專利名稱：用普魯士藍(lán)平板定量測(cè)定l-氨基酸氧化酶活力的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及L-氨基酸氧化酶活力測(cè)試方法，特別涉及一種利用普魯士藍(lán)瓊脂平板定量檢測(cè)L-氨基酸氧化酶活力的方法。
背景技術(shù)：
L-氛基酸氧化酶(L-amino acid oxidase,簡(jiǎn)稱 LAA0,酶學(xué)編號(hào)為ECl. 4. 3. 2)是一種以黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)或單核苷酸(FMN)為輔基的黃素蛋白酶。此酶能夠特異性催化L-氨基酸的氧化脫氨生成α -酮酸、氨和過(guò)氧化氫。因此，它能被應(yīng)用于L-氨基酸定量分析、LD-氨基酸的拆分和α-酮酸的制備。近年來(lái)有文獻(xiàn)報(bào)道了 LAAO本身具有抗菌、殺蟲(chóng)、抗病毒等生物活性，還具有與血小板相互作用、細(xì)胞毒性及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有極其廣闊的應(yīng)用前景?！?br> LAAO被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于微生物、蛇毒、魚(yú)的表皮粘液、老鼠、海兔子等多種生物體中。目前檢測(cè)LAAO活性的常用方法有2種，即熒光法和分光光度法。這2種方法均是依據(jù)測(cè)定由LAAO催化底物所生成的H2O2變化量來(lái)實(shí)現(xiàn)的。熒光法是依據(jù)酶促反應(yīng)產(chǎn)生的H2O2可使無(wú)熒光性的高香草酸等物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)橛袕?qiáng)烈熒光的物質(zhì)，根據(jù)反應(yīng)體系熒光值的變化來(lái)測(cè)定LAAO酶活。此方法雖然測(cè)定精確度、靈敏度都較高，但熒光壽命短，容易淬滅，操作時(shí)需避免長(zhǎng)時(shí)間暴露于光和空氣中，而且蛋白質(zhì)中某些氨基酸對(duì)其干擾較大。分光光度法是依據(jù)酶促反應(yīng)產(chǎn)生的H2O2可作用于色素原物質(zhì)而使其在一定波長(zhǎng)下產(chǎn)生吸光值，根據(jù)反應(yīng)體系吸光值的變化來(lái)測(cè)定LAAO酶活。此方法對(duì)設(shè)備要求低，反應(yīng)快，操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，且價(jià)格便宜，具有明顯的優(yōu)勢(shì)，因此分光光度法是目前測(cè)定LAAO活性的最常用方法° MacHeroux 等(MacHeroux P, Seth O, Bollschweiler C，et al. L-Amino acidoxidase from the Malayan pit viper Calloselasma rhodostoma. Comparative sequenceanalysis and charaterization of active and inactive forms ofthe enzyme. Eur JBiochem, 2001, 268:1679-1686.)以鄰聯(lián)茴香胺(ODA)為偶聯(lián)探針，用分光光度法測(cè)定不同蛇毒LAAO的活性。結(jié)果表明，測(cè)定方法具有較好的穩(wěn)定性。陳洲等(陳洲，黃劍鈞，薛玲，等.眼鏡蛇毒L-氨基酸氧化酶活性檢測(cè)方法的優(yōu)化.海峽藥學(xué)，2009，21 (5) :29-31.)采用鄰聯(lián)茴香胺、鄰苯二胺(OPD)和3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)三種供氫體測(cè)定LAAO的活性并比較其靈敏度和重復(fù)性，結(jié)果表明鄰苯二胺方法測(cè)定LAAO酶活性具有較好的靈敏度和穩(wěn)定性。以上的這些方法主要是用來(lái)定性地檢測(cè)LAA0，而建立一種既簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定和靈敏，又能定性并定量檢測(cè)LAAO活力的方法，將具有極重要的研究和應(yīng)用價(jià)值。