專利名稱：灰綠霉素和綠灰霉素的生物合成基因簇及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物基因工程領(lǐng)域,具體涉及一組鏈陽菌素(streptogramin),灰綠霉素(griseoviridin)和綠灰霉素(viridogrisein)生物合成基因簇及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鏈陽菌素類化合物是一類主要由鏈霉菌代謝合成的抗生素，與臨床上常見的許多抗生素不同，這類型抗生素主要由兩種結(jié)構(gòu)上完全不同的化合物協(xié)同發(fā)揮功效，它們分別命名為類型A和類型B，其中A型抗生素是一類環(huán)狀不飽和大環(huán)內(nèi)酯而B型抗生素是一類六元或七元環(huán)脂肽。最早人們發(fā)現(xiàn)陸生灰綠鏈霉菌Streptomyces griseoviridis NRRL 2427產(chǎn)生一組鏈陽菌素類化合物，它們分別是屬于A類型的灰綠霉素，其結(jié)構(gòu)式如圖I所示和B類型的綠灰霉素，其結(jié)構(gòu)式如圖I所示，后者又叫做宜它霉素(etamycin)。單一的A型或B型抗生素僅具有一定程度的抑菌效果，但當(dāng)二者聯(lián)合應(yīng)用后，能表現(xiàn)出明顯的協(xié)同效應(yīng)且具有廣譜抗菌效果。它們的抗菌機(jī)制為作用于細(xì)菌的50S核糖體亞基的不同位點(diǎn)，干擾細(xì)菌蛋白合成的延伸階段，其中A類抗生素抑制氨酰tRNA與核糖體的結(jié)合，同時(shí)抑制肽鍵的形成；而B類抗生素加速肽酰tRNA的釋放從而阻斷了多肽鏈的進(jìn)一步合成。當(dāng)細(xì)菌翻譯過程中，A類抗生素結(jié)合于核糖體大亞基后，會(huì)促進(jìn)核糖體的構(gòu)型變化增強(qiáng)B類抗生素的親和力，因此AB兩類化合物的協(xié)同作用活性能比單獨(dú)作用提高100倍以上。鏈陽菌素類抗生素能夠?qū)挂恍O端抗藥菌，越來越弓I起人們的重視。藥物合成化學(xué)家已經(jīng)開展了對(duì)鏈陽菌素類抗生素的化學(xué)合成和結(jié)構(gòu)修飾工作，已經(jīng)完成了灰綠霉素，維及霉素M2 (virginiamycin M2)和馬杜霉素II (madumycinII)這一類具有挑戰(zhàn)性的聚酮-聚肽類大環(huán)內(nèi)酯化合物的化學(xué)全合成研究，但收率較低。另外通過化學(xué)修飾原霉素I A和原霉素II A獲得的奎奴普丁(quinupristin)和達(dá)福普汀(dalfopristin)，已經(jīng)開發(fā)成藥物，二者協(xié)同應(yīng)用能夠有效的抑制一些萬古霉素(vancomycin)抗性菌及其他一些革蘭氏陽性菌，使得鏈陽菌素類抗生素的研究得到不斷深入而成為新藥開發(fā)的一大熱點(diǎn)。生物合成和組合生物合成是上世紀(jì)末發(fā)展起來的重要的生物技術(shù)，近年來隨著基因組學(xué)研究的快速進(jìn)步，新的高通量基因測序技術(shù)的出現(xiàn)，λ -RED基因重組技術(shù)和高效異源表達(dá)技術(shù)的發(fā)展，組合生物合成技術(shù)獲得迅速發(fā)展，給化學(xué)學(xué)科創(chuàng)造新化合物等方面帶來新的契機(jī)?？股氐纳锖铣苫蛲ǔＮ挥谌旧wDNA或者巨型質(zhì)粒上，主要由結(jié)構(gòu)基因、調(diào)控基因和抗性基因組成，往往成簇排列，少有例外。組合生物合成是實(shí)現(xiàn)化合物結(jié)構(gòu)多樣化的重要途徑，通過分析相關(guān)的生物合成基因簇，獲得相應(yīng)代謝途徑信息，了解關(guān)鍵酶，底物和產(chǎn)物，可以較為系統(tǒng)的獲得相關(guān)化合物的代謝信息。再通過遺傳操作進(jìn)行基因阻斷、置換或重組，有目的地對(duì)基因簇進(jìn)行改造，從而利用生物技術(shù)手段生產(chǎn)“非天然”的天然化合物，為新藥開發(fā)提供化學(xué)實(shí)體。獲得的微生物突變株可以開發(fā)成優(yōu)良的工程菌，為日后的工業(yè)化生產(chǎn)打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。