專(zhuān)利名稱(chēng)：：具有多功能或結(jié)合特異性的明確組成的改進(jìn)的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)的制作方法具有多功能或結(jié)合特異性的明確組成的改進(jìn)的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)發(fā)明背景具有多功能或結(jié)合特異性的基于抗體的藥物的現(xiàn)有生產(chǎn)技術(shù)，存在很多局限性。對(duì)于通過(guò)重組工程生產(chǎn)的藥物來(lái)說(shuō)，這些局限可包括生產(chǎn)成本高，表達(dá)收率低，在血清中不穩(wěn)定，在溶液中不穩(wěn)定而導(dǎo)致有聚集體或離解亞基形成，因存在多種產(chǎn)物形式并含有污染副產(chǎn)物而導(dǎo)致不確定的批組成，由于位阻因素或構(gòu)型改變而導(dǎo)致的功能活性或結(jié)合親和力/親合力降低，等等。對(duì)于用不同化學(xué)交聯(lián)方法生產(chǎn)的藥物來(lái)說(shuō)，兩個(gè)主要的局限是生產(chǎn)成本高與純化產(chǎn)物異質(zhì)性。近年來(lái)，對(duì)于能結(jié)合不止一個(gè)抗原決定簇(也稱(chēng)為表位)的抗體或其它結(jié)合部分，人們的興趣不斷增加。一般來(lái)說(shuō)，天然存在的抗體和單克隆抗體有識(shí)別同一表位的兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。相比語(yǔ))是經(jīng)合成或基因工程改造的可結(jié)合兩個(gè)不同表位的結(jié)構(gòu)。因此，同一分子構(gòu)建體中存在能結(jié)合兩個(gè)不同抗原決定簇的能力。雙特異性抗體可用于許多生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。例如，具有腫瘤細(xì)胞表面抗原結(jié)合位點(diǎn)和T細(xì)胞表面受體結(jié)合位點(diǎn)的雙特異性抗體，能導(dǎo)致特定腫瘤細(xì)胞被T細(xì)胞溶解。識(shí)別膠質(zhì)瘤和T細(xì)胞CD3表位的雙特異性抗體，已成功地用于治療人類(lèi)患者的腦腫瘤(Nitta等,Lancet.1990;355:368-371)。已知有多種生產(chǎn)雙特異性抗體的方法。構(gòu)建和利用雙特異性及多特異性抗體的方法，公開(kāi)于例如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布號(hào)20050002945(2004年11月2日申請(qǐng))，所述文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本文中。雙特異性抗體可通過(guò)四源雜交瘤(quadroma)方法生產(chǎn)，該方法包括使兩個(gè)不同雜交瘤融合，每個(gè)雜交瘤都產(chǎn)生一種識(shí)別不同抗原性位點(diǎn)的單克隆抗體(Milstein和Cuello.Nature.1983;305:537-540)。該融合雜交瘤能合成兩個(gè)不同重鏈和兩個(gè)不同輕鏈，它們能隨機(jī)結(jié)合產(chǎn)生具有10種不同抗體結(jié)構(gòu)的異質(zhì)群體，其中只有一個(gè)(占全部抗體分子的1/8)是雙特異性的，因而必須進(jìn)一步純化以與其它形式分開(kāi)，即使這是可行的但也是不經(jīng)濟(jì)的。此外，在細(xì)胞遺傳學(xué)上融合雜交瘤經(jīng)常不如親代雜交瘤穩(wěn)定，導(dǎo)致生產(chǎn)細(xì)胞系在傳代時(shí)有很多問(wèn)題。另一個(gè)生產(chǎn)雙特異性抗體的方法利用雜雙官能交聯(lián)劑，用化學(xué)鍵束縛兩個(gè)不同單克隆抗體，致使所得的雜交綴合物能結(jié)合兩個(gè)不同草巴標(biāo)(Staerz等，Nature.1985;314:628-631;Perez等，Nature.1985;316:354-356)。用此方法產(chǎn)生的雙特異性抗體基本上是兩個(gè)IgG分子的異源綴合物，它緩慢擴(kuò)散到組織中并迅速?gòu)难h(huán)中清除。雙特異性抗體也可通過(guò)如下方法制備將兩個(gè)親本單克隆抗體各自還原成相應(yīng)的半個(gè)分子，然后混合并氧化得到雜合體結(jié)構(gòu)，從而生產(chǎn)雙特異性抗體(Staerz和Bevan.ProcNatlAcadSciUSA.1986;83:1453-1457)。一個(gè)替代方法是利用合適接頭，使兩個(gè)或三個(gè)單獨(dú)純化的Fab'片段發(fā)生化學(xué)交聯(lián)。例如，歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)0453082公開(kāi)了應(yīng)用三-馬來(lái)酰亞胺化合物來(lái)制備雙特異性或三特異性抗體樣結(jié)構(gòu)。美國(guó)專(zhuān)利第6,511,663號(hào)提供了一種通過(guò)連接結(jié)構(gòu)使三個(gè)或四個(gè)Fab片段彼此共價(jià)連接來(lái)制備三價(jià)和四價(jià)單特異性抗原結(jié)合蛋白的方法。由于所有這些化學(xué)方法都有生產(chǎn)成本高、生產(chǎn)過(guò)程繁復(fù)、純化步驟過(guò)多、收率低(<20%)及產(chǎn)物異質(zhì)性等缺點(diǎn)，因此不適于商業(yè)開(kāi)發(fā)。其它方法包括通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒衍生的穿梭載體，將帶有不同選擇標(biāo)記的基因轉(zhuǎn)移到相應(yīng)親本雜交瘤中并隨后使之融合，以提高雜合雜交瘤的生產(chǎn)效率(DeMonte等，ProcNatlAcadSciUSA.1990,87:2941-2945);或者用含有不同抗體的重鏈和輕鏈基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染雜交瘤細(xì)胞系。這些方法也面臨上述不可避免的純化問(wèn)題。美國(guó)專(zhuān)利第5，582,9%號(hào)公開(kāi)了產(chǎn)生重組雙特異性抗體的方法，該重組雙特異性抗體由來(lái)自相同或不同抗體的Fab片段組成，這些Fab片l殳通過(guò)插入該抗體重鏈恒定區(qū)的互補(bǔ)相互作用結(jié)構(gòu)域而締合。互補(bǔ)相互作用結(jié)構(gòu)域選自交互的亮氨酸拉鏈或一對(duì)肽區(qū)段，其中一個(gè)含有一系列帶正電荷的氨基酸殘基，而另一個(gè)含有一系列帶負(fù)電荷的氨基酸殘基。該方法的一個(gè)局限性是，含有融合的互補(bǔ)相互作用結(jié)構(gòu)域的各個(gè)Fab亞基表現(xiàn)出對(duì)其靶抗原的親和力急劇下降，除非兩個(gè)亞基結(jié)合在一起。通過(guò)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的抗體的離散VH區(qū)和VL區(qū)會(huì)彼此配對(duì)，形成具有結(jié)合能力的二聚體(重組Fv片段)(美國(guó)專(zhuān)利第4,642,334號(hào))。然而，這樣非共價(jià)締合的分子在生理?xiàng)l件下不夠穩(wěn)定以致沒(méi)有實(shí)際用途。關(guān)聯(lián)VH區(qū)和VL區(qū)能通過(guò)具有合適長(zhǎng)度(通常由多于12個(gè)氨基酸殘基組成)和合適組成的肽接頭連接起來(lái)，形成具有結(jié)合活性的單鏈Fv(scFv)。scFv的生產(chǎn)方法公開(kāi)于美國(guó)專(zhuān)利第4,946，778號(hào)和美國(guó)專(zhuān)利第5,132,405號(hào)。將肽接頭長(zhǎng)度減少到少于12個(gè)氨基酸殘基，可以避免同一鏈的Vh區(qū)和W區(qū)配對(duì)，而迫使Vh區(qū)和V^區(qū)與其它鏈的互補(bǔ)區(qū)配對(duì)，形成功能性多聚體。由3-12個(gè)氨基酸殘基接頭連接的VH區(qū)和VL區(qū)多肽鏈主要形成二聚體(稱(chēng)為雙鏈抗體(diabodies))。0-2個(gè)氨基酸殘基接頭主要形成三聚體(稱(chēng)為三鏈抗體(triabodies》和四聚體(稱(chēng)為四鏈抗體(tetrabodies)),但是除了接頭長(zhǎng)度外，寡聚化的確切形式看來(lái)還取決于V區(qū)的組成和取向(VH-接頭-Vi或V^接失-Vh)。用5個(gè)氨基酸殘基或更短的肽接頭，可得到多價(jià)單特異性雙鏈抗體、三鏈抗體和四鏈抗體。利用雙順?lè)醋?dicistronic)表達(dá)載體也制備了雙特異性雙鏈抗體，該雙特異性雙鏈抗體是兩個(gè)不同scFv的異源二聚體，其中每個(gè)scFv由一個(gè)抗體的VH區(qū)經(jīng)短肽接頭與另一抗體的Vl區(qū)連接而成；所述雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體中的一個(gè)順?lè)醋雍杏蒝w-接頭-Vu構(gòu)成的重組基因構(gòu)建體，而另一個(gè)順?lè)醋雍杏蒝H2-接頭-Vu構(gòu)成的笫二重組基因構(gòu)建體(Holliger等，ProcNatlAcadSciUSA.1993;90:6444-6448;Atwell等，MolImmunol.1996;33:1301-1302;Holliger等，NatureBiotechnol.1997;15:632-631;Helfrich等，Int.JCancer.1998;76:232-239;Kipriyanov等，IntJCancer.1998;77:763-772;Holliger等，CancerRes.1999;59:2909-2916)。最近，也報(bào)道了具有雙特異性的四價(jià)串聯(lián)雙鏈抗體(稱(chēng)為串聯(lián)雙鏈抗體(tandab))(Cochlovms等，CancerRes.2000;60:4336-4341)。該雙特異性串聯(lián)雙鏈抗體是兩個(gè)相同多肽的二聚體，每個(gè)多肽含有兩個(gè)不同抗體的四個(gè)可變區(qū)(VH,、Vu、VH2、VL2)，這四個(gè)可變區(qū)按一定方向連接，以便一旦自締合就形成各自針對(duì)兩個(gè)不同特異性的兩個(gè)潛在結(jié)合位點(diǎn)。迄今為止，尚未構(gòu)建得到表達(dá)雙特異性或三特異性三鏈抗體的載體。然而，含有膠原凝集素頸區(qū)(collectinneckregion)的多肽三聚化已有報(bào)道(H叩pe等，F(xiàn)EBSLetters.1994;344:191-195)。美國(guó)專(zhuān)利第6,190,886號(hào)公開(kāi)了用含有膠原凝集素頸區(qū)的融合蛋白生產(chǎn)同源三聚體或異源三聚體。美國(guó)專(zhuān)利第5,844,094號(hào)、美國(guó)專(zhuān)利第5,837,242號(hào)和WO98/44001中公開(kāi)了通過(guò)改變接頭長(zhǎng)度，制備基于scFv的多價(jià)和多特異性藥物的方法。美國(guó)專(zhuān)利第5,989,830號(hào)和美國(guó)專(zhuān)利第6,239,259號(hào)公開(kāi)了通過(guò)構(gòu)建兩條多肽鏈，制備基于scFv的多價(jià)和多特異性藥物的方法，其中一條多肽鏈含有來(lái)自至少兩個(gè)抗體的Vh區(qū)，另一條多肽鏈含有相應(yīng)的區(qū)。用現(xiàn)有技術(shù)產(chǎn)生基于scFv的多價(jià)和多特異性藥物的常見(jiàn)問(wèn)題是表達(dá)水平低，產(chǎn)品形式不均一，在溶液中不穩(wěn)定導(dǎo)致聚集，在血清中不穩(wěn)定以及親和力降低。美國(guó)專(zhuān)利第6,809,185號(hào)公開(kāi)了通過(guò)重組方法產(chǎn)生的雙特異性或三特異性抗體，該抗體中Fab的CHI和Q鏈的C端各自與來(lái)自相同或不同單克隆抗體的scFv融合。這項(xiàng)"三鏈體(Tribody)"技術(shù)的主要缺點(diǎn)包括附加的scFv結(jié)合親和性降低，產(chǎn)品形式不均一，在溶液中不穩(wěn)定導(dǎo)致聚集。因此，本領(lǐng)域仍然需要多所述特異性或功能性的多價(jià)結(jié)構(gòu)的制備方法，特別是雙特異性抗體的制備方法，這類(lèi)多價(jià)結(jié)構(gòu)的組成確定，純度均一，親和性未改變，并且生產(chǎn)收率高而無(wú)需大量的純化步驟。此外，這類(lèi)結(jié)構(gòu)物必須在血清中足夠穩(wěn)定，以便在體內(nèi)應(yīng)用。需要易于構(gòu)建和/或以相對(duì)純的形式獲得的多特異性或功能性的穩(wěn)定多價(jià)結(jié)構(gòu)。發(fā)明概述本發(fā)明提供定量產(chǎn)生穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)的平臺(tái)技術(shù)，所述結(jié)構(gòu)具有多功能或結(jié)合特異性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)兩個(gè)不同肽序列間特定的相互作用，將這類(lèi)穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)制備成任何兩個(gè)組分(在本文中稱(chēng)為A和B)的獨(dú)特二元復(fù)合物，這兩個(gè)肽序列中的一個(gè)稱(chēng)、為二聚/ft和4亭靠結(jié)構(gòu)域(dimedzationanddockingdomain，DDD)，另一個(gè)稱(chēng)為錨定結(jié)構(gòu)域(anchoringdomain,AD)。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，DDD序列(見(jiàn)圖1中的DDD1和DDD2)來(lái)自依賴(lài)cAMP的蛋白激酶(PKA)調(diào)節(jié)(R)亞基，而AD序列(見(jiàn)圖2中的AD1和AD2)來(lái)自不同A-激酶錨定蛋白(AKAP)中存在的特定區(qū)域，其介導(dǎo)與PKA的R亞基的締合。然而，技術(shù)人員將會(huì)知道，其它二聚化和?？拷Y(jié)構(gòu)域及錨定結(jié)構(gòu)域是已知的，任何這樣的已知結(jié)構(gòu)域可在本文要求保護(hù)的主題范圍之內(nèi)使用。其它示例性的4-螺旋束類(lèi)型DDD結(jié)構(gòu)域可得自p53、DCoH(肝細(xì)胞核因子la(TCF1))的蝶呤4a甲醇胺脫水酶/二聚化輔因子)和HNF-1(肝細(xì)胞核因子l)。盡管S100蛋白也表現(xiàn)4螺旋-束DDD序列，但是這些蛋白質(zhì)都具有生物活性，例如使其無(wú)法實(shí)用的致癌性。具有潛在用途的其它AD序列可參見(jiàn)專(zhuān)利申請(qǐng)順序號(hào)US2003/0232420A1，所述文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本文中。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，二元復(fù)合物中的一個(gè)組分A是通過(guò)重組工程或者經(jīng)間隔基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)綴合，將DDD序列與A的前體(稱(chēng)為力)連接而產(chǎn)生的，結(jié)果產(chǎn)生爿/DDD結(jié)構(gòu)(在下文中稱(chēng)為a)。因?yàn)閍中的DDD序列影響二聚體的自發(fā)形成，所以A由32組成。二元復(fù)合物中的另一組分B是通過(guò)重組工程或者經(jīng)間隔基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)綴合，將AD序列與B的前體(稱(chēng)為S)連接而產(chǎn)生的，結(jié)果產(chǎn)生S/AD結(jié)構(gòu)(在下文中稱(chēng)為b)。二聚體結(jié)構(gòu)包含在a2中，這一事實(shí)產(chǎn)生?？课稽c(diǎn)，用于結(jié)合b中所含的AD序列，導(dǎo)致a2與b迅速締合，形成由a2b組成的二元復(fù)合物。在不同實(shí)施方案中，這樣的結(jié)合事件還因后續(xù)反應(yīng)而進(jìn)一步穩(wěn)定化，所述后續(xù)反應(yīng)共價(jià)保護(hù)了該裝配的兩個(gè)組分，例如通過(guò)二硫橋，所述反應(yīng)非常有效地發(fā)生，因?yàn)槠鹗冀Y(jié)合相互作用使活性硫醇基定向，以便進(jìn)行位點(diǎn)特異性連接。為了將半胱氨酸殘基放置在DDD和AD序列(如DDD2和AD2所示)的戰(zhàn)略位置上，32與b間可通過(guò)二硫橋而發(fā)生共價(jià)結(jié)合相互作用，由此形成穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)，這使得體內(nèi)應(yīng)用更可行。穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)也保留了兩個(gè)前體和S的全部功能特性。本發(fā)明人無(wú)法公開(kāi)的設(shè)計(jì)在自然界是模塊狀的，因?yàn)樗x的兩個(gè)前體中的每個(gè)都可與DDD或AD連接并隨后組合。這兩個(gè)前體也可相同04=3)或不同G4-5)。當(dāng)爿=5時(shí)，所得a2b復(fù)合物由穩(wěn)定束縛裝配的3個(gè)亞基組成，在下文中稱(chēng)為a3。適合作為前體的材料包括蛋白質(zhì)、肽、肽模擬物、多核苷酸、RNAz、寡糖、天然或合成聚合物、納米粒、量子點(diǎn)(quantumdot)以及有機(jī)或無(wú)機(jī)化合物。可能應(yīng)用的前體的其它非限制性實(shí)例見(jiàn)下表6-10。除了使用二硫鍵以防組成性亞基解離之外，也可使用能增強(qiáng)a2b結(jié)構(gòu)的總體穩(wěn)定性的其它方法。例如，可選擇市售的或研究中使用的各種交聯(lián)劑或方法，用于這些目的。可能有用的試劑是戊二醛，它已廣泛用于探究非共價(jià)締合的多聚體蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，即通過(guò)使組成性亞基交聯(lián)，形成穩(wěn)定的綴合物(Silva等，F(xiàn)oodTechnolBiotechnol.2004;42:M-56)。兩種涉及蛋白質(zhì)亞基氧化交聯(lián)的化學(xué)方法也令人感興趣。一個(gè)方法是近端標(biāo)記#支術(shù)(proximitylabelingtechnique),采用六組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)(Fancy等，ChemBiol.1996;3:551-559)或N端甘氨酸-甘氨酸-組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)(Brown等，Biochemistry.1998;37:4397-4406)。這些標(biāo)記與Ni(II)緊密結(jié)合，當(dāng)用過(guò)酸氧化時(shí)，生成Ni(m),Ni(m)能介導(dǎo)各種氧化反應(yīng)，包括蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)交聯(lián)。稱(chēng)為picup(未修飾蛋白質(zhì)的光誘導(dǎo)交聯(lián))的另一技術(shù)采用[Ru(II)(bipy)3:T、過(guò)硫酸銨和可見(jiàn)光，以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)交聯(lián)(Fancy和Kodadek.ProcNatlAcadSciUSA.1999;96:6020-6024)。然而，如下所述，用于化學(xué)交聯(lián)肽、多肽、蛋白質(zhì)或其它各種大分子的多種方法是本領(lǐng)域已知的，任何這樣的已知方法都可用于使a2b結(jié)構(gòu)共價(jià)穩(wěn)定?？梢杂靡蟊Ｗo(hù)的方法和組合物開(kāi)發(fā)各種產(chǎn)物。例如，考慮了至少6類(lèi)基于蛋白質(zhì)或基于肽的產(chǎn)物，其由穩(wěn)定束縛裝配的基因工程結(jié)構(gòu)組成1類(lèi)雙特異性三價(jià)321)復(fù)合物，由兩個(gè)來(lái)自同一單克隆抗體(mAb)的Fab或scFv片段以及一個(gè)來(lái)自不同mAb的Fab或scFv片段組成(參見(jiàn)例如表6);2A類(lèi)多功能性a^復(fù)合物，由兩個(gè)來(lái)自同一mAb的Fab或scFv片段以及一個(gè)非免疫球蛋白或肽組成(參見(jiàn)例如表7A);2B類(lèi)多功能性a^復(fù)合物，由兩個(gè)相同的非免疫球蛋白或肽以及一個(gè)來(lái)自mAb的Fab或scFv片段組成(參見(jiàn)例如表7B);3類(lèi)多功能性321)復(fù)合物，由三個(gè)非免疫球蛋白或肽組成，這三個(gè)中有兩個(gè)是相同的(參見(jiàn)例如表8);4類(lèi)三價(jià)33復(fù)合物，由三個(gè)來(lái)自同一mAb的Fab或scFv片段組成(參見(jiàn)例如表9);5類(lèi)三價(jià)33復(fù)合物，由三個(gè)相同的非免疫球蛋白或肽組成(參見(jiàn)例如表10)。技術(shù)人員將會(huì)知道，盡管以上討論涉及Fab或scFv片段，但是在下文中詳細(xì)討論的其它類(lèi)型的抗體和/或抗體片l殳也可被替代。一般來(lái)講，1類(lèi)產(chǎn)物可用于需要雙特異性抗體的各種用途。例如，同時(shí)與活化血小板和組織纖溶酶原激活物(tPA)反應(yīng)的雙特異性抗體不僅能通過(guò)抑制血小板聚集而防止進(jìn)一步形成血凝塊，而且能通過(guò)將內(nèi)源tPA募集到血小板表面而溶解現(xiàn)有的血凝塊(Neblock等，BioconjugateChem.1991,3:126-31)?！愣裕?A類(lèi)和2B類(lèi)產(chǎn)物可用于需要靶特異性遞送或結(jié)合非免疫球蛋白的各種用途。例如，由針對(duì)內(nèi)化胂瘤相關(guān)抗原(例如CD74)及與其連接的毒素(例如核糖核酸酶)的雙價(jià)抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)組成的穩(wěn)定束綽a2b復(fù)合物，對(duì)選擇性遞送毒素以破壞目標(biāo)腫瘤細(xì)胞來(lái)說(shuō)是很重要的。—般而言，3類(lèi)產(chǎn)物可用于更需要兩種不同非免疫球蛋白組合、而非單個(gè)非免疫球蛋白的各種用途。例如，由IL-4R受體的可溶性組分(sIL-4R)以及IL-13受體的可溶性組分(sIL-13R)組成的穩(wěn)定束縛a2b復(fù)合物，將是治療哮喘或變態(tài)反應(yīng)的潛在治療藥。—般而言，4類(lèi)和5類(lèi)產(chǎn)物可用于更需要三價(jià)復(fù)合物、而非其單價(jià)類(lèi)似物的各種用途。例如，與單價(jià)類(lèi)似物(ReoPro,Centocor)或雙價(jià)類(lèi)似物相比，由三個(gè)抗GPIIb/IIIaFab片段組成的穩(wěn)定束縛a3復(fù)合物結(jié)合結(jié)構(gòu)，在預(yù)防血凝塊形成中應(yīng)該更有效，因?yàn)楹笳呔哂懈呓Y(jié)合親合力。在治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和某些其它自身免疫性疾病(AID)中，對(duì)于抑制TNF方面來(lái)說(shuō)，由TNFa-R的可溶性組分的三個(gè)拷貝組成的穩(wěn)定束縛a3復(fù)合物比Enbrel(Amgen)更有效。要求保護(hù)的方法和組合物也包括綴合物，所述綴合物由一種或多種效應(yīng)物或載體及與其連接的a2b或33形式的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)組成。效應(yīng)物或載體可與a2b或a3復(fù)合物非共〗介或共^介連^妄，例如通過(guò)化學(xué)交聯(lián)。根據(jù)所需用途，效應(yīng)物可選自診斷試劑、治療藥、化療藥、放射性同位素、放射性核素、顯像劑(imagingagent)、抗血管生成藥、細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子、藥物、前體藥物、酶、結(jié)合分子、細(xì)胞表面受體的配體、螯合劑、免疫調(diào)節(jié)劑、寡核香酸、激素、光檢測(cè)標(biāo)記、染料、肽、毒素、造影劑(contrastagent)、順磁標(biāo)記、超聲標(biāo)記、促凋亡劑(pro-apoptoticagent)、月旨質(zhì)體、纟內(nèi)米粒或其組合。