連接產(chǎn) 物；此處所述的接頭元件同樣為核酸分子，用于連接基因組DNA、線粒體DNA、質(zhì)?；騌NA的片段化產(chǎn)物，可采用多種結構，包括但不限于平末端接頭、突出末端接頭、分叉接頭和含莖環(huán)結構的接頭，上述各種結構的接頭具體已在中國專利CN201110222952. 4中公開，在這里通過引用的形式全部引入；但是此處的接頭元件的序列不能與構建捕獲探針過程中所使用的接頭元件的序列相同或互補配對，這樣在獲得捕獲產(chǎn)物后，利用與此處的接頭元件的3’端相同或互補配對的核酸分子進行PCR擴增時，能夠稀釋混在捕獲產(chǎn)物中的捕獲探針，減少混入的捕獲探針對后續(xù)實驗的干擾。所述固相載體的表面為適于鏈霉親和素或親和素標記的材料，該材料包括但不限于玻片、硅片、陶瓷、金屬、金屬氧化物、塑料、橡膠、尼龍；所述固相載體可為各種形狀，包括但不限于球狀固相載體、半球狀固相載體、橢球狀固相載體、柱狀固相載體或不規(guī)則形狀的固相載體。本方案是基于已有的含待捕獲核酸片段的核酸分子，從待捕獲核酸片段庫中捕獲所述的待捕獲核酸片段，其實質(zhì)就是從待捕獲核酸片段庫中富集目標片段，該目標片段是與含待捕獲核酸片段的核酸分子中的待捕獲核酸片段互補的核酸片段。所述待捕獲核酸片段的序列信息可以是已知的，也可以是未知的。其中，所述步驟A有多種實現(xiàn)方式，以下將通過多個具體實施方式
來進一步闡述。本發(fā)明提出第一實施例，所述含待捕獲核酸片段的核酸分子為克隆載體庫，所述待捕獲核酸片段有多個并被分別構建至多個克隆載體中，所述步驟A包括以下步驟
A01.使用限制性酶將克隆載體庫中的待捕獲核酸片段酶切下來，從而獲得DNA模板； A02.片段化DNA模板，得DNA模板片段化產(chǎn)物；
A03. DNA模板片段化產(chǎn)物與生物素標記的接頭元件連接，得生物素標記的捕獲探針。本方案通過酶切的方式，將待捕獲核酸片段從克隆載體中酶切下來，進而與生物素標記的接頭元件連接，得生物素標記的捕獲探針。本方案中的克隆載體庫中的克隆載體可轉化至大腸桿菌或酵母菌中分別進行培養(yǎng)放大，以制備足量的捕獲探針進行步驟B的捕獲，且當載體在大腸桿菌或酵母菌中進行復制時，可利用大腸桿菌或酵母菌的糾錯機制，保證克隆載體上的待捕獲核酸片段的高保真復制。本方案與通過PCR步驟實現(xiàn)對待捕獲核酸片段的擴增相比，待捕獲核酸片段中出現(xiàn)突變的概率更低，從而保證了高質(zhì)量的生物素標記的捕獲探針的獲得，進而保證了后續(xù)的步驟B中捕獲所得的待捕獲核酸片段的準確率。
需要說明的是，所述DNA模板為從克隆載體庫中酶切下來的待捕獲核酸片段。所述克隆載體中的待捕獲核酸片段兩端含有限制性酶酶切位點。所述DNA模板片段化產(chǎn)物與生物標記的接頭元件的連接可只發(fā)生在所述DNA模板片段化產(chǎn)物的一端或兩端。本發(fā)明還提出第二實施例，所述含待捕獲核酸片段的核酸分子為克隆載體庫，所述待捕獲核酸片段有多個并被分別構建至多個克隆載體中，所述步驟A包括以下步驟
All.使用限制性酶將克隆載體庫中的待捕獲核酸片段酶切下來，從而獲得DNA模板； A12.片段化DNA模板，得DNA模板片段化產(chǎn)物 ；
A13. DNA模板片段化產(chǎn)物與接頭元件連接，得含接頭的DNA模板片段；
A14.利用生物素標記的擴增引物對步驟A13的產(chǎn)物進行PCR擴增，得生物素標記的捕獲探針。本方案與第一實施例相比，所需的克隆載體庫的量更少，且可通過PCR步驟實現(xiàn)對含接頭的DNA模板片段的擴增，從而獲得足量的捕獲探針進行步驟B的捕獲。因為PCR擴增的速度較原核生物培養(yǎng)的速度更快，因此，本方案制備捕獲探針的效率更高。需要說明的是，所述DNA模板為從克隆載體庫中酶切下來的待捕獲核酸片段。所述克隆載體中的待捕獲核酸片段兩端含有限制性酶酶切位點。所述生物素標記的擴增引物的3’端與接頭元件互補。所述DNA模板片段化產(chǎn)物與接頭元件的連接發(fā)生在所述DNA模板片段化產(chǎn)物的兩端。所述接頭元件為核酸分子，用于連接，可采用多種結構，包括但不限于平末纟而接頭、關出末纟而接頭、分叉接頭和含3；環(huán)結構的接頭，上述各種結構的接頭具體已在中國專利CN201110222952. 4中公開，在這里通過引用的形式全部引入。優(yōu)選的，所述接頭元件為分叉接頭，所述分叉接頭為雙鏈核酸分子，所述分叉接頭包括分叉區(qū)和互補區(qū)。其中，所述分叉接頭的互補區(qū)可含有單核苷酸突出末端，所述單核苷酸為T，所述單核苷酸突出末端位于其所在核酸鏈的3’末端。本方案既可避免接頭自連現(xiàn)象的出現(xiàn)，還可以與含有A突出末端的核酸鏈特異性連接，提高連接效率。其中，所述分叉接頭的互補區(qū)可含有雙脫氧核苷酸，所述雙脫氧核苷酸位于其所在核酸鏈的3’末端，此時雙脫氧核苷酸所在核酸鏈的互補鏈的5’端含有磷酸基團。本方案可避免接頭自連現(xiàn)象的出現(xiàn)。其中，所述分叉接頭的互補區(qū)可含有無磷酸核苷酸，所述無磷酸核苷酸位于其所在核酸鏈的5’末端。本方案同樣可避免接頭自連現(xiàn)象的出現(xiàn)。本發(fā)明還提出第三實施例，所述步驟A包括以下步驟
A21.片段化含待捕獲核酸片段的核酸分子，得片段化產(chǎn)物；
A22.片段化產(chǎn)物與接頭元件連接，得含接頭的核酸片段；
