專利名稱：一種檢測人類dna修復(fù)酶基因多態(tài)性的芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及一種人類DNA修復(fù)酶基因多態(tài)性的芯片，尤其涉及一種能同時檢 測XRCC1 Argl94Trp、Arg399Gln位點(diǎn)和XPDAsp312Asn位點(diǎn)基因多態(tài)性的玻璃基因芯片，屬 生物芯片診斷技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
基因芯片是指將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針，有規(guī)律的排列 固定于固相支持物上，然后與待測的標(biāo)記的核酸樣品按堿基配對原理進(jìn)行雜交，再經(jīng)過一 定的檢測系統(tǒng)對雜交信號進(jìn)行檢測，并配以計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對每一雜交信號進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處 理，從而迅速得出所要的信息。與傳統(tǒng)的雜交技術(shù)相比，該技術(shù)具有微型化、高靈敏性、高度 平行性，和高速性的顯著特點(diǎn)。其發(fā)展速度和其中所運(yùn)用的技術(shù)令人矚目。迄今為止，已在 基因表達(dá)檢測，基因突變檢測，單核苷酸多態(tài)性和DNA序列測定等方面展開了廣泛的研究 和應(yīng)用。機(jī)體細(xì)胞DNA遭受環(huán)境理化因子(如電離輻射和化學(xué)物質(zhì))或由正常和異常細(xì)胞 代謝產(chǎn)物(如氧自由基)的襲擊，可引起不同類型的損傷堿基和脫氧核糖變化、DNA鏈間 交聯(lián)和(或)DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)、DNA單鏈和雙鏈的斷裂。DNA修復(fù)則是對損傷的主要生物學(xué) 反應(yīng)，促使DNA中損傷的、不合適的或錯配的堿基恢復(fù)本來的生物化學(xué)過程，維持遺傳物質(zhì) 穩(wěn)定。機(jī)體DNA修復(fù)能力差者更易于罹患惡性腫瘤等嚴(yán)重疾病以及對鉬類化療藥物更為敏 感。研究表明，體內(nèi)DNA修復(fù)酶類活性受基因表達(dá)所控制，并且與基因序列上極小的遺傳差 異即單核苷酸多態(tài)性有關(guān)。因此了解機(jī)體DNA修復(fù)酶類基因的遺傳變異，對DNA損傷修復(fù) 能力的遺傳風(fēng)險進(jìn)行科學(xué)、客觀地評估具有重要意義。XRCC1是一種重要的DNA修復(fù)基因，對維持基因組穩(wěn)定具有關(guān)鍵作用。XRCC1蛋 白通過與聚合酶0、DNA連接酶III和多聚ADP核糖聚合酶形成復(fù)合物(PARP)，參與因電 離輻射和氧化損傷引起的堿基切除修復(fù)和單鏈斷裂修復(fù)。研究發(fā)現(xiàn)在XRCC1194密碼子和 399密碼子處具有2個單核苷酸多態(tài)，分別引起C — T和A — G堿基突變，導(dǎo)致相應(yīng)氨基酸 殘基的改變Argl94Trp和Arg399Gln。這些突變使XRCC1在人體形成3種基因型野生 型、突變型和雜合型。Argl94Trp發(fā)生在與DNApol 0和PARP作用域之間的連接區(qū)，而Arg 399Gln突變是在C00H端與PARP作用域，即BRCT1域。由于發(fā)生在多蛋白復(fù)合體的蛋白質(zhì) 交界面上殘基與活性中心相關(guān)殘基在酶功能中有一定作用，這些多態(tài)性可能會導(dǎo)致蛋白質(zhì) 活性的改變。XPD基因產(chǎn)物是一個由760個氨基酸構(gòu)成的蛋白質(zhì)，該蛋白具有ATP依賴的 5' -3' DNA解旋酶，參與NER和基因轉(zhuǎn)錄，XPD基因312密碼子G —A堿基存在著遺傳多 態(tài)性，可導(dǎo)致其產(chǎn)物具不同的生物學(xué)活性，使人群DNA損傷的修復(fù)能力存在明顯的差異。目前對于基因多態(tài)性檢測，已經(jīng)建立的技術(shù)有1DNA測序法PCR擴(kuò)增包含突變位點(diǎn)的一段基因序列，利用DNA測序儀進(jìn)行測序分 析，缺點(diǎn)是測序價格昂貴，只能逐個基因進(jìn)行檢測，不適合對多個基因同時進(jìn)行檢測。