此外，綴合物可含有不止一種效應(yīng)物(效應(yīng)物可以相同或不同)或不止一種載體(載體可以相同或不同)。效應(yīng)物和載體也可存在于同一綴合物中。當(dāng)效應(yīng)物是螯合劑時(shí)，所得綴合物通常還與金屬絡(luò)合，所述金屬可以是放射性或非放射性的。含有載體的綴合物還可與診斷或治療功能試劑聯(lián)合用于所需用途。在某些實(shí)施方案中，效應(yīng)物或載體可以在給予患者a2b復(fù)合物之后給予，例如在如下討論的預(yù)靶向(pre-targeting)策略中?？上葘2b復(fù)合物給予患者，讓其定位于例如患病組織，例如腫瘤。隨后添加效應(yīng)物或載體，讓其與定位的a2b復(fù)合物結(jié)合。盡管效應(yīng)物或載體與有毒部分(例如放射性核素)綴合，但是這種預(yù)靶向方法減少了患者對(duì)毒性的全身暴露，讓毒性劑按更大比例遞送到靶組織。在這樣的實(shí)施方案中，A亞基可含有例如腫瘤相關(guān)抗原的結(jié)合位點(diǎn)，而B(niǎo)亞基可含有效應(yīng)物或載體的結(jié)合位點(diǎn)或者含有與效應(yīng)物或載體綴合的半抗原的結(jié)合位點(diǎn)。本文所公開(kāi)的方法和組合物能使任何兩個(gè)結(jié)構(gòu)與DDD/AD偶聯(lián)系統(tǒng)定點(diǎn)共價(jià)或非共價(jià)締合。DDD結(jié)構(gòu)特征的X類(lèi)4-螺旋束二聚化基序(Newlon等，EMBOJ.2001;20:1651-1662;Newlon等，NatureStructBiol.1999;3:222-227)存在于其它類(lèi)型的蛋白質(zhì)中，例如S100蛋白(例如S100B和鈣周期蛋白)和轉(zhuǎn)錄因子的肝細(xì)胞核因子(HNF)家族(例如HNF-la和HNF-1(3)。參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)錄活化的超過(guò)300種蛋白質(zhì)也含有6S-70個(gè)氨基酸的模塊，稱(chēng)為不育oc基序(SAM)結(jié)構(gòu)域，其具有在二聚化界面上存在的X類(lèi)4-螺旋束的變化。對(duì)于S100B,該X類(lèi)4-螺旋束能使各二聚體以孩l摩爾親和力與來(lái)自c端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域(殘基367-388)的兩個(gè)p53肽結(jié)合(Rustandi等，Biochemistry.1998;37:1951-1960)。同樣，HNF-loc的N端二聚化結(jié)構(gòu)域(HNF-pl)顯示出通過(guò)HNF-pl二聚體與DCoH二聚體(HNF-1的二聚化輔因子)締合(Rose等，NatureStructBiol.2000;7:744-748)。在替代實(shí)施方案中，這些天然存在的系統(tǒng)也可用于要求保護(hù)的方法和組合物，以提供具有多功能或結(jié)合特異性的穩(wěn)定的多聚體結(jié)構(gòu)。其它結(jié)合事件例如酶與其底物/抑制劑(例如角質(zhì)酶和膦酸西旨)間的結(jié)合事件(Hodneland等，ProcNatlAcdSciUSA.2002;99:5048-5052)也可用于產(chǎn)生兩個(gè)締合組分("停靠"步驟)，其隨后經(jīng)共價(jià)穩(wěn)定化("鎖定"步驟)。在不同實(shí)施方案中，可將題述組合物給予疾病患者，用于治療和/或診斷目的。技術(shù)人員將會(huì)知道，可用多功能性、雙價(jià)、三價(jià)、多特異性或雙特異性復(fù)合物診斷和/或治療的任何疾病，都可用題述組合物治療。示例性的疾病包括但不限于癌癥、增生、神經(jīng)變性性疾病、阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease)、脈管炎、病毒感染、真菌感染、細(xì)菌感染、糖尿病性視網(wǎng)膜病、黃斑變性、自身免疫性疾病、炎性腸病、節(jié)段性回腸炎(Crohn，sdisease)、潰瘍性結(jié)腸炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)病、哮喘、水腫、肺動(dòng)脈高壓、青少年糖尿病、銀屑病、系統(tǒng)性紅斑狼裔、斯耶格倫綜合征(Sj6gren，ssyndrome)、多發(fā)性硬化、重癥肌無(wú)力、膿毒病、角膜移植排斥、新生血管性青光眼、遺傳性出血性毛細(xì)血管擴(kuò)張(Osler-WebberSyndrome)、心肌血管生成、斑塊新血管形成、再狹窄、血管創(chuàng)傷后新內(nèi)膜形成、毛細(xì)管擴(kuò)張、血友病性關(guān)節(jié)、血管纖維瘤、慢性炎癥相關(guān)的纖維化、肺纖維化、深部靜脈血栓形成或傷口肉芽形成。在具體實(shí)施方案中，本文所^開(kāi)的方法和組合物可用于治療自身免疫性疾病(例如急性特發(fā)性血小板減少性紫癜、慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜)、皮肌炎、小舞蹈病(Sydenham'schorea)、重癥肌無(wú)力、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎、風(fēng)濕熱、多腺性綜合征、大皰性類(lèi)天皰癡、青少年糖尿病、亨-舍二氏紫癜(Henoch-Schonleinpurpura)、鏈球菌感染后的腎炎(post-streptococcalnephritis)、結(jié)節(jié)性紅斑、無(wú)脈病(Takayasu，sarteritis)、艾迪生病(Addison'sdisease)、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、結(jié)節(jié)病、潰瘍性結(jié)腸炎、多形性紅斑、IgA腎病、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、關(guān)節(jié)強(qiáng)硬性脊推炎、肺出血腎炎綜合征(Goodpasture'ssyndrome)、閉塞4生血才全'性月永管炎(thromboangitisubiterans)、斯耶格倫綜合征(Sjogren'ssyndrome)、原發(fā)性膽汁性肝硬化、橋本曱狀腺炎(Hashimoto'sthyroiditis),曱狀腺毒癥、硬皮病、慢性活動(dòng)性肝炎、多肌炎/皮肌炎、多軟骨炎、尋常性天皰齊、韋格納肉芽腫病(Wegener，sgranulomatosis)、膜性腎病、肌萎縮性側(cè)索硬化、脊髓癆、巨細(xì)胞動(dòng)脈炎/多肌痛、惡性貧血、急進(jìn)性腎小球性腎炎、銀屑病或纖維性肺泡炎。在某些實(shí)施方案中，穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可用于癌癥的治療性治療?？梢灶A(yù)料，可以靶向任何類(lèi)型的腫瘤和任何類(lèi)型的肺瘤抗原?？梢园蚁虻氖纠阅[瘤類(lèi)型包括急性成淋巴細(xì)胞性白血病、急性髓細(xì)胞性白血病、膽嚢癌、乳癌、宮頸癌、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、慢性髓細(xì)胞性白血病、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、霍奇金淋巴瘤(Hodgkm，slymphoma),肺癌、甲狀腺髓質(zhì)癌、非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin，slymphoma))、多發(fā)性骨髓瘤、腎癌、卵巢癌、胰腺癌、膠質(zhì)瘤、黑素瘤、肝癌、前列腺癌和膀胱癌?？梢园邢虻碾狭鱿嚓P(guān)抗原包括但不限于碳酸酐酶IX、A3、A33抗體特異性抗原、BrE3-抗原、CD1、CDla、CD3、CD5、CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD45、CD74、CD79a、CD80、HLA-DR、NCA95、NCA90、HCG及其亞基、CEA(CEACAM-5)、CEACAM-6、CSAp、EGFR、EGP-1、EGP隱2、Ep-CAM、Ba733、HER2Zneu、低氧誘導(dǎo)因子(HIF)、KC4-抗原、KS-l-抗原、KSl-4、Le-Y、巨復(fù)細(xì)胞抑制因子(MIF)、MAGE、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、PAM-4-抗原、PSA、PSMA、RS5、S100、TAG-72、p53、生腱蛋白、IL-6、IL-8、胰島素生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、腫瘤壞死抗原、VEGF、胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(P1GF)、17-lA-抗原、血管生成標(biāo)記(例如ED-B纖連蛋白)、癌基因標(biāo)記、癌基因產(chǎn)物和其它肺瘤相關(guān)抗原。目前對(duì)腫瘤相關(guān)抗原的報(bào)道包括Mizukami等(2005,NatureMed.11:992-97);Hatfield等(2005,Curr.CancerDrugTargets5:229-48);Vallbohmer等(2005,J.Clin.Oncol.23:3536-44);和Ren等(2005,Ann.Surg.242:55-63),所述各文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。其它實(shí)施方案涉及治療患者的淋巴瘤、白血病或自身免疫病的方法，即通過(guò)給予患者一種或多種劑量的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)，其中第二前體的結(jié)合位點(diǎn)與淋巴細(xì)胞抗原結(jié)合，第一前體的結(jié)合位點(diǎn)與相同或不同的淋巴細(xì)胞抗原結(jié)合。一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)可與選自以下的抗原的一個(gè)或多個(gè)獨(dú)特表位結(jié)合CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD74、C函、CD126、CD13S、CD154、B7、MUC1、Ia、Ii、固1.24、HLA-DR、生腱蛋白、VEGF、P1GF、ED-B纖連蛋白、癌基因、癌基因產(chǎn)物、NCA66a-d、壞死抗原、IL-2、T101、TAG、IL-6、MIF、TRAIL-R1(DR4)和TRAIL-R2(DR5)?？赏ㄟ^(guò)胃腸外給予組合物，劑量例如為每劑20-1500毫克蛋白、每劑20-500毫克蛋白、每劑20-100毫克蛋白、或每劑20-1500毫克蛋白。在又一些實(shí)施方案中，穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可用于治療例如細(xì)菌、病毒或真菌等病原生物感染的患者?？芍委煹氖纠哉婢ㄐ℃莅泳鷮?A/z'cmsporwm)、發(fā)褲菌屬(7>/c/o//^to")、表皮褲菌屬(五/7/de/7wo//2少to")、申克孑包子絲菌(iS/o/Y^n^:sc/^"ch7)、#f型隱3求菌(C7/7tococcMS/7eq/b/72(5fm1)、4丑3求孑包子菌(Cocc/力oz^fes1z'w,m'"力、莢刀莫組織胞漿菌(7iXsto//"5waca戸w/afMw)、皮炎芽生菌(5/osto附;;ces6fermfl"'^fo)或白色念珠菌(C朋WJaa/6Zcan)。示例性的病毒包括人免疫缺陷病毒(HIV)、皰滲病毒、巨細(xì)胞病毒、狂犬病毒、流感病毒、人乳頭瘤病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、仙臺(tái)病毒、貓白血病病毒、呼腸孤病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、人血清細(xì)小病毒樣病毒(parvo-likevirus)、猿猴病毒40、呼吸道合胞病毒、小鼠乳腺腫瘤病毒、水痘帶狀皰滲病毒、登革熱病毒、風(fēng)滲病毒、麻滲病毒、腺病毒、人T細(xì)胞白血病病毒、Epstein-Barr病毒、鼠白血病病毒、肥、腺炎病毒、皰滲性口腔炎病毒、辛德比斯病毒(Sindbisvirus)、淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒或藍(lán)舌病毒。示例性的細(xì)菌包括炭疽芽孢桿菌(5ac〃/ws朋f/irac/s)、無(wú)乳鏈球菌(Sfr，ococcwsaga/a"iae)、嗜肺軍團(tuán)菌(Leg/cwe〃a/wew附o/7/^7/a)、酉良膿葡萄J求菌(5Treptococciw、大腸桿菌(五》c/^n'c/n'"co")、淋病奈瑟氏;求菌(A^/Me廠z'"go"o"/zoeae)、月S膜炎奈瑟氏3求菌(iVe""n'"wem'"gz."cfo)、月巿炎球菌(尸"ewOTococczws/7/7.)、；危感p耆血4干菌B(//ewo/^Z/zi1^)、蒼白密蟲(chóng)累》走體(7>e/o"e/7ap"〃i(iMm)、萊姆病螺旋體(Lymediseasespirochetes)、綠膿々支單月包菌CP^w6fomo/7cwaerwg7'"ora)、麻風(fēng)分4支4干菌(A^yco6actehwm/eprae)、流產(chǎn)布魯氏桿菌(3race〃a"/wm^)、結(jié)核分枝桿菌(A/j/coMcten'wwfw6en^/o57力或支原體(A^yco;7/as7wa)。這些穩(wěn)、定束縛結(jié)構(gòu)可包含例如針對(duì)病原體上一個(gè)或多個(gè)抗原決定簇的結(jié)合位點(diǎn)，并且可以與針對(duì)病原體的治療藥綴合或連接，所述治療藥例如抗病毒藥、抗生素或抗真菌藥。或者，穩(wěn)定束縛綴合物可包含針對(duì)病原體抗原的第一結(jié)合位點(diǎn)和針對(duì)半抗原或載體的第二結(jié)合位點(diǎn)，所述半抗原或載體與一種或多種治療藥連接。所采用的針對(duì)感染性生物體的、并綴合或摻入或定向結(jié)合所述穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)的治療藥，包括但不限于阿昔洛韋、阿苯達(dá)唑、金剛烷胺、阿米卡星、阿莫西林、兩性霉素B、氨千西林、氨曲南、阿奇霉素、桿菌肽、復(fù)方新諾明(bactrim)、巴特芬(Batmfen)⑤、聯(lián)苯千唑、羧千西林、卡泊芬凈、頭孢克洛、頭孢唑林、頭孢菌素類(lèi)(cephalosporins),頭孢吡肟、頭孢曲松、頭孢噻肟、氯霉素、西多福韋、鹽酸環(huán)丙沙星制劑(Cipro)⑧、克拉霉素、克拉維酸、克霉唑、氯唑西林、多西環(huán)素、益康唑、erythrocycline、紅霉素、甲竭峻、氟康唑、氟胞嘧啶、膦曱酸、呋喃唑酮、更昔洛韋、慶大霉素、亞胺培南、異煙肼、伊曲康唑、卡那霉素、酮康唑、林可霉素、利奈唑胺、美羅培南、咪康唑、米諾環(huán)素、萘替芬、萘啶酸、新霉素、奈替米星、呋喃妥因、制霉菌素、奧塞米韋、苯唑西林、巴龍霉素、青霉素、噴他脒、喊拉西纟木-三唑巴坦、利福布汀、利福平、金剛乙胺、鏈霉素、磺胺甲嗯唑、柳氮磺吡啶、四環(huán)素、噻康唑、妥布霉素、托西拉酯、托萘酯、甲氧千啶-磺胺甲嗨唑、伐昔洛韋、萬(wàn)古霉素、zanamir和zithromycin。盡管并非限制性的，在不同實(shí)施方案中，摻入到穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)中的前體可包含一種或多種蛋白質(zhì)，例如細(xì)菌毒素、植物毒素、蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌腸毒素-A、美洲商陸抗病毒蛋白、多花白樹(shù)毒蛋白、白喉毒素、假單胞菌外毒素、假單胞菌內(nèi)毒素、豹蛙酶(Rap)、Rap(N的Q)、PE38、dgA、DT390、PLC、tPA、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、可溶性受體組分、表面活性蛋白D、IL-4、sIL-4R、sIL-13R、VEGF121、TPO、EPO、溶血栓劑、酶、焚光蛋白、sTNFa-R、avimer、scFv、dsFv或納米抗體(nanobody)。在其它實(shí)施方案中，抗血管生成藥可形成前體的一部分或全部，或者可與穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)連接。使用的示例性抗血管生成藥包括血管生長(zhǎng)抑素、baculostatin、人血管能抑素(canstatin)、乳腺絲抑蛋白、抗VEGF抗體或肽、抗胎盤(pán)生長(zhǎng)因子抗體或肽、抗Flk-l抗體、抗Flt-l抗體或肽、層粘連蛋白肽、纖連蛋白肽、纖溶酶原激活物抑制劑、組織金屬蛋白酶抑制劑、干擾素、白介素12、IP-IO、Gro-p、血小板應(yīng)答蛋白(thrombospondin)、2-曱氧基雌二醇、增殖蛋白相關(guān)蛋白、carboxiamidotriazole、CM101、馬立馬司他、戊聚糖多聚石克酸酯(pentosanpolysulphate)、促血管生成素2、干擾素-ot、除莠霉素A、PNU145156E、16K催乳素片段、利諾胺、沙利度胺、己酮可可石威、染料木堿、TNP-470、內(nèi)皮生長(zhǎng)抑素、紫杉醇、accutin、血管生長(zhǎng)抑素、西多福韋、長(zhǎng)春新堿、博來(lái)霉素、AGM-1470、血小板因子4或米諾環(huán)素。在又一些實(shí)施方案中，一種或多種例如以下的治療藥可與穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)綴合或者摻入到其中aplidin、阿4L立平、阿那曲唑、氮雜胞苷、博來(lái)霉素、硼替佐米(bortezomib)、苔蘚抑素-1、白消安、加利車(chē)霉素、喜樹(shù)堿、10-羥基喜樹(shù)堿、卡莫司汀、西樂(lè)葆、苯丁酸氮芥、順鉑、伊立替康(CPT-ll)、SN-38、卡鉑、克拉曲濱、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、達(dá)卡巴嗪、多西他賽、放線菌素D、葡糖苷酸道諾霉素、柔紅霉素、地塞米松、己烯雌酚、多栗比星、二氫吡咯多柔比星(2P-DOX)、氰基嗎啉代多柔比星、葡糖普酸多柔比星、葡糖苷酸表柔比星、炔雌醇、雌莫司汀、依托泊苷、葡糖苷酸依托泊苷、磷酸依托泊苷、氟尿苷(FUdR)、3',5'-0-二油?；?FudR(FUdR-dO)、氟達(dá)拉濱、氟他胺、氟尿嘧啶、氟曱睪酮、吉西他濱、己酸羥孕酮、羥基脲、伊達(dá)比星、異環(huán)磷酰胺、L-天冬酰胺酶、亞葉酸、洛莫司汀、氮芥、醋酸甲羥孕酮(medroprogesteroneacetate)、醋酸甲地孕酮、美法侖、巰基嘌呤、6-巰基嘌呤、曱氨蝶呤、米托蒽醌、光輝霉素、絲裂霉素、米托坦、丁酸苯酯、潑尼松、丙卡巴肼、紫杉醇、噴司他丁、PSI-341、司莫司汀、鏈佐星、他莫昔芬、紫杉烷類(lèi)、泰素、丙酸睪酮、沙利度胺、硫鳥(niǎo)嘌呤、塞替派、替尼泊苷、托泊替康、烏4立莫司汀、velcade、長(zhǎng)春石成、長(zhǎng)春瑞濱、長(zhǎng)春新石咸、蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶、onconase、mpLRl、DNA酶I、葡萄J求菌腸毒素-A、美洲商陸抗病毒蛋白、多花白樹(shù)毒蛋白、白喉毒素、假單胞菌外毒素、假單胞菌內(nèi)毒素、反義寡核苷酸、干擾RNA或其組合。在其它實(shí)施方案中，第一前體可與患病組織相關(guān)抗原或其它靶標(biāo)結(jié)合，而第二前體可設(shè)計(jì)成與可尋耙構(gòu)建體(targetableconstruct)結(jié)合，用于遞送一種或多種效應(yīng)物。給予穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)并定位于疾病相關(guān)細(xì)胞或組織之后，可以添加可尋耙構(gòu)建體，以結(jié)合定位的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)。任選可給予清除劑，以便從環(huán)境循環(huán)中清除未定位的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)，然后再給予可尋靶構(gòu)建體。這些方法是本領(lǐng)域已知的，詳見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第4,624,846號(hào)、WO92/19273和Sharkey等，Int.J.Cancer51:266(1992)。示例性的可尋草巴構(gòu)建體具有以下結(jié)構(gòu)X-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Y)-NH2,其中該化合物在X或Y上包含硬酸陽(yáng)離子螯合劑，在剩余X或Y上包含軟酸陽(yáng)離子螯合劑；并且其中該化合物還包含至少一種診斷性或治療性陽(yáng)離子，和/或一種或多種螯合的或化學(xué)結(jié)合的治療藥、診斷試劑或酶。診斷試劑可以是例如Gd(III)、Eu(III)、Dy(III)、Pr(III)、Pa(IV)、Mn(II)、Cr(m)、Co(III)、Fe(III)、Cu(II)、Ni(II)、Ti(III)、V(IV)離子或基團(tuán)。第二個(gè)示例性的構(gòu)建體可以是下式X-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Y)-NH2，其中該化合物在X或Y上包含硬酸陽(yáng)離子螯合劑或軟酸螯合劑，而在剩余X或Y上沒(méi)有；并且其中該化合物還包含至少一個(gè)診斷性或治療性陽(yáng)離子，和/或一種或多種螯合的或化學(xué)結(jié)合的治療藥、診斷試劑或酶。不同實(shí)施方案可涉及用于誘導(dǎo)患病細(xì)胞凋亡的穩(wěn)定束縳結(jié)構(gòu)及其使用方法。詳情可參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布號(hào)20050079184，所迷專(zhuān)利申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容都通過(guò)引用結(jié)合到本文中。這類(lèi)結(jié)構(gòu)可包含具有針對(duì)選自以下抗原的結(jié)合親和性的第一和/或第二前體CD2、CD3、CD8、CDIO、CD21、CD23、CD24、CD25、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD48、CD52、CD55、CD59、CD70、CD74、CD80、CD86、CD138、CD147、HLA-DR、CEA、CSAp、CA-125、TAG-72、EFGR、HER2、HER3、HER4、IGF-1R、c-Met、PDGFR、而C1、固C2、固C3、MUC4、TNFR1、TNFR2、NGFR、Fas(CD95)、DR3、DR4、DR5、DR6、VEGF、PIGF、ED-B纖連蛋白、生腱蛋白、PSMA、PSA、碳酸酐酶IX和IL-6。在更具體的實(shí)施方案中，用于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)可包含單克隆抗體、Fab片段、嵌合抗體、人源化抗體或人抗體或片段。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可包含以下抗體的組合抗CD74X抗CD20、抗CD74X抗CD22、抗CD22X抗CD20、抗CD20X抗HLA-DR、抗CD19X抗CD20、抗CD20X抗CD80、抗CD2X抗CD25、抗CD8X抗CD25和抗CD2X抗CD147。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，嵌合抗體、人源化抗體或人抗體或抗體片段可來(lái)自LL2(抗CD22)、LL1(抗CD74)或A20(抗CD20)的可變區(qū)。不同實(shí)施方案可涉及治療炎性和免疫失調(diào)疾病、感染性疾病、病理性血管生成或癌癥的方法。在本申請(qǐng)中，穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)與選自以下的兩個(gè)不同靶標(biāo)結(jié)合(A)先天免疫系統(tǒng)的促炎效應(yīng)物，(B)凝血因子，(C)補(bǔ)體因子和補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白，和(D)與炎性或免疫失調(diào)障礙或與病理性血管生成或癌癥特異性相關(guān)的靶標(biāo)，其中后一靶標(biāo)不是(A)、(B)或(C)。至少一個(gè)靶標(biāo)是(A)、(B)或(C)。