A23.利用生物素標記的擴增引物對步驟A22的產(chǎn)物進行PCR擴增，得生物素標記的捕獲探針。需要說明的是，所述含待捕獲核酸片段的核酸分子為PCR擴增產(chǎn)物，所述PCR擴增產(chǎn)物是利用相應的PCR引物對基因組DNA、線粒體DNA、質(zhì)?；騌NA上的目標區(qū)域進行擴增獲得的。所述目標區(qū)域由待捕獲核酸片段組成。所述目標區(qū)域可有多個。所述接頭元件為核酸分子，用于連接，可采用多種結構，包括但不限于平末端接頭、突出末端接頭、分叉接頭和含莖環(huán)結構的接頭，上述各種結構的接頭具體已在中國專利CN201110222952.4中公開，在這里通過引用的形式全部引入。所述片段化產(chǎn)物與接頭元件的連接發(fā)生在所述片段化產(chǎn)物的兩端。所述生物素標記的擴增引物的3’端與接頭元件互補。優(yōu)選的，所述接頭元件為分叉接頭，所述分叉接頭為雙鏈核酸分子，所述分叉接頭包括分叉區(qū)和互補區(qū)。其中，所述分叉接頭的互補區(qū)可含有單核苷酸突出末端，所述單核苷酸為T，所述單核苷酸突出末端位于其所在核酸鏈的3’末端。本方案既可避免接頭自連現(xiàn)象的出現(xiàn)，還可以與含有A突出末端的核酸鏈特異性連接，提高連接效率。其中，所述分叉接頭的互補區(qū)可含有雙脫氧核苷酸，所述雙脫氧核苷酸位于其所在核酸鏈的3’末端，此時雙脫氧核苷酸所在核酸鏈的互補鏈的5’端含有磷酸基團。本方案可避免接頭自連現(xiàn)象的出現(xiàn)。其中，所述分叉接頭的互補區(qū)可含有無磷酸核苷酸，所述無磷酸核苷酸位于其所在核酸鏈的5’末端。本方案同樣可避免接頭自連現(xiàn)象的出現(xiàn)。 本發(fā)明還提出第四實施例，所述步驟A包括以下步驟
A31.片段化含待捕獲核酸片段的核酸分子，得片段化產(chǎn)物；
A32.片段化產(chǎn)物與生物素標記的接頭元件連接，得生物素標記的捕獲探針。需要說明的是，所述含待捕獲核酸片段的核酸分子為PCR擴增產(chǎn)物，所述PCR擴增產(chǎn)物是利用相應的PCR引物對基因組DNA、線粒體DNA、質(zhì)?；騌NA上的目標區(qū)域進行擴增獲得的。所述目標區(qū)域由待捕獲核酸片段組成。所述目標區(qū)域可有多個。所述片段化產(chǎn)物與生物素標記的接頭元件連接可只發(fā)生在所述DNA模板片段化產(chǎn)物的一端或兩端。所述生物素標記的接頭元件為核酸分子，用于連接，可采用多種結構，包括但不限于平末纟而接頭、關出末纟而接頭、分叉接頭和含3；環(huán)結構的接頭，上述各種結構的接頭具體已在中國專利CN201110222952. 4中公開，在這里通過引用的形式全部引入。優(yōu)選的，所述生物素標記的接頭元件為生物素標記的分叉接頭，所述生物素標記的分叉接頭為含生物素標記的雙鏈核酸分子，所述生物素標記的分叉接頭包括分叉區(qū)和互補區(qū)。其中，所述生物素標記的分叉接頭的互補區(qū)可含有單核苷酸突出末端，所述單核苷酸為T，所述單核苷酸突出末端位于其所在核酸鏈的3’末端。本方案既可避免接頭自連現(xiàn)象的出現(xiàn)，還可以與含有A突出末端的核酸鏈特異性連接，提高連接效率。其中，所述生物素標記的分叉接頭的互補區(qū)可含有雙脫氧核苷酸，所述雙脫氧核苷酸位于其所在核酸鏈的3’末端，此時雙脫氧核苷酸所在核酸鏈的互補鏈的5’端含有磷酸基團。本方案可避免接頭自連現(xiàn)象的出現(xiàn)。其中，所述生物素標記的分叉接頭的互補區(qū)可含有無磷酸核苷酸，所述無磷酸核苷酸位于其所在核酸鏈的5’末端。本方案同樣可避免接頭自連現(xiàn)象的出現(xiàn)。其中，所述生物素標記的分叉接頭的生物素標記位于分叉區(qū)；進一步的，所述生物素標記位于分叉接頭的末端，更優(yōu)選的，所述生物素標記位于其所在核酸鏈的5’端。第三實施例和第四實施例各有優(yōu)點。第三實施例的A步驟中，含待捕獲核酸片段的核酸分子的用量可更少，而第四實施例的A步驟中少了一個PCR擴增的步驟，效率更高。優(yōu)選的，所述步驟A之前還可包括步驟
A00.以基因組DNA為模板，利用用于特異性擴增待捕獲核酸片段的引物對進行PCR擴增，得含待捕獲核酸片段的核酸分子。需要說明的是，本方案中，所述待捕獲核酸片段至少有一個，位于基因組DNA中；所述用于特異性擴增待捕獲核酸片段的引物對與待捕獲核酸片段相對應，每個待捕獲核酸片段均有一對所述的用于特異性擴增待捕獲核酸片段的引物對。本方案尤其適用于第三和第四實施例。更優(yōu)選的，所述待捕獲核酸片段不大于20kb，以防因為模板過長，而導致PCR擴增不成功；更進一步的，所述待捕獲核酸片段大小在Ikb至4kb之間，以保證待捕獲核酸片段的高效擴增，且不同待捕獲核酸片段的擴增條件可統(tǒng)一，簡化了實驗設計。在本發(fā)明的一具體實施例中，所述待捕獲核酸片段均為與乳腺癌相關的基因片段，所述用于特異性擴增待捕獲核酸片段的引物對包括SEQ ID NO: I和SEQ ID NO: 2, SEQID NO:3 和 SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8、SEQID N0:9和 SEQ ID NO: 10,SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13和 SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO:15 和 SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17 和 SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19 和 SEQ IDNO: 20中的至少一對。上述各引物對能夠對乳腺癌相關的基因片段進行特異性的擴增，且擴 增效率也基本一致，它們的擴增產(chǎn)物均在Ikb至I. 4kb之間。