利用不斷發(fā)展的生物合成和組合生物技術(shù)，人們對(duì)越來越多的復(fù)雜抗生素進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾和改造，獲得了一系列新結(jié)構(gòu)衍生物，有些生物活性優(yōu)于或跟母體化合物相當(dāng)。近年來隨著微生物基因組測序、生物信息學(xué)分析及信息數(shù)據(jù)庫的發(fā)展，大大縮短了抗生素生物合成和組合生物合成的研究周期及成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種灰綠霉素和綠灰霉素的生物合成基因簇。 本發(fā)明的灰綠霉素和綠灰霉素的生物合成基因簇來源于鏈霉素Streptomycesgriseoviridis NRRL 2427，其特征在于該生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO. I的第1353(Tl 18200位的堿基序列所示，包含36個(gè)基因，具體為(I)負(fù)責(zé)灰綠霉素大環(huán)內(nèi)酯骨架合成和后修飾的基因，即sgvEl、sgvE2、sgvE3、sgvE4、sgvE5、sgvE6、sgvQ 和 sgvP 共 8 個(gè)基因sgvEl位于基因簇核苷酸序列(SEQ ID NO. 1，下同)第64158-77825個(gè)堿基處，長度為13668個(gè)堿基對(duì)，編碼雜合的聚酮合酶與非核糖體肽合成酶，4555個(gè)氨基酸；sgvE2位于基因簇核苷酸序列第77828-84568個(gè)堿基處，長度為6741個(gè)堿基對(duì)，編碼雜合的聚酮合酶與非核糖體肽合成酶，2246個(gè)氨基酸；sgvE3位于基因簇核苷酸序列第84740-91246個(gè)堿基處，長度為6507個(gè)堿基對(duì)，編碼雜合的聚酮合酶與非核糖體肽合成酶，2168個(gè)氨基酸； sgvE4位于基因簇核苷酸序列第91257-99092個(gè)堿基處，長度為7836個(gè)堿基對(duì)，編碼雜合的聚酮合酶與非核糖體肽合成酶，2611個(gè)氨基酸；sgvE5位于基因簇核苷酸序列第99089-104953個(gè)堿基處，長度為5865個(gè)堿基對(duì)，編碼雜合的聚酮合酶與非核糖體肽合成酶，1954個(gè)氨基酸；sgvE6位于基因簇核苷酸序列第105894-108320個(gè)堿基處，長度為2427個(gè)堿基對(duì)，編碼非核糖體肽合成酶，808個(gè)氨基酸；SgvQ位于基因簇核苷酸序列第104950-105900個(gè)堿基處，長度為951個(gè)堿基對(duì)，編碼?；D(zhuǎn)移酶，316個(gè)氨基酸；sgvP位于基因簇核苷酸序列第62773-63963個(gè)堿基處，長度為1191個(gè)堿基對(duì)，編碼P450家族的單氧化酶，396個(gè)氨基酸；(2)負(fù)責(zé)綠灰霉素環(huán)脂肽骨架合成的基因，即sgvDl、sgvD2、sgvD3、sgvD4共4個(gè)
基因sgvDl位于基因簇核苷酸序列第29782-31404個(gè)堿基處，長度為1623個(gè)堿基對(duì)，編碼3-羥基吡啶甲酸AMP連接酶，540個(gè)氨基酸；sgvD2位于基因簇核苷酸序列第19073-26989個(gè)堿基處，長度為7917個(gè)堿基對(duì)，編碼非核糖體肽合成酶，2638個(gè)氨基酸；sgvD3位于基因簇核苷酸序列第51851-56554個(gè)堿基處，長度為4704個(gè)堿基對(duì)，編碼非核糖體肽合成酶，1567個(gè)氨基酸；sgvD4位于基因簇核苷酸序列第34683-51854個(gè)堿基處，長度為17172個(gè)堿基對(duì)，編碼非核糖體肽合成酶，5723個(gè)氨基酸；(3)編碼Y-butyrolactone(GBL) Y-丁內(nèi)酯類化合物合成蛋白和受體蛋白的相關(guān)基因，即sgvA、sgvB、sgvC、sgvK共4個(gè)基因SgvA位于基因簇核苷酸序列第115710-116678個(gè)堿基處，長度為969個(gè)堿基對(duì)，編碼AfsA類Y - 丁內(nèi)酯生物合成蛋白，322個(gè)氨基酸；SgvB位于基因簇核苷酸序列第116703-117386個(gè)堿基處，長度為684個(gè)堿基對(duì)，編碼Y-丁內(nèi)酯受體蛋白，227個(gè)氨基酸；sgvC位于基因簇核苷酸序列第117511-118200個(gè)堿基處，長度為690個(gè)堿基對(duì)，編碼磷酸酶，229個(gè)氨基酸；SgvK位于基因簇核苷酸序列第114756-115520個(gè)堿基處，長度為765個(gè)堿基對(duì)，編碼酮體還原酶，254個(gè)氨基酸。