合適的靶標(biāo)組合參見(jiàn)美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第60/634,076(2004年12月8日申請(qǐng)，發(fā)明名稱(chēng)為"MethodsandCompositionsforImmunotherapyandDetectionofInflammatoryandImmune-DysregulatoryDisease,InfectiousDisease,PathologicAngiogenesisandCancer"),所迷臨時(shí)申i青的內(nèi)容通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。結(jié)合分子可結(jié)合的先天免疫系統(tǒng)的促炎效應(yīng)物，可以是促炎效應(yīng)物細(xì)胞因子、促炎效應(yīng)物趨化因子或促炎效應(yīng)物受體。合適的促炎效應(yīng)物細(xì)胞因子包括MIF、HMGB-1(高遷移率族框蛋白1(highmobilitygroupboxproteinl))、TNF-a、IL-1、IL-4、IL-5、IL-6、IL隱8、IL-12、IL-15和IL-18。促炎效應(yīng)物趨化因子的實(shí)例包括CCL19、CCL21、IL-8、MCP-1、RANTES、MIP-1A、MIP-1B、ENA-78、MCP-1、IP-IO、GROB和嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子(Eotaxin)。促炎效應(yīng)物受體包括IL-4R(白介素-4受體)、IL-6R(白介素-6受體)、IL-UR(白介素-13受體)、IL-15R(白介素-15受體)和IL-18R(白介素-18受體)。結(jié)合分子也可與至少一種凝血因子(尤其是組織因子(TF)或凝血酶)發(fā)生特異性反應(yīng)。在其它實(shí)施方案中，結(jié)合分子與至少一種補(bǔ)體因子或補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白特異性反應(yīng)。在優(yōu)選的實(shí)施方案種，補(bǔ)體因子選自C3、C5、C3a、C3b和C5a。當(dāng)結(jié)合分子與補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白特異性反應(yīng)時(shí)，補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白優(yōu)選選自CD46、CD55、CD59和mCRP。附圖簡(jiǎn)述圖1顯示兩個(gè)示例性DDD序列。DDD1中加下劃線的序DDD2(SEQIDNO:2)在N端有兩個(gè)氨基酸與DDD1不同。圖2顯示兩個(gè)示例性AD序列。AD1中加下劃線的序列(SEQIDNO:3)對(duì)應(yīng)于AKAP-w，它是據(jù)報(bào)道Kd為0.4nM的優(yōu)化RII-選才奪性肽。也顯示了AD2(SEQIDNO:4)。圖3顯示RII的DDD與AKAP的AD之間相互作用的結(jié)構(gòu)模型。圖4顯示N-DDD2-Fab-hMN-14(A)以及由DDD2介導(dǎo)的二聚化而形成的推定的a2結(jié)構(gòu)(B)的示意圖。圖5顯示N-DDD2-VH-hMN-14-pdHL2質(zhì)粒表達(dá)載體的設(shè)計(jì)。圖6顯示C-DDD2-Fab-hMN-14(A)以及由DDD2介導(dǎo)的二聚化而形成的推定的a2結(jié)構(gòu)(B)的示意圖。圖7顯示C-DDD2-VH-hMN-14-pdHL2質(zhì)粒表達(dá)載體的設(shè)計(jì)。A)及其推定的結(jié)構(gòu)(B)的示意圖。圖9顯示h6"-VH-AD2-pdHL2質(zhì)粒表達(dá)載體的設(shè)計(jì)。圖10顯示用IMP-291-Affigel純化的h679-Fab-AD2的SE-HPLC分析。圖11顯示h679-Fab-AD2ds(A)通過(guò)還原而活化成h679-Fab-AD2(B)的示意圖。圖12顯示用CBindL(蛋白L纖維素)純化的N-DDD2-Fab-hMN-14中占優(yōu)勢(shì)存在34型。SE-HPLC描記圖也揭示了存在a2型，以及以單體形式和二聚體形式存在的游離輕鏈。圖13顯示當(dāng)用5mMTCEP還原時(shí)，純化的N-DDD2-Fab-hMN-14中存在的34型解離成32型，5mMTCEP也將二聚體輕鏈轉(zhuǎn)化成單體輕鏈。圖14顯示當(dāng)還原時(shí)，N-DDD2-Fab-hMN-14的a4型(A)轉(zhuǎn)化成a2型(B)的示意圖。圖15顯示用CBindL(蛋白L纖維素)純化的C-DDD2-Fab-hMN-14中占優(yōu)勢(shì)存在34型。SE-HPLC描記圖也揭示了存在a2型，以及以單體形式和二聚體形式存在的游離輕鏈圖16顯示當(dāng)用5mMTCEP還原時(shí)，純化的C-DDD2-Fab-hMN-14中存在的34型解離成32型。圖17顯示(A)在還原條件下當(dāng)N-DDD2-Fab-hMN-14與h679-Fab-AD2混合時(shí)所形成的非共價(jià)a2b復(fù)合物和(B)通過(guò)二6H橋形成的共價(jià)TF1結(jié)構(gòu)的示意圖?！?059]圖18顯示包括產(chǎn)生TF1的步驟的SE-HPLC分析。圖A顯示在添加TCEP之前含有N-DDD2-Fab-hMN-14和h679-Fab-AD2的反應(yīng)混合物。圖B顯示在添加5mMTCEP之后，形成非共價(jià)a2b復(fù)合物。圖C顯示用10%DMSO處理后經(jīng)二斬J建連接的產(chǎn)物。圖D顯示經(jīng)IMP-291-親和色譜和制備型SE-HPLC后TF1的純度。圖19顯示在BIAcore分析所采用的條件下，僅共價(jià)TF1結(jié)構(gòu)能同時(shí)結(jié)合HSG(作為IMP-239固定在傳感器芯片上)和WI2(針對(duì)hMN-14的抗id)。N-DDDl-Fab-hMN-14與h679-Fab-ADl之間所形成的非共價(jià)a2b復(fù)合物未能捕獲WI2,雖然已與偶聯(lián)HSG的傳感器芯片結(jié)合。圖20顯示TF1含有hMN-14的兩個(gè)功能性結(jié)合位點(diǎn)，因?yàn)樗芙Y(jié)合WI2的兩個(gè)Fab分子。圖21顯示在組分A和B的DDD和AD序列中戰(zhàn)略性放置半胱氨酸殘基的作用，以影響穩(wěn)定結(jié)構(gòu)(N-DDD2+AD2)的形成，該結(jié)構(gòu)在BIAcore分析所采用的條件下能同時(shí)結(jié)合HSG(作為IMP-239固定在傳感器芯片上)和WI2(針對(duì)hMN-14的抗id)。在DDD與AD特異性結(jié)合后，當(dāng)組分A不能與組分B形成二硫鍵時(shí)，所得321>復(fù)合物在BIAcore分析所采用的條件下不夠穩(wěn)定，不能保持結(jié)合在一起。32與b解離是明顯的，因?yàn)閺?fù)合物(N-DDD1+AD2)不能捕獲WI2。圖22顯示IMP-291親和純化之前(A)和之后(B)的SE-HPLC分析。將過(guò)量N-DDD2-Fab-hMN-14與h679-Fab-AD2混合，以保證在IMP-291親和色譜后，沒(méi)有游離h679-Fab-AD2與穩(wěn)定束縛復(fù)合物一起純化出來(lái)。圖23顯示TF2的示意圖。圖24顯示包括產(chǎn)生TF2的步驟的SE-HPLC分析。圖A顯示在添加TCEP之前含有C-DDD2-Fab-hMN-14和h679-Fab-AD2的反應(yīng)混合物。圖B顯示在添加5mMTCEP之后形成非共價(jià)a2b復(fù)合物。圖25顯示對(duì)TF2的IMP-291親和純化的SE-HPLC分析。圖A顯示上樣到IMP-291-affigel之前的TF2。圖B顯示未結(jié)合流分。圖C顯示結(jié)合流分，僅包含TF2。圖26顯示TF2的(A)非還原性和(B)還原性SDS-PAGE分析。圖27顯示TF2的MALDI-TOF質(zhì)i普分析。圖28顯示通過(guò)BIAcore分析，TF2與HSG(固定在傳感器芯片上)和WI2的結(jié)合。圖29顯示TF2含有hMN-14的兩個(gè)功能性結(jié)合位點(diǎn)，因?yàn)樗芙Y(jié)合WI2的兩個(gè)Fab分子。圖30顯示比較TF1、TF2和hMN-14IgG對(duì)CEA的親合力的竟?fàn)幮訣LISA結(jié)果。圖31顯示在7天為一個(gè)周期，監(jiān)測(cè)TF2在合并人血清中的穩(wěn)定性結(jié)果。在濃度或雙特異性結(jié)合活性方面都沒(méi)有觀察到可;險(xiǎn)測(cè)變化。圖32顯示注射99mTc-IMP-245的、用TF2預(yù)靶向的棵鼠體內(nèi)造影。給雌性無(wú)胸腺棵鼠皮下(s.c.)注射1x107LS-174T腫瘤細(xì)胞/小鼠。一周后，平均腫瘤大小為0.105±0.068cm3。給20只為一組的第一組小鼠每只注射80嗎125I-TF2(500pmol,2pCi),在給予TF2后16小時(shí)給予99mTc-IMP-245(40^Ci，92ng，50pmol)(圖像中上面一排)。笫二組小鼠僅給予99mTc-IMP-245,沒(méi)有TF^圖像中下面一排)。注射99mTc-IMP-245后1、4和24小時(shí)的圖像顯示出強(qiáng)的胂瘤特異性信號(hào)，TF2定位于腫瘤(上面一排)。不同于腫瘤，在1小時(shí)時(shí)僅膀胱具有強(qiáng)烈信號(hào)，表明從尿液中排出。在不存在TF2時(shí)僅觀察到非特異性分布(下面一排)。數(shù)據(jù)表明，TF2對(duì)體內(nèi)應(yīng)用來(lái)說(shuō)是高度穩(wěn)定的，能提供良好的肺瘤造影。發(fā)明詳述在某些實(shí)施方案中，提供了新的a2b形式的穩(wěn)定束縛二元復(fù)合物及其制備方法。一般而言，二元復(fù)合物是由非共價(jià)連接的同型二聚體結(jié)構(gòu)(稱(chēng)為A或a。與第二結(jié)構(gòu)(稱(chēng)為B或b)經(jīng)位點(diǎn)特異性締合而形成。所得a2b結(jié)構(gòu)可經(jīng)A與B間非共價(jià)、或優(yōu)選共〗介相互作用(例如二硫鍵)而穩(wěn)定。A是由兩個(gè)相同亞基構(gòu)成，其中每個(gè)亞基都由前體與肽序列連接而組成，稱(chēng)為二聚化和4f靠結(jié)構(gòu)域(DDD),在優(yōu)選實(shí)施方案中DDD來(lái)自依賴(lài)cAMP的蛋白激酶(PKA)。亞基中所含的DDD結(jié)構(gòu)域自發(fā)締合形成穩(wěn)定的同型二聚體，而這樣的締合又對(duì)肽序列產(chǎn)生具有高親和性的結(jié)合位點(diǎn)，稱(chēng)為錨定結(jié)構(gòu)域(AD),該AD在例如各種A-激酶錨定蛋白(AKAP)中存在，而且在B中含有。因此，B由前體與AD連接而組成。通過(guò)AD肽與(DDD)2結(jié)合位點(diǎn)的相互作用，很容易地進(jìn)行二元復(fù)合物的裝配。DDD肽可插入到幾乎任何多肽序列中或束縛到任何前體中，只要這樣的衍生不干擾其二聚化、以及與AD肽結(jié)合的能力。同樣，AD肽可插入到幾乎任何多肽序列中或束綽到任何前體中，只要這樣的衍生不干擾其與同型二聚體DDD結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合。該模塊方法是高度通用的，可用于將幾乎任何A與任何B結(jié)合形成二元裝配物，該二元裝配物含有來(lái)自A的前體的兩個(gè)亞基(32)和來(lái)自B的前體的一個(gè)亞基(b)。當(dāng)A和B的前體都含抗體結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域可與第二抗體結(jié)構(gòu)域締合產(chǎn)生抗原結(jié)合位點(diǎn)(例如Fab或scFv)，則所得a2b復(fù)合物是雙特異性和三價(jià)的。在某些實(shí)施方案中，二元復(fù)合物可通過(guò)例如化學(xué)綴合而與效應(yīng)物(例如配體或藥物)連接，與載體(例如葡聚糖或納米粒)連接，或同時(shí)與效應(yīng)物和載體連接，通過(guò)這樣的修飾而具有額外用途。因?yàn)槎獜?fù)合物的穩(wěn)定性基本取決于A中所含的DDD對(duì)B中所含的AD的結(jié)合親和性，經(jīng)平衡尺寸排阻HPLC分析估計(jì)，對(duì)于兩種原型a2b結(jié)構(gòu)來(lái)說(shuō)，其親和性不大于8nM(描述于實(shí)施例5)，這兩種原型是C端融合AD1構(gòu)建體(h679-Fab-ADl，參見(jiàn)實(shí)施例3)至C端或N端融合DDD1構(gòu)建體(C-DDDl-Fab-hMN-14或N-DDD1-Fab-hMN-14,都參見(jiàn)實(shí)施例4)而形成，共價(jià)連接a2b復(fù)合物中所含的A和B，將會(huì)防止各個(gè)亞基的不合要求的締合，因而方便體內(nèi)應(yīng)用。為了使二元復(fù)合物穩(wěn)定，可將半胱氨酸殘基引入DDD和AD序列的戰(zhàn)略位置上，使DDD與AD間能形成二好"建?？刹捎闷渌椒ɑ虿呗裕ㄟ^(guò)使32和b交聯(lián)而形成穩(wěn)定復(fù)合物。例如，采用戊二醛或PICUP方法，組成性亞基可以低特異性方式、以低效率，彼此共價(jià)連接。也可使用其它已知的共價(jià)交聯(lián)方法。定義在下面的描述中，使用各種術(shù)語(yǔ)，提供以下定義以便于理解本文所公開(kāi)的內(nèi)容。尚未明確定義的術(shù)語(yǔ)按其通常含義來(lái)使用。包括復(fù)數(shù)形式。本文所用的術(shù)語(yǔ)"和"和"或"可用于指與(conjunctive)或析取(disjunctive)。也就是說(shuō)，這兩個(gè)術(shù)語(yǔ)應(yīng)當(dāng)理解為等同于"和/或"，除非另有說(shuō)明。錨定結(jié)構(gòu)域(anchoringdomam,AD)是對(duì)二聚化DDD序列具有結(jié)合親和性的肽序列。盡管示例性AD序列可得自任何A-激酶錨定蛋白(AKAP),但也可使用其它已知AD序列。術(shù)語(yǔ)前體按其物質(zhì)的通常含義來(lái)使用，自該物質(zhì)能形成更穩(wěn)定而確定的產(chǎn)物或終產(chǎn)物。本文所用的結(jié)合分子、結(jié)合部分或靶向分子是可特異性結(jié)合耙分子、細(xì)胞、復(fù)合物和/或組織的任何分子。結(jié)合分子可包括但不限于抗體或其片段、類(lèi)似物或模擬物、avimer、適體或把向肽。本文所述的抗體是指全長(zhǎng)(即天然存在的或經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)免疫球蛋白基因片段重組方法而形成的)免疫球蛋白分子(例如IgG抗體)或免疫活性(即特異性結(jié)合)部分或免疫球蛋白分子類(lèi)似物，例如抗體片段?？贵w片段是抗體部分，例如F(ab)2、F(ab')2、Fab、Fv、sFv等。無(wú)論其結(jié)構(gòu)如何，抗體片段所結(jié)合的抗原與完整抗體所識(shí)別的抗原相同。術(shù)語(yǔ)"抗體片段"也包括任何合成或基因工程蛋白質(zhì)，其作用類(lèi)似于抗體，是通過(guò)結(jié)合特異性抗原而形成復(fù)合物。例如，抗體片段包括由可變區(qū)組成的分離的片段(例如由重鏈和輕鏈可變區(qū)組成的"Fv"片段)、重組單鏈多肽分子(其中輕鏈和重鏈可變區(qū)由肽接頭連接("scFv蛋白"))以及最小識(shí)別單元(由模擬超變區(qū)的氨基酸殘基組成)。效應(yīng)物是產(chǎn)生所選結(jié)果的原子、分子或化合物。效應(yīng)物可包括治療藥和/或診斷試劑。治療藥是可用于治療疾病的原子、分子或化合物。治療藥的實(shí)例包括抗體、抗體片段、肽、藥物、毒素、酶、核酸酶、激素、免疫調(diào)節(jié)劑、反義寡核苷酸、小干擾RNA(siRNA)、螯合劑、硼化合物、光敏劑、染料和放射性同位素。所采用的其它示例性治療藥和方法公開(kāi)于美國(guó)專(zhuān)利公布號(hào)20050002945、20040018557、20030148409和20050014207，所述各專(zhuān)利通過(guò)引用結(jié)合到本文中。診斷試劑是可用于診斷疾病的原子、分子或化合物。有用的診斷試劑包括但不限于放射性同位素、染料(例如帶有生物素-鏈霉抗生物素復(fù)合物)、造影劑、熒光化合物或分子以及用于磁共振成像(MRI)的增強(qiáng)劑(例如順磁離子)。免疫綴合物是結(jié)合分子(例如抗體組分)與原子、分子或高級(jí)結(jié)構(gòu)(例如與載體、治療藥或診斷試劑)的綴合物。[OO卯]棵抗體是未與任何其它藥物或試劑綴合的抗體。載體是能與治療藥或診斷試劑締合、以便將這些藥物或試劑遞送到靶細(xì)胞的原子、分子或高級(jí)結(jié)構(gòu)。載體可包含脂質(zhì)(例如能形成高級(jí)結(jié)構(gòu)的兩親性脂質(zhì))、多糖(例如葡聚糖)、肽、蛋白質(zhì)或其它高級(jí)結(jié)構(gòu)，例如膠束(micelle)、脂質(zhì)體或納米粒。本文所用的術(shù)語(yǔ)抗體融合蛋白是重組產(chǎn)生的抗原結(jié)合分子，其中具有相同或不同特異性的兩個(gè)以上相同或不同scFv或抗體片段連接在一起。融合蛋白的價(jià)表示融合蛋白對(duì)單個(gè)抗原或表位具有多少結(jié)合臂或位點(diǎn)；即單價(jià)、雙價(jià)、三價(jià)或多價(jià)?？贵w融合蛋白的多價(jià)表明它在結(jié)合抗原時(shí)可利用多重相互作用，因此增加了結(jié)合抗原的親合力。特異性表示抗體融合蛋白能結(jié)合多少抗原或表位；即單特異性、雙特異性、三特異性、多特異性。使用這些定義，天然抗體(例如IgG)是雙價(jià)的，因?yàn)榫哂袃蓚€(gè)結(jié)合臂，但卻是單特異性的，因?yàn)槟芙Y(jié)合一個(gè)表位。單特異性的多價(jià)融合蛋白具有不止一個(gè)表位結(jié)合位點(diǎn)，但只結(jié)合一個(gè)這樣的表位，例如雙鏈抗體具有能與同一抗原反應(yīng)的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。融合蛋白可包含單個(gè)抗體組分、不同抗體組分的多價(jià)或多特異性組合、或者同一抗體組分的多個(gè)拷貝。融合蛋白還可包含抗體或抗體片段以及治療藥。適用于這樣的融合蛋白的治療藥的實(shí)例包括免疫調(diào)節(jié)劑("抗體-免疫調(diào)節(jié)劑融合蛋白")和毒素("抗體-毒素融合蛋白")。一個(gè)優(yōu)選的毒素包括核糖核酸酶(RNA酶)，優(yōu)選重組RNA酶。多特異性抗體是能同時(shí)結(jié)合不同結(jié)構(gòu)的至少兩個(gè)靶標(biāo)(例如兩種不同抗原、同一抗原的兩個(gè)不同表位、或半抗原和/或抗原或表位)的抗體。多價(jià)抗體是能同時(shí)結(jié)合相同或不同結(jié)構(gòu)的至少兩個(gè)耙標(biāo)的抗體。雙特異性抗體是能同時(shí)結(jié)合不同結(jié)構(gòu)的兩個(gè)耙標(biāo)的抗體。特別令人感興趣的雙特異性抗體和雙特異性抗體片段具有至少一個(gè)臂(該臂能特異性結(jié)合例如B細(xì)胞、T細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、漿細(xì)胞和肥大細(xì)胞抗原或表位)以及至少一個(gè)其它臂(該臂能特異性結(jié)合攜帶治療藥或診斷試劑的可尋靶綴合物)。本文所用的功能性蛋白質(zhì)是具有生物活性的蛋白質(zhì)。如果所給予的劑量具有生理上的意義時(shí)，就可以說(shuō)是以"治療有效量"給予抗體或免疫綴合物制劑或本文所述的組合物。當(dāng)受體哺乳動(dòng)物的生理狀態(tài)因一種藥物或試劑的存在而導(dǎo)致可檢測(cè)的變化時(shí)，該藥物或試劑就具有生理上的意義。具體地講，當(dāng)抗體制劑的存在產(chǎn)生了抗腫瘤反應(yīng)或減輕自身免疫性疾病狀態(tài)的體征和癥狀時(shí)，該制劑就具有生理上的意義。生理意義的效果也可以是誘導(dǎo)受體哺乳動(dòng)物的體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答，導(dǎo)致生長(zhǎng)抑制或靶細(xì)胞死亡。如果給予的組合物是受體患者可耐受的，就可以說(shuō)該組合物是"藥學(xué)上可接受的載體"。無(wú)菌磷酸緩沖鹽溶液就是藥學(xué)上可接受的載體的一個(gè)實(shí)例。其它合適載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。參見(jiàn)例如REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES,第19X反(MackPublishingCo.1995)和GoodmanandGilman的THEPHARMACOLOGICALBASISOFTHERAPEUTICS(Goodman等編著.MacmillanPublishingCo.,NewYork,1980和2001出版)。產(chǎn)生模塊亞基的穩(wěn)定束縛裝配的方法本文所公開(kāi)的方法和組合物提供產(chǎn)生模塊亞基的穩(wěn)定束縛裝配的平臺(tái)技術(shù)。一個(gè)實(shí)施方案涉及由兩個(gè)確定組分(A和B)形成的穩(wěn)定束縛二元復(fù)合物，這兩個(gè)組分優(yōu)選分別制備。然而，在替代實(shí)施方案中，A和B可一起制備，例如通過(guò)用同時(shí)編碼A和B的載體、或者用分別編碼A和B的兩個(gè)不同載體轉(zhuǎn)染單細(xì)胞系。當(dāng)A和B都是Fab片段時(shí)，優(yōu)選分別制備，否則，如果同時(shí)制備的話，將會(huì)因輕鏈顛倒(scrambling)而產(chǎn)生不同產(chǎn)物。在某些實(shí)施方案中，由兩個(gè)相同亞基(a》組成的A與由一個(gè)亞基(b)組成的B結(jié)合，形成a2b構(gòu)型的裝配。A與B的締合是位點(diǎn)特異性的，而且是自發(fā)的，因?yàn)锳和B中分別構(gòu)建的DDD與AD序列間具有強(qiáng)烈的結(jié)合相互作用。A和B都可以是任何實(shí)體，連接DDD的A的前體可與連接AD的B的前體不同或相同。在后一種情況下，所得a2b復(fù)合物(稱(chēng)為33)由三個(gè)亞基組成，每個(gè)亞基都含有相同前體，但都連接DDD和AD。要求保護(hù)的方法和組合物的模塊特性允許將任何A與任何B組合。對(duì)可連接A和B或者摻入其中的前體類(lèi)型基本上沒(méi)有限制，只要它們不妨礙DDD二聚化或DDD與AD的結(jié)合。當(dāng)經(jīng)重組工程而構(gòu)建時(shí)，可在不同宿主細(xì)胞中獨(dú)立制備(或者在如上所述的同一宿主細(xì)胞中制備)、純化并貯存A和B。然而，在裝配之前，并非絕對(duì)需要對(duì)A和B進(jìn)行純化。在合適條件下，可將含有A和B的細(xì)胞提取物或培養(yǎng)物直接混合，從而形成二元復(fù)合物，然后在氧化后通過(guò)二硫鍵而穩(wěn)定該復(fù)合物，再進(jìn)行純化。在某些應(yīng)用中，最好在純化之后、與A混合之前，將B與效應(yīng)物或載體綴合?；蛘撸詈迷诩兓?、與B混合之前，將A與效應(yīng)物或載體綴合。最好在混合之前，還用效應(yīng)物或載體修飾A和B。另外，在某些應(yīng)用中，最好將a2b復(fù)合物與效應(yīng)物或栽體綴合。當(dāng)在同一宿主細(xì)胞中制備A和B時(shí)，它們可自發(fā)裝配成321)復(fù)合物。優(yōu)選的實(shí)施方案利用依賴(lài)cAMP的蛋白激酶(PKA)調(diào)節(jié)亞基與天然存在的A-激酶錨定蛋白(AKAP)錨定結(jié)構(gòu)域之間的特定的蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)相互作用。PKA于1968年首次報(bào)道(參見(jiàn)Walsh等，J.Biol.Chem.243:3763-65(1968.))。在二十世紀(jì)七十年代中期才闡明全酶結(jié)構(gòu)，是由兩個(gè)催化亞基組成，這兩個(gè)亞基通過(guò)調(diào)節(jié)(R)亞基二聚體維持無(wú)活性形式(參見(jiàn)Corbin等，J.Biol.Chem.248:1813-21(1973))。發(fā)現(xiàn)兩類(lèi)R亞基(RI和RII)，各自具有a和P同種型。已經(jīng)分離出R亞基，是穩(wěn)定二聚體，而且已經(jīng)知道二聚化結(jié)構(gòu)域是由前44個(gè)氨基端殘基組成(參見(jiàn)Hausken等，J.Biol.Chem.271:29016-22(1996))。作為廣譜絲氨g吏/蘇氨酸激酶的PKA的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)特異性，是通過(guò)全酶經(jīng)?？康鞍?稱(chēng)為A-激酶錨定蛋白(AKAP》區(qū)室化而得到的(Scott等，J.Biol.Chem.265:21561-66(1990》。AKAP(微管相關(guān)蛋白-2)首先于1984年完成表征(Lohmann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.81:6723-27(1984))。