目前，定性及定量檢測(cè)LAAO的方法主要是商品化的H2O2檢測(cè)試劑盒,如美國(guó)Invitrogen公司的Amplex Red Hydrogen Peroxide/Peroxidase Assay kit。發(fā)明專利(余志良、喬華、裘娟萍.交替假單胞菌B3及其在生物氧化L-氨基酸中的應(yīng)用.申請(qǐng)?zhí)?01110336029. 3 ;申請(qǐng)日期2011-10-28.)也用 Amplex Red Hydrogen Peroxide/Peroxidase Assay kit 試劑盒篩選到一株產(chǎn)LAAO的交替假單胞菌B3 (菌種保藏號(hào)為CGMCC NO. 5353)。雖然，該試劑盒比較靈敏、穩(wěn)定，被廣泛使用，但是，其對(duì)設(shè)備要求高，操作復(fù)雜，價(jià)格極其昂貴(每個(gè)反應(yīng)大約要幾十元人民幣)。2OO7 年，Saito 等(Saito M, et al. A Noval Agar Medium to Detect HydrogenPeroxide-Producing Bacteria Based on the Prussion Blue-Forming Reaction.Microbiol Immunol, 2007, 51(9) :889-892.)創(chuàng)建了一種新的簡(jiǎn)易的檢測(cè)H2O2的方法來(lái)運(yùn)用于檢測(cè)LAA0,即普魯士藍(lán)瓊脂平板法(Prussian Blue Agar),該方法是基于Fe3+和鐵氰化鉀混合液與H2O2通過(guò)氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生藍(lán)色沉淀的原理檢測(cè)LAA0，能夠產(chǎn)生H2O2的菌株培養(yǎng)在含有該混合液的培養(yǎng)基上能產(chǎn)生藍(lán)色菌落，不能產(chǎn)生H2O2的菌株則不會(huì)產(chǎn)生藍(lán)色菌落而只表現(xiàn)其原本的形態(tài)特征，通過(guò)菌落顏色的改變可以判斷出菌株是否能夠產(chǎn)生LAA0，而且該Fe3+和鐵氰化鉀混合液對(duì)于培養(yǎng)基的種類沒(méi)有嚴(yán)格的限制與要求，可以與所需的培養(yǎng)基進(jìn)行混合培養(yǎng)，具有廣泛的適用性，而且，該方法極其方便、簡(jiǎn)單和經(jīng)濟(jì)。Saito等只建立了一種定性分析LAAO的方法，如何將其發(fā)展成為一種定量的LAAO活力檢測(cè)方法，顯得極為重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種用普魯士藍(lán)瓊脂平板定量檢測(cè)L-氨基酸氧化酶活力的方法，以及所述方法的PH適用性，該方法具有成本低，操作簡(jiǎn)單方便，適用性廣，穩(wěn)定性高等特點(diǎn)。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是用普魯士藍(lán)瓊脂平板定量檢測(cè)L-氨基酸氧化酶活力的方法為(I)普魯士藍(lán)瓊脂平板的制備將l(T30g/L氯化鐵水溶液與l(T30g/L鐵氰化鉀水溶液以體積比O. 2飛I混合制成混合液，然后將混合液與麗瓊脂液以體積比1:5 20混合搖勻，在115°C下滅菌30min,倒平板，制成所述普魯士藍(lán)瓊脂平板；所述麗瓊脂液終濃度組成為酵母膏O 10g/L、蛋白胨2 20g/L、瓊脂15 30g/L，pH 5 9，溶劑為水；(2) L-氨基酸氧化酶活力的測(cè)定取步驟(I)制得的普魯士藍(lán)瓊脂平板，用打孔器在所述普魯士藍(lán)瓊脂平板上打出直徑為riOmm的小孔，然后將小孔中加入待測(cè)液，室溫靜置l(T300min，待測(cè)液產(chǎn)生的過(guò)氧化氫在所述的小孔周圍形成藍(lán)色圈，測(cè)定藍(lán)色圈的直徑，根據(jù)過(guò)氧化氫與藍(lán)色圈直徑標(biāo)準(zhǔn)直線來(lái)確定過(guò)氧化氫釋放量，從而推論得L-氨基酸氧化酶活力；所述的過(guò)氧化氫與藍(lán)色圈直徑的標(biāo)準(zhǔn)直線是用步驟(2)同樣的普魯士藍(lán)瓊脂平板以梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)過(guò)氧化氫為測(cè)試樣品做與待測(cè)液平行試驗(yàn)取得的數(shù)據(jù)得到的標(biāo)準(zhǔn)濃度的過(guò)氧化氫與藍(lán)色圈直徑線性關(guān)系圖；所述待測(cè)液的制備方法為以交替假單胞菌B3 (Pseudoalteromonas sp. B3)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的酶為酶源，以待測(cè)L-氨基酸為底物，25 50°C，pH 5 9條件下反應(yīng)O. 5 2h，獲得的反應(yīng)液即為待測(cè)液；所述酶來(lái)自于交替假單胞菌B3發(fā)酵培養(yǎng)后獲得的含濕菌體發(fā)酵液離心棄去沉淀后獲得的上清液，所述L-氨基酸初始底物濃度為2 20mmol/L，所述上清液用量以含濕菌體發(fā)酵液中濕菌體質(zhì)量計(jì)為O. 5 IOmg濕菌體/mmol底物，所述含濕菌體發(fā)酵液是指離心前的含濕菌體發(fā)酵液；所述L-氨基酸氧化酶活力的定義為30°C下，ImL酶液作用底物濃度為5mmol/L的氨基酸Ih后釋放出lmmol/L過(guò)氧化氫即為I個(gè)酶活單位(U)。進(jìn)一步，所述氯化鐵水溶液優(yōu)選為15 25g/L，更優(yōu)選為20g/L ;鐵氰化鉀水溶液的質(zhì)量濃度優(yōu)選為15 25g/L，更優(yōu)選為20g/L。
進(jìn)一步，所述氯化鐵水溶液和鐵氰化鉀水溶液的體積配比優(yōu)選為O. 4 2. 5:1，更優(yōu)選為1:1。進(jìn)一步，所述MM瓊脂液終濃度組成優(yōu)選為酵母膏2 5g/L、蛋白胨3 7g/L、瓊脂18 25g/L，pH 6 8，溶劑為水；所述MM瓊脂液終濃度組成更優(yōu)選為酵母膏3g/L、蛋白胨5g/L、瓊脂20g/L, pH 7. 5，溶劑為水。進(jìn)一步，所述氯化鐵水溶液和鐵氰化鉀水溶液的混合液與麗瓊脂液體積配比優(yōu)選為1:7 15，更優(yōu)為1:9。進(jìn)一步，所述打孔器打出小孔的直徑優(yōu)選為5 7_，更優(yōu)選為6mm。進(jìn)一步，所述每孔中加入的待測(cè)液為30 70 μ L，更優(yōu)選為50 μ L。進(jìn)一步,所述小孔加入待測(cè)液后室溫靜置15 60min,更優(yōu)選為30min。 進(jìn)一步，所述L-氨基酸為L(zhǎng)-亮氨酸(L-Leu)、L-精氨酸(L-Arg)、L-苯丙氨酸(L-Phe)、L-賴氨酸(L-Lys)、L-胱氨酸(L_cystine)、L-色氨酸(L-Trp)、L-甲硫氨酸(L-Met)、L-異売氨酸(L-Ile)、L-天冬酰胺(L-Asn)、L-聞苯丙氨酸(L-Hpa)、L-酪氨酸(L-Tyr)、L-苯甘氨醇(L-Phg)、L-天冬氨酸(L-Asp)、L-谷氨酸(L-Glu)、L-半胱氨酸(L-Cys)、L-纈氨酸(L-Val)、L-脯氨酸(L-Pro)、L_ 甘氨酸(L-Gly)、L_ 絲氨酸(L-Ser)和β -丙氨酸(β -Ala)，優(yōu)選為L(zhǎng)-亮氨酸、L-精氨酸、L-苯丙氨酸、L-賴氨酸、L-胱氨酸、L-色氨酸、L-甲硫氨酸、L-異亮氨酸、L-天冬酰胺、L-高苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-苯甘氨醇或L-纈氨酸。進(jìn)一步，所述酶源按如下步驟制備(I)斜面培養(yǎng)將交替假單胞菌B3接種于斜面培養(yǎng)基(即MM固體培養(yǎng)基)，20 37°C培養(yǎng)12 24h，獲得斜面菌體，所述斜面培養(yǎng)基終濃度組成為酵母膏I. 5 6g/L，蛋白胨2. 5 10g/L,海鹽15 45g/L，瓊脂15 25g/L，pH7 8，溶劑為水；(2)種子培養(yǎng)從斜面菌體挑取一接種環(huán)菌株接種至種子培養(yǎng)基(即MM液體培養(yǎng)基)，20 37°C培養(yǎng)18 24h，獲得種子液，所述種子培養(yǎng)基終濃度組成為酵母膏I. 5 6g/L，蛋白胨2. 5 10g/L,海鹽15 45g/L，pH 7 8，溶劑為水；(3)發(fā)酵培養(yǎng)將種子液以體積濃度I 10%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基(即MM液體培養(yǎng)基)，20 37°C培養(yǎng)48 120h，獲得發(fā)酵液，將發(fā)酵液經(jīng)8000 12000rpm，離心5 IOmin后，棄去沉淀，收集上清液，獲得所述酶源；所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為酵母膏I. 