2聚合酶鏈-限制性長度多態(tài)性(PCR-RFLP)法目前最為常用，主要為采用PCR擴(kuò)增包含突變位點(diǎn)的DNA片段，然后將待檢測的DNA片段用限制性內(nèi)切酶酶切，限制性內(nèi)切酶識別并切割特異的序列，然后將酶切后的產(chǎn)物進(jìn)行電泳，再由限制酶圖譜(restriction map)分析此段序列的特異切位點(diǎn)，即由片段的多樣性來比對不同來源基因序列的差異性。 此方法費(fèi)用不高，但是操作步驟繁瑣，費(fèi)時費(fèi)力。3聚合酶鏈-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)法采用PCR擴(kuò)增包含突變位點(diǎn)的DNA 片段，變性后進(jìn)行聚丙烯酰胺電泳，銀染后觀察結(jié)果。因其檢測敏感，快速和所需裝置簡便 而在分子生物學(xué)各個領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。但該方法的試驗(yàn)結(jié)果受多種因素的影響，如溫度，電 壓，PAGE膠的濃度和交聯(lián)度等，重復(fù)性較差。4 變個生的高效液才目色譜檢 IlJ (denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC)法采用PCR擴(kuò)增包含多態(tài)性位點(diǎn)的DNA片段，加熱變性后緩慢復(fù) 性，將樣品置于色譜儀的96孔板上，輸入DNA序列，根據(jù)軟件計(jì)算提示選擇最佳運(yùn)行溫度， 在色譜圖中判斷不同的基因突變類型。此方法靈敏度較高，可以搜尋未知的SNP位點(diǎn)，但是 無法對已知SNP實(shí)現(xiàn)100%檢出。然而，上述檢測方法存在一個共同的缺點(diǎn)通量低，即一次檢測反應(yīng)僅能檢出一種 基因一個位點(diǎn)的基因多態(tài)性，而不能進(jìn)行多個基因的檢測。經(jīng)檢索，利用DNA修復(fù)酶基因多態(tài)性檢測的玻璃基因芯片，至今未見報(bào)道。

實(shí)用新型內(nèi)容針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本實(shí)用新型提供了 一種同時檢測XRCClArgl94Trp、 Arg399Gln位點(diǎn)和XPDAsp312Asn基因多態(tài)性的玻璃基因芯片。該芯片能夠克服現(xiàn)有技術(shù)存 在的不能一次檢測多個基因多態(tài)性的缺陷，滿足疾病預(yù)防控制和臨床醫(yī)療領(lǐng)域的需要。本實(shí)用新型所述檢測人類DNA修復(fù)酶類基因多態(tài)性的玻璃基因芯片，由玻璃基片 和陣列式分布于玻璃基片上的寡核苷酸探針與對照及空白的點(diǎn)涂層組成，其特征在于所 述的玻璃基片是表面有醛基化修飾層的玻璃片；所述點(diǎn)涂層的形狀為圓形，涂層區(qū)設(shè)1 2個，每涂層區(qū)設(shè)有6條不同位點(diǎn)的DNA修復(fù)酶基因特異性檢測探針、1條陽性對照探針和 3條陰性對照探針、以及一個由點(diǎn)樣液做對照的空白，其中所述每種探針與對照及空白分別 以2X2方式在玻璃基片表面陣列排布4個平行的點(diǎn)涂層，每個點(diǎn)涂層的直徑為0. 15mm,同 種探針或?qū)φ栈蚩瞻c(diǎn)涂層間距為0. 4mm，不同探針或?qū)φ拯c(diǎn)涂層間距為0. 8mm。其中上述的玻璃基片是長方形，面積是73mm 77mmX 25mm 27mm;厚度為0. 6mm 2. Omm0上述的涂層區(qū)面積優(yōu)選3. 5mmX6mm。上述6條不同位點(diǎn)的DNA修復(fù)酶基因特異性檢測探針的基因序列分別是(XRCCl-194)-w :5，-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-AAGAAGTCGGCCTAGTTG ；(XRCCl-194)-m :5，-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-AAGAAGTCGAGGTAGTTG ；(XRCC1-399)_w:5，-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-ACGGGAGGGTCTCCATT ；(XRCCl-399)-m :5，-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-ACGGGAGGGCCTCCATT ；(XPD-312)-w:5，- (NH2) - (CH2) 6_Po 1 (dT) 15-CACGACGGGTTGCTTCA ；(XPD-312)-m 5，-(NH2)-(CH2)6_Po1(dT)15-CACGACGGGCTGCTTCA ；[0024]上述1條陽性對照探針的基因序列是β -actin :5，-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-TACTCTAACCGTACCGA ；上述3條陰性對照探針的基因序列分別是(XRCC1-194)CK :5，-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-AAGAAGTCGCGGTAGTTG ；(XRCC1-399)CK :5，-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-ACGGGAGGGGCTCCATT ；(XPD-312)CK 5，-(NH2)-(CH2)6_Po1(dT)15-CACGACGGGGTGCTTCA ；上述檢測探針與對照探針均以poly (dT) 15作為連接臂，并在探針的5’端加入帶
氨基的六碳基團(tuán)。上述經(jīng)醛基化處理的玻璃片是指將未經(jīng)任何化學(xué)修飾的玻璃片裸片以體積百分比濃度為5% 10%戊二醛水溶液浸泡處理制得的玻璃片。本實(shí)用新型所述的人類DNA修復(fù)酶類基因多態(tài)性檢測玻璃基因芯片具有如下優(yōu) 點(diǎn)和效果(1)本芯片實(shí)現(xiàn)了高通量檢測的目的，芯片采用的將XRCCl和XPD基因多態(tài)性特異 性探針點(diǎn)制在同一個檢測微陣列上，能夠?qū)崿F(xiàn)對3個基因位點(diǎn)的同時檢測。(2)本實(shí)用新型芯片采用Tamara熒光標(biāo)記下游引物對各位點(diǎn)基因進(jìn)行擴(kuò)增和標(biāo) 記，并結(jié)合玻璃載片，可以通過使用特定的儀器和軟件對雜交信號進(jìn)行定量分析，提供精確 而嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臄?shù)據(jù)。(3)本實(shí)用新型芯片采用的 XRCClArgl94Trp、Arg399Gln，XPDAsp312Asn 多態(tài)性位 點(diǎn)特異性引物和檢測探針，能夠?qū)崿F(xiàn)對XRCCl和XPD基因進(jìn)行有效擴(kuò)增和精確鑒定?？傊?，本實(shí)用新型涉及的芯片能同時用于DNA修復(fù)酶類XRCClArgl94Trp、 Arg399Gln和XPDAsp312Asn位點(diǎn)基因多態(tài)性檢測，確定DNA修復(fù)酶基因的基因型，提供人體 DNA損傷修復(fù)基因相關(guān)的遺傳信息咨詢，有望滿足疾病預(yù)防控制和臨床醫(yī)療領(lǐng)域的需要。

圖1 本實(shí)用新型所述檢測人類DNA修復(fù)酶類基因多態(tài)性的玻璃基因芯片(檢測 DNA修復(fù)酶類XRCCIArg 194Trp、Arg399Gln和XPDAsp312Asn基因多態(tài)性的玻璃基因芯片) 的探針排布圖其中，所述探針排布為al, a2, bl, b2 :P-XRCCl-194_w(野生型)；a3, a4, b3, b4 :P-XRCCl-194_m(突變 型)；a5，a6，b5，b6 :P-XRCC1-194_CK (陰性對照);a7，a8，b7，b8 β -actin (陽性對照)cl, c2, dl, d2 :P-XRCCl-399_w(野生型)；c3, c4, d3, d4 P-XRCCl-399-m(突變 型)；c5, c6，d5，d6 P-XRCC1-399-CK (陰性對照)；c7, c8，d7，d8 空白對照(點(diǎn)樣液)；el, e2，fl, f2 ； β -actin(陽性對照)；e3, e4，f3, f4 :P_XPD-312_w(野生型)；e5，e6，f5，f6 :P-XPD-312_m(突變型)；e7,e8,f7,f8 :P-XPD-312_CK(陰性對照)。進(jìn)一步的，所述探針排布如表所示P-XRCCl-194-wP-XRCC1-194-mP-XRCC1-194-CKβ-actin (陽性對照)