迄今為止，已經(jīng)鑒定出了超過(guò)50種結(jié)構(gòu)不同的AKAP，其物種范圍從酵母到人類(lèi)(參見(jiàn)Wong等，NatRevMolCellBiol.12:959-70(2004》。AKAP的PKA錨定結(jié)構(gòu)域是14-18個(gè)殘基的兩親性螺旋(參見(jiàn)Carr等，J.Biol.Chem.266:14188-92(1991))。PKA錨定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列在AKAP中是相當(dāng)多變的，對(duì)RII二聚體的結(jié)合親和性范圍為2-90nM,而對(duì)RI二聚體的結(jié)合親和性低約100倍(參見(jiàn)Alto等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.100:4445-50(2003》。錨定結(jié)構(gòu)域與RII二聚體上由RII的氨基端前23個(gè)殘基所形成的疏水表面相結(jié)合(Colledge等，TrendsCellBiol.6:216-21(1999))。因此，RII二聚化結(jié)構(gòu)域和AKAP結(jié)合結(jié)構(gòu)域全都位于相同的44個(gè)氨基酸序列中。此外，AKAP只與RII二聚體結(jié)合，而不與單體結(jié)合。這種相互作用的結(jié)構(gòu)模型見(jiàn)圖3。通過(guò)DDD和AD序列相互作用而形成的a2b或a3復(fù)合物可以經(jīng)共價(jià)鍵穩(wěn)定，以允許體內(nèi)應(yīng)用。可通過(guò)將半胱氨酸殘基同時(shí)引入DDD和AD序列的戰(zhàn)略位置上而達(dá)到這一目的(如DDD2和AD2所示)，以便在^與b間形成二硫鍵?；蛘撸部刹捎闷渌阎?lèi)型的共價(jià)交聯(lián)。當(dāng)通過(guò)重組工程產(chǎn)生二元復(fù)合物的兩個(gè)組分(A和B)時(shí)，可在同一宿主細(xì)^^內(nèi)合成它們，或更優(yōu)選在兩個(gè)不同的宿主細(xì)^^系內(nèi)合成。指導(dǎo)A合成的表達(dá)載體含有目標(biāo)多肽(J)的DNA序列，該序列與PKAR-亞基的DDD(例如DDDl或DDD2)編碼序列融合，其由RIa、RI(3、RIIa、RIip或任何天然或合成的功能類(lèi)似物的前30個(gè)或更多氨基酸組成。DDD可以直接與j的氨基端或羧基端偶聯(lián)，或者優(yōu)選通過(guò)間隔區(qū)(其含有氨基酸殘基的合適長(zhǎng)度或組成)與j的氨基端或羧基端偶聯(lián)?；蛘?，可將DDD放在融合蛋白內(nèi)部，只要不影響DDD的結(jié)合活性和多肽融合配偶體的所需活性。合成后，A/DDD融合蛋白將會(huì)與DDD1專(zhuān)一地形成穩(wěn)定的同型二聚體(32)或者與DDD2主要形成穩(wěn)定同型四聚體(a》。亞基的模塊特性允許任何DDD2-多肽二聚體與任何AD2-多肽組合。各種34/32和b模塊亞基的貯液可以純化產(chǎn)物形式或未純化的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液形式分別保存，隨后視需要進(jìn)行混合，以得到各種321)結(jié)構(gòu)。本文所公開(kāi)的方法和組合物可用于提供基于重組抗體的多價(jià)結(jié)合結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可以是單特異性或雙特異性的。例如，DDD2序列可以與單鏈Fv融合，得到34/1)2形式的單特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)。更通常的是，DDD序列可以與抗體可變區(qū)融合，其可與互補(bǔ)抗體可變區(qū)締合，形成抗原結(jié)合位點(diǎn)。例如，DDD1或DDD2序列可與含有VH區(qū)和CH1區(qū)的抗體序列融合(Fd/DDD),或可與Vl區(qū)和CL區(qū)融合(L/DDD)。Fd/DDD或L/DDD再可分別與互補(bǔ)L或Fd締合，形成Fab/DDD,然后形成Fab/DDD1二聚體或Fab/DDD2四聚體和/或二聚體。同樣，類(lèi)似于AD2，AD序列可與單鏈Fv融合，或更常見(jiàn)的是與含有VH區(qū)和CH1區(qū)的抗體序列融合(Fd/AD2),當(dāng)與關(guān)聯(lián)L-鏈配對(duì)時(shí)，其形成Fab/AD2?；蛘?，類(lèi)似于AD2,AD序列可與含有區(qū)和CL區(qū)的抗體序列融合，當(dāng)與關(guān)聯(lián)Fd鏈配對(duì)時(shí)，其形成Fab/AD2。將Fab/DDD2四聚體/二聚體與Fab/AD2混合，然后經(jīng)還原和氧化，產(chǎn)生三價(jià)結(jié)合結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定束綽裝配，該結(jié)構(gòu)可以是單特異性的(a》或雙特異性的(a2b)。結(jié)合結(jié)構(gòu)的VH區(qū)和、區(qū)可來(lái)自"人源化，，單克隆抗體或來(lái)自人抗體?；蛘撸琕h和/或區(qū)可包含來(lái)自從組合免疫球蛋白文庫(kù)中分離得到的人抗體片段序列。參見(jiàn)例如Barbas等，Methods:AcompaniontoMethodsinEnzymology2:119(1991)和Winter等，Ann.Rev.Immunol.12:433(1994)?？蓮睦鏢TRATAGENE克隆系統(tǒng)(LaJolla,Calif.)得到克隆載體和表達(dá)載體，用于產(chǎn)生人免疫球蛋白噬菌體文庫(kù)。人抗體Vh或Vt序列可來(lái)自小鼠產(chǎn)生的人單克隆抗體。這類(lèi)抗體得自轉(zhuǎn)基因小鼠，該類(lèi)小鼠已經(jīng)"工程改造"而在響應(yīng)抗原攻擊時(shí)產(chǎn)生特定人抗體。在該技術(shù)中，將人重鏈和輕鏈基因座元件引入源自胚胎干細(xì)胞系的小鼠品系中，該類(lèi)胚胎干細(xì)胞系含有定向破壞的內(nèi)源重鏈和輕鏈基因座。轉(zhuǎn)基因小鼠可合成對(duì)人抗原具有特異性的人抗體，而且小鼠可用于產(chǎn)生分泌人抗體的雜交瘤。從轉(zhuǎn)基因小鼠得到人抗體的方法參見(jiàn)Green等，NatureGenet7:13(1994),Lonberg等，Nature368:856(1994)和Taylor等，Int.Immim.6:579(1994)。含有抗體片段的重組融合蛋白的通用制備方法可以通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)，得到編碼能識(shí)別特定表位的抗體片段的核酸序列。例如，可使用分泌具有所需特異性的抗體的雜交瘤，得到抗體編碼DNA,可用PCR或傳統(tǒng)cDNA克隆技術(shù)等已知技術(shù)來(lái)制備這樣的DNA。或者，可以構(gòu)建Fab'表達(dá)文庫(kù)或抗體噬菌體展示文庫(kù)，以篩選具有所需特異性的抗體片段。然后，可將編碼抗體片段的核酸與編碼DDD或AD的核酸直接連接，或通過(guò)編碼肽間隔區(qū)的序列間接連接。產(chǎn)生編碼這類(lèi)融合蛋白的核酸序列的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，而且在以下實(shí)施例中有進(jìn)一步討論。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可將額外氨基酸殘基添加在由爿/DDD或S/AD組成的模塊亞基的N端或C端，其中準(zhǔn)確的融合位點(diǎn)取決于DDD或AD是否與N端或C端(或內(nèi)部位置)連接。額外氨基酸殘基可包括肽標(biāo)記、信號(hào)肽、細(xì)胞因子、酶(例如前體藥物活化酶)、激素、毒素、肽藥物、膜相互作用肽或其它功能性蛋白。用所需宿主細(xì)胞制備重組蛋白的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。為了便于純化，穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可含有合適肽標(biāo)記，例如FLAG序列或多聚組氨酸序列，以便用相應(yīng)的親和柱進(jìn)行純化。適于表達(dá)穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)組成性亞基的示例性表達(dá)系統(tǒng)是pdHL2載體，該載體具有可擴(kuò)增的鼠dhfr基因，允許通過(guò)甲氨蝶呤處理而進(jìn)行選擇和擴(kuò)增。參見(jiàn)Gillies等，J.Immunol.Methods125:191(1989)。pdHL2載體提供兩個(gè)基因的依賴(lài)型表達(dá)，其由兩個(gè)金屬硫蛋白(metallothiomne)啟動(dòng)子和IgH增強(qiáng)子獨(dú)立控制。用于穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)組成性亞基表達(dá)的合適宿主細(xì)胞或細(xì)胞系是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。采用人宿主細(xì)胞，使得任何表達(dá)的分子可經(jīng)人糖基化模式而修飾。然而，對(duì)于本文所公開(kāi)的方法來(lái)說(shuō)，這并非表示人宿主細(xì)胞是必需的或優(yōu)選的。正如所說(shuō)明的，可通過(guò)電穿孔，用線狀pdHL2載體轉(zhuǎn)染鼠骨髓瘤細(xì)胞系(例如Sp2/0)，該載體編碼穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)的組成性亞基。將細(xì)胞在含0.05-0.1piM甲氨蝶呤的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)進(jìn)行選擇。再通過(guò)逐步增加曱氨蝶呤的濃度至5iaM,擴(kuò)增所選克隆。穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)的綴合物可將額外部分與如上所述的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)綴合。例如，藥物、毒素、放射性化合物、酶、激素、細(xì)胞毒性蛋白、螯合物、細(xì)胞因子和其它功能性試劑，均可與穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)的一個(gè)或多個(gè)模塊亞基綴合?？赏ㄟ^(guò)例如共價(jià)連接亞基側(cè)鏈上含有氨基、羧基、巰基或羥基的氨基酸殘基，來(lái)進(jìn)行綴合。各種常規(guī)接頭可用于該目的，例如二異氰酸酯、二異硫氰酸酯、雙(羥基琥珀酰亞胺)酯、碳二亞胺、馬來(lái)酰亞胺-輕基琥珀酰亞胺酯、戊二醛等。藥物或試劑與穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)的綴合優(yōu)選不顯著影響未修飾結(jié)構(gòu)中所含的各亞基的活性。在形成穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)之前，32或b都可用于化學(xué)綴合。32和b也都可在混合之前綴合。也可在形成穩(wěn)定束縛a2b結(jié)構(gòu)之后進(jìn)行綴合。另外，細(xì)胞毒劑可先與聚合物載體偶聯(lián)，然后再與穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)綴合。對(duì)于該方法，參見(jiàn)Ryser等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75:3867-3870,1978,U.S.4,699,784和U.S.4,046,722，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中?？赏ㄟ^(guò)用于將抗體與以下載體連接的已知方法來(lái)制備本文所述的綴合物脂質(zhì)、碳水化合物、蛋白質(zhì)、放射性核素或其它原子和分子。例如，本文所述的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可與本文所述的一種或多種載體(例如脂質(zhì)、聚合物、脂質(zhì)體、膠束或納米粒)連接，形成綴合物，再將其通過(guò)共價(jià)、非共價(jià)或其它方式與治療藥或診斷試劑結(jié)合?；蛘撸疚乃龅娜魏畏€(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可以直接與本文所述的一種或多種治療藥或診斷試劑綴合。例如，穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可以用1311進(jìn)行放射性標(biāo)記并與脂質(zhì)綴合，使得所得綴合物形成脂質(zhì)體。該脂質(zhì)體可摻入到一種或多種治療藥(例如藥物，例如FUdR-dO)或診斷試劑中?；蛘?，除了載體之外，穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)還可與1311(例如在酪氨酸殘基上)和藥物(例如在賴(lài)氨酸殘基的s氨基上)綴合，然后將載體與額外治療藥或診斷試劑結(jié)合。治療藥和診斷試劑可與穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)的一個(gè)或多個(gè)亞基共價(jià)締合。脂質(zhì)體和膠束的形成是本領(lǐng)域已知的。參見(jiàn)例如Wrobel和Collins,BiochimicaetBiophysicaActa(1995),1235:296-304;Lundberg等,J.Pharm.Pharmacol.(1999),51:1099-1105;Lundberg等，Int.丄Pharm.(2000),205:101-108;Lundberg,J.Pharm.Sci.(1994),83:72-75;Xu等，Molec.CancerTher.(2002),1:337-346;Torchilin等，Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.(2003),100:6039-6044;U.S.5,565,215;U.S.6,379,698;和U.S.2003/0082154。也已描述了由聚合物、二氧化硅或金屬制成的納米?；蚣{米嚢，用于藥物遞送或造影。參見(jiàn)例如West等，ApplicationsofNanotechnologytoBiotechnology(2000),11:215-217;U.S.5,620，708;U.S.5,702,727;和U.S.6,530,944。已經(jīng)描述了將抗體或結(jié)合分子與脂質(zhì)體綴合，形成耙向載體，用于治療藥或診斷試劑。參見(jiàn)例如Bendas,Biodrugs(2001)，15:215-224;Xu等,Mol.CancerTher(2002),1:337-346;Torchilin等，Proc.NatlAcad.Sci.U.S.A.(2003)，100:6039-6044;Bally等，J.LiposomeRes.(1998),8:299-335;Lundberg,Int.J.Pharm.(1994),109:73-81;Lundberg,J.Pharm.Pharmacol.(1997),49:16-21;Lundberg,Anti-cancerDrugDesign(1998),13:453-461。另見(jiàn)U.S.6,306,393、美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)順序號(hào)10/350,096、美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)順序號(hào)09/590,284和美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)順序號(hào)60/138,284(1999年6月9日申請(qǐng))。所有這些參考文獻(xiàn)都通過(guò)引用結(jié)合到本文中?？煞奖愕厥褂酶鞣N診斷試劑和治療藥，以形成穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)的綴合物，或者可將各種診斷試劑和治療藥與半抗原連接，該半抗原可與穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)上的識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合。診斷試劑可包括放射性同位素、MRI增強(qiáng)劑或超聲成像的造影劑以及焚光化合物。許多合適造影劑是本領(lǐng)域已知的，它們與蛋白質(zhì)或肽的連接方法也是已知的(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利5,021,236和4,472,509,這兩篇文獻(xiàn)都通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。某些連接方法包括使用金屬螯合物(例如有機(jī)螯合劑，例如DTPA)與蛋白質(zhì)或肽連接(美國(guó)專(zhuān)利4,472,509)。為了將放射性金屬或順磁離子加載到穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)上，可能需要先將其與栽體反應(yīng)，使已經(jīng)結(jié)合在載體上的多拷貝螯合基團(tuán)與放射性金屬或順磁離子結(jié)合。這樣的載體可以是具有側(cè)基的聚賴(lài)氨酸、多糖或者經(jīng)衍生的或可衍生的聚合物，其側(cè)基上可結(jié)合螯合基團(tuán)，例如1,2-乙二胺四乙酸(EDTA)、二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)、卟啉、多胺、冠醚、雙縮氨基硫脲、聚肟等，已知可用于該目的。用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)方法，將含有螯合物的載體與穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)偶聯(lián)，其方式是盡量減少聚集和損失免疫反應(yīng)性。于U.S.4,824，659,所述專(zhuān)利通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。特別有用的金屬-螯合物組合包括2-千基-DTPA及其一甲基和環(huán)己基類(lèi)似物，與診斷用同位素一起使用，其通常的能量范圍為60-4,000keV。某些有用的診斷用核素可包括18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、89Zr、94Tc、94mTc、99mTc或mIn。與非放射性金屬(例如錳、鐵和禮)絡(luò)合的相同螯合物可用于MRI，當(dāng)單獨(dú)與本文所述的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)和載體一起使用時(shí)。大環(huán)螯合物(例如NOTA、DOTA和TETA)可與各種金屬和放射性金屬一起使用，尤其是鎵、釔和銅的放射性核素。通過(guò)針對(duì)目標(biāo)金屬來(lái)定制環(huán)的大小，可以非常穩(wěn)定地制備這樣的金屬-螯合復(fù)合物?？墒褂闷渌h(huán)-型螯合物，例如用于絡(luò)合^Ra的大環(huán)聚醚。治療藥包括例如化療藥物，例如長(zhǎng)春花屬生物堿、蒽環(huán)類(lèi)、印idophyllotoxin、紫杉》克類(lèi)、4元^^射物、》克4b劑、4元生素、Cox國(guó)2抑制劑、抗有絲分裂藥、抗血管生成藥和促凋亡劑、尤其是多柔比星、甲氨蝶呤、泰素、CPT-ll、喜樹(shù)生物堿類(lèi)(camptothecans)以及其它這些類(lèi)型和其它類(lèi)型的抗癌藥等。其它癌癥化療藥物包括氮芥類(lèi)、磺酸烷基酯類(lèi)、亞硝基脲類(lèi)、三氮烯類(lèi)、葉酸類(lèi)似物、嘧啶類(lèi)似物、嘌呤類(lèi)似物、鉑配位絡(luò)合物、激素等。合適的化療藥參見(jiàn)REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES,第19版(MackPublishingCo.1995),和GoodmanandGilman的THEPHARMACOLOGICALBASISOFTHERAPEUTICS,第7版(MacMillanPublishingCo.1985),以及這些出版物的修訂版。其它合適的化療藥例如實(shí)驗(yàn)性藥物是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，可采用本領(lǐng)域已知方法與本文所述的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)綴合。另一類(lèi)治療藥由以下放射性核素組成發(fā)射a-粒子的放射性核素(例如212Pb、212Bi、213Bi、211At、223Ra、225Ac)、發(fā)射(3-粒子的放射性核素(例如32P、33P、47Sc、67Cu、67Ga、89Sr、9°Y、mAg、125I、131I、142Pr、153Sm、161Tb、166Ho、166Dy、177Lu、186Re、18SRe、1S9Re),或發(fā)射俄歇電子的放射性核素(例如mIn、125I、67Ga、191Os、193mPt、195mPt、195mHg)?？刹捎盟龇椒?，將穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)用一種或多種上述放射性核素標(biāo)記，用于診斷試劑。含有可檢測(cè)標(biāo)記(例如熒光分子)或細(xì)胞毒劑(例如放射性碘)的合適肽，可與穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)共價(jià)、非共價(jià)或其它方式締合。例如，通過(guò)將光敏劑或染料摻入到穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)上，可得到治療上有用的綴合物。已經(jīng)使用熒光組合物(例如熒光染料)和對(duì)可見(jiàn)光敏感的其它發(fā)色團(tuán)或染料(例如卟啉)來(lái)檢測(cè)和治療病變，即用合適的光照射病變部位。在治療中，這4皮稱(chēng)為光輻射、光療或光動(dòng)力療法。參見(jiàn)Jori等(編著)，PHOTODYNAMICTHERAPYOFTUMORSANDOTHERDISEASES(LibreriaProgetto1985);vandenBergh,Chem.Britain(1986),22:430。此外，已將單克隆抗體與光敏染料偶聯(lián)，用于進(jìn)行光療。參見(jiàn)Mew等，J.Immunol.(1983),130:1473;同上，CancerRes.(1985),45:4380;Oseroff等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986),83:8744;作者同上(idem.),Photochem.Photobiol.(1987),46:83;Hasan等，Prog.Clin.Biol.Res.(1989),288:471;Tatsuta等，LasersSurg.Med.(1989),9:422;Pelegrin等，Cancer(1991),67:2529。也包括內(nèi)窺鏡或腹腔鏡應(yīng)用。檢測(cè)和治療的內(nèi)窺鏡方法參見(jiàn)U.S.4，932,412、U.S.5,525,338、U.S.5,716,595、U.S.5,736,119、U.S.5,922,302、U.S.6,096,289和U.S.6,387,350，所述專(zhuān)利通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。治療藥藥物組合物在某些實(shí)施方案中，可將穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)和/或一種或多種其它治療藥給予患者，例如癌癥患者。這樣的藥物可以藥物組合物的形式給予。一般來(lái)說(shuō)，需要制備基本上不含對(duì)人或動(dòng)物有害的雜質(zhì)的組合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道，可通過(guò)包括口服或胃腸外(例如靜脈內(nèi))在內(nèi)的不同途徑將藥物組合物給予患者。在某些實(shí)施方案中，必須給予患者有效量的治療藥。"有效量"是藥物產(chǎn)生所需效果的用量。有效量取決于例如藥物的功效和所需效果。例如，治療增生性疾病(例如黃斑變性或子宮內(nèi)膜異位癥)可能需要較少量的抗血管生成藥，相比之下，癌癥治療則需要更大用量，以減少或消除實(shí)體瘤，或者防止或減少其轉(zhuǎn)移?？