5 6g/L，蛋白胨2. 5 10g/L，海鹽15 45g/L，pH 7 8，溶劑為水。更進(jìn)一步，所述的交替假單胞菌B3產(chǎn)LAAO活力的測(cè)定方法為(I)普魯士藍(lán)瓊脂平板的制備將20g/L氯化鐵水溶液與20g/L鐵氰化鉀水溶液以體積比I: I混合制成混合液，然后將混合液與麗瓊脂液以體積比1:9混合搖勻，在115°C下滅菌30min，倒平板，制成所述普魯士藍(lán)瓊脂平板，用打孔器在上述普魯士藍(lán)瓊脂平板上打出直徑為6mm的小孔；所述MM瓊脂液終濃度組成為酵母膏3g/L、蛋白胨5g/L、瓊脂20g/L，pH 6. 8，溶劑為水；(2)L-氨基酸氧化酶活力的測(cè)定為以交替假單胞菌B3發(fā)酵培養(yǎng)后的含濕菌體發(fā)酵液離心獲得的上清液為酶源，以待測(cè)L-氨基酸為底物，在30°C，pH7. O的條件下反應(yīng)30min，使L-氨基酸氧化釋放出過(guò)氧化氫，獲得反應(yīng)液，即為待測(cè)液；取50 μ L反應(yīng)液加入到上述普魯士藍(lán)瓊脂平板的6mm小孔，室溫放置30min后，待測(cè)液產(chǎn)生的過(guò)氧化氫在所述的小孔周圍形成藍(lán)色圈，測(cè)定藍(lán)色圈的大小，根據(jù)過(guò)氧化氫與藍(lán)色圈直徑標(biāo)準(zhǔn)直線來(lái)確定過(guò)氧化氫釋放量，從而推論得L-氨基酸氧化酶活力；所述待測(cè)液的制備方法為以交替假單胞菌B3 (Pseudoalteromonas sp. B3)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的酶為酶源，以待測(cè)L-氨基酸為底物,25 50°C，pH 5 9條件下反應(yīng)O. 5 2h，獲得的反應(yīng)液即為待測(cè)液；所述酶來(lái)自于交替假單胞菌B3發(fā)酵培養(yǎng)后獲得的含濕菌體發(fā)酵液離心棄去沉淀后獲得的上清液，所述L-氨基酸初始底物濃度為5mmol/L，所述上清液用量以含濕菌體發(fā)酵液中濕菌體質(zhì)量計(jì)為4mg濕菌體/mmol底物。本發(fā)明中菌株B3所產(chǎn)生的L-氨基酸氧化酶是被分泌到細(xì)胞外的，因此，交替假單胞菌B3發(fā)酵培養(yǎng)后獲得的含濕菌體發(fā)酵液離心后去除菌體，獲得的上清液中含有酶，即酶源。所以本發(fā)明中以交替假單胞菌B3發(fā)酵液離心后獲得的上清液而不是濕菌體來(lái)進(jìn)行酶促反應(yīng)。所述上清液的用量以離心前含濕菌體發(fā)酵液中濕菌體的質(zhì)量來(lái)計(jì)。所述的過(guò)氧化氫濃度與藍(lán)色圈直徑大小的標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及方程擬合過(guò)程為配置濃度為 O. 5mmol/L> lmmol/L、2mmol/L、5mmol/L、10mmol/L、20mmol/L、25mmol/L 和 30mmol/L的過(guò)氧化氫標(biāo)準(zhǔn)水溶液；各取50 μ L以上不同濃度的過(guò)氧化氫水溶液,加入到普魯士藍(lán) 瓊脂平板的6mm小孔中，室溫放置30min后,測(cè)定藍(lán)色圈的大小；以過(guò)氧化氫濃度為橫坐標(biāo)(X)，藍(lán)色圈直徑為縱坐標(biāo)(Y)，用Origin作圖軟件繪制直線；由Origin軟件自動(dòng)擬合出X-Y之間的關(guān)系方程式Y(jié)=0. 561X+1. 068，其中R2=O. 993。交替假單胞菌B3 (Pseudoalteromonas sp. B3),保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，菌種保藏號(hào)為=CGMCC NO. 5353，保藏日期為2011年10月17日。所述交替假單胞菌B3已在先前的專利申請(qǐng)中進(jìn)行了保藏，申請(qǐng)?zhí)枮?011103360293。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明提供一種用普魯士藍(lán)瓊脂平板定量檢測(cè)L-氨基酸氧化酶活力的方法，以及所述方法的pH適用性為ρΗ4 12，該方法具有成本低，操作簡(jiǎn)單方便，適用性廣，穩(wěn)定性高等特點(diǎn)。