P-XRCC 1-399-wP-XRCC1-399- mP-XRCC1-399- CK空白對照
~β-actin (陽性對照) P-XPD-312-wP-XPD-312-mP-XPD-312-CK圖2 本實(shí)用新型所述檢測人類DNA修復(fù)酶類基因多態(tài)性的玻璃基因芯片的直觀圖，其中，1為玻璃基片；2為涂層區(qū)。圖3 包含各位點(diǎn)基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物同基因芯片的雜交掃描結(jié)果結(jié)果顯示，包含各多態(tài)位點(diǎn)的基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物同芯片上XRCCIArg 194Trp、 Arg399Gln位點(diǎn)突變基因型的特異性探針雜交后均出現(xiàn)陽性結(jié)果，XPDAsp312Asn野生型 特異性探針雜交后也出現(xiàn)陽性信號，β-actin陽性對照點(diǎn)的位置上也出現(xiàn)了陽性信號， 陰性對照和空白對照點(diǎn)的位置上均出現(xiàn)陰性結(jié)果。此檢測樣本的芯片雜交結(jié)果表明， XRCCIArg 194Trp位點(diǎn)為突變型，Arg399Gln位點(diǎn)為突變型，XPDAsp312Asn位點(diǎn)為野生型。圖4 包含各位點(diǎn)基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物同基因芯片的雜交掃描結(jié)果結(jié)果顯示，包含XRCCIArg 194Trp位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物同芯片上XRCCIArg 194Trp 位點(diǎn)野生型和突變型特異性探針雜交后均出現(xiàn)陽性結(jié)果，PM-w和PM-m信號比值為1.34; 包含XRCClArg399Gln位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物同芯片上XRCClArg399Gln位點(diǎn)野生型特異性 探針雜交后出現(xiàn)陽性結(jié)果；XPDAsp312Asn基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與芯片上XPDAsp312Asn突變 型探針雜交后出現(xiàn)陰性信號，β-actin陽性對照點(diǎn)的位置上出現(xiàn)陽性信號；各位點(diǎn)位點(diǎn)陰 性對照和芯片空白對照點(diǎn)的位置上均出現(xiàn)陰性結(jié)果。此檢測樣本的芯片雜交結(jié)果表明， XRCCIArg 194Trp位點(diǎn)為雜合突變型，XRCClArg399Gln位點(diǎn)為野生型，XPDAsp312Asn位點(diǎn)為 突變型。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合附圖對本實(shí)用新型的內(nèi)容作進(jìn)一步闡述實(shí)施例1本實(shí)用新型所述檢測人類DNA修復(fù)酶類基因多態(tài)性的玻璃基因芯片(即 檢測DNA修復(fù)酶類XRCClArgl94Trp、Arg399Gln和XPDAsp312Asn基因多態(tài)性的玻璃基因芯 片)的制備，芯片結(jié)構(gòu)見圖1所述檢測人類DNA修復(fù)酶類基因多態(tài)性的玻璃基因芯片的點(diǎn) 涂層探針排布圖及圖2芯片的直觀圖。(1)玻片處理取未經(jīng)化學(xué)修飾的面積是75mmX 25mm、厚度為1. Omm的玻璃片裸片 以體積百分比濃度為8%戊二醛水溶液浸泡1小時，得到醛基化的玻璃片作為芯片的基片。