捎帽绢I(lǐng)域眾所周知的方法，確定具體藥物的有效量，用于特定目的?；熕幵谀承?shí)施方案中，可給予化療藥。所用的抗癌化療藥包括但不限于5-氟尿嘧啶、博來(lái)霉素、白消安、喜樹(shù)堿、卡鉑、苯丁酸氮芥、順鉑(CDDP)、環(huán)磷酰胺、放線菌素D、柔紅霉素、多柔比星、雌激素受體結(jié)合劑、依托泊苷(VP16)、法尼基(famesyl)-蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑、吉西他濱、異環(huán)磷酰胺、氮芥、美法侖、曱氨蝶呤、絲裂霉素、諾維本、硝基脲、普卡霉素(plicomycin)、丙卡巴肼、雷洛昔芬、他莫昔芬、泰素、temazolomide(DTIC含水形式)、反柏、長(zhǎng)春堿和曱氨蝶呤、長(zhǎng)春新堿或上述藥物的任何類(lèi)似物或衍生變異體。所采用的針對(duì)感染性生物體的化療藥包括但不限于阿昔洛韋、阿苯達(dá)唑、金剛烷胺、阿米卡星、阿莫西林、兩性霉素B、氨千西林、氨曲南、阿奇霉素、桿菌肽、復(fù)方新諾明、巴特芬⑧、聯(lián)苯千唑、羧千西林、卡泊芬凈、頭孢克洛、頭孢唑林、頭孢菌素類(lèi)、頭孢吡肟、頭孢曲松、頭孢p塞肟、氯霉素、西多福韋、Cipro⑧鹽酸環(huán)丙沙星制劑、克拉霉素、克拉維酸、克霉唑、氯唑西林、多西環(huán)素、益康唑、erythrocycline、紅霉素、曱硝唑、氟康唑、氟胞嘧咬、膦曱酸、呋喃唑酮、更昔洛韋、慶大霉素、亞胺培南、異煙肼、伊曲康唑、卡那霉素、酮康唑、林可霉素、利奈唑胺、美羅培南、咪康唑、米諾環(huán)素、萘替芬、萘啶酸、新霉素、奈替米星、呋喃妥因、制霉菌素、奧塞米韋、苯唑西林、巴龍霉素、青霉素、噴他脒、哌拉西林-三唑巴坦、利福布汀、利福平、金剛乙胺、鏈霉素、石黃胺曱噁唑、柳氮磺吡啶、四環(huán)素、噻康唑、妥布霉素、托西拉酯、托萘酯、曱氧千咬-磺胺曱嗯哇、伐昔洛韋、萬(wàn)古霉素、zanamir和zithromycin?；熕幖捌浣o藥方法、劑量等是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的(參見(jiàn)例如"PhysiciansDeskReference",GoodmanandGilman白勺"ThePharmacologicalBasisofTherapeutics"和"Remington'sPharmaceuticalSciences",所述文獻(xiàn)的相關(guān)部分通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。劑量上的某些變動(dòng)取決于所治療患者的情況。負(fù)責(zé)給藥的人員在任何情況下都要為每個(gè)患者確定合適劑量。激素皮質(zhì)類(lèi)固醇激素可提高其它化學(xué)治療藥的有效性，因此，它們經(jīng)常用于聯(lián)合治療。潑尼松和地塞米松是皮質(zhì)類(lèi)固醇激素藥的實(shí)例。己酸羥孕酮、醋酸曱羥孕酮和醋酸曱地孕酮等孕酮類(lèi)藥，已經(jīng)用于子宮內(nèi)膜癌和乳癌。己烯雌酚和炔雌醇等雌激素藥，已經(jīng)用于前列腺癌等癌癥。他莫昔芬等抗雌激素藥已經(jīng)用于乳癌等癌癥。丙酸睪酮和氟曱睪酮等雄激素藥也已用于治療乳癌。血管生成抑制劑在某些實(shí)施方案中，可采用例如以下的抗血管生成藥血管生長(zhǎng)抑素、baculostatin、人血管能抑素(canstatin)、乳腺絲抑蛋白、抗VEGF抗體、抗P1GF肽和抗體、抗血管生長(zhǎng)因子抗體、抗Flk-l抗體、抗Flt-l抗體和肽、層粘連蛋白肽、纖連蛋白肽、纖溶酶原激活物抑制劑、組織金屬蛋白酶抑制劑、干擾素、白介素-12、IP-IO、Gro-P、血小板應(yīng)答蛋白、2-甲氧基雌二醇、增殖蛋白相關(guān)蛋白、carboxiamidotriazole、CM101、馬立馬司他、戊聚糖多聚硫酸酯、促血管生成素-2、干擾素-a、除莠霉素A、PNU1M1WE、WK催乳素片段、利諾胺、沙利度胺、己酮可可堿、染料木堿、TNP-470、內(nèi)皮生長(zhǎng)抑素、紫杉醇、accutin、血管生長(zhǎng)抑素、西多福韋、長(zhǎng)春新石咸、博來(lái)霉素、AGM-l470、血小板因子4或米諾環(huán)素。免疫調(diào)節(jié)劑本文所用的術(shù)語(yǔ)"免疫調(diào)節(jié)劑"包括細(xì)胞因子、干細(xì)月包生長(zhǎng)因子、淋巴毒素和造血因子，例如白介素、集落刺激因子、干擾素(例如干擾素-ct、-p和-力和稱(chēng)為"S1因子，，的干細(xì)胞生長(zhǎng)因子。合適的免疫調(diào)節(jié)劑部分的實(shí)例包括IL-2、IL-6、IL-IO、IL-12、IL-18、IL-21、干擾素-Y、TNF-a等。術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞因子"是由一個(gè)細(xì)胞群體釋放、并作為細(xì)月包間介質(zhì)而作用于另一細(xì)胞的蛋白質(zhì)或肽的通稱(chēng)。本文更廣泛采用的細(xì)胞因子的實(shí)例包括淋巴因子、單核因子、生長(zhǎng)因子和傳統(tǒng)的多肽激素。細(xì)胞因子包括生長(zhǎng)激素，例如人生長(zhǎng)激素、N-甲硫氨酰人生長(zhǎng)激素和牛生長(zhǎng)激素；曱狀旁腺激素；曱狀腺素；胰島素；胰島素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，例如濾泡剌激激素(FSH)、甲狀腺刺激激素(TSH)和黃體激素(LH);肝生長(zhǎng)因子；前列腺素、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；催乳素；胎盤(pán)催乳激素、OB蛋白；腫瘤壞死因子-a和肺瘤壞死因子-p;米勒管抑制物(mullerian-inhibitingsubstance);小鼠促性腺激素相關(guān)肽；抑制素；活化素(activin);血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；整聯(lián)蛋白；血小板生成素(TPO);神經(jīng)生長(zhǎng)因子，例如NGF-(3;血小板-生長(zhǎng)因子；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF),例如TGF-a和TGF-p;胰島素樣生長(zhǎng)因子-I和-II;紅細(xì)胞生成素(EPO);骨誘導(dǎo)因子(osteoinductivefactor);千擾素，例如干擾素-oc、p和y;集落刺激因子(CSF)，例如巨噬細(xì)胞-CSF(M-CSF);粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-CSF(GM-CSF);和粒細(xì)胞-CSF(G-CSF);白介素(IL),例如IL-1、IL陽(yáng)la、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-IO、IL-11、IL-12;IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、LIF、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、EPO、kit-配體或FLT-3、血管生長(zhǎng)抑素、血小板應(yīng)答蛋白、內(nèi)皮生長(zhǎng)抑素、肺瘤壞死因子和LT。本文所用的術(shù)語(yǔ)細(xì)胞因子包括天然來(lái)源或來(lái)自重組細(xì)胞培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)以及天然序列細(xì)胞因子的生物活性等同物。趨化因子通常作為化學(xué)引誘物起作用，以將免疫效應(yīng)細(xì)胞募集到趨化因子表達(dá)的位點(diǎn)上。趨化因子包括但不限于RANTES、MCAF、MIPl-a、MIP1-P和IP-IO。技術(shù)人員將會(huì)知道，已知某些細(xì)胞因子也具有化學(xué)引誘效果，并且也可歸類(lèi)于該術(shù)語(yǔ)趨化因子之內(nèi)。同樣，術(shù)語(yǔ)免疫調(diào)節(jié)劑和細(xì)胞因子在其各自成員中是重疊的。放射性同位素治療和放免治療在某些實(shí)施方案中，肽和/或蛋白質(zhì)可用于放射性核素治療或放免治療方法(參見(jiàn)例如Govindan等，2005,TechnologyinCancerResearch&Treatment,4:375-91;Sharkey和Goldenberg，2005,丄Nucl.Med.46:115S畫(huà)127S;Goldenberg等(JCiinOncol2006;24:823-834),"AntibodyPre扁targetingAdvancesCancerRadioimmunodetectionandRadioimmunotherapy"，所述各文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。在具體的實(shí)施方案中，穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可直接用放射性同位素標(biāo)記，然后給予患者。在替代實(shí)施方案中，可以如上所述的預(yù)靶向方法，采用帶有放射性標(biāo)記的半抗原性肽或配體給予放射性同位素，并在給予雙特異性穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)(其定位于患病組織表達(dá)增加的位點(diǎn)上)之后注射。用于治療患病組織的放射性同位素包括但不限于mIn、177Lu、212Bi、213Bi、211At、62Cu、67Cu、90Y、125I、131I、32P、33P、47Sc、mAg、67Ga、142Pr、153Sm、I61Tb、I66Dy、166Ho、186Re、188Re、189Re、212Pb、223Ra、225Ac、59Fe、75Se、77As、89Sr、"Mo、105Rh、109Pd、143Pr、149Pm、169Er、194Ir、19SAu、199Au和211Pb。治療性放射性核素優(yōu)選衰變能范圍為20-6，000keV，對(duì)于俄歇發(fā)射體的優(yōu)選范圍為60-200keV,對(duì)于P發(fā)射體為100-2,500keV,而對(duì)于a發(fā)射體為4,000-6,000keV。有用的(3粒子發(fā)射放射性核素的最大衰變能優(yōu)選為20-5,000keV,更優(yōu)選100-4,000keV,最優(yōu)選500-2,500keV。還優(yōu)選基本衰變俄歇發(fā)射粒子的放射性核素。例如，Co-58、Ga-67、Br-80m、Tc-99m、Rh-103m、Pt-109、In畫(huà)lll、Sb-119、1-125、Ho-161、Os-189m和Ir-192。有用的(3粒子發(fā)射放射性核素的衰變能優(yōu)選<1,000keV,更優(yōu)選<100keV,最優(yōu)選<70keV。還優(yōu)選基本衰變a粒子的放射性核素。這樣的放射性核素包括但不限于Dy-152、At-211、Bi-212、Ra-223、Rn-219、Po-215、Bi-211、Ac-225、Fr-221、At-217、Bi-213和Fm-255。有用的a粒子發(fā)射放射性核素的衰變能優(yōu)選為2,000-10,000keV,更優(yōu)選3,000-8,000keV,最優(yōu)選4,000-7,000keV。例如，67Cu因其半衰期為61.5小時(shí)和充足供應(yīng)P粒子和Y射線，被認(rèn)為是用于放免治療的更有希望的放射性同位素，可采用螯合劑對(duì)溴乙酰氨基-芐基-四乙胺四乙酸(TETA)將67Cu與蛋白質(zhì)或肽綴合在一起。或者，使用二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)，可將發(fā)射高能(3粒子的^Y與肽、抗體、融合蛋白或其片段綴合在一起。額外的潛在放射性同位素包括"C、I3N、150、"Br、I98Au、224Ac、126I、133I、77Br、113mIn、95Ru、97Ru、103Ru、105Ru、107Hg、203Hg、121mTe、122mTe、125mTe、165Tm、167Tm、168Tm、197Pt、l09Pd、105Rh、142Pr、143Pr、161Tb、166Ho、199Au、57Co、58Co、51Cr、59Fe、75Se、201T1、225Ac、76Br、16、等。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可使用輻射敏化劑。添加輻射敏化劑可導(dǎo)致功效增強(qiáng)。輻射敏化劑參見(jiàn)D.MGoldenberg(主編)，CANCERTHERAPYWITHRADIOLABELEDANTIBODIES,CRCPress(1995),所述文獻(xiàn)通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。通常以類(lèi)似方式影響具有加載硼附加物的載體、用于熱中子活化治療的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)。然而，有利的是可以等待下去，直到非靶向免疫綴合物清除后再進(jìn)行中子輻射。使用能結(jié)合配體的抗體可加速清除。參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第4,624，846號(hào)對(duì)該通用原理的描述。例如，硼附加物例如^友硼烷，可以與抗體連"l妄?？梢杂么箲覀?cè)4連上的羧基官能團(tuán)，制備碳硼烷，正如本領(lǐng)域眾所周知的?？赏ㄟ^(guò)石炭硼烷的羧基活化并與載體上的胺縮合，使碳硼烷與載體(例如氨基葡聚糖)連接起來(lái)。然后將中間綴合物與抗體綴合。給予綴合物之后，通過(guò)熱中子輻射活化硼附加物并轉(zhuǎn)化成放射性原子，其通過(guò)a-發(fā)射衰變，產(chǎn)生高毒性、短射程效果。藥盒各種實(shí)施方案可涉及含有適于治療或診斷患者患病組織的組分的藥盒。示例性的藥盒可含有至少一種穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)。如果含有給藥組分的組合物并非配制成經(jīng)消化道(例如口服)給予，則可包括能夠通過(guò)某些其它途徑遞送藥盒組分的裝置。一類(lèi)裝置(例如用于胃腸外給藥)是注射器，用于將組合物注射到患者體內(nèi)。也可使用吸入裝置?？蓪⑺幒薪M分包裝在一起，或分開(kāi)包裝在兩個(gè)以上單獨(dú)容器中。在某些實(shí)施方案中，容器可以是含有適于重配的無(wú)菌凍干組合物制劑的小瓶(管)。藥盒也可含有適于重配和/或其它試劑稀釋的一種或多種緩沖劑?？墒褂玫钠渌萜靼ǖ幌抻诖?、盤(pán)、盒、管等。可將藥盒組分無(wú)菌包裝并保存在容器內(nèi)。可包括的另一部分是給藥盒使用人員的使用說(shuō)明書(shū)。配制和給藥還可配制穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)(包括其綴合物)，以得到包含一種或多種藥學(xué)上合適的賦形劑、一種或多種額外成分或它們的某些組合的組合物。這可通過(guò)已知方法來(lái)完成即制備藥學(xué)上有用的劑量，其中活性成分(即穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)或綴合物)與混合物中的一種或多種藥學(xué)上合適的賦形劑混合在一起。無(wú)菌磷酸緩沖鹽溶液就是藥學(xué)上合適的賦形劑的一個(gè)實(shí)例。其它合適賦形劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。參見(jiàn)例如Ansel等，PHARMACEUTICALDOSAGEFORMSANDDRUGDELIVERYSYSTEMS,第5版(Lea&Febiger1990),和Gennaro(主編)，REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES,笫18片反(MackPublishingCompany1990)及其修訂X反。給予本文所述的組合物的優(yōu)選途徑是胃腸外注射。在胃腸外給藥中，組合物可與藥學(xué)上可接受的賦形劑一起配制成單位劑量注射用形式，例如溶液劑、混懸劑或乳劑。這類(lèi)賦形劑是固有無(wú)毒、無(wú)治療性的。這類(lèi)賦形劑的實(shí)例是鹽水、林格液、葡萄糖溶液和Hank液。也可使用非水賦形劑例如固定油和油酸乙酯。優(yōu)選的貝武形劑是5%葡萄糖鹽水。賦形劑可含有少量添加劑，例如增加等滲性和化學(xué)穩(wěn)定性的物質(zhì)，包括緩沖劑和防腐劑。也包括其它給藥方法(包括口服給藥)。所配制的包含穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)的組合物可用于靜脈內(nèi)給藥，通過(guò)例如快速注射或連續(xù)輸注。注射用組合物可呈單位劑型，例如裝在安瓿中，或者裝在多劑量容器中并添加防腐劑。組合物也可采用在油或含水溶媒中的混懸劑、溶液劑或乳劑的形式，并且可含有配方劑(formulatoryagent),例如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。或者，組合物可呈粉劑形式，用于在使用前用合適溶媒(例如無(wú)菌無(wú)熱原水)配制。組合物可以溶液劑形式給予。溶液劑的pH應(yīng)該在pH5-9.5范圍內(nèi)，優(yōu)選在pH6.5-7.5范圍內(nèi)。其制劑應(yīng)該在具有合適藥學(xué)上可接受的緩沖劑的溶液中，所述緩沖劑例如磷酸鹽、三(羥甲基)氨基曱烷-HCl或檸檬酸鹽等。緩沖劑濃度應(yīng)當(dāng)在1-100mM范圍內(nèi)。所配制的溶液也可含鹽，例如氯化鈉或氯化鉀，濃度為50-150mM。也可包含有效量的穩(wěn)定劑，例如甘油、白蛋白、球蛋白、去垢劑、明膠、魚(yú)精蛋白或魚(yú)精蛋白的鹽。所配制的組合物的系統(tǒng)給藥通常為每2-3天一次，或每周一次，如果采用抗體人源化形式作為穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)的模板的話?；蛘?，可采用每日給藥。通常給藥是通過(guò)肌內(nèi)注射或血管內(nèi)輸注?？赏ㄟ^(guò)哺乳動(dòng)物皮下或其它胃腸外途徑給予組合物。此外，可通過(guò)連續(xù)輸注或者單次或多次快速推注方式給藥?？捎糜诳姑庖呔Y合物、融合蛋白或棵抗體的人用劑量將取決于以下因素患者年齡、體重、身高、性別、基本身體狀況和先前的醫(yī)療史。通常最好給予受體的活性成分劑量的范圍約為1mg/kg-20mg/kg(單次靜脈內(nèi)輸注)，盡管視情況而定，也可給予更低或更高劑量。按照需要，該劑量可重復(fù)，例如每周一次、共4-10周，優(yōu)選每周一次、共8周，更優(yōu)選每周一次、共4周。也可給予更少次數(shù)，例如每?jī)芍芤淮巍⒐矓?shù)月。可通過(guò)不同的胃腸外途徑給藥，并適當(dāng)調(diào)整劑量和時(shí)間表。用于控制免疫綴合物或抗體的作用持續(xù)時(shí)間的藥學(xué)方法，適用于所配制的本文所述的組合物。可通過(guò)使用生物相容的聚合物以絡(luò)合或吸收免疫綴合物或棵抗體，達(dá)到控釋制劑，所述聚合物例如乙烯醋酸乙烯共聚物基質(zhì)和硬脂酸二聚體和癸二酸的聚酐共聚物基質(zhì)。參見(jiàn)Sherwood等，Bio/丁echnology(1992),10:1446。免疫綴合物或抗體從這類(lèi)基質(zhì)中釋放的速率取決于免疫綴合物或抗體的分子量、免疫綴合物的數(shù)量、基質(zhì)內(nèi)的抗體和分散顆粒的大小。參見(jiàn)Saltzman等，Bi叩hys.J(1989),55:163;Sherwood等,出處同上。其它固體劑型參見(jiàn)Ansel等，PHARMACEUTICALDOSAGEFORMSANDDRUGDELIVERYSYSTEMS,第5版(Lea&Febiger1990),和Gennaro(主編)，REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES,第18版(MackPublishingCompany1990)及其修訂片反。為了治療目的，將組合物以治療有效量給予哺乳動(dòng)物。適于本文所公開(kāi)的治療和診斷方法的患者通常是人患者，盡管也包括非人類(lèi)動(dòng)物患者。本文所公開(kāi)的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)在治療自身免疫病的方法中是特別有用的，公開(kāi)于待審的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)順序號(hào)09/590,284(2000年6月9日申i青，發(fā)明名稱(chēng)為"ImmunotherapyofAutoimmuneDisordersusingAntibodiesthatTargetB-Cells"，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。含有所述結(jié)合結(jié)構(gòu)的組合物優(yōu)選經(jīng)"^爭(zhēng)脈內(nèi)或肌內(nèi)給予，劑量為20-5000mg。也可經(jīng)鼻內(nèi)或其它非胃腸外途徑給予。也可通過(guò)微球體、脂質(zhì)體或放置在特定組織(包括血液)中的其它4敬粒(microparticulate)給藥系統(tǒng)給予組合物?？赏ㄟ^(guò)氣溶膠給予組合物，以達(dá)到肺局部給予。可使用含水氣溶膠或非水(例如氟代烴拋射劑)混懸劑。超聲噴霧器優(yōu)選用于制備氣溶膠，以盡量減少暴露組合物中的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)，從而降低剪切力，該剪切力能導(dǎo)致降解和活性損失?！愣?，給藥劑量將取決于諸如以下的因素患者年齡、體重、身高、性別、基本身體狀況和先前的醫(yī)療史。優(yōu)選將穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)的飽和劑量給予患者。通常最好給予受體劑量的范圍約為50-500毫克的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)，盡管視情況而定，也可給予更低或更高劑量。劑量實(shí)例包括20-1500毫克蛋白/劑，20-500毫克蛋白/劑，20-100毫克蛋白/劑，20-1000毫克蛋白/劑，100-1500毫克蛋白/劑。在組合物包含放射性核素的實(shí)施方案中，劑量可用毫居里(milUcumes)度量。就9°Y而論，劑量可介于15-40mCi、10-30mCi、20-30mCi或10-20mCi之間。與放射性核素連接的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)對(duì)微生物治療特別有效。當(dāng)已測(cè)定到穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)定位在患者體內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)感染部位之后，注射更高劑量的標(biāo)記組合物，通常為20mC1-l50mCi/劑(對(duì)于1311)，5mCi-30mCi/劑(對(duì)于卯Y),或5mCi-20mCi/劑(對(duì)于賜Re),都以70kg患者體重計(jì)。注射可以是靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、淋巴管內(nèi)、鞘內(nèi)或腔內(nèi)(即胃腸外)并可重復(fù)。對(duì)于某些治療來(lái)說(shuō)，最好給予多次、分次劑量，從而提供更高的微生物毒性劑量，而對(duì)正常組織的輻射方面通常不引起比例增加?？稍诮o予組合物之前、期間或之后，給予未與穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)化學(xué)連接的如下藥物化療藥、抗微生物藥、細(xì)胞因子、粒細(xì)胞-集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(GM-CSF)、紅細(xì)胞生成素、血小板生成素等。或者，這些藥物可與穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)連接。a2b形式的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)是特別合適的預(yù)靶向劑。示例性結(jié)構(gòu)由兩個(gè)scFv或Fab亞基(a。和一個(gè)scFv或Fab亞基(b)組成，其中32雙價(jià)結(jié)合靶組織或細(xì)胞，而b結(jié)合半抗原。對(duì)于治療方法，先將這種雙特異性三價(jià)結(jié)構(gòu)給予患者，任選再給予清除劑，最后給予診斷試劑或治療藥，所述診斷試劑中半抗原與功能性試劑(例如可一企測(cè)標(biāo)記)結(jié)合。技術(shù)人員將會(huì)知道，使用穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)，也可采用雙特異性抗體的其它已知方法。