圖IpH對(duì)過(guò)氧化氫作用下普魯士藍(lán)瓊脂顯色的影響；圖2不同濃度過(guò)氧化氫作用下普魯士藍(lán)瓊脂平板的藍(lán)色圈大?。粓D3過(guò)氧化氫濃度和普魯士藍(lán)瓊脂平板的藍(lán)色圈直徑之間的擬合曲線及所擬合的方程式；圖4過(guò)氧化氫濃度和普魯士藍(lán)瓊脂平板的藍(lán)色圈直徑之間的標(biāo)準(zhǔn)直線及所擬合的方程式；圖5交替假單胞菌B3所產(chǎn)LAAO對(duì)L-Leu和L-Met的活力；圖6交替假單胞菌B3所產(chǎn)LAAO對(duì)20種常見(jiàn)氨基酸活力大小的比較。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例I普魯士藍(lán)瓊脂平板的制備稱取Ig的FeCl3 ·6Η20溶于50mL的水中，配置成溶液A ;稱取Ig的鐵氰化鉀(赤血鹽，K3Fe (CN)6)溶于50mL的水中，配置成溶液B ;將50mL的溶液A和50mL的溶液B混合搖勻，配成溶液C;配置900mL的MM瓊脂液(酵母膏3g/L，蛋白胨5g/L，瓊脂20g/L，pH 7.2，溶劑為水)，然后將IOOmL的溶液C與900mL的麗瓊脂液混合搖勻，于115°C下滅菌30min后，倒入培養(yǎng)皿配置普魯士藍(lán)瓊脂平板50塊；待瓊脂冷卻凝固后，用打孔器在普魯士藍(lán)瓊脂平板上打出直徑為6_的小孔(平板往往略顯淺綠色)。所述MM瓊脂液終濃度組成更優(yōu)選為酵母膏3g/L、蛋白胨5g/L、瓊脂20g/L，pH 7. 5，溶劑為水。實(shí)施例2過(guò)氧化氫于不同pH值下對(duì)普魯士藍(lán)瓊脂顯色性能的影響(1·6Ν的HCl水溶液和6Ν的NaOH水溶液分別配制pH為1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13和14的水溶液，用移液器分別移取50 μ L的上述pHl 14的水溶液，分別轉(zhuǎn)入實(shí)施例I方法制備的普魯士藍(lán)瓊脂平板的小孔內(nèi)(直徑6mm)，室溫(25°C)放置30min后觀察普魯士藍(lán)瓊脂顯色結(jié)果，見(jiàn)圖I第I行所示。 從圖I第I行可見(jiàn)，pH4情況下，普魯士藍(lán)瓊脂平板產(chǎn)生一個(gè)藍(lán)色小圈，隨著pH的下降，藍(lán)色圈變大，說(shuō)明普魯士藍(lán)瓊脂對(duì)PH4及以下pH值比較敏感；在pH5 8情況下，普魯士藍(lán)瓊脂平板沒(méi)有顏色變化；而在PH9 14情況下，有白偏黃的圈產(chǎn)生，這是因?yàn)樵趬A性條件下，平板中的三價(jià)鐵與氫氧根離子形成沉淀所致，隨著PH的增加，白偏黃的圈變大。(2)用水配制濃度為5mmol/L的過(guò)氧化氫水溶液(pH均為6),分別取50μ L,轉(zhuǎn)入實(shí)施例I方法制備的普魯士藍(lán)瓊脂平板的小孔內(nèi)(直徑6mm)，室溫放置30min后觀察普魯士藍(lán)瓊脂顯色結(jié)果(圖I第2行所示)，從圖I第2行可見(jiàn)，14個(gè)小孔周圍均形成了大小基本一致的藍(lán)色圈，這是因?yàn)樵谶^(guò)氧化氫作用下，鐵氰化鉀中的Fem(CN)63_變成了 Fe11 (CN)64_，然后與FeCl3中的Fe3+作用，形成了藍(lán)色物質(zhì)Fem4tFe 11 (CN)6]3，普魯士藍(lán)瓊脂可被用來(lái)檢測(cè)過(guò)氧化氫。(3)用6N的HCl水溶液和6N的NaOH水溶液混合水溶液調(diào)節(jié)過(guò)氧化氫水溶液的pH值分別為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14，并使過(guò)氧化氫水溶液的終濃度為5mmol/L，依次取50 μ L，轉(zhuǎn)入實(shí)施例I方法制備的普魯士藍(lán)瓊脂平板的小孔內(nèi)(直徑6mm)，室溫放置30min后觀察普魯士藍(lán)瓊脂顯色結(jié)果(圖I第3行所示)，從圖I第3行可見(jiàn)，當(dāng)pH為4 12情況下，普魯士藍(lán)瓊脂平板上均形成了大小基本一致的藍(lán)色圈，這是因?yàn)樵谶^(guò)氧化氫作用下形成了藍(lán)色物質(zhì)Fe1114 [Fe 11 (CN)丄；而在pH為I 3情況下，低pH值的背景干擾較大，影響對(duì)過(guò)氧化氫的檢測(cè)；雖然在pH為13下，也形成了藍(lán)色圈，但是，圈相對(duì)較??