上述第一實施例和第二實施例所述的含待捕獲核酸片段的核酸分子均為克隆載體庫，因為克隆載體庫中除了待捕獲核酸片段外，還含有其他的結構性核酸序列，如果不經(jīng)過限制性酶酶切步驟將待捕獲核酸片段切出來，直接進行片段化步驟的話，會導致制備的捕獲探針中含有用于捕獲克隆載體庫中的其他的結構性核酸序列的探針，導致非目標捕獲，捕獲準確率不高。此外，所述克隆載體庫是指以待捕獲核酸片段作為插入片段的克隆載體組成的庫，所述克隆載體包括但不限于細菌人工染色體(Bacterial ArtificialChromosome, BAC)、酵母人工染色體(Yeast Artificial Chromosome, YAC)> Pl 派生人工染色體(PI Derived Artificial Chromosome, PAC)和哺乳動物人工染色體(MammalArtificial Chromosome, MAC)。在上述克隆載體中的插入片段的大小無特殊要求,可在50bp至200kb之間。優(yōu)選的，所述插入片段，即待捕獲核酸片段大小在Ikb至30kb之間。因為克隆載體可在例如大腸桿菌或酵母菌中進行復制，不受克隆載體分子大小的影響，且保真度極高，而PCR反應對于長片段(例如大于5kb或IOkb或20kb的核酸分子)的擴增存在困難。所以，當需要對較大區(qū)域(例如IOOkb，甚至4000kb)的核酸片段進行捕獲時，可將該核酸片段拆分成多個待捕獲核酸片段并分別構建克隆載體中，所述多個待捕獲核酸片段在疊加之后能夠形成該完整的較大區(qū)域的核酸片段。所述多個待捕獲核酸片段可大于等于Ikb 或 5kb 或 IOkb 或 20kb。第三實施例和第四實施例中，因為所述的含待捕獲核酸片段的核酸分子均為PCR擴增產(chǎn)物，而所述PCR擴增產(chǎn)物是利用相應的PCR引物對基因組DNA、線粒體DNA、質(zhì)?；騌NA上的目標區(qū)域進行擴增獲得的；所以，第三實施例和第四實施例中所述的含待捕獲核酸片段的核酸分子可直接進行片段化步驟，而無需在片段化之前增加將非待捕獲核酸片段去除的步驟。上述四個實施例中，均含有片段化步驟，目的在于將待捕獲核酸片段制成大小較為一致且適于捕獲的捕獲探針。優(yōu)選的，上述四個實施例中的片段化步驟之后，還可包括將片段產(chǎn)物進行凝膠電泳，進而切膠純化特定大小的片段化產(chǎn)物的步驟。進一步的，純化的特定大小的片段化產(chǎn)物的大小在IOObp至600bp之間；更進一步的，純化的特定大小的片段化產(chǎn)物的大小在200bp至500bp之間；更進一步的,純化的特定大小的片段化產(chǎn)物的大小在300bp至400bp之間。此外，在上述四個實施例中的片段化步驟之后往往還可包括末端補平、去磷酸化或磷酸化、加A尾等處理，并在上述處理之后再與接頭元件連接。所述末端補平、去磷酸化、磷酸化和加A尾處理均為現(xiàn)有技術，在此不再贅述。應當說明的是，所述步驟A的實現(xiàn)方式包括但不限于上述四個實施例。例如，當待捕獲核酸片段不大于20kb時，特別是小于等于5kb時，還可通過PCR擴增的方式替換限制酶酶切的步驟，將第一實施例和第二實施例所述的含待捕獲核酸片段的核酸分子中的待捕獲核酸片段分離出來。另外，當待捕獲核酸片段小于等于500bp，且其頭尾兩端的序列已知時，可無需片段化步驟，直接利用生物素標記的引物或接頭元件參照上述的四個實施例進行捕獲探針的制備。其中，所述步驟B有多種實現(xiàn)方式，以下將通過多個具體實施方式
來進一步闡述。 本發(fā)明提出第五實施例，所述步驟B包括以下步驟
B01.利用含鏈霉親和素或親和素標記的固相載體捕獲步驟A中的生物素標記的捕獲探針，得固定在固相載體上的捕獲探針；
B02.使固定在固相載體上的捕獲探針與待捕獲核酸片段庫雜交得第一次雜交產(chǎn)物，分離純化第一次雜交產(chǎn)物得含固相載體的第一產(chǎn)物；
B03.使步驟B02得到的產(chǎn)物變性，得第一次捕獲產(chǎn)物。因為本發(fā)明的步驟A所得的捕獲探針中，既有與待捕獲核酸片段的正義鏈互補的探針，也有與待捕獲核酸片段的反義鏈互補的探針，所以，在步驟B的雜交過程中，步驟A所得的捕獲探針中可能存在部分探針之間互補配對的現(xiàn)象。如圖I所示，首先，生物素標記的捕獲探針與待捕獲核酸片段庫雜交，再利用含鏈霉親和素或親和素標記的固相載體捕獲生物素標記的捕獲探針，然后經(jīng)變性步驟獲得捕獲產(chǎn)物，這個方案在雜交過程中生物素標記的捕獲探針之間可能發(fā)生互補配對，而含鏈霉親和素或親和素標記的固相載體在捕獲生物素標記的捕獲探針時，并不一定能夠與所有的生物素標記結合，所以這個方案所得的捕獲產(chǎn)物中可能混有捕獲探針，而這些混有的捕獲探針會干擾捕獲產(chǎn)物的后續(xù)應用，包括但不限于序列分析等。如圖2所示，第五實施例的基本流程是先將捕獲探針固定在固相載體上，然后利用固定有捕獲探針的固相載體捕獲待捕獲核酸片段庫中的待捕獲核酸片段，進而通過變性步驟獲得捕獲產(chǎn)物。在第五實施例的雜交過程中，生物素標記的捕獲探針之間同樣可能發(fā)生的互補配對，但是能夠避免捕獲廣物中混有捕獲探針，捕獲準確率更聞，即捕獲廣物中待捕獲核酸片段所占的比率更高。需要說明的是，所述第一次雜交產(chǎn)物是固定在固相載體上的捕獲探針與待捕獲核酸片段庫完成雜交反應后的整個反應體系；所述含固相載體的第一產(chǎn)物是指從第一次雜交產(chǎn)物中純化出的含固相載體的產(chǎn)物；所述第一次捕獲產(chǎn)物是指經(jīng)變性步驟，從含固相載體的第一產(chǎn)物上釋放出的未固定在固相載體上的核酸分子。為了進一步提高捕獲準確率，本發(fā)明提出第六實施例，所述步驟B包括以下步驟 B01.利用含鏈霉親和素或親和素標記的固相載體捕獲步驟A中的生物素標記的捕獲