這些診斷和治療方法可用于幾乎任何情況下，其中已經(jīng)使用基于抗體的藥劑進(jìn)行診斷或治療。治療和診斷用途不包括預(yù)耙向的應(yīng)用穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)(包括其綴合物)適用于采用抗體或免疫綴合物的各種治療和診斷用途，不需要預(yù)耙向。例如，三價(jià)結(jié)構(gòu)可作為"棵"構(gòu)建體用于治療，即在所述結(jié)構(gòu)未與額外功能性試劑綴合的實(shí)施方案中，以與使用棵抗體相同的方式進(jìn)行治療?；蛘?，穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可用一種或多種功能性試劑衍生，以便用于診斷或治療用途。額外試劑可與如上所述的穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)共價(jià)連接。也包括使用放射性和非放射性診斷試劑，所述試劑與穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)連接。合適的非放射性診斷試劑是那些用于磁共振成像(MRI)、計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)或超聲的試劑。MRI試劑包括例如非放射性金屬(例如例如錳、鐵和釓)，它們可與合適的螯合物(例如2-千基-DTPA及其一曱基和環(huán)己基類(lèi)似物)絡(luò)合。參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)順序號(hào)09/921,290(2001年10月10日申請(qǐng))，所述專(zhuān)利通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可由用于診斷造影的放射性同位素進(jìn)行標(biāo)記。合適的放射性同位素可包括能量范圍為60-4,000keV的同位素，或更具體地講，包括18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、89Zj94mTe94Tc99mTc45rpimIni23I24Ii25IU1Ii54_158GdmLu、32P、188Re等或其組合。參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)，發(fā)明名稱(chēng)為"LabelingTargetingAgentswithGallium-68"陽(yáng)發(fā)明人為G.L.Griffiths和WJ.McBride,以及美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第60/342,104號(hào)，其中/>開(kāi)了正電子發(fā)射體，例如18F、6SGa、94mTc等，用于造影目的；所述文獻(xiàn)通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中)。可以通過(guò)例如單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描(SPECT)或正電子發(fā)射斷層掃描(PET)進(jìn)行檢測(cè)。其應(yīng)用也可用于手術(shù)中診斷，以鑒定隱蔽的肺瘤。在另一實(shí)施方案中，穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可以用一種或多種放射性同位素進(jìn)行標(biāo)記，用于殺傷胂瘤或其它快速分裂的細(xì)胞，所述同位素包括(3-發(fā)射體(例如32p、33P、47Sc、67Cu、67Ga、89Sr、90Y、mAg、125I、131I、142Pr、153Sm、161Tb、166Ho、166Dy、177Lu、186Re、環(huán)Re、189Re)，俄歇電子發(fā)射體(例如mIn、125I、67Ga、1910s、193mPt、195mPt、195mHg)，a-發(fā)射體(例如2"Pb、212Bi、213Bi、211At、223Ra、^Ac)或其組合。穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可用于MRI,即通過(guò)與一種或多種造影增強(qiáng)劑連接，所述增強(qiáng)劑可包括選自以下金屬的絡(luò)合物鉻(III)、錳(II)、鐵(in)、鐵(n)、鈷(ii)、鎳(n)、銅(n)、釹(m)、衫(ni)、鐿(ni)、釓(ni)、釩(ii)、鋱(ni)、鏑(m)、鈥(m)和鉺(in)。同樣，穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)可用于超聲成像，即通過(guò)與目前市場(chǎng)上銷(xiāo)售的一種或多種造影增強(qiáng)劑連接。美國(guó)專(zhuān)利第6,331,175號(hào)描述了MRI技術(shù)以及與MRI增強(qiáng)劑綴合的抗體制劑，所述專(zhuān)利通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。功能性蛋白質(zhì)(例如毒素)可以幾種方式存在于穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)中。例如，功能性蛋白質(zhì)可作為二元復(fù)合物組分的前體，即通過(guò)與DDD2或AD2融合，然后將其與耙向?qū)嶓w(分別由例如Fab/AD2或Fab/DDD2組成)結(jié)合?；蛘?，功能性蛋白質(zhì)可以與耙向結(jié)構(gòu)融合，作為A的前體，而且所得A任選與合適的B配對(duì)?？捎糜谠撃康牡亩舅匕ū吐槎镜鞍?、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌腸毒素-A、美洲商陸抗病毒蛋白、多花白樹(shù)毒蛋白、白喉毒素、假單胞菌外毒素和假單胞菌內(nèi)毒素。(參見(jiàn)例如Pastan.等,Cell(1986)，47:641,以及Goldenberg,CA-ACancerJournalforClinicians(1994),44:43。適用于本文的額外毒素是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，公開(kāi)于U.S.6,077,499，所述專(zhuān)利通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。其它功能性目標(biāo)蛋白包括各種細(xì)胞因子、溶血栓劑、酶和焚光蛋白質(zhì)。也提供治療患者胂瘤的方法，即通過(guò)給予患者如上所述的"棵"穩(wěn)定束縛結(jié)合結(jié)構(gòu)，其中至少一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)與選自以下的抗原結(jié)合碳酸肝酶IX、曱胎蛋白、A3、A33抗體特異性抗原、Ba733、BrE3-抗原、CA125、癌胚抗原(CEACAM5)、CEACAM6、CD1、CDla、CD3、CD5、CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD38、CD45、CD74、CD79a、CD80、CD138、結(jié)腸特異性抗原-p(CSAp)、EGFR、EGP-1、EGP-2、Flt畫(huà)l、Flt-3、葉酸受體、HER2/neu、HLA-DR、人絨毛膜促性腺激素、Ia、IL-2、IL-6、IL-8、胰島素樣生長(zhǎng)因子、KC4-抗原、KS-1、KSl-4、Le(y)、巨噬細(xì)胞-抑制因子(MIF)、MAGE、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、NCA66、NCA95、NCA90、壞死抗原、p53結(jié)合抗原、PAM-4抗體、胎盤(pán)生長(zhǎng)因子、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PSMA、RS5、SIOO、TlOl、TAC、TAG-72、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、腫瘤壞死抗原、生腱蛋白、TRAIL受體、ED-B纖連蛋白、VEGF、17-lA-抗原、血管生成標(biāo)記、癌基因標(biāo)記或癌基因產(chǎn)物。針對(duì)TRAIL受體(例如TRAIL-R1和TRAIL-R2)的抗體是本領(lǐng)域眾所周知的。(參見(jiàn)例如Georgakis等，Br.J.Haematol.2005,130:501-510;Mori等，F(xiàn)EBSLett.2005,579:5379-84)。這類(lèi)抗體或片段可單獨(dú)使用或與抗TAA抗體聯(lián)用，用于癌癥治療。瘤性疾病可選自癌癥、肉瘤、膠質(zhì)瘤、淋巴瘤、白血病和黑素瘤?？砂邢虻氖纠阅[瘤類(lèi)型包括急性成淋巴細(xì)胞性白血病、急性髓細(xì)胞性白血病、膽嚢癌、乳癌、宮頸癌、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、慢性髓細(xì)胞性白血病、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、霍奇金淋巴瘤、肺癌、曱狀腺髓質(zhì)癌(medullarythyroid)、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、膠質(zhì)瘤、黑素瘤、肝癌、前列腺癌和膀胱癌。也提供治療患者的B細(xì)胞惡性肺瘤或B細(xì)胞免疫病或自身免疫病的方法，即通過(guò)給予患者一個(gè)或多個(gè)劑量的含有如上所述的穩(wěn)定束縛結(jié)合結(jié)構(gòu)和藥學(xué)上可接受的載體的治療性組合物，所述穩(wěn)定束縛結(jié)合結(jié)構(gòu)中各抗原結(jié)合位點(diǎn)與CD19、CD20、CD22或IL-17的不同表位結(jié)合。可經(jīng)胃腸外給予治療性組合物，劑量為20-1500毫克蛋白/劑，或20-500毫克蛋白/劑，或20-100毫克蛋白/劑。患者可重復(fù)接受胃腸外給予的20-100毫克蛋白/劑，或重復(fù)接受胃腸外給予的20-1500毫克蛋白/劑。在這些方法中，結(jié)合結(jié)構(gòu)部分可用放射性同位素標(biāo)記，例如"P、33P、47Sc、67Cu、67Ga、90Y、mAg、mIn、125I、131I、142Pr、153Sm、161Tb、I66Dy、166Ho、177Lu、186Re、188Re、ls9Re、212Pb、212Bi、213Bi、211At、223Ra和225Ac或其組合。也提供檢測(cè)或診斷患者的B細(xì)胞惡性胂瘤或B細(xì)胞免疫病或自身免疫病的方法，即通過(guò)給予患者含有穩(wěn)定束縛結(jié)合結(jié)構(gòu)、藥學(xué)上可接受的載體和放射性核素的診斷用組合物，所述穩(wěn)定束縛結(jié)合結(jié)構(gòu)中各抗原結(jié)合位點(diǎn)與CD19、CD20、CD22或IL-17的不同表位結(jié)合；所述放射性核素選自18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga86Y89Zr94mTc94Tc""TcU1ln123I124I125I、131I、154-158Gd、177Lu、32P、45Ti和188Re或其組合。如上所述的SPECT或PET可進(jìn)行檢測(cè)。其應(yīng)用也可用于手術(shù)中診斷，以鑒定隱蔽的腫瘤。也提供檢測(cè)或診斷患者的B細(xì)胞惡性腫瘤或B細(xì)胞免疫病或自身免疫病的方法，即通過(guò)給予患者含有穩(wěn)定束縛結(jié)合結(jié)構(gòu)、藥學(xué)上可接受的載體和一種或多種造影增強(qiáng)劑的診斷用組合物，所述穩(wěn)定束縛結(jié)合結(jié)構(gòu)中各抗原結(jié)合位點(diǎn)與CD19、CDM、CD22或IL-17的不同表位結(jié)合；所述造影增強(qiáng)劑用于磁共振成像(MRI)。造影增強(qiáng)劑可選自上述造影增強(qiáng)劑。也提供診斷和/或治療患者的非瘤性疾病或障礙的方法，即通過(guò)給予患病的患者穩(wěn)定束綽結(jié)合結(jié)構(gòu)，其中連接可檢測(cè)標(biāo)記或治療藥；并且一種或多種抗原結(jié)合位點(diǎn)對(duì)疾病的標(biāo)記物具有特異性。疾病或障礙可由真菌或病毒所引起，所述真菌例如小孢子菌屬(A//croj/7on/w)、發(fā)辨菌屬(7Wc/20/7/_yto")、表皮褲菌屬(五/i(sferw(9/7/2;Ko")、申克孑包子絲菌0S^oraf/nxsc/]ewcA:/z')、新型隱3求菌(Oy/^ococcwi1"eq/bw/朋力、粗球孑包子菌(Cocc/^o/c^/w脂.to)、莢月莢組織月包漿菌(//"fo;Zasmaca尸sw/afwm)、皮炎芽生菌(別aWomycesderma"YW力和白色念珠菌(Ca"力(iaa/6z'c朋)；所述病毒例如人免疫擊夫陷病毒(HIV)、皰滲病毒、巨細(xì)胞病毒、狂犬病毒、流感病毒、人乳頭瘤病毒、乙型肝炎病毒、仙臺(tái)病毒、貓白血病病毒、呼腸孤病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、人血清細(xì)小病毒樣病毒、猿猴病毒40、呼吸道合胞病毒、小鼠乳腺腫瘤病毒、水痘帶狀皰瘆病毒、登革熱病毒、風(fēng)滲病毒、麻滲病毒、^泉病毒、人T細(xì)月包白血病病毒、Epstein-Barr病毒、鼠白血病病毒、腮腺炎病毒、皰滲性口腔炎病毒、辛德比斯病毒、淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒和藍(lán)舌病毒。疾病或障礙可由細(xì)菌所引起，所述細(xì)菌例如炭疽芽孢桿菌(5acz7/w5a/if/7rac75)、無(wú)孝lj鏈3求菌(5^eptococcw51aga/art/ore)、p省月申軍團(tuán)菌(Leg70/ie〃fl/wewmop/z7/a)、酉良膿葡萄3求菌(5^e;tococci/51、大腸桿菌(Es"c/m'c/2/aco//)、淋病奈瑟氏球菌(A^逗n'ago"o"/2oeae)、月鹵月荑炎奈瑟氏球菌(7Vezhenawem'"gz'"cfo)、肺炎3求菌(尸wew/wococcMSs戶p.)、';虎感p者血詳干菌B(//ewop/z7,5"z>//wezaeB)、蒼白密蟲(chóng)累S走體(7>e/w"ewa/a〃Www)、萊姆病螺j走體(Lymediseasespirochetes)、纟錄膿々支單月包菌(7^ewdo附o"(ZS1aerwg/"osa)、麻風(fēng)分牙支坤干菌(A^ycoZ(3"e廠/wm/e/rae)、流產(chǎn)布魯氏桿菌(Brace〃aa6ortz^)和結(jié)核分枝桿菌(A^yco6ac&n'wwfw6ercw/os7'力或支原體(A^yco//asma)。疾病或障礙可由寄生蟲(chóng)所引起，例如瘧疾。疾病或障礙可以是自身免疫性疾病，例如急性特發(fā)性血小板減少性紫癜、慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜、皮肌炎、小舞蹈病、重癥肌無(wú)力、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎、風(fēng)濕熱、多&，性綜合征、大皰性類(lèi)天皰瘡、糖尿病、亨-舍二氏紫癜、鏈3求菌感染后的腎炎、結(jié)節(jié)性紅斑、無(wú)脈病、艾迪生病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、結(jié)節(jié)病、潰瘍性結(jié)腸炎、多形性紅斑、IgA腎病、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、關(guān)節(jié)強(qiáng)硬性脊推炎、肺出血腎炎綜合征、閉塞性血栓性脈管炎、斯耶格倫綜合征、原發(fā)性膽汁性肝硬化、橋本曱狀腺炎、甲狀腺毒癥、硬皮病、慢性活動(dòng)性肝炎、多肌炎/皮肌炎、多軟骨炎、尋常性天皰瘡、韋格納肉芽腫病、膜性腎病、肌萎縮性側(cè)索硬化、脊髓癆、巨細(xì)胞動(dòng)脈炎/多肌痛、惡性貧血、急進(jìn)性腎小球性腎炎、銀屑病和纖維性肺泡炎。疾病或障礙可以是心肌梗塞、缺血性心臟病、或動(dòng)脈粥樣硬化斑塊、或移植排斥、或阿爾茨海默病，或者是由特應(yīng)性組織所引起的。疾病或障礙可以是因活化粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴樣細(xì)胞或巨噬細(xì)胞在炎癥部位增多所引起的炎癥，并且炎癥是由感染性因子所引起。另外，使用穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)，可以耙向表達(dá)特定受體或過(guò)量表達(dá)受體的細(xì)胞，所述穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)中A或B組分含有所述受體的配體，所述受體指導(dǎo)該結(jié)構(gòu)與帶有受體的細(xì)胞結(jié)合。治療藥或診斷試劑可以與該結(jié)構(gòu)的一個(gè)或多個(gè)亞基融合或綴合，以利于診斷和治療方法。治療和診斷用途包括預(yù)靶向的應(yīng)用預(yù)耙向是一種多步驟方法，起初是為解決直接靶向抗體在血中緩慢清除而開(kāi)發(fā)的，后者對(duì)正常組織(特別是骨髓)具有不想要的毒性。有了預(yù)靶向，就可將放射性核素或其它治療藥與小的化合物連接，這樣在數(shù)分鐘內(nèi)即可從血中清除掉。首先給予除能識(shí)別靶抗原之外、還能識(shí)別小的放射性標(biāo)記化合物的預(yù)輩巴向劑，稍后當(dāng)預(yù)把向劑從血中充分清除時(shí)，再給予放射性標(biāo)記化合物。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了預(yù)粑向方法，以增加檢測(cè)試劑或治療藥的耙:背景的比率。預(yù)靶向和生物素/抗生物素蛋白方法的實(shí)例參見(jiàn)例如Goodwin等，美國(guó)專(zhuān)利第4,863,713號(hào)；Goodwin等，J.Nucl.Med.29.226,1988;Hnatowich等,J.Nucl.Med.28:1294,1987;Oehr等,J.Nucl.Med.29:728,1988;Klibanov等,J.Nucl.Med.29:1951,1988;Sinitsyn等，J.Nucl.Med.30:66,1989;Kalofonos等，J.Nucl.Med.31:1791,1990;Schechter等，Int.J.Cancer48:167,1991;Pag認(rèn)lli等，CancerRes.51:5960,1991;Paganelli等，Nucl.Med.Commun.12:211,簡(jiǎn);美國(guó)專(zhuān)利第5,256，395號(hào)；Stickney等，CancerRes.51:6650,1991;Yuan等，CancerRes.51:3119,1991;美國(guó)專(zhuān)利第6,077,499號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)順序號(hào)09/597,580;美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)順序號(hào)10/361,026;美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)順序號(hào)09/337,756;美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)順序號(hào)09/823,746;美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)順序號(hào)10/116,116;美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)順序號(hào)09/382,186;美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)順序號(hào)10/150,654;美國(guó)專(zhuān)利第6,090,381號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6,472，511號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)順序號(hào)10/114,315;美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第60/386,411;美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第60/345,641號(hào)；美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第60/3328,835號(hào)；美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第60/426,379;美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)順序號(hào)09/823,746;美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)順序號(hào)09/337,756;美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第60/342,103號(hào)；和美國(guó)專(zhuān)利第6,962,702號(hào)，所有這些文獻(xiàn)都通過(guò)引用結(jié)合到本文中。在一個(gè)具體的非限制性實(shí)例中，基于穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)的預(yù)靶向劑含有兩個(gè)相同腫瘤抗原結(jié)合位點(diǎn)(其對(duì)CEA具有特異性)和第三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)(其對(duì)半抗原、組胺-琥珀酰-甘氨酸(HSG)具有特異性)。在替代實(shí)施方案中，可以用相同或不同半抗原靶向不同腫瘤相關(guān)抗原。對(duì)于預(yù)把向的應(yīng)用，可尋耙試劑(taretableagent)可以是脂質(zhì)體，其帶有與脂質(zhì)體脂質(zhì)膜外表面共價(jià)連接的雙價(jià)HSG-肽。脂質(zhì)體可以充滿氣體。如下提供治療或診斷患者的疾病或障礙的預(yù)輩巴向方法(l)給予患者如上所述的雙特異性三價(jià)結(jié)合結(jié)構(gòu)，其中兩個(gè)二聚體抗原結(jié)合位點(diǎn)指向?qū)膊【哂刑禺愋缘囊粋€(gè)或多個(gè)標(biāo)記物，而其它抗原結(jié)合位點(diǎn)涉及含有雙價(jià)半抗原的可尋靶構(gòu)建體；(2)任選給予患者清除用組合物，讓該組合物從循環(huán)中清除結(jié)合結(jié)構(gòu)；和(3)給予患者含有雙價(jià)半抗原的可尋靶構(gòu)建體，其中可尋靶構(gòu)建體還含有一種或多種螯合或化學(xué)結(jié)合的治療藥或診斷試劑。疾病或障礙如上所迷。如下還提供抗體依賴(lài)型酶前體藥物治療(ADEPT)方法(1)給予患有腫瘤的患者上述結(jié)合結(jié)構(gòu)，其中該結(jié)構(gòu)含有能夠活化前體藥物的共價(jià)連接的酶，(2)任選給予患者清除用組合物，讓該組合物從循環(huán)中清除結(jié)合結(jié)構(gòu)，和(3)將前體藥物給予患者。其它用途—般而言，穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可替代基于抗體的藥物，所述藥物已經(jīng)顯示有用于治療癌癥或非癌癥疾病的功效。眾所周知，放射性同位素、藥物和毒素可與抗體或抗體片段綴合，這些抗體或抗體片段能特異性結(jié)合癌細(xì)胞產(chǎn)生的或與癌細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)記物，而且這類(lèi)抗體綴合物可用于將放射性同位素、藥物或毒素靶向腫瘤部位，以增強(qiáng)其療效并減少副作用。有關(guān)這些藥物和方法實(shí)例的綜述參見(jiàn)Wawrzynczak禾口Thorpe(載于IntroductiontotheCellularandMolecularBiologyofCancer,L.M.Franks和N.M.Teich主編，第18章，第378-410頁(yè)，OxfordUniversityPress.Oxford,1986)，載于Immunoconjugates.AntibodyConjugatesinRadioimagingandTherapyofCancer(C.W.Vogel主編，3-300,OxfordUniversityPress，N.Y.,1987)和載于Dillman,R.O.