；而在pH為14下，沒(méi)有形成藍(lán)色圈，不能檢測(cè)過(guò)氧化氫；綜上可見(jiàn)，在pH為4 12情況下，普魯士藍(lán)瓊脂平板能被用來(lái)檢測(cè)過(guò)氧化氫。實(shí)施例3不同過(guò)氧化氫濃度下的普魯士藍(lán)瓊脂平板上的藍(lán)色圈直徑大小用水分別配制濃度為O. 5mmoI /I,、Immol /T,、2_o1 /T,.5mmo1 /I,、10mmol /T,、20_o1 /L、25mmol/L和30mmol/L的過(guò)氧化氫標(biāo)準(zhǔn)溶液(pH約為6)，各取50 μ L，轉(zhuǎn)入實(shí)施例I方法制備的普魯士藍(lán)瓊脂平板的6mm直徑小孔內(nèi)(每個(gè)過(guò)氧化氫濃度做三個(gè)平行)，室溫放置30min后觀察普魯士藍(lán)瓊脂顯色結(jié)果(圖2所示)。從圖2可見(jiàn)，不同濃度過(guò)氧化氫作用下，普魯士藍(lán)瓊脂平板均形成了藍(lán)色圈，實(shí)驗(yàn)的平行性較理想；而且，隨著過(guò)氧化氫濃度的增力口，藍(lán)色圈直徑隨之增加；當(dāng)過(guò)氧化氫濃度達(dá)到20mmol/L，藍(lán)色圈直徑基本達(dá)到最大，進(jìn)一步增加過(guò)氧化氫濃度，藍(lán)色圈直徑基本不再變化。用尺量取不同過(guò)氧化氫濃度下藍(lán)色圈大小(平行實(shí)驗(yàn)取平均值)，見(jiàn)表I所示。以過(guò)氧化氫濃度為橫坐標(biāo)，普魯士藍(lán)瓊脂平板的藍(lán)色圈直徑為縱坐標(biāo)，用Origin作圖軟件擬合曲線，結(jié)果如圖3所示，擬合曲線呈現(xiàn)指數(shù)形式；用作圖軟件自帶工具進(jìn)行方程式擬合后發(fā)現(xiàn)，方程式為Y=2. 451-2. 047/(l+(X/4. 571)° 491)，其中R2=O. 992，說(shuō)明擬合良好。在過(guò)氧化氫濃度為O. 5 20mmol/L范圍內(nèi)，以過(guò)氧化氫濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)(即X為IgC, C為過(guò)氧化氫濃度)，普魯士藍(lán)瓊脂平板的藍(lán)色圈直徑為縱坐標(biāo)(Y)，用Origin作圖軟件擬合標(biāo)準(zhǔn)直線，結(jié)果如圖4所示，用作圖軟件自帶工具進(jìn)行方程式擬合后發(fā)現(xiàn)，方程式為Y=O. 561X+1. 068，其中R2=O. 993，說(shuō)明線性關(guān)系良好。綜上可見(jiàn)，在過(guò)氧化氫濃度為O. 5 20mmol/L范圍內(nèi)，過(guò)氧化氫濃度與普魯士藍(lán)瓊脂平板的藍(lán)色圈直徑有較好的對(duì)應(yīng)關(guān)系，兩者呈現(xiàn)較好的指數(shù)關(guān)系；尤其是在過(guò)氧化氫濃度為O. 5 20mmol/L范圍內(nèi)，過(guò)氧化氫濃度的對(duì)數(shù)值與普魯士藍(lán)瓊脂平板的藍(lán)色圈直徑大小有較好線性關(guān)系。過(guò)氧化氫濃度大小可以通過(guò)普魯士藍(lán)瓊脂平板上藍(lán)色圈直徑大小來(lái)度量。表I.不同過(guò)氧化氫濃度下藍(lán)色圈直徑大小
權(quán)利要求
1.用普魯士藍(lán)瓊脂平板定量檢測(cè)L-氨基酸氧化酶活力的方法，其特征在于所述方法為(1)普魯士藍(lán)瓊脂平板的制備將l(T30g/L氯化鐵水溶液與l(T30g/L鐵氰化鉀水溶液以體積比O. 