探針，得固定在固相載體上的捕獲探針；B02.使固定在固相載體上的捕獲探針與待捕獲核酸片段庫雜交得第一次雜交產(chǎn)物，分離純化第一次雜交產(chǎn)物得含固相載體的第一產(chǎn)物；
B03.使步驟B02得到的產(chǎn)物變性，得第一次捕獲產(chǎn)物；
B04.利用在步驟BOl中得到的固定在固相載體上的捕獲探針與步驟B03所得的第一次捕獲產(chǎn)物雜交得第二次雜交產(chǎn)物，分離純化第二次雜交產(chǎn)物得含固相載體的第二產(chǎn)物；
B05.使步驟B04得到的產(chǎn)物變性，得第二次捕獲產(chǎn)物。本方案實質(zhì)上是利用第五實施例中步驟BOl中得到的固定在固相載體上的捕獲探針對第五實施例中的第一次捕獲產(chǎn)物進行第二次捕獲。本方案能夠進一步提高捕獲準確率。需要說明的是，所述第二次雜交產(chǎn)物是步驟BOl中得到的固定在固相載體上的捕獲探針與第一次捕獲產(chǎn)物完成雜交反應后的整個反應體系；所述含固相載體的第二產(chǎn)物是指從第二次雜交產(chǎn)物中純化出的含固相載體的產(chǎn)物；所述第二次捕獲產(chǎn)物是指經(jīng)變性步 驟，從含固相載體的第二產(chǎn)物上釋放出的未固定在固相載體上的核酸分子。為了保證所述步驟B04中的第一次捕獲產(chǎn)物的量足夠進行第二次捕獲，可在步驟B03獲得第一次捕獲產(chǎn)物之后，在步驟B04中的雜交反應之前，對第一次捕獲產(chǎn)物進行PCR擴增。應當說明的是，所述步驟B的實現(xiàn)方式包括但不限于上述兩個實施例，例如圖I所示的方案同樣能夠實現(xiàn)本發(fā)明的目的。上述任一實施例中，所述步驟B中的雜交可以是在周期性震動中進行的。本方案能夠讓捕獲探針與待捕獲核酸片段庫中的庫分子充分接觸，提高捕獲探針對待捕獲核酸片段庫中的含待捕獲核酸片段的核酸分子的捕獲效率。本方案尤其適用于第五和第六實施例。在第五和第六實施例中，捕獲探針是固定在固相載體上與含待捕獲核酸片段的核酸分子進行雜交反應的；當所述固相載體的密度與雜交反應體系中的液體的密度不一致時，固相載體會發(fā)生沉降或上浮，進而導致固定在固相載體上的捕獲探針與含待捕獲核酸片段的核酸分子之間的接觸不充分，在雜交反應體系的底部或頂部的固定在固相載體上的捕獲探針的密度過高，使得捕獲探針相互之間發(fā)生互補配對的概率大增，降低了捕獲效率。因此，在第五和第六實施例中，使所述步驟B中的雜交是在周期性震動中進行，能夠提高捕獲探針對待捕獲核酸片段庫或第一次捕獲產(chǎn)物中的含待捕獲核酸片段的核酸分子的捕獲效率，降低捕獲探針之間發(fā)生互補配對的概率。需要說明的是，所述周期性震動的實現(xiàn)方式有多種，包括但不限于在旋轉儀上進行雜交反應，或按一定的時間間隔，吹打或震蕩雜交反應體系。以下將通過第一具體實施例對本發(fā)明進行進一步的詳細說明，本具體實施例是利用捕獲探針從乳腺癌病人血液樣品的基因組DNA中捕獲乳腺癌相關的基因片段。一、捕獲探針的制備。I.以正常人基因組DNA為模板，擴增乳腺癌相關的基因片段。乳腺癌相關的基因片段擴增引物對如下BRCA1-F1(SEQ ID NO: I)和BRCA1-R1SEQID NO:2,BRCAI-F2 (SEQ ID NO:3)和 BRCAI-R2 (SEQ ID N0:4)、BRCA1_F3 (SEQ ID N0:5)和BRCAI-R3 (SEQ ID NO:6)、BRCA1_F4 (SEQ ID NO:7)和 BRCAI-R4 (SEQ ID NO:8)、BRCA1_F5(SEQ ID NO :9)和 BRCAI-R5 (SEQ ID NO: 10)、BRCA1_F6 (SEQ ID NO: 11)和 BRCAI-R6 (SEQID NO: 12), BRCA2-F1 (SEQ ID NO: 13)和 BRCA2-R1 (SEQ ID NO: 14)、BRCA2-F2 (SEQ IDN0:15)和 BRCA2-R2 (SEQ ID NO: 16)、BRCA2-F3 (SEQ ID NO: 17)和 BRCA2-R3 (SEQ IDN0:18)、BRCA2-F4 (SEQ ID NO:19)和 BRCA2-R4 (SEQ ID NO:20)。以上述10對擴增引物為PCR引物，分別按以下PCR反應體系進行配置5XLongAmp Taq Reaction Buffer, 10 μ L ；dNTP (各 2· 5mM)，I. 5 μ L ;上游引物(10 μ Μ)，2μ L ;下游引物(10μΜ)，2μ L ;基因組 DNA，300ng，LongAmp Taq DNA polymerase (NEB,E5200S, 2. 5U/ μ L)，2 μ L ；ddH20,加至 50 μ L。PCR反應條件如下
95 °C, 4min ；
95°C，30min ；58°C，30s ；72°C, I. 5min ;重復 25 個循環(huán)； 72。。，IOmin。利用PCR清潔試劑盒，分別對擴增產(chǎn)物進行清潔，除去未擴增的引物和dNTP，柱純化并用 TE (IOmM Tris-HCl, ImM EDTA, pH7. 5)回收,得擴增產(chǎn)物。2.片段化乳腺癌相關的基因片段。測定步驟I所得的柱純化回收的擴增產(chǎn)物濃度，以TE為溶液，按等質(zhì)量混合步驟I所得的柱純化回收的擴增產(chǎn)物，配置IOOng/ μ L的混合液600 μ L，然后超聲片段化。反應條件如下在430至440W的功率條件下，超聲5s，暫停5s，重復40次。超聲結束后，將超聲后的產(chǎn)物跑8%的PAGE膠，回收200至500bp大小的片段，得片段化產(chǎn)物一。3.去磷酸化。