(2)確定探針根據(jù)DNA修復(fù)酶基因多態(tài)性位點(diǎn)基因序列，選擇確定6條特異性檢 測探針，其基因序列分別是(XRCC1-194)_w :5，-(ΝΗ2)-(CH2)6-Pol(dT)15-AAGAAGTCGGCCTAGTTG ；(XRCC1-194)_m :5，-(NH2)-(CH2) 6-Pol(dT)15-AAGAAGTCGAGGTAGTTG ；(XRCC1-399)_w:5，-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-ACGGGAGGGTCTCCATT ；(XRCC1-399)_m :5，-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-ACGGGAGGGCCTCCATT ；(XPD-312)-w:5，- (NH2) - (CH2) 6_Po 1 (dT) 15-CACGACGGGTTGCTTCA ；(XPD-312)-m :5，-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-CACGACGGGCTGCTTCA ；[0062]選擇確定1條陽性對照探針，其基因序列是β -actin :5，-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-TACTCTAACCGTACCGA ；選擇確定3條陰性對照探針，其基因序列分別是(XRCC1-194)CK :5，-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-AAGAAGT CGCGGTAGTTG ；(XRCC1-399)CK :5，-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-ACGGGAGGGGCTCCATT ；(XPD-312)CK :5，-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-CACGACGGGGTGCTTCA ；(3)芯片制備將上述選擇的人類DNA修復(fù)酶類基因多態(tài)性特異性檢測探針，陽性 對照探針和陰性對照探針，以poly (dT) 15作為連接臂，并在探針5’段加入帶氨基的六碳基 團(tuán)，以3XSSC作為稀釋液將上述探針分別稀釋為10 μ M，，以點(diǎn)樣液位空白對照，以生物芯 片點(diǎn)樣儀Pixsys5500配以SMP3點(diǎn)樣針接觸式點(diǎn)制在所述醛基化玻璃基片上，探針排布由 圖1所示，其中每種探針與對照及空白的點(diǎn)涂層以2 X 2方式在玻璃基片表面點(diǎn)制4個平行 的點(diǎn)涂層，每個點(diǎn)涂層的直徑為0. 15mm,同種探針或?qū)φ栈蚩瞻c(diǎn)涂層間距為0. 4mm，不同 探針或?qū)φ拯c(diǎn)涂層間距為0. 8mm ；芯片點(diǎn)涂層區(qū)面積為3. 5mmX6mm ；將點(diǎn)制后的芯片平放 于紫外交聯(lián)儀內(nèi)，4500J/cm2交聯(lián)3min，得所述檢測人類DNA修復(fù)酶類基因多態(tài)性的玻璃基 因芯片。檢測人類DNA修復(fù)酶類基因多態(tài)性的玻璃基因芯片的直觀圖如圖2。實(shí)施例2利用本實(shí)用新型所述XRCC1、XPD基因多態(tài)性的玻璃基因芯片檢測DNA修 復(fù)酶 XRCCIArg 194Trp、Arg399Gln 和 XPDAsp312Asn 位點(diǎn)基因多態(tài)性(1)以O(shè)mega全血DNA提取試劑盒按照使用說明提取外周血標(biāo)本基因組DNA，應(yīng)用 滅菌超純水溶解DNA。(2) PCR擴(kuò)增包含各位點(diǎn)的基因片段針對XRCClArgl94Trp、Arg399Gln和XPDAsp312Asn多態(tài)位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性上下游引 物，具體是XRCCIArg 194Trp 位點(diǎn)上游引物 5，-AGCAGCCCACCTATAATACTG-3，下游引物5，-Tamara-CTCAGACCCAGGAATCTGAG-3，XRCClArg399Gln 位點(diǎn)上游引物 5，-CCCTCAGATC ACACCTAACTG-3，下游引物5，-Tamara-AGTAGTCTGCTGGCTCTGGGC-3，XPDAsp312Asn 位點(diǎn)上游引物 5，-AGGATCAAAGAGACAGACGAG-3，下游引物5，-Tamara-TCTGCGAGGAGACGCTATCAG-3，陽性對照基因 β -actin 上游引物 5，-TTAGTTGCGTTACACCCTTTC-3，下游引物 5，-Tamara-GAACGGTGAAGGTGACAGC-3，以Tamara熒光標(biāo)記上述下游引物，進(jìn)行目的基因的PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR擴(kuò)增反應(yīng) 體系為20μ 1的PCR反應(yīng)體系，混合液中含模板DNA5y l，20mM上下游引物各0. 