2飛I混合制成混合液，然后將混合液與麗瓊脂液以體積比1:5 20混合搖勻，在115°C下滅菌30min，倒平板，制成所述普魯士藍(lán)瓊脂平板；所述麗瓊脂液終濃度組成為酵母膏O 10g/L、蛋白胨2 20g/L、瓊脂15 30g/L，pH 5 9，溶劑為水；(2) L-氨基酸氧化酶活力的測(cè)定取步驟(I)制得的普魯士藍(lán)瓊脂平板，用打孔器在所述普魯士藍(lán)瓊脂平板上打出直徑為riOmm的小孔，然后將小孔中加入待測(cè)液，室溫靜置l(T300min，待測(cè)液產(chǎn)生的過(guò)氧化氫在所述的小孔周圍形成藍(lán)色圈，測(cè)定藍(lán)色圈的直徑，根據(jù)過(guò)氧化氫與藍(lán)色圈直徑標(biāo)準(zhǔn)直線來(lái)確定過(guò)氧化氫釋放量，從而推論得L-氨基酸氧化酶活力；所述的過(guò)氧化氫與藍(lán)色圈直徑的標(biāo)準(zhǔn)直線是以所取用步驟(2)同樣的普魯士藍(lán)瓊脂平板以梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)過(guò)氧化氫為測(cè)試樣品做與待測(cè)液平行試驗(yàn)取得的數(shù)據(jù)得到的標(biāo)準(zhǔn)濃度的過(guò)氧化氫與藍(lán)色圈直徑線性關(guān)系圖；所述待測(cè)液的制備方法為以交替假單胞菌B3 (Pseudoalteromonas sp. B3)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的酶為酶源，以待測(cè)L-氨基酸為底物,25 50°C,pH 5 9條件下反應(yīng)0.5 2h，獲得的反應(yīng)液即為待測(cè)液；所述酶來(lái)自于交替假單胞菌B3發(fā)酵培養(yǎng)后獲得的含濕菌體發(fā)酵液離心棄去沉淀后獲得的上清液，所述L-氨基酸初始底物濃度為2 20mmol/L，所述上清液用量以含濕菌體發(fā)酵液中濕菌體質(zhì)量計(jì)為O. 5 IOmg濕菌體/mmol底物；所述L-氨基酸氧化酶活力的定義為30°C下，ImL酶液作用底物濃度為5mmol/L的L-氨基酸Ih后釋放出lmmol/L過(guò)氧化氫即為I個(gè)酶活單位(U)。
2.如權(quán)利要求I所述利用普魯士藍(lán)瓊脂平板定量檢測(cè)L-氨基酸氧化酶活力的方法，其特征在于所述氯化鐵水溶液的質(zhì)量濃度均為15 25g/L，所述鐵氰化鉀水溶液的質(zhì)量濃度為15 25g/L。
3.如權(quán)利要求I所述利用普魯士藍(lán)瓊脂平板定量檢測(cè)L-氨基酸氧化酶活力的方法，其特征在于所述氯化鐵水溶液和鐵氰化鉀水溶液的體積配比為O. Γ2. 5:1，所述氯化鐵水溶液和鐵氰化鉀水溶液的混合液與MM瓊脂液體積配比為1: 7 15。
4.如權(quán)利要求I所述利用普魯士藍(lán)瓊脂平板定量檢測(cè)L-氨基酸氧化酶活力的方法，其特征在于所述MM瓊脂液終濃度組成為酵母膏2 5g/L、蛋白胨3 7g/L、瓊脂18 25g/L，pH 6 8，溶劑為水。
5.如權(quán)利要求I所述利用普魯士藍(lán)瓊脂平板定量檢測(cè)L-氨基酸氧化酶活力的方法，其特征在于所述打孔器打出小孔的直徑為5 7mm。
6.如權(quán)利要求I所述利用普魯士藍(lán)瓊脂平板定量檢測(cè)L-氨基酸氧化酶活力的方法，其特征在于所述每孔中加入的待測(cè)液為30 70 μ L0
7.如權(quán)利要求I所述利用普魯士藍(lán)瓊脂平板定量檢測(cè)L-氨基酸氧化酶活力的方法，其特征在于所述小孔加入待測(cè)液后室溫靜置15飛Omin。
8.如權(quán)利要求I所述利用普魯士藍(lán)瓊脂平板定量檢測(cè)L-氨基酸氧化酶活力的方法，其特征在于所述L-氨基酸為L(zhǎng)-亮氨酸、L-精氨酸、L-苯丙氨酸、L-賴氨酸、L-胱氨酸、L-色氨酸、L-甲硫氨酸、L-異亮氨酸、L-天冬酰胺、L-高苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-苯甘氨醇或L-纈氨酸。
9.如權(quán)利要求I所述利用普魯士藍(lán)瓊脂平板定量檢測(cè)L-氨基酸氧化酶活力的方法，其特征在于所述的方法按如下步驟進(jìn)行(I)普魯士藍(lán)瓊脂平板的制備將20g/L氯化鐵水溶液與20g/L鐵氰化鉀水溶液以體積比I: I混合制成混合液，然后將混合液與MM瓊脂液以體積比1:9混合搖勻，在115°C下滅菌30min，倒平板，制成所述普魯士藍(lán)瓊脂平板，用打孔器在上述普魯士藍(lán)瓊脂平板上打出直徑為6mm的小孔；所述MM瓊脂液終濃度組成為酵母膏3g/L、蛋白胨5g/L、瓊脂20g/L，pH 6. 