對步驟2所得的片段化產(chǎn)物一進行去磷酸化處理，以防止在后續(xù)的連接反應過程中，片段化產(chǎn)物一之間發(fā)生自連，進而干擾后續(xù)的捕獲反應。反應體系如下片段化產(chǎn)物一(50ng/ μ L),40 μ L ；10ΧΑΡ Buffer, 10 μ L ；Fast AP (Fermentas,EF0651, IU/ μ L), 10 μ L ；ddH20，加至100 μ L。37°C消化30min后，柱純化并用TE回收，得去磷酸化產(chǎn)物。4.末端修復。對步驟3所得的去磷酸化產(chǎn)物進行末端修復。反應體系如下去磷酸化產(chǎn)物(30ng/μ L),60 μ L ;5XT4 DNA Polymerase Buffer,20 μ L ；T4 DNA Polymerase(Fermentas, ΕΡ0061, 5U/ μ L ), I μ L ；dNTP (各 2. 5mM),2y L ;ddH20，加至 100 μ L0 12。。反應30min，柱純化并用TE回收，得末端修復產(chǎn)物一。5.與接頭元件一連接。將步驟4所得的末端修復產(chǎn)物一與接頭元件一(SEQ ID NO:21和SEQ ID NO 22)連接，其中SEQ ID NO: 21的3’末端核苷酸C為雙脫氧核苷酸，SEQ ID NO 22的5’末端核苷酸G被磷酸化，含有磷酸基團。反應體系如下末端修復產(chǎn)物一(20ng/y L)，40y L ;接頭元件一(150ng/y L)，4y L ;10XT4 Ligase Buffer, 10 μ L ;IOmM ATP, 10 μ L ;4XPEG 6000(30%), 25 μ L ；T4 Ligase (Fermentas，EL0013，30U/μ L)，I μ L ;ddH20，加至 100 μ L。16°C反應2h，柱純化并用TE回收，得連接產(chǎn)物一。6.引物替換。因為接頭元件一上含有雙脫氧核苷酸，所以連接產(chǎn)物一中的一條鏈會含有一個切口，為了除去這個切口，使用一條與接頭元件一中的含有雙脫氧核苷酸的鏈的3’端具有相同序列的引物進行替換，該替換引物(SEQ ID NO:23)的3’末端不含有雙脫氧核苷酸。反應體系如下連接產(chǎn)物一(15ng/y L)，40y L ；5 X Buffer, 20 μ L ;替換引物(10 μ Μ)，10 μ L ；dNTP(各 2. 5mM), I μ L ; IOmM ATP，5 μ L ；ddH20,加至 100 μ L。先在 60°C放置 5min,然后冷卻至 37°C,再加入 6μ Taq DNA Polymerase (GenScript, 5U/μ L)和 I μ L T4 DNA Ligase(Fermentas，ELOO13，30U/μ L)，于37°C反應30min，然后柱純化回收，得引物替換產(chǎn)物。7. PCR 擴增。利用3，端與置換引物的5，端部分相同的Primer-Fl (SEQ ID NO: 24) 3，端與接頭元件互補的PCR引物Primer-Rl (SEQ ID NO:25)對步驟所得引物替換產(chǎn)物進行PCR擴增得乳腺癌相關的基因片段捕獲探針。其中，Primer-Fl的5’末端含有雙生物素標記。反應體系如下:引物替換產(chǎn)物(IOng/μ L)，50 μ L ；Primer-Fl (ΙΟμΜ), 100 μ L ；Primer-Rl(ΙΟμΜ),IOOyL ；10ΧΕχ Taq Buffer, 100 μ L ；Εχ Taq (TaKaRa, 5U/μ L), 8 μ L ；dNTP (各2. 5mM), 80 μ L ；ddH20 加至 1000 μ L。反應條件如下
94°C,2min ；
94°C，15s ；58°C，IOs ；72°C, 30s ;重復 15 個循環(huán)；
72。。，5 min。利用PCR清潔試劑盒，對擴增產(chǎn)物進行清潔，除去未擴增的引物和dNTP，柱純化并用TE (IOmM Tris-HCl, ImM EDTA, pH7. 5)回收，得乳腺癌相關的基因片段捕獲探針。二、將乳腺癌相關的基因片段捕獲探針固定至磁珠上。取Iyg的乳腺癌相關的基因片段捕獲探針與30 μ L的磁珠(Dynabeads Μ-280Streptavidin)結合,室溫下放置30min,每隔2min輕彈管壁。用磁鐵吸附磁珠，去除上清，加入50 μ L，O. IM的NaOH，室溫下變性5min，重復一次，最后用25yL TE溶解磁珠。因為步驟一的步驟7中，僅有一條PCR引物含有生物素標記，而本步驟中的磁珠是過量的，所以可以認為本步驟中固定在磁珠上的捕獲探針約為O. 5μ g。三、待捕獲核酸片段庫的制備。I.以一乳腺癌病人(深圳北大醫(yī)院患者)的基因組DNA為原材料，進行片段化處理。測定乳腺癌病人全血基因組DNA濃度，并用TE配置成IOOng/ μ L，去600 μ L進行超聲片段化。反應條件如下在430至440W的功率條件下，超聲5s，暫停5s，重復40次。超聲結束后，將超聲后的產(chǎn)物跑8%的PAGE膠，回收300至400bp大小的片段，得片段化產(chǎn)物二。2.磷酸化和末端修復。對步驟I所得的片段化產(chǎn)物二進行磷酸化，反應體系如下片段化產(chǎn)物二，lug;10XT4 Ligase Buffer, 10 μ L ;dNTP (各 2. 5mM), I. 5 μ L ;T4 DNA Polymerase (Fermentas,EP0061,5U/μ L), I μ L ;Klenow DNA Polymerase(Fermentas, 3，to 5’ exo minus,EP0421,5U/y L)，0. I μ L ；T4 PNK (Fermentas, EK0031, IOU/μ L), 0. 