(4)編碼調(diào)控子蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)子的基因，即sgvRl、sgvR2、sgvR3、sgvTl、sgvT2、sgvT3共6個(gè)基因sgvRl位于基因簇核苷酸序列第113627-114274個(gè)堿基處，長度為648個(gè)堿基對(duì)，編碼TetR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白，215個(gè)氨基酸；sgvR2位于基因簇核苷酸序列第112395-113237個(gè)堿基處，長度為843個(gè)堿基對(duì)，編碼SARP家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白，280個(gè)氨基酸；sgvR3位于基因簇核苷酸序列第13530-14696個(gè)堿基處，長度為1167個(gè)堿基對(duì)，編碼SARP家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白，388個(gè)氨基酸；SgvTl位于基因簇核苷酸序列第14816-16408個(gè)堿基處，長度為1593個(gè)堿基對(duì)，編碼主要協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，530個(gè)氨基酸；sgvT2位于基因簇核苷酸序列第60959-62614個(gè)堿基處，長度為1656個(gè)堿基對(duì)，編碼ABC家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，551個(gè)氨基酸；sgvT3位于基因簇核苷酸序列第108570-109964個(gè)堿基處，長度為1395個(gè)堿基對(duì)，編碼EmrB/QacA亞家族藥物抗性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，464個(gè)氨基酸；(5)編碼綠灰霉素前體合成蛋白的基因,包括sgvG、sgvM、sgvL、sgvN4個(gè)基因sgvG位于基因簇核苷酸序列第16726-17847個(gè)堿基處，長度為1122個(gè)堿基對(duì)，編碼支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶，373個(gè)氨基酸；sgvM位于基因簇核苷酸序列第17916-18935個(gè)堿基處，長度為1020個(gè)堿基對(duì)，編碼甲基轉(zhuǎn)移酶，339個(gè)氨基酸；sgvL位于基因簇核苷酸序列第31408-32709個(gè)堿基處，長度為1302個(gè)堿基對(duì)，編碼L-賴氨酸2-氨基轉(zhuǎn)移酶,433個(gè)氨基酸；SgvN位于基因簇核苷酸序列第33036-34343個(gè)堿基處，長度為1308個(gè)堿基對(duì)，編碼苯乙酰輔酶A雙氧化酶，435個(gè)氨基酸；(6)編碼脫氫酶相關(guān)基因，包括sgvHl、sgvH2、sgvH3共3個(gè)基因SgvHl位于基因簇核苷酸序列第57108-58265個(gè)堿基處，長度為1158個(gè)堿基對(duì)，編碼支鏈α酮酸脫氫酶Ela亞基，385個(gè)氨基酸；sgvH2位于基因簇核苷酸序列第58262-59317個(gè)堿基處，長度為1056個(gè)堿基對(duì)，編碼支鏈a酮酸脫氫酶El β亞基，351個(gè)氨基酸；sgvH3位于基因簇核苷酸序列第59323-60720個(gè)堿基處，長度為1398個(gè)堿基對(duì)，編碼支鏈a酮酸脫氫酶E2,465個(gè)氨基酸；(7)編碼灰綠霉素和綠灰霉素生物合成過程修復(fù)與綠灰霉素調(diào)節(jié)基因，SgvI和SgVj共2個(gè)基因