4μ IUOmM dNTPO. 4 μ l、25mM MgCl2L 2 μ 1、5υ/μ 1 Taq 聚合酶 0· 2μ 1 及 10XPCR Buffer 2 μ 1。上述各位點(diǎn)基因片段及β -actin基因PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min后，于 94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸40s進(jìn)行40個循環(huán)，最后72°C總延伸7min。(3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與人DNA修復(fù)酶類基因檢測芯片的雜交將Tamara熒光標(biāo)記的 靶DNA擴(kuò)增產(chǎn)物與雜交液等體積混合，雜交液為5 X SSC (0.5% SDS、50%甲酰胺)。取2μ 1 標(biāo)記的DNA溶液加到芯片的表面，加蓋玻片，放入雜交盒中65V雜交6h。[0085](4)雜交后洗片和信號的掃描以終濃度為2XSSC，0.2% SDS溶液洗片，每次2min,再用2X SSC沖洗2次，每次2min，最后用三蒸水清洗2次，每次2min，然后800r/m 離心5min。用Scanarray 4000掃描儀掃描，掃描參數(shù)為激光強(qiáng)度100%，PMT100%。用 Quantarray 3. 0定量分析軟件分析掃描圖像的熒光強(qiáng)度值。根據(jù)各個探針雜交信號的強(qiáng)弱 來判定雜交結(jié)果。結(jié)果顯示(見圖3)，包含各多態(tài)位點(diǎn)的基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物同芯片上 XRCClArgl94Trp、Arg399Gln位點(diǎn)突變基因型的特異性探針雜交后均出現(xiàn)陽性結(jié)果， XPDAsp312Asn野生型特異性探針雜交后也出現(xiàn)陽性信號，β-actin陽性對照點(diǎn)的位置上 也出現(xiàn)了陽性信號，陰性對照和空白對照點(diǎn)的位置上均出現(xiàn)陰性結(jié)果。此檢測樣本的芯片 雜交結(jié)果表明，XRCClArgl94Trp位點(diǎn)為突變型，Arg399Gln位點(diǎn)為突變型，XPDAsp312Asn位 點(diǎn)為野生型。實(shí)施例3利用本實(shí)用新型所述XRCCl和XPD基因多態(tài)性的玻璃基因芯片檢測DNA 修復(fù)酶 XRCClArgl94Trp、Arg399Gln 和 XPDAsp312Asn 位點(diǎn)基因多態(tài)性(1)以O(shè)mega全血DNA提取試劑盒按照使用說明提取外周血標(biāo)本基因組DNA，應(yīng)用 滅菌超純水溶解DNA。(2)PCR擴(kuò)增包含各位點(diǎn)的基因片段和β-actin基因片段。以Tamara熒光標(biāo)記上 述下游引物，進(jìn)行目的基因的PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20μ 1的PCR反應(yīng)體系， 混合液中含模板DNA5y l，20mM上下游引物各 0. 4μ IUOmM dNTPO. 4 μ l、25mMMgCl2l. 2 μ 1、 5U/y 1 Taq聚合酶0. 2μ 1及10XPCR Buffer 2μ1。取5 μ IPCR產(chǎn)物，用含有溴化乙錠的 1 %瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行電泳觀察結(jié)果。(3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與人DNA修復(fù)酶類基因檢測芯片的雜交將Tamara熒光標(biāo)記的 靶DNA擴(kuò)增產(chǎn)物與雜交液等體積混合，雜交液為5 X SSC (0.5% SDS、50%甲酰胺)。取2μ 1 標(biāo)記的DNA溶液加到芯片的表面，加蓋玻片，放入雜交盒中65V雜交6h。(4)雜交后洗片和信號的掃描以終濃度為2XSSC，0.2% SDS溶液洗片，每次 2min,再用2X SSC沖洗2次，每次2min，最后用三蒸水清洗2次，每次2min，然后800r/m 離心5min。