5 μ L, IOmM ATP, I. 5μ L ；ddH20,加至100 μ L。20°C反應20min，柱純化并用TE回收，得末端修復產(chǎn)物二。3.與接頭兀件_■連接。將步驟2所得末端修復產(chǎn)物二與接頭元件二(SEQ ID N0:26和SEQ ID N0:27)連接，反應體系如下末端修復產(chǎn)物二，700ng ;接頭元件二，700ng ;10XT4 Ligase Buffer,20 μ L ；10mM ATP, 25 μ L ;4XPEG 6000 (30%), 50 μ L ；Τ4 Ligase (Fermentas,EL0013,30U/yL)，10yL;ddH20，WM 200yL。16°C反應2h，柱純化并用TE回收，得連接產(chǎn)物二。4. PCR 擴增 O利用與接頭元件二中的一條核酸鏈(SEQ ID N0:26)具有相同序列的引物作為PCR擴增的上游引物和下游引物，對步驟3所得連接產(chǎn)物二進行擴增得待捕獲核酸片段庫。反應體系如下連接產(chǎn)物二，IOOng ;10XEx Taq Buffer，5 μ L ;Ex Taq (TaKaRa, 5U/μ L),0. 5μ L ；dNTP (各 2· 5πιΜ)，4μ L ;PCR 引物(SEQ ID NO: 26，100 μ M)，0. 5 μ L ;ddH20 力口M 50 μ L0反應條件如下
94°C,2min ；
94°C，15s ；58°C，IOs ；72°C, 30s ;重復 15 個循環(huán)；
72。。，5 min。利用PCR清潔試劑盒，對擴增產(chǎn)物進行清潔，除去未擴增的引物和dNTP，柱純化并用ddH20回收，得待捕獲核酸片段庫。四、雜交和捕獲。I.第一次雜交捕獲。取步驟三所得的待捕獲核酸片段庫2. 5 μ g，溶于5 μ L的ddH20中，95°C變性5min，然后冰浴2min，再置于65°C處理15min ;然后加入25 μ L步驟二所得的固定在磁珠上的捕獲探針，30yL 2 X 雜交緩沖液(pH 8. 0，10XSSPE，lOXDenhardt’ s，10 mM EDTA,0. 2%SDS);置于65°C烘箱中的旋轉儀上，旋轉雜交36h。2.清洗和變性。磁珠吸附步驟I雜交后的產(chǎn)物，棄上清；然后用500 μ L清洗緩沖液(I. 5mM檸檬酸鈉，150mM氯化鈉，O. 1%SDS)清洗三次；然后加入50 μ L O. IM氫氧化鈉處理5min ;磁珠吸附，留上清；在上清中加入3μ L 20%的乙酸，以中和上清中的氫氧化鈉，得第一次捕獲產(chǎn)物。3. PCR 擴增。對步驟2所得的第一次捕獲產(chǎn)物進行PCR擴增，反應體系如下第一次捕獲產(chǎn)物，IOOng ； 10 XEx Taq Buffer, 5 μ L ；Ex TaqCTaKaRa, 5U/ μ L), 0. 5 μ L ;dNTP(各 2· 5mM), 4 μ L ；PCR 引物(SEQ ID 勵:26，10(^]\0，0.54 1^;(1(扭20加至5(^1^反應條件如下
94°C,2min ；
94°C，15s ；58°C，IOs ；72°C, 30s ;重復 25 個循環(huán)；
72℃。，5 min。
利用PCR清潔試劑盒，對擴增產(chǎn)物進行清潔，除去未擴增的引物和dNTP，柱純化并用ddH20回收，得用于第二次捕獲的待捕獲核酸片段庫。4.第二次雜交捕獲。參考上述步驟I和2的步驟，利用步驟二所得的固定在磁珠上的捕獲探針對步驟3所得的用于第二次捕獲的待捕獲核酸片段庫進行第二次捕獲，得第二次捕獲產(chǎn)物。五、測序檢驗捕獲效果。對步驟四中得到的第一次捕獲產(chǎn)物和第二次捕獲產(chǎn)物分別進行高通量測序。結果顯示，第一次捕獲產(chǎn)物和第二次捕獲產(chǎn)物均能完全覆蓋乳腺癌相關的基因片段(步驟一中的10對擴增引物所能擴增出的區(qū)域)，即它們的覆蓋度均達到了 100%;此外第一次捕獲產(chǎn)物和第二次捕獲產(chǎn)物的均一度也基本一致。另外將步驟四中得到的第一次捕獲產(chǎn)物和第二次捕獲產(chǎn)物分別進行擴增，擴增條件可參考步驟四中的步驟3，然后PCR清潔回收擴增產(chǎn)物，并將回收得到的產(chǎn)物與pGEMm -T Easy VectorCPromega, Cat# A1360)連接，再將連接產(chǎn)物轉化至感受態(tài)大腸桿菌DH5 α(天根生化科技(北京)有限公司CB101-01)中，并將轉化后的大腸桿菌DH 5α涂布至氨芐抗性的LB平板上，進行藍白斑篩選。以平板上的白斑作為模板，鑒定引物(SEQ ID Ν0:26)作為菌落PCR的上游引物和下游引物，進行菌落PCR驗證。各隨機挑取100個陽性克隆進行Sanger測序，并將測序結果與NCBI上的已公開的上述10個乳腺癌相關的基因片段進行比對。結果顯示，由第一次捕獲產(chǎn)物得到的100個陽性克隆中，有88個陽性克隆能比對上，由第二次捕獲產(chǎn)物得到的100個陽性克隆中，有97個陽性克隆能比對上；即第一次捕獲的準確率為88%，第二次捕獲的準確率為97%。