(CRCCriticalReviewsmOncology/Hematology1:357,CRCPress,Inc.,1984)。另見(jiàn)Pastan等，Cell(1986),47:641;Vitetta等,Science(1987):238:1098-1104;和Brady等，Int.J.Rad.Oncol.Biol.Phys.(1987),13:1535-1544。在某些實(shí)施方案中，多價(jià)穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可用于正?；蚧疾〗M織和器官的治療和/或造影，例如采用參見(jiàn)以下文獻(xiàn)的方法美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,126,916、6,077,499、6,010,680、5，776,095、5,776,094、5,776,093、5,772,981、5,753,206、5,746,996、5,697,902、5,328,679、5，128,119、5,101,827和4,735,210,所述各專(zhuān)利通過(guò)引用結(jié)合到本文中。另外的方法參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)順序號(hào)09/337,756(1999年6月申請(qǐng))和美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)順序號(hào)09/823,746(2001年4月3日申請(qǐng))。通過(guò)直接標(biāo)記穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)或通過(guò)預(yù)靶向造影方法，可以進(jìn)行這樣的造影,參見(jiàn)Goldenberg等，"AntibodyPretargetingAdvancesCancerRadioimmunodetectionandRadiotherapy"G寺發(fā)表，J.Clin.Oncol.),另見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利乂>布號(hào)20050002945、20040018557、20030148409和20050014207,所述各文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。在以下美國(guó)專(zhuān)利中已經(jīng)公開(kāi)了免疫綴合物在癌癥和其它形式療法中的用途4,331,647、4,348,376、4,361,544、4,468,457、4，444,744、4,460,459、4,460,561、4,624,846、4,818,709、4,046,722、4,671,958、4,046,784、5,332,567、5,443,953、5,541，297、5,601,825、5,635,603、5,637,288、5,677,427、5,686,578、5,698,178、5,789,554、5,922,302、6,187,287和6,319,500。這些方法也可用于本文所公開(kāi)的方法，即通過(guò)用本發(fā)明的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)替代先前方法中的基因工程抗體。在某些實(shí)施方案中，本文公開(kāi)并要求保護(hù)的穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)可用于放射性核素治療或放免治療方法(參見(jiàn)例如Govmdan等，2005,TechnologyinCancerResearch&Treatment,4:375-91;Sharkey和Goldenberg,2005,J.Nucl.Med.46:115S-127S;Goldenberg等(待發(fā)表,J.Clin.Oncol.),"AntibodyPretargetingAdvancesCancerRadioimmunodetectionandRadioimmunotherapy",戶斤述各文南史通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可將輻射敏化劑與棵的或綴合的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)、抗體或抗體片段聯(lián)用。例如，可將輻射敏化劑與放射性標(biāo)記的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)聯(lián)用。與單用放射性標(biāo)記的穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)進(jìn)行治療相比，添加輻射敏化劑可導(dǎo)致功效增強(qiáng)。輻射敏化劑參見(jiàn)D.M.Goldenberg(主編)，CANCERTHERAPYWITHRADIOLABELEDANTIBOD正S，CRCPress(1995)，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。用于任何要求保護(hù)的方法的穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)可與抗微生物藥結(jié)合或一起給予。和免疫調(diào)節(jié)劑結(jié)合或一起給予。這些細(xì)胞因子和免疫調(diào)節(jié)劑至少包括干擾素-a、-P和-"f以及集落刺激因子。應(yīng)答。在一個(gè)實(shí)施方案中，穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可包含抗獨(dú)特型抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)(ABS)。這類(lèi)穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可模擬胂瘤相關(guān)抗原表位，以增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答。穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可用于目前使用抗體的許多免疫學(xué)方法。這些方法包括使用抗獨(dú)特型抗體和與抗體綴合的表位，以增強(qiáng)免疫系統(tǒng)。參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5,798,100、6,090,381和6,132,718?？躬?dú)特型抗體也用作針對(duì)癌癥和感染性疾病的疫苗。參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利6,440,416和6,472，511。此外，多特異性三聚體結(jié)合結(jié)構(gòu)可結(jié)合多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白并征服細(xì)胞和病原體的多重藥物抗性表型。這些方法中的抗體可用本文所公開(kāi)的穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)來(lái)替代。不同實(shí)施方案涉及治療自身免疫病癥狀的方法。在該方法中，將穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)給予自身免疫病患者，所述結(jié)構(gòu)在給藥前可與藥學(xué)上可接受的載體混合。該方法中的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)應(yīng)含有對(duì)B細(xì)胞或T細(xì)胞的抗原表位具有結(jié)合特異性的至少一個(gè)ABS。B細(xì)胞抗原可以是CD22,而表位可以是CD22等的表位A、表位B、表位C、表位D和表位E。B細(xì)胞相關(guān)抗原也可以是另一細(xì)月包抗原，例如CD19、CD20、HLA-DR和CD74。T細(xì)胞抗原可包括CD25。在某些實(shí)施方案中，可選擇用于治療自身免疫性疾病的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)，以結(jié)合IL-17。ABS可含有近似人類(lèi)的靈長(zhǎng)類(lèi)、鼠單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體或人類(lèi)來(lái)源的序列。例如，ABS可以來(lái)源于人源化LL2(抗CD22)、人源化LL1(抗CD74)或A20(抗CD20)單克隆抗體。可經(jīng)胃腸外給予20-2000mg/劑?？芍貜?fù)給藥，直至達(dá)到癥狀減輕的程度。穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可用于治療對(duì)系統(tǒng)化學(xué)治療具有抗性或難治性的疾病。這些疾病包括各種病毒感染、真菌感染、細(xì)菌感染和原生動(dòng)物感染、特別是寄生蟲(chóng)感染。病毒感染包括以下病毒所引起的感染流感病毒、皰滲病毒、Epstein-Barr病毒和巨細(xì)月包病毒、狂犬病毒(彈狀病毒科(尺/^Z^oWmtoe》、乳頭瘤病毒和乳多空病毒，所有這些感染都難以用系統(tǒng)抗生素/細(xì)胞毒劑治療。采用多價(jià)結(jié)合結(jié)構(gòu)可提供對(duì)靶病毒的更高親合力，導(dǎo)致顯著增加的治療指數(shù)。采用具結(jié)構(gòu)的綴合物進(jìn)行靶向放免治療，為抗病毒治療提供了新方法。可用本發(fā)明所述方法治療的原生動(dòng)物包括例如癡原蟲(chóng)(尤其是惡性瘧原蟲(chóng)(尸/wmo力ww/a/cz/wn/m)，瘧疾寄生蟲(chóng))、鼠弓形體(roxop/os"wago"dz7,弓開(kāi)j體病感染因子)、矛M十曼原蟲(chóng)(丄e^/2mam'ae,利什曼病感染因子)和Escherichiahistolytica。在瘧疾不同時(shí)相中,使用穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可顯著增強(qiáng)對(duì)瘧疾的檢測(cè)和治療。能結(jié)合子孢子抗原的單克隆抗體(mAb)是已知的。然而，因?yàn)樽渔咦涌乖⒎茄獌?nèi)寄生蟲(chóng)(bloodstageparasite)所共有，所以使用針對(duì)子孢子抗原的這類(lèi)mAb來(lái)尋靶，僅局限在相對(duì)短時(shí)間內(nèi)，在此時(shí)間內(nèi)子孢子游離于循環(huán)中，這只是在剛注射后和在宿主肝細(xì)胞內(nèi)發(fā)育之前。因此，優(yōu)選使用靶向原生動(dòng)物(例如惡性瘧原蟲(chóng))的不止一種寄生時(shí)相的mAb混合物，可以用具有多特異性的一種或多種穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)來(lái)達(dá)到該目的。使用綴合物可為造影(例如用""Tc)或治療(例如用川At或其它抗瘧藥，例如乙胺嘧啶)提供更多優(yōu)勢(shì)。弓形體病也對(duì)系統(tǒng)化學(xué)治療具有抗性。尚不清楚，能特異性結(jié)合鼠弓形體的mAb或天然宿主抗體是否在針對(duì)弓形體病的免疫應(yīng)答中起作用，但是在瘧原蟲(chóng)的情況下，合適的靶向穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)是遞送治療藥的有效載體。血吸蟲(chóng)病是廣泛流行的蠕蟲(chóng)感染，它是由某些淡水螺所攜帶的自由泳動(dòng)的尾蚴而引發(fā)的疾病。與癥疾的情況類(lèi)似，在感染過(guò)程中也存在不同時(shí)相的尾蝴?？梢詫⒛芙Y(jié)合多個(gè)時(shí)相的尾姆、任選結(jié)合在一種或多種尾蚴的表位上、優(yōu)選呈多特異性組成形式的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)，與造影劑或治療藥綴合，用于有效尋耙并增加療效?？梢灾苽渑c一種或多種形式的克氏4,蟲(chóng)(7>_y/7a"o^wacn^'),恰加斯病(Chagas'disease)的病原體)結(jié)合的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)，用于檢測(cè)和治療該類(lèi)纟斂生物感染。與不同時(shí)相錐蟲(chóng)的細(xì)胞表面糖蛋白或其它表面抗原反應(yīng)的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)，適用于將造影劑和治療藥靶向體內(nèi)寄生蟲(chóng)浸潤(rùn)部位。用合適藥物治療的另一非常難治的傳染性生物體就是麻風(fēng)桿菌(麻風(fēng)分枝桿菌(A^yco6ac化m/m/e/rae))?？梢灾苽淠芴禺愋越Y(jié)合麻風(fēng)分枝桿菌表面多個(gè)表位的穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)，單獨(dú)或聯(lián)合用于將造影劑和/或抗生素/細(xì)胞毒劑靶向該桿菌。用化療藥相當(dāng)難治的腸道寄生蟲(chóng)感染(例如類(lèi)圓線蟲(chóng)病(Strongyloidosis)和旋毛蟲(chóng)病(Trichinosis》，是穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)的合適革巴標(biāo)。通過(guò)能特異性結(jié)合寄生蟲(chóng)的一個(gè)、或優(yōu)選多個(gè)表位的合適穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)或綴合物，可以進(jìn)行對(duì)它們的診斷和治療?？梢允褂谩⒒蛘呖梢匀菀椎禺a(chǎn)生這樣的抗體所述抗體能特異性結(jié)合引起大部分人類(lèi)感染的大多數(shù)微生物和寄生蟲(chóng)。它們?cè)S多先前已經(jīng)用于體外診斷目的，可以摻入到穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)中作為抗體綴合物組分，以將i貪斷試劑和治療藥耙向感染部位。人和哺乳動(dòng)物的微生物病原體和無(wú)脊推動(dòng)物寄生蟲(chóng)是具有復(fù)雜生命周期的生物，在其不同時(shí)相表達(dá)多種抗原。因此，當(dāng)制備能識(shí)別不同形式上的抗原決定簇的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)(連接有合適的治療藥)、并以混合物或多特異性綴合物形式聯(lián)用時(shí)，最好進(jìn)行耙向治療。同樣的原理也適用于使用包含用于測(cè)定感染部位的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)的試劑，即通過(guò)連接造影劑(例如放射性核素)和/或MRI增強(qiáng)劑。其它實(shí)施方案涉及手術(shù)中鑒定患病組織的方法，即通過(guò)給予有效量的穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)和可尋靶構(gòu)建體，其中該穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)包含能特異性結(jié)合靶組織的至少一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)以及能特異性結(jié)合可尋靶構(gòu)建體的至少一個(gè)其它抗原結(jié)合位點(diǎn)；并且所述至少一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)能結(jié)合靶細(xì)胞、組織或病原體上的互補(bǔ)結(jié)合部分，或者能結(jié)合由這些靶細(xì)胞、組織或病原體產(chǎn)生的或與它們締合的分子上的互補(bǔ)結(jié)合部分。又一些實(shí)施方案涉及用于內(nèi)窺鏡檢查患者的患病組織的方法，即通過(guò)給予有效量的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)并給予可尋靶構(gòu)建體。穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)包含能特異性結(jié)合靶組織的至少一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)以及能特異性結(jié)合可尋靶構(gòu)建體的至少一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)；并且其中至少一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)顯示出能特異性結(jié)合靶細(xì)胞、組織或病原體上的互補(bǔ)結(jié)合部分，或者能結(jié)合由這些靶細(xì)胞、組織或病原體產(chǎn)生的或與它們締合的分子上的互補(bǔ)結(jié)合部分。檢測(cè)用途的一個(gè)替代方法是無(wú)線的膠嚢內(nèi)窺鏡(capsuleendoscopy),采用可咽下的膠嚢照相才幾/檢測(cè)器(capsulecamera/detector),這樣的照相才幾/檢測(cè)器是市售的，來(lái)自例如GivenImaging(NorcrossGA)。某些實(shí)施方案涉及用內(nèi)窺4竟鑒定患者患病組織的方法，即通過(guò)給予有效量的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)并給予可尋耙構(gòu)建體。在該實(shí)施方案中，穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)包含能特異性結(jié)合耙組織的至少一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)以及能特異性結(jié)合可尋靶構(gòu)建體的至少一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)；并且其中至少一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)顯示出能特異性結(jié)合把細(xì)胞、組織或病原體上的互補(bǔ)結(jié)合部分，或者能結(jié)合由這些耙細(xì)胞、組織或病原體產(chǎn)生的或與它們締合的分子上的互補(bǔ)結(jié)合部分。替代實(shí)施方案涉及血管內(nèi)鑒定患者患病組織的方法，即通過(guò)給予有效量的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)和可尋靶構(gòu)建體。穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)包含至少一個(gè)ABS,所述ABS能特異性結(jié)合耙細(xì)胞、組織或病原體上的互補(bǔ)結(jié)合部分，或者能特異性結(jié)合由這些把細(xì)胞、組織或病原體個(gè)ABS，所述ABS能特異性結(jié)合可尋耙構(gòu)建體。耙組織可以是正常組織，例如甲狀腺、肝、心、卵巢、胸腺、曱狀旁腺、子宮內(nèi)膜、骨髓、淋巴結(jié)或脾臟。某些實(shí)施方案涉及實(shí)施要求保護(hù)的方法的藥盒。藥盒可包含可尋靶構(gòu)建體?？蓪ぐ袠?gòu)建體可用適于上述可尋靶構(gòu)建體的任何試劑進(jìn)行標(biāo)記。此外，可尋靶構(gòu)建體也可不標(biāo)記，但是藥盒可包含標(biāo)記用試劑，以標(biāo)記可尋耙構(gòu)建體。如果有的話，標(biāo)記用試劑可含有標(biāo)記和交聯(lián)劑。藥盒也可含有穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)，其包含對(duì)可尋靶構(gòu)建體具有特異性的至少一個(gè)ABS和對(duì)可尋靶組織具有特異性的至少一個(gè)ABS。藥盒可任選含有清除用組合物，以從循環(huán)中除去穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)。穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)的靶標(biāo)涉及穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)的耙標(biāo)的額外公開(kāi)內(nèi)容公開(kāi)于臨時(shí)美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)順序號(hào)60/634,076,"MethodsandCompositionsforImmunotherapyandDetectionofInflammatoryandImmune-dysregulatoryDisease,InfectiousDisease,PathologicAngiogenesisandCancer",Goldenberg等(2004年12月9日申請(qǐng))，所述文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容都通過(guò)引用結(jié)合到本文中。在某些實(shí)施方案中，本文要求保護(hù)的穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)與兩種不同靶標(biāo)特異性反應(yīng)。不同靶標(biāo)可包括但不限于先天免疫系統(tǒng)的促炎效應(yīng)物、凝固因子、補(bǔ)體因子和補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白，與炎性障礙或免疫失調(diào)障礙、與傳染性病原體或與病理性血管生成或癌癥特異性相關(guān)的靶標(biāo)，其中這后一類(lèi)靶標(biāo)不是免疫系統(tǒng)的促炎效應(yīng)物或凝固因子。因此，在某些實(shí)施方案中，穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)含有至少一個(gè)結(jié)合特異性(其與患病細(xì)胞、病理性血管生成或癌癥，或傳染性疾病相關(guān))以及至少一個(gè)特異性[其針對(duì)免疫系統(tǒng)組分(例如B細(xì)胞、T細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞的受體或抗原)，或凝固調(diào)節(jié)劑(例如凝血酶或組織因子)，或促炎細(xì)胞因子(例如IL-1、IL-6、IL-IO、HMGB-1和MIF)]。當(dāng)穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)包含單個(gè)抗體的組合時(shí)，不包括這樣的組合所述組合中的一個(gè)組分靶向B細(xì)胞抗原，而另一組分靶向T細(xì)胞、漿細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或炎性細(xì)胞因子，因?yàn)檫@樣的組合能引起免疫系統(tǒng)功能障礙。穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可以是棵露的，也可以與診斷造影劑(例如同位素、放射性造影劑)綴合，或者與治療藥綴合，所述治療藥包括放射性核素、硼化合物、免疫調(diào)節(jié)劑、肽、激素、激素拮抗劑、酶、寡核苷酸、酶抑制劑、光敏治療藥、細(xì)胞毒劑、血管生成抑制劑及其組合。穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)與靶標(biāo)結(jié)合，可以下調(diào)或以其它方式影響免疫細(xì)胞功能，但是穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)也可結(jié)合其它靶標(biāo)而不直接影響免疫細(xì)胞功能。例如，抗粒細(xì)胞抗體，例如針對(duì)CD66或CEACAM6(例如NCA90或NCA95)，可用于靶向受感染組織中的粒細(xì)胞，而且也可用于靶向表達(dá)CEACAM6的癌癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，治療藥是寡核苷酸。例如，寡核苷酸可以是反義寡核苷酸或雙鏈干擾RNA(RNA/)分子。寡核苷酸可針對(duì)癌基因，例如bcl-2或p53。抑制bcl-2表達(dá)的反義分子參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第5,734,033號(hào)。可將其綴合，或形成穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)的治療藥部分?；蛘撸?寡核苷酸可與穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)同時(shí)給予或序貫給予。在另一個(gè)實(shí)施方案中，治療藥是硼附加物，并且當(dāng)治療藥定位后，治療需要用熱或超熱中子輻射。