sgvl位于基因簇核苷酸序列第27311-28057個(gè)堿基處，長度為747個(gè)堿基對(duì)，編碼II型硫酯酶，248個(gè)氨基酸；SgvJ位于基因簇核苷酸序列第34358-34609個(gè)堿基處，長度為252個(gè)堿基對(duì)，編碼含MbtH結(jié)構(gòu)域的蛋白，83個(gè)氨基酸；(8)其它功能尚未明確的蛋白，sgvF、sgvU、sgvO、sgvY、sgvS等5個(gè)基因sgvF位于基因簇核苷酸序列第28052-29134個(gè)堿基處，長度為1083個(gè)堿基對(duì)，編碼含F(xiàn)AD (黃素)依賴的氧化還原酶，360個(gè)氨基酸；sgvU位于基因簇核苷酸序列第29368-29613個(gè)堿基處，長度為246個(gè)堿基對(duì)，編碼未知功能蛋白，81個(gè)氨基酸；sgvO位于基因簇核苷酸序列第32763-32951個(gè)堿基處，長度為189個(gè)堿基對(duì)，編碼4-草酰巴豆酯互變異構(gòu)酶，62個(gè)氨基酸；SgvY位于基因簇核苷酸序列第109996-110889個(gè)堿基處，長度為894個(gè)堿基對(duì)，鏈陽菌素B裂合酶，297個(gè)氨基酸；sgvS位于基因簇核苷酸序列第111137-112285個(gè)堿基處，長度為1149個(gè)堿基對(duì)，編碼肌氨酸氧化酶,382個(gè)氨基酸。(9)灰綠霉素和綠灰霉素生物合成基因簇的上下游基因，即orf(-10)至orf(-1)和 orf (+1) orf (+4)共 14 個(gè)基因orf (-10)位于基因簇核苷酸序列第1_669個(gè)堿基處，長度為669個(gè)堿基對(duì)，編碼TetR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白，222個(gè)氨基酸；orf (-9)位于基因簇核苷酸序列第800-1558個(gè)堿基處，長度為759個(gè)堿基對(duì)，編碼短鏈脫氫酶，252個(gè)氨基酸；orf (-8)位于基因簇核苷酸序列第3674-5158個(gè)堿基處，長度為1485個(gè)堿基對(duì)，編碼內(nèi)-1，4-β-木聚糖酶，494個(gè)氨基酸；orf (-7)位于基因簇核苷酸序列第5768-6094個(gè)堿基處，長度為327個(gè)堿基對(duì)，編碼轉(zhuǎn)座酶，108個(gè)氨基酸；orf (-6)位于基因簇核苷酸序列第6130-6621個(gè)堿基處，長度為492個(gè)堿基對(duì)，編碼HxlR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白，163個(gè)氨基酸；orf (-5)位于基因簇核苷酸序列第6722-7213個(gè)堿基處，長度為492個(gè)堿基對(duì)，編碼未知蛋白，163個(gè)氨基酸；orf (-4)位于基因簇核苷酸序列第8067-8699個(gè)堿基處，長度為633個(gè)堿基對(duì)，編碼TetR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白，210個(gè)氨基酸；orf (-3)位于基因簇核苷酸序列第8820-10439個(gè)堿基處，長度為1620個(gè)堿基對(duì)，編碼ABC家族的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，539個(gè)氨基酸；orf (-2)位于基因簇核苷酸序列第10516-11322堿基處，長度為807個(gè)堿基對(duì)，編碼植烷輔酶A雙氧化酶，268個(gè)氨基酸；orf(-l)位于基因簇核苷酸序列第11746-13152個(gè)堿基處，長度為1407個(gè)堿基對(duì)，編碼HflX家族GTP結(jié)合蛋白，468個(gè)氨基酸；orf (+1)位于基因簇核苷酸序列第118937-119581個(gè)堿基處，長度為645個(gè)堿基對(duì)，編碼LuxR家族的雙組分系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白，編碼214個(gè)氨基酸；
orf (+2)位于基因簇核苷酸序列第119572-121527個(gè)堿基處，長度為1956個(gè)堿基對(duì)，編碼膜內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)組氨酸激酶，編碼651個(gè)氨基酸；orf (+3)位于基因簇核苷酸序列第121673-122668個(gè)堿基處，長度為996個(gè)堿基對(duì)，編碼BN家族的核糖核酸酶，編碼331個(gè)氨基酸；of (+4)位于基因簇核苷酸序列第122820-123563個(gè)堿基處，長度為744個(gè)堿基對(duì)，編碼2，3-雙羥苯甲酸AMP連接酶，編碼247個(gè)氨基酸。SEQ ID NO. I (序列表)所示序列的第13530 118200位的堿基序列的互補(bǔ)序列可根據(jù)DNA堿基互補(bǔ)原則隨時(shí)得到。