應當說明的是，本發(fā)明典型的應用包括但不限于上述的乳腺癌相關的基因片段捕獲，在其他類似的基因片段、質(zhì)粒片段、線粒體DNA或RNA片段捕獲中，例如人類白細胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)基因片段或DMD基因(X連鎖隱性遺傳病基因)片段的捕獲中，也可以應用本發(fā)明所闡述的方法。所述HLA是人類的主要組織相容性復合體，HLA基因位于人類第6號染色體短臂上6p21. 3，全長為4000Kb。所述DMD基因位于人類X染色體短臂Xp21上，全長為2500kb。另外，本發(fā)明還分別針對雜交過程中的溫度、雜交時間、雜交過程中是否在旋轉儀上旋轉以及雜交時捕獲探針與待捕獲核酸片段庫的比例等因素進行了一系列的對比實驗。結果顯示，當雜交過程中的溫度分別為50°C、55°C、60°C、65°C、7(rC，其他反應條件與第一具體實施例相同時，隨著溫度的升高，第一次和第二次捕獲產(chǎn)物的量不斷下降，第一次和第二次捕獲的準確率不斷上升；其中65°C時的捕獲準確率與70°C時的捕獲準確率基本一致，但是70°C時的第一次和第二次捕獲產(chǎn)物的量分別是65°C時的第一次和第二次捕獲產(chǎn)物的量的73%和76%。當雜交時間分別為12h、18h、24h、36h、48h、72h，其他反應條件與第一具體實施例相同時，隨著時間的延長，第一次和第二次捕獲產(chǎn)物的量不斷上升；第一次和第二次捕獲的準確率則呈下降趨勢(見圖3)，其中，當雜交時間為18h時，第一次和第二次捕獲的準確率分別較36h時提高了 8%和3% ;第一次和第二次捕獲的覆蓋度在12h時為93%，在18h及18h以上均為100%。當雜交過程中雜交反應是靜置進行，其他反應條件與第一具體實施例相同時，第一次和第二次捕獲的準確率分別是66%和72%，遠低于旋轉儀上雜交的準確率。旋轉儀上第一次捕獲的準確率就比靜置第二次捕獲的準確率高。當捕獲探針的量與待捕獲核酸片段庫的量的比例分別為2 :1、1 :1、1 :2、1 :5(與第一具體實施例相同)、I 10時，其中捕獲探針的量固定為O. 5μ g，隨著待捕獲核酸片段庫的增加，所得第一次和第二次捕獲產(chǎn)物的量呈上升的趨勢，第一次和第二次捕獲的覆蓋度、準確率基本一致。因此可根據(jù)實際情況，根據(jù)樣品所得的基因組DNA的量對捕獲探針的量與待捕獲核酸片段庫的量的比例進行適當?shù)恼{(diào)整。
綜上，最佳雜交反應條件為65°C旋轉儀上雜交18h。在實際實驗過程中，一般認為捕獲的準確率高于85%，覆蓋度達到100%即可認為捕獲成功。因此，本發(fā)明的捕獲方法實際上只需要一次捕獲即可達到本領域對捕獲的一般要求，這能夠大大簡化實驗步驟，提高實驗效率，降低實驗成本。當然，進行兩次捕獲能夠提供更好的實驗效果。此外，現(xiàn)有技術中在進行捕獲探針與待捕獲核酸片段庫的雜交反應一般都在36h至72h之間，本發(fā)明的優(yōu)選方案中(周期性震蕩雜交)，雜交反應只需18h即可達到甚至超過現(xiàn)有技術的雜交反應效果，大大減少了雜交捕獲的時間，這能夠大大提高實驗效率，降低實驗的時間成本。以下本發(fā)明還做了兩個對比實驗，用于進一步闡述本發(fā)明的實驗效果。一、對比實驗一。對比實驗一主要是將步驟一中的步驟7用步驟7’代替，其他反應條件與第一具體實施例保持一致。步驟7’:利用3’端與置換引物的5’端部分相同的Primer-Fl (SEQ ID N0:24)和 3’端與接頭元件互補的PCR引物Primer-Rl (SEQ ID NO:25)對步驟所得引物替換產(chǎn)物進行PCR擴增得乳腺癌相關的基因片段捕獲探針。其中，Primer-Fl和Primer-Rl均不含有生物素標記。反應體系如下引物替換產(chǎn)物(lOng/μ L)，50y L ;Primer-Fl (10 μ Μ), 100 μ L ；Primer-Rl (ΙΟμΜ),ΙΟΟμ ；10ΧΕχ Taq Buffer, 100 μ L ；Εχ Taq (TaKaRa, 5U/ μ L), 8 μ L ;dNTP (各 2. 5mM),80 μ L ；dUTP (IOmM), 4 μ L ；ddH20 加至 1000 μ L。反應條件如下
94°C,2min ；
94°C，15s ；58°C，IOs ；72°C, 30s ;重復 15 個循環(huán)；
72。。，5 min。利用PCR清潔試劑盒，對擴增產(chǎn)物進行清潔，除去未擴增的引物、dNTP、dUTP，柱純化并用TE (IOmM Tris-HCiamM EDTA，pH7. 5)回收得對照組乳腺癌相關的基因片段捕獲探針。結果顯示，與第一具體實施例相比，對比實驗一所得的第一次和第二次捕獲產(chǎn)物的量分別只有第一具體實施例的73%和77%，第一次和第二次捕獲的捕獲準確率分別為86%和94%，第一次和第二次捕獲的覆蓋度分別為87%、86%。其中第一次和第二次捕獲產(chǎn)物的量遠低于第一具體實施例的原因可能是在完成步驟7’之后的磁珠捕獲過程中，出現(xiàn)了多個磁珠與同一捕獲探針結合的情況，導致步驟V所得的捕獲探針并未完全被磁珠捕獲，而步驟7’所得的捕獲探針未完全被磁珠捕獲可能進一步導致了本對比實驗的第一次和第二次捕獲的覆蓋度的明顯下降。而多個磁珠與同一捕獲探針的結合對于捕獲探針對待捕獲核酸片段庫的雜交的特異性并未有太大的影響，所以本對比實驗的第一次和第二次捕獲的捕獲準確率與第一具體實施例基本一致。二、對比實驗二。對比實驗二主要是將第一具體實施例中步驟二捕獲探針被鏈霉親和素標記的磁珠捕獲這一步驟同時置于步驟四中的第一次雜交捕獲和第二次雜交捕獲之后。結果顯示，對比實驗二所得的第一次和第二次捕獲產(chǎn)物的量與第一具體實施例基本一致，分別是第一具體實施例的101%和99%，遠高于對比實驗一；第一次和第二次捕獲的捕獲準確率分別為87%和95%，與第一具體實施例和對比實驗一基本相同；第一次和第二次捕獲的覆蓋度與第一具體實施例相同，均為100%，遠高于對比實驗一。對比實驗二的高通量測序結果與第一具體實施例相比，所捕獲乳腺癌相關的基因片段中，存在較多的雜合突變，其原因可能是在雜交過程中捕獲探針之間發(fā)生了互補配對，而含鏈霉親和素標記的磁珠在捕獲生物素標記的捕獲探針時，沒有與所有的生物素標記結合，進而導致所得的捕獲產(chǎn)物中可能混有捕獲探針，從而使得后續(xù)的高通量測序結果含有了捕獲探針的序列，而捕獲探針的序列與待捕獲核酸片段庫之間的不一致的地方，在測序結果中顯示成了雜合突變，而實際上待捕獲核酸片段在這些不一致的地方可能是純合突變或野生型。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權利要求