8，溶劑為水；(2) L-氨基酸氧化酶活力的測(cè)定為以交替假單胞菌B3發(fā)酵培養(yǎng)后的含濕菌體發(fā)酵液離心獲得的上清液為酶源，以待測(cè)L-氨基酸為底物，在30°C，pH7. O的條件下反應(yīng)30min，使L-氨基酸氧化釋放出過(guò)氧化氫，獲得反應(yīng)液，即為待測(cè)液；取50μ L反應(yīng)液加入到步驟(I)制備的普魯士藍(lán)瓊脂平板的小孔內(nèi)，室溫放置30min后，待測(cè)液產(chǎn)生的過(guò)氧化氫在所述的小孔周圍形成藍(lán)色圈，測(cè)定藍(lán)色圈的大小，根據(jù)過(guò)氧化氫與藍(lán)色圈直徑標(biāo)準(zhǔn)直線來(lái)確定過(guò)氧化氫釋放量，從而推論得L-氨基酸氧化酶活力；所述待測(cè)液的制備方法為以交替假單胞菌B3 (Pseudoalteromonas sp.B3)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的酶為酶源，以待測(cè)L-氨基酸為底物，25 50°C，pH 5 9條件下反應(yīng)O. 5 2h，獲得的反應(yīng)液即為待測(cè)液；所述酶來(lái)自于交替假單胞菌B3發(fā)酵培養(yǎng)后獲得的含濕菌體發(fā)酵液離心棄去沉淀后獲得的上清液，所述L-氨基酸初始底物濃度為5mmol/L，所述上清液用量以含濕菌體發(fā)酵液中濕菌體質(zhì)量計(jì)為4mg濕菌體/mmol底物。
10.如權(quán)利要求I所述利用普魯士藍(lán)瓊脂平板定量檢測(cè)L-氨基酸氧化酶活力的方法， 其特征在于所述酶源按如下步驟制備(I)斜面培養(yǎng)將交替假單胞菌B3接種于斜面培養(yǎng)基，20 37°C培養(yǎng)12 24h，獲得斜面菌體，所述斜面培養(yǎng)基終濃度組成為酵母膏I. 5 6g/L，蛋白胨2. 5 10g/L，海鹽15 45g/L，瓊脂15 25g/L，pH 7 8，溶劑為水；(2)種子培養(yǎng)從斜面菌體挑取一接種環(huán)菌株接種至種子培養(yǎng)基，20 37°C培養(yǎng)18 24h，獲得種子液，所述種子培養(yǎng)基終濃度組成為酵母膏I. 5 6g/L，蛋白胨2. 5 10g/L，海鹽15 45g/L，pH 7 8，溶劑為水；(3)發(fā)酵培養(yǎng)將種子液以體積濃度I 10%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，20 37°C培養(yǎng)48 120h，獲得發(fā)酵液，將發(fā)酵液經(jīng)8000 12000rpm，離心5 IOmin后，棄去沉淀，收集上清液，獲得所述酶源；所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為酵母膏1.5 68/1，蛋白胨2.5 10g/L，海鹽15 45g/L，pH 7 8，溶劑為水。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用普魯士藍(lán)瓊脂平板定量檢測(cè)L-氨基酸氧化酶活力的方法用打孔器在普魯士藍(lán)瓊脂平板上打出直徑為4~10mm的小孔，然后將小孔中加入待測(cè)液，室溫靜置10~300min，待測(cè)液產(chǎn)生的過(guò)氧化氫在所述的小孔周圍形成藍(lán)色圈，測(cè)定藍(lán)色圈的直徑，根據(jù)過(guò)氧化氫與藍(lán)色圈直徑制作的標(biāo)準(zhǔn)直線來(lái)確定過(guò)氧化氫釋放量，從而推論得L-氨基酸氧化酶活力；所述待測(cè)液以交替假單胞菌B3(Pseudoalteromonas sp.B3)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的酶為酶源，以L-氨基酸為底物，25～50℃，pH為5～9條件下反應(yīng)0.5～2h，獲得的反應(yīng)液即為待測(cè)液；本發(fā)明方法具有成本低，操作簡(jiǎn)單方便，適用性廣，穩(wěn)定性高等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12R1/38GK102911999SQ201210284618
公開(kāi)日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2012年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月10日
發(fā)明者余志良, 周寧, 裘娟萍 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)