且第1353(Γ118200位的的核苷酸序列或部分核苷酸序列可以通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或用合適的限制性內(nèi)切酶酶切相應(yīng)的DNA或DNA體外合成技術(shù)或使用其他合適的技術(shù)得到。本發(fā)明提供了得到至少包含部分SEQ ID NO. I所示序列的第13530 118200位中DNA序列的重組DNA載體的途徑。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生灰綠霉素和綠灰霉素生物合成基因被中斷或其他基因改造的途徑，至少其中之一的基因包含有SEQ ID NO. I所示序列的第1353(Γ118200位中的核苷酸序列。本發(fā)明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的方法或包含本發(fā)明SEQ ID NO. I所示序列的第13530 118200位的DNA作為探針以Southern雜交等方法從其他生物體中得到與灰綠霉素和綠灰霉素的生物合成基因簇相似的基因。包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆DNA可用于從鏈霉菌Streptomyces griseoviridis NRRL 2427基因組文庫中定位更多的文庫質(zhì)粒。這些文庫質(zhì)粒至少包含本發(fā)明中的部分序列，也包含有Streptomyces griseoviridis NRRL 2427基因組中鄰近區(qū)域未克隆的DNA。包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列可以被體內(nèi)體外修飾或進(jìn)行突變，包括插入、置換或缺失，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，錯(cuò)誤介導(dǎo)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，位點(diǎn)特異性突變，不同序列的重新連接，序列的不同部分或與其他來源的同源序列進(jìn)行定向進(jìn)化，或通過紫外線或化學(xué)試劑誘變等。包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因可以通過合適的表達(dá)體系在外源宿主中表達(dá)以得到相應(yīng)的酶或其他更高的生物活性物質(zhì)或產(chǎn)量。這些外源宿主包括大腸桿菌、鏈霉菌、小單孢菌、假單孢菌、芽孢桿菌、酵母、植物和動(dòng)物等。本發(fā)明所提供的氨基酸序列可以用來分離所需要的蛋白并可用于抗體的制備。包含本發(fā)明所提供的氨基酸序列或至少部分序列的多肽可能在去除或替代某些氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物學(xué)活性，或者提高了產(chǎn)量或優(yōu)化了蛋白動(dòng)力學(xué)特征或其他致力于得到的性質(zhì)。包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以在異源宿主中表達(dá)并了解它們?cè)谒拗鞔x中的功能。包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以通過遺傳重組來構(gòu)建重組載體以獲得新型生物合成途徑，也可以通過插入、置換、缺失或失活進(jìn)而獲得其他新型生物合成途徑或者產(chǎn)生新的化合物。包含DNA片段或基因可以用來提高灰綠霉素和綠灰霉素或其衍生物的產(chǎn)量，本發(fā)明提供了在基因工程微生物中提高產(chǎn)量的途徑。
本發(fā)明還提供了灰綠霉素和綠灰霉素的生物合成基因簇在制備灰綠霉素或/和綠灰霉素及其類似物中的應(yīng)用?？傊?，本發(fā)明所提供的包含灰綠霉素和綠灰霉素生物合成相關(guān)的所有基因和蛋白信息，可以幫助人們理解廈霉素家族天然產(chǎn)物的生物合成機(jī)制，為進(jìn)一步遺傳改造提供了材料和知識(shí)。本發(fā)明所提供的基因及其蛋白質(zhì)也可以用來尋找和發(fā)現(xiàn)可用于醫(yī)藥、工業(yè)或農(nóng)業(yè)的化合物或基因、蛋白。本發(fā)明的灰綠鏈霉菌Streptomyces griseoviridis NRRL 2427屬于現(xiàn)有技術(shù)中的已知菌株，在美國專利(U. S3, 023, 204)公開過，該菌株保藏于美國農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心(Agricultural Research Service Culture Collection,NRRL),保藏號(hào)為NRRL 2427。