1.一種捕獲核酸片段的方法，其特征在于，包括以下步驟 A.以含待捕獲核酸片段的核酸分子為原料，利用生物素標記的擴增引物或接頭元件制備生物素標記的捕獲探針； B.使生物素標記的捕獲探針與待捕獲核酸片段庫雜交，利用含鏈霉親和素或親和素標記的固相載體捕獲所述待捕獲核酸片段。
2.根據(jù)權利要求I所述的捕獲核酸片段的方法，其特征在于，所述步驟B包括以下步驟 BOl.利用含鏈霉親和素或親和素標記的固相載體捕獲步驟A中的生物素標記的捕獲探針，得固定在固相載體上的捕獲探針； B02.使固定在固相載體上的捕獲探針與待捕獲核酸片段庫雜交得第一次雜交產(chǎn)物，分離純化第一次雜交產(chǎn)物得含固相載體的第一產(chǎn)物； B03.使步驟B02得到的產(chǎn)物變性，得第一次捕獲產(chǎn)物。
3.根據(jù)權利要求2所述的捕獲核酸片段的方法，其特征在于，在所述步驟B03之后還包括以下步驟 B04.利用在步驟BOl中得到的固定在固相載體上的捕獲探針與步驟B03所得的第一次捕獲產(chǎn)物雜交得第二次雜交產(chǎn)物，分離純化第二次雜交產(chǎn)物得含固相載體的第二產(chǎn)物； B05.使步驟B04得到的產(chǎn)物變性，得第二次捕獲產(chǎn)物。
4.根據(jù)權利要求I至3中任一項所述的捕獲核酸片段的方法，其特征在于，所述步驟B中的雜交是在周期性震動中進行的。
5.根據(jù)權利要求I至3中任一項所述的捕獲核酸片段的方法，其特征在于，所述含待捕獲核酸片段的核酸分子為克隆載體庫；所述步驟A包括以下步驟 A01.使用限制性酶將克隆載體庫中的待捕獲核酸片段酶切下來，從而獲得DNA模板； A02.片段化DNA模板，得DNA模板片段化產(chǎn)物； A03. DNA模板片段化產(chǎn)物與生物素標記的接頭元件連接，得生物素標記的捕獲探針。
6.根據(jù)權利要求I所述的捕獲核酸片段的方法，其特征在于，所述含待捕獲核酸片段的核酸分子為克隆載體庫；所述步驟A包括以下步驟 All.使用限制性酶將克隆載體庫中的待捕獲核酸片段酶切下來，從而獲得DNA模板； A12.片段化DNA模板，得DNA模板片段化產(chǎn)物； A13. DNA模板片段化產(chǎn)物與接頭元件連接，得含接頭的DNA模板片段； A14.利用生物素標記的擴增引物對步驟A13的產(chǎn)物進行PCR擴增，得生物素標記的捕獲探針。
7.根據(jù)權利要求I至3中任一項所述的捕獲核酸片段的方法，其特征在于，所述步驟A之前還包括步驟 A00.以基因組DNA為模板，利用用于特異性擴增待捕獲核酸片段的引物對進行PCR擴增，得含待捕獲核酸片段的核酸分子。
8.根據(jù)權利要求I所述的捕獲核酸片段的方法，其特征在于，所述步驟A包括以下步驟 A21.片段化含待捕獲核酸片段的核酸分子，得片段化產(chǎn)物； A22.片段化產(chǎn)物與接頭元件連接，得含接頭的核酸片段；A23.利用生物素標記的擴增引物對步驟A22的產(chǎn)物進行PCR擴增，得生物素標記的捕獲探針。
9.根據(jù)權利要求I至3中任一項所述的捕獲核酸片段的方法，其特征在于，所述步驟A包括以下步驟 A31.片段化含待捕獲核酸片段的核酸分子，得片段化產(chǎn)物； A32.片段化產(chǎn)物與生物素標記的接頭元件連接，得生物素標記的捕獲探針。
10.根據(jù)權利要求6或8所述的捕獲核酸片段的方法，其特征在于，所述的接頭元件為分叉接頭。
11.根據(jù)權利要求7所述的捕獲核酸片段的方法，其特征在于，所述用于特異性擴增待捕獲核酸片段的引物對包括SEQ ID NO:l和SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3和SEQ ID NO: 4,SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO:11 和 SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13 和 SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15 和 SEQ IDNO: 16、SEQ ID NO: 17 和 SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19 和 SEQ ID NO: 20 中的至少一對。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程及分子生物學領域，提供了一種捕獲核酸片段的方法。所述方法包括以下步驟A.以含待捕獲核酸片段的核酸分子為原料，利用生物素標記的擴增引物或接頭元件制備捕獲探針；B.使捕獲探針與待捕獲核酸片段庫雜交，利用含鏈霉親和素或親和素標記的固相載體捕獲所述待捕獲核酸片段。本發(fā)明的捕獲核酸片段的方法能夠避免因為捕獲探針的均一性差而導致的捕獲效果差的現(xiàn)象的發(fā)生，并降低捕獲核酸片段的成本。
文檔編號C12N15/10GK102827830SQ201210286589
公開日2012年12月19日 申請日期2012年8月14日 優(yōu)先權日2012年8月14日
發(fā)明者盛司潼 申請人:盛司潼