用Scanarray 4000掃描儀掃描，掃描參數(shù)為激光強(qiáng)度100%，PMT100%。用 Quantarray 3. 0定量分析軟件分析掃描圖像的熒光強(qiáng)度值。根據(jù)各個探針雜交信號的強(qiáng)弱 來判定雜交結(jié)果。結(jié)果顯示(見圖4)，包含XRCC IArg 194Trp位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物同芯片上 XRCCIArg 194Trp位點(diǎn)野生型和突變型特異性探針雜交后均出現(xiàn)陽性結(jié)果，PM-w和PM_m 信號比值為1. 34 ；包含XRCClArg399Gln位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物同芯片上XRCClArg399Gln 位點(diǎn)野生型特異性探針雜交后出現(xiàn)陽性結(jié)果；XPDAsp312Asn基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與芯片上 XPDAsp312Asn突變型探針雜交后出現(xiàn)陰性信號，β -actin陽性對照點(diǎn)的位置上出現(xiàn)陽性 信號；各位點(diǎn)位點(diǎn)陰性對照和芯片空白對照點(diǎn)的位置上均出現(xiàn)陰性結(jié)果。此檢測樣本的 芯片雜交結(jié)果表明，XRCClArgl94Trp位點(diǎn)為雜合突變型，XRCClArg399Gln位點(diǎn)為野生型， XPDAsp312Asn位點(diǎn)為突變型。
權(quán)利要求一種檢測人類DNA修復(fù)酶類基因多態(tài)性的玻璃基因芯片，由玻璃基片和陣列式分布于玻璃基片上的寡核苷酸探針與對照及空白的點(diǎn)涂層組成，其特征在于所述的玻璃基片是表面有醛基化修飾層的玻璃片；所述點(diǎn)涂層的形狀為圓形，涂層區(qū)設(shè)1～2個，每涂層區(qū)設(shè)有6條不同位點(diǎn)的DNA修復(fù)酶基因特異性檢測探針、1條陽性對照探針和3條陰性對照探針、以及一個由點(diǎn)樣液做對照的空白，其中所述每種探針與對照及空白分別以2×2方式在玻璃基片表面陣列排布4個平行的點(diǎn)涂層，每個點(diǎn)涂層的直徑為0.15mm，同種探針或?qū)φ栈蚩瞻c(diǎn)涂層間距為0.4mm，不同探針或?qū)φ拯c(diǎn)涂層間距為0.8mm。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測人類DNA修復(fù)酶類基因多態(tài)性的玻璃基因芯片，其特征在 于，所述的玻璃基片是長方形，面積是73mm 77mmX 25mm 27mm ；厚度為0. 6mm 2. 0mm。
3.如權(quán)利要求1所述的檢測人類DNA修復(fù)酶類基因多態(tài)性的玻璃基因芯片，其特征在 于，所述的涂層區(qū)面積為3. 5mmX6mm。
專利摘要本實(shí)用新型公開了一種檢測人類DNA修復(fù)酶類基因多態(tài)性的玻璃基因芯片，由玻璃基片和陣列式分布于玻璃基片上的寡核苷酸探針與對照及空白的點(diǎn)涂層組成，其中所述的玻璃基片是表面有醛基化修飾層的玻璃片；所述點(diǎn)涂層的形狀為圓形，涂層區(qū)設(shè)1～2個，每涂層區(qū)設(shè)有6條不同位點(diǎn)的DNA修復(fù)酶基因特異性檢測探針、1條陽性對照探針和3條陰性對照探針、以及一個由點(diǎn)樣液做對照的空白。本實(shí)用新型的芯片可快速、高效對人類DNA修復(fù)酶XRCC1Arg194Trp、Arg399Gln位點(diǎn)和XPD Asp312Asn位點(diǎn)基因多態(tài)性進(jìn)行同步檢測，了解機(jī)體對內(nèi)外源因素引起的DNA損傷的修復(fù)能力，對判斷個體罹患惡性腫瘤的風(fēng)險和指導(dǎo)腫瘤病人選擇合適的化療藥物、實(shí)施個體化治療具有重要的意義。
文檔編號C12Q1/68GK201574154SQ200920292350

公開日2010年9月8日 申請日期2009年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月10日
發(fā)明者劉曙光, 劉杰, 呂麗燕, 宋寶, 張政偉, 王哲海, 白雪麗, 鄭燕 申請人:山東省腫瘤醫(yī)院