圖I是灰綠霉素(GV)和綠灰霉素(VG)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。圖 2 是 Streptomyces griseoviridis NRRL 2427 中灰綠霉素和綠灰霉素生物合成基因簇Regulation/repari調(diào)控和修復(fù)基因！Resistance抗性基因；Gamma_butyrolactone biosynthesis Y -丁內(nèi)酯類化合物生物合成基因；VGbiosynthesis NRPS綠灰霉素生物合成中非核糖體妝合成酶；GV biosynthesis HybirdPKS/NRPS灰綠霉素生物合成中的雜合的聚酮合酶和非核糖體肽合成酶；VG biosynthesisprecursor biosynthesis綠灰霉素生物合成前體單兀生物合成基因；GV biosynthesistailor enzyme灰綠霉素環(huán)內(nèi)C-S鍵催化酶；Boundary邊界基因；Unknown未知功能基因。圖3是灰綠霉素推測的生物合成途徑。圖4是綠灰霉素推測的生物合成途徑。圖5 是 Streptomyces griseoviridis NRRL 2427 內(nèi) Y - 丁內(nèi)酯類化合物推測的生物合成途徑。圖6是部分基因遺傳改造后鏈霉菌Streptomyces griseoviridis NRRL 2427中灰綠霉素和綠灰霉素生物合成基因簇得到的突變株在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵的發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC 分析圖1 野生型 Streptomyces griseoviridis NRRL 2427 ；II 突變株Λ sgvDl ；III突變株Λ sgvL ；IV突變株Λ sgvN ；V突變株Λ sgvj ；VI突變株Λ sgvl ;VII突變株Λ sgvE5 ；VIII突變株Λ sgvQ ;ΙΧ突變株Λ sgvE6 ;Χ突變株Λ sgvY。 表示灰綠霉素，▲表示綠灰霉素。圖7是灰綠霉素和綠灰霉素生物合成調(diào)控相關(guān)的基因遺傳改造后得到的突變株，及sgvA基因失活突變株和回補(bǔ)菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵的發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC分析圖1野生型 Streptomyces griseoviridis NRRL 2427 ;II 突變株Λ sgvA ;III 突變株Λ sgvA 遺傳回補(bǔ)菌株Λ sgvA-C ；IV突變株Λ sgvB ；V突變株Λ sgvC ；VI突變株Λ sgvK ；VII突變株Δ sgvRl ；VIII突變株sgvR2 ；IX突變株Λ sgvR3。 表示灰綠霉素，▲表示綠灰霉素。圖8是SgvN基因遺傳得到的突變株發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵及喂養(yǎng)后的HPLC分析圖I突變株Λ SgvN5II突變株Λ sgvN喂養(yǎng)了 L-Phg ；111突變株Λ sgvN喂養(yǎng)了 D-Phg ；IV突變株Λ sgvDl 喂養(yǎng)了 L-Phg ；V 突變株Λ sgvDl 喂養(yǎng)了 D-Phg ；VI 野生型 Streptomycesgriseoviridis NRRL2427。 表示灰綠霉素，▲表示綠灰霉素。圖9 是鏈霉菌 Streptomyces griseoviridis NRRL 2427 野生菌或突變株 RNA 抽
8提及 RT-PCR 分析。Wild type 野生型 Streptomyces griseoviridis NRRL 2427。 表不灰綠霉素，▲表不綠灰霉素。圖10是灰綠霉素和綠灰霉素生物合成合成基因簇邊界基因的確定1野生型Streptomyces griseoviridis NRRL 2427 ;II 突變株Λ orf (-10) ;III 突變株Λ orf (-9)；IV 突變株Λ orf (-8) ;V 突變株Λ orf (-6) ;VI 突變株Λ orf(-5) ;VII 突變株Λ orf(-4)；VIII 突變株Λ orf (-3) ;IX 突變株Λ orf (-2) ;Χ 突變株Λ orf (+1) ;ΧΙ 突變株Λ orrf (+2)；XII突變株Aorf(+3) ;ΧΙΙI突變株Λ orf(+4)。 表示灰綠霉素，▲表示綠灰霉素。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。I.鏈霉菌Streptomyces griseoviridis NRRL 2427基因組序列掃描及灰綠霉素和綠灰霉素的生物合成基因簇序列分析和功能分析通過對(duì)鏈霉菌Streptomyces griseoviridis NRRL 2427進(jìn)行全基因組掃描和注釋，在其中找到了 105kb的灰綠霉素和綠灰霉素的生物合成基因簇，包含了 36個(gè)開放閱讀框(open reading frames, ORFs)(表 I)。根據(jù)生物信息學(xué)分析，其中 sgvEl、sgvE2、sgvE3、sgvE4、sgvE5、sgvE6、sgvQ和sgvP共8個(gè)基因可能參與灰綠霉素合成，灰綠霉素的生物合成途徑初步確定如下(圖3)。sgvDl、sgvD2、sgvD3、sgvD4共4個(gè)基因負(fù)責(zé)綠灰霉素的生物合成，其合成途徑初步確定如下(圖4)。sgvA、sgvB、sgvC、sgvK共4個(gè)基因負(fù)責(zé)編碼調(diào)控灰綠霉素和綠灰霉素生產(chǎn)的Y-丁內(nèi)酯類化合物的合成基因，其相關(guān)合成途徑確定如下(圖5)。sgvRl、sgvR2、sgvR3、sgvTl、sgvT2、sgvT3這六個(gè)基因負(fù)責(zé)編碼灰綠霉素和綠灰霉素的生產(chǎn)調(diào)控基因和相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。sgvG、sgvM、sgvL、sgvN共4個(gè)基因負(fù)責(zé)綠灰霉素骨架的前體單元的合成基因的編碼。此外還有一系列催化酶的編碼基因，包括三個(gè)脫氫酶的編碼基因sgvHl、sgvH2、sgvH3,和五個(gè)其它蛋白編碼基因sgvF、sgvU、sgvO、sgvY、sgvS。另外還發(fā)現(xiàn)了負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)綠灰霉素生產(chǎn)的sgvj和編碼對(duì)灰綠霉素和綠灰霉素生物合成中進(jìn)行修復(fù)調(diào)節(jié)蛋白的基因sgvl。表I :灰綠霉素和綠灰霉素生物合成基因簇的基因及其功能分析
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權(quán)利要求
1.一種灰綠霉素和綠灰霉素的生物合成基因簇，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO. I的第13530 118200位的堿基序列所示。
2.權(quán)利要求I所述的灰綠霉素和綠灰霉素的生物合成基因簇在制備灰綠霉素或/和綠灰霉素及其類似物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種灰綠霉素和綠灰霉素的生物合成基因簇及其應(yīng)用。其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第13530～118200位所示，包含36個(gè)基因，負(fù)責(zé)灰綠霉素大環(huán)內(nèi)酯骨架合成和后修飾的基因；負(fù)責(zé)綠灰霉素環(huán)脂肽骨架合成的基因；編碼γ-丁內(nèi)酯類化合物合成蛋白和受體蛋白的相關(guān)基因；編碼調(diào)控子蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)子的基因；編碼綠灰霉素前體合成蛋白的基因；編碼脫氫酶相關(guān)基因；編碼灰綠霉素和綠灰霉素生物合成過程修復(fù)與綠灰霉素調(diào)節(jié)基因；其它功能尚未明確的蛋白。
文檔編號(hào)C12N15/61GK102911957SQ20121028493
公開日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2012年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月10日
發(fā)明者鞠建華, 謝運(yùn)昌 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院南海海洋研究所