治療藥也可以是光敏治療藥，尤其是發(fā)色團(tuán)或染料。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，治療藥是來(lái)自動(dòng)物、植物和孩史生物來(lái)源的毒素。優(yōu)選的毒素包括蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、oc毒素、皂草毒蛋白、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌腸毒素-A、美洲商陸抗病毒蛋白、多花白樹(shù)毒蛋白、白喉毒素、假單胞菌外毒素和假單胞菌內(nèi)毒素。治療藥可以是免疫調(diào)節(jié)劑，例如細(xì)胞因子、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干擾素(IFN)、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、紅細(xì)胞生成素、血小板生成素及其組合。所述淋巴毒素是腫瘤壞死因子(TNF)。造血因子可以是白介素(IL),集落刺激因子可以是粒細(xì)胞-集落刺激因子(G-CSF)或粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(GM-CSF)),干擾素可以是干擾素-a、P或y,干細(xì)胞生長(zhǎng)因子可以是S1因子?；蛘?，免疫調(diào)節(jié)劑可包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-IO、IL-12、IL-17、IL-18、IL-21、干擾素-y、TNF-a或其組合。優(yōu)選的治療用放射性核素包括p、a和俄歇發(fā)射體，其keV范圍為80-500keV。示例性的治療用放射性同位素包括"P、33P、47Sc、125I、131I、86Y、90Y、186Re、188Re、189Re、64Cu、67Cu、67Ga、mIn、川Ag、142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、177Lu、198Au、211At、212Pb、212Bi、213Bi、223Ra和225Ac及其組合。示例性的光敏治療藥選自生色團(tuán)和染料。還優(yōu)選的治療藥是選自以下的酶蘋(píng)果酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、S-V-甾體異構(gòu)酶、酵母醇脫氫酶、a-甘油磷酸脫氬酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、P-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、過(guò)氧化氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氬酶、葡糖淀粉酶和乙酰膽石威酯酶。治療用肽的各種實(shí)例是本領(lǐng)域已知的，任何這類(lèi)已知藥物都可使用。示例性的治療用肽包括但不限于激素、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、趨化因子、結(jié)合肽、封閉肽(blockmgpeptide)、毒素、血管生成因子、抗血管生成因子、抗生素、抗癌肽、抗病毒肽、藥用肽、酶、激動(dòng)劑、拮抗劑、造血因子例如紅細(xì)胞生成素和許多其它臨床用化合物。穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可與至少一個(gè)促炎效應(yīng)物細(xì)胞因子、促炎效應(yīng)物趨化因子或促炎效應(yīng)物受體特異性結(jié)合。穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可結(jié)合的促炎效應(yīng)物細(xì)胞因子包括但不限于MIF、HMGB-1、TNF-a(腫瘤壞死因子a)、IL-1、IL畫(huà)4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17和IL-18。促炎效應(yīng)物趨化因子包括但不限于CCL19、CCL21、IL-8、MCP-1(單核細(xì)胞趨化蛋白1)、RANTES、MIP-1A(巨噬細(xì)胞炎性蛋白1A)、MIP-1B(巨噬細(xì)胞炎性蛋白1B)、ENA-78(上皮嗜中性粒細(xì)胞活化肽78)、IP-IO、GROB(GRO(3)和嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子。促炎效應(yīng)物受體包括但不限于IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R和IL-18R。穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)也可與至少一個(gè)凝固因子(例如組織因子或凝血酶)特異性反應(yīng)。淋巴因子/細(xì)胞因子與免疫細(xì)胞上它們的受體反應(yīng)，導(dǎo)致活化，而抗體則可通過(guò)中和這些淋巴因子/細(xì)月包因子而阻斷活化?；蛘撸贵w可以與淋巴因子/細(xì)胞因子受體反應(yīng)而阻斷活化。穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合的不同靶標(biāo)可以是相同或不同類(lèi)型的效應(yīng)物和凝固因子。例如，穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合的兩種或多種不同靶標(biāo)可以選自同類(lèi)效應(yīng)物或凝固因子，例如兩種或多種不同促炎效應(yīng)物細(xì)胞因子、兩種或多種不同促炎效應(yīng)物趨化因子、兩種或多種不同促炎效應(yīng)物受體、或兩種或多種凝固因子?；蛘撸瑑煞N或多種不同輩巴標(biāo)可以選自不同類(lèi)型的效應(yīng)物和凝固因子。例如，一種靶標(biāo)可以是先天免疫系統(tǒng)的促炎效應(yīng)物，另一種靶標(biāo)可以是凝固因子?；蛘?，穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可以與諸如以下的兩種不同類(lèi)型的促炎效應(yīng)物特異性反應(yīng)至少一種促炎效應(yīng)物細(xì)胞因子和至少一種促炎效應(yīng)物趨化因子、至少一種促炎效應(yīng)物細(xì)胞因子和至少一種促炎效應(yīng)物受體、或者至少一種促炎效應(yīng)物趨化因子和至少一種促炎效應(yīng)物受體。也可有這種情況穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)特異性反應(yīng)的兩種不同靶標(biāo)是先天免疫系統(tǒng)同一促炎效應(yīng)物的不止一個(gè)表位，或同一凝固因子的不止一個(gè)表位。因此，"兩個(gè)不同耙標(biāo)"可指兩種不同抗原或同一抗原的兩個(gè)不同表位。多種抗體可針對(duì)同一抗原而使用，因此增加價(jià)位。例如，當(dāng)耙向MIF或HMGB-1時(shí)，尤其是用于治療膿毒病、某些癌癥和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊時(shí)，結(jié)合靶標(biāo)的兩個(gè)相同表位的兩個(gè)抗體可以摻入到穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)中，所述結(jié)構(gòu)帶有另一抗體，其具有針對(duì)不同抗原的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合臂，所述抗原例如II類(lèi)HLA恒定鏈抗原，例如CD74?？梢赃x擇抗體，以結(jié)合兩種不同抗原，例如針對(duì)MIF和CD74的抗體；針對(duì)HMGB-1和CD74的抗體。當(dāng)促炎效應(yīng)物受體被輩巴向時(shí)，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，真實(shí)把標(biāo)可以是促炎效應(yīng)物受體的胞外區(qū)。在一個(gè)替代實(shí)施方案中，穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可包含至少一個(gè)能與促炎效應(yīng)物受體反應(yīng)的分子。該分子可以是所述促炎效應(yīng)物受體的天然拮抗劑，或者該拮抗劑的片段或突變體，并且能與受體發(fā)生特異性相互作用。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，天然拮抗劑是天然IL-1受體拮抗劑，或該拮抗劑的片段或突變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶標(biāo)可以是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的抗原或受體。在其它實(shí)施方案中，穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)的靶標(biāo)可存在于先天免疫系統(tǒng)的細(xì)胞上，所述細(xì)胞例如粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨謹(jǐn)細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞和NK細(xì)胞。其它靶標(biāo)包括血小板和內(nèi)皮細(xì)胞。而另一組耙標(biāo)選自C5a、LPS、IFNy和B7。再一組合適的輩巴標(biāo)包括CD2、CD4、CD14、CD18、CDlla、CD20、CD22、CD23、CD25、CD29、CD38、CD40L、CD52、CD64、CD83、CD147和CD154。CD是免疫細(xì)胞上的耙標(biāo)，可將其阻斷以阻止免疫細(xì)胞反應(yīng)。CD83是特別有用的活化樹(shù)突細(xì)胞標(biāo)記(Cao等，BiochemJ,Aug.23,2004(Epubaheadofprint);Zinser等，J.ExpMed.200(3):345-51(2004》。某些靶標(biāo)特別令人感興趣，例如MIF、HMGB-1、TNF-a、補(bǔ)體因子和補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白以及凝固因子。MIF是先天免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵性細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)控制中起到重要作用。原先是作為抑制巨噬細(xì)胞隨機(jī)遷移的T淋巴細(xì)胞衍生因子而予以描述，稱(chēng)為巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(MIF)的蛋白質(zhì)，在大約30多年以來(lái)一直是謎一樣的細(xì)胞因子。近年來(lái)，發(fā)現(xiàn)MIF是腦垂體腺前葉的產(chǎn)物，生物活性的重組MIF蛋白的克隆和表達(dá)，得出了它在體內(nèi)關(guān)鍵性生物學(xué)作用的定義。MIF具有獨(dú)特性質(zhì)，是由巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞在受到糖皮質(zhì)激素刺激后釋放的。一旦釋放，MIF在體外能克服糖皮質(zhì)激素對(duì)TNF-a、IL-1(3、IL-6和IL-8產(chǎn)生的抑制效應(yīng)(這些TNF-a、IL-lp、IL-6和IL-8是由LPS刺激的單核細(xì)胞產(chǎn)生的)并在體內(nèi)抑制甾體對(duì)致死性?xún)?nèi)毒素血癥的保護(hù)效應(yīng)。MIF在體外也拮抗T細(xì)胞增殖的糖皮質(zhì)激素抑制，即通過(guò)恢復(fù)產(chǎn)生IL-2和IFN卞MIF是第一種已鑒定的可反調(diào)節(jié)(counter-regulate)糖皮質(zhì)激素抑制效應(yīng)的介質(zhì)，因而在炎癥和免疫的宿主控制中起到關(guān)鍵性作用。MIF在治療癌癥、病理性血管生成和膿毒病或膿毒性休克中特別有用。HMGB-1是DNA結(jié)合核和胞質(zhì)溶膠蛋白，它是在IL-ip、TNF或LPS活化后由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞釋放的一種促炎細(xì)胞因子。通過(guò)其B框結(jié)構(gòu)域，它誘導(dǎo)DC的表型成熟。它也可引起促炎細(xì)胞因子IL-la、IL-6、IL-8、IL-12、TNTF-a和RANTES的分泌增加。由壞死細(xì)胞釋放的HMGB-1可以是組織或細(xì)胞損傷的信號(hào)，這樣的信號(hào)當(dāng)被DC感受到之后，能誘導(dǎo)和/或增強(qiáng)免疫反應(yīng)。Palumbo等報(bào)道了HMBG1誘導(dǎo)成血管細(xì)胞(mesoangioblast)遷移和增殖(JCellBiol,164:441-449(2004))。HMGB-1是內(nèi)毒素誘導(dǎo)的致死率的晚期介質(zhì)，它相對(duì)于TNF和IL-1(3表現(xiàn)出顯著延遲動(dòng)力學(xué)。已經(jīng)證明，靶向特定早期炎性介質(zhì)(例如單獨(dú)的TNF和IL-1(3)的實(shí)驗(yàn)性治療藥在臨床上是有效的，但穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可提高反應(yīng)，即通過(guò)同時(shí)靶向早期和晚期炎性介質(zhì)。靶向HMBG-1的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)在治療關(guān)節(jié)炎、尤其是膠原誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎中特別有用。包含HMBG-1的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)也可用于治療膿毒病和/或膿毒性休克。Yang等，PNASUSA101:296-301(2004);Kokkola等，ArthritisRheum,48:2052-8(2003);Czura等，JInfectDis，187Suppl2:S391-6(2003);Treutiger等，JInternMed,254:375-85(2003)。TNF-ot是參與全身炎癥和急性期反應(yīng)的一種重要細(xì)胞因子。TNF-ot由受刺激的單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞釋放。巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、肥大細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞在受到刺激后也產(chǎn)生TNF-a。在損傷過(guò)程中，例如感染過(guò)程中，其釋放受到白介素-1和細(xì)菌內(nèi)毒素等其它幾種介質(zhì)的刺激。它在不同器官系統(tǒng)中具有許多作用，通常與白介素-1和-6在一起。TNF-a的作用之一是抑制食欲；因此用于治療惡病質(zhì)的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)優(yōu)選草巴向TNF-ot。它也刺激肝臟急性期反應(yīng)，導(dǎo)致C-反應(yīng)蛋白和多種其它介質(zhì)的增加。當(dāng)治療膿毒病或膿毒性休克時(shí)，它也是有用的耙標(biāo)。補(bǔ)體系統(tǒng)是復(fù)雜級(jí)聯(lián)，包括血清糖蛋白的蛋白水解(通常由細(xì)胞受體激活)。"補(bǔ)體級(jí)聯(lián)"是組成型而非特異性的，但它必須被活化，才能起作用。補(bǔ)體激活導(dǎo)致單向順序的酶促和生化反應(yīng)。在該級(jí)聯(lián)中，特定補(bǔ)體蛋白C5形成兩個(gè)高度活化的炎性副產(chǎn)物C5a和C5b,它們共同激活白細(xì)胞。這反過(guò)來(lái)又產(chǎn)生大量其它炎性副產(chǎn)物，包括有害的細(xì)胞因子、炎性酶和細(xì)胞粘附分子?？偠灾?，這些副產(chǎn)物可導(dǎo)致在許多炎性疾病中可見(jiàn)的組織破壞。該級(jí)聯(lián)最終引起對(duì)炎癥反應(yīng)、吞噬細(xì)胞趨化性和調(diào)理作用和細(xì)胞溶解的誘導(dǎo)。補(bǔ)體系統(tǒng)可通過(guò)兩個(gè)不同途徑而活化，即經(jīng)典途徑和替代途徑。大多數(shù)補(bǔ)體組分是有編號(hào)的(例如Cl、C2、C3等)，但有些則稱(chēng)為"因子"。某些組分必需經(jīng)酶促切割以活化其功能；其它的則簡(jiǎn)單結(jié)合以形成具有活性的復(fù)合物。經(jīng)典途徑的活性組分包括Clq、Clr、Cls、C2a、C2b、C3a、C3b、C4a和C4b。一,4戈途徑的活性組分包括C3a、C3b、因子B、因子Ba、因子Bb、因子D和備解素。各途徑的最后階段相同，都包括將組分裝配到膜攻擊復(fù)合體(membraneattackcomplex)。膜攻擊復(fù)合體的活性組分包括C5a、C5b、C6、C7、C8和C9n。盡管穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可以靶向補(bǔ)體系統(tǒng)這些組分中的任一種，但是優(yōu)選某些補(bǔ)體組分。C3a、C4a和C5a使肥大細(xì)胞釋放趨化因子(例如組胺和5-羥色胺，這些因子攻擊吞噬細(xì)胞)、抗體和補(bǔ)體等。這些構(gòu)成一組優(yōu)選靶標(biāo)。另一組優(yōu)選的靶標(biāo)包括C3b、C4b和C5b,它們?cè)鰪?qiáng)對(duì)外源細(xì)胞的吞噬作用。另一組優(yōu)選的靶標(biāo)是這兩組的前體組分，即C3、C4和C5。C5b、C6、C7、C8和C9請(qǐng)導(dǎo)外源細(xì)胞溶解(膜攻擊復(fù)合體)并構(gòu)成又一組優(yōu)選的靶標(biāo)。補(bǔ)體C5a，同C3a—樣，也是一種過(guò)敏毒素。它介導(dǎo)炎癥，是誘導(dǎo)嗜中性粒細(xì)胞釋放抗微生物蛋白酶和氧自由基的化學(xué)引誘物。因此，C5a及其前體C5是特別優(yōu)選的靶標(biāo)。通過(guò)耙向C5，不僅C5a受影響，而且C5b也受影響，這引起膜攻擊復(fù)合體的裝配。因此，C5是另一優(yōu)選靶標(biāo)。C3b及其前體C3也是優(yōu)選靼標(biāo)，因?yàn)榻?jīng)典和替代補(bǔ)體途徑依賴(lài)于C3b。三種蛋白質(zhì)影響該因子水平Cl抑制劑、蛋白H和因子I,它們也是本發(fā)明的優(yōu)選靶標(biāo)。補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白(例如CD46、CD55和CD59)可以是穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)所結(jié)合的耙標(biāo)。凝固因子也是優(yōu)選耙標(biāo)，尤其是組織因子(TF)和凝血酶。TF也稱(chēng)為組織促凝血酶原激酶、CD142、凝固因子III或因子m。TF是膜內(nèi)在受體糖蛋白，是細(xì)胞因子受體超家族成員。TF的配體結(jié)合胞外域由兩個(gè)結(jié)構(gòu)模塊組成，其特征與TF的分類(lèi)一致，都是2型細(xì)胞因子受體的成員。TF參與凝血蛋白酶級(jí)聯(lián)，引發(fā)外源性和內(nèi)源性凝血級(jí)聯(lián)，即通過(guò)形成TF胞外域與循環(huán)凝血因子、絲氨酸蛋白酶因子VII或因子Vila之間的高親和性復(fù)合物。這些酶促活性復(fù)合物再激活因子IX和因子X(jué),導(dǎo)致凝血酶的產(chǎn)生和血凝塊的形成。TF由包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞在內(nèi)的不同細(xì)胞類(lèi)型表達(dá)，并由IL-1、TNF-a或細(xì)菌脂多糖誘導(dǎo)。蛋白激酶C參與內(nèi)皮細(xì)胞TF表達(dá)的細(xì)胞因子活化。內(nèi)毒素和細(xì)胞因子誘導(dǎo)TF是引發(fā)革蘭氏陰性膿毒病患者中可見(jiàn)的彌散性血管內(nèi)凝血的重要機(jī)制。TF也表現(xiàn)出參與不同的非止血功能，包括炎癥、癌癥、腦功能、免疫應(yīng)答和腫瘤相關(guān)血管生成。因此，按照本發(fā)明，靶向TF的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)不僅在治療凝血病中有用，而且在治療膿毒病、癌癥、病理性血管生成和其它免疫和炎癥失調(diào)疾病中也有用。認(rèn)為凝血途徑與細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)間具有復(fù)雜的相互作用，因?yàn)閹追N細(xì)胞因子影響各種細(xì)胞內(nèi)TF表達(dá)的能力以及配體對(duì)受體的結(jié)合作用。已經(jīng)報(bào)道了配體結(jié)合(因子VIIa)，以給出胞內(nèi)《丐信號(hào)，因此表明TF是真受體。在其它實(shí)施方案中，穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)結(jié)合I類(lèi)MHC、II類(lèi)MHC或輔助分子，例如CD40、CD54、CD80或CD86。穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)也可結(jié)合T細(xì)胞活化細(xì)胞因子，或結(jié)合細(xì)胞因子介質(zhì)，例如NF-kB。在某些實(shí)施方案中，兩個(gè)不同靶標(biāo)中的一個(gè)可以是癌細(xì)胞受體或癌癥相關(guān)抗原，尤其是選自以下的一個(gè)B-細(xì)胞譜系抗原(CD19、CD20、CD21、CD22、CD23等)、VEGFR、EGFR、癌胚抗原(CEA)、胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(PLGF)、生腱蛋白、EER-2/"ew、EGP-1、EGP-2、CD25、CD30、CD33、CD38、CD40、CD45、CD52、CD74、CD80、CD138、NCA66、CEACAM6(癌胚抗原相關(guān)性細(xì)胞粘附分子6)、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC16、IL-6、甲胎蛋白(AFP)、A3、CA125、結(jié)腸特異性抗原-p(CSAp)、葉酸受體、HLA-DR、人絨毛膜促性腺激素(HCG)、Ia、EL-2、胰島素樣生長(zhǎng)因子(ILGF)和ILGF受體、KS-1、Le(y)、MAGE、壞死抗原、PAM-4、前列腺酸性褲酸酶(PAP)、Prl、前列腺特異性抗原(PSA)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、SIOO、TlOl、TAC、TAG72、TRAIL受體和碳酸酐酶IX。膿毒病和免疫失調(diào)以及其它免疫性疾病相關(guān)的靶標(biāo)包括MIF、IL-1、IL-6、IL-8、CD74、CD83和C5aR。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)針對(duì)C5aR的抗體和抑制劑能提高患有膿毒病的嚙齒動(dòng)物的生存率(Huber-Lang等，F(xiàn)ASEBJ2002;16:1567-1574;Riedemann等，JClmInvest2002;110:101-108),并提高患有膿毒性休克和成人呼吸窘迫綜合征的猴子的生存率(Hangen等，JSurgRes1989;46.195-199;Stevens等，JClinInvest1986;77:1812-1816)。因此，對(duì)于膿毒病，兩個(gè)不同輩巴標(biāo)之一優(yōu)選是感染相關(guān)靶標(biāo)，例如LPS/C5a。其它優(yōu)選靶標(biāo)包括HMGB-l、TF、CD14、VEGF和IL-6,它們各自與敗血癥或膿毒性休克相關(guān)。優(yōu)選穩(wěn)定束縳結(jié)構(gòu)是那些靶向兩個(gè)或更多以下靶標(biāo)的結(jié)構(gòu)HMGB-1、TF和MIF,例如MIF/TF和HMGB-1/TF。在另一些實(shí)施方案中，兩個(gè)不同靶標(biāo)之一可以是移植物抗宿主病或移植排斥相關(guān)靶標(biāo)，例如MIF(Lo等，BoneMarrowTransplant,30(6):375-80(2002))。這兩個(gè)不同把標(biāo)之一也可以是以下疾病相關(guān)靶標(biāo)急性呼吸窘迫綜合征相關(guān)靶標(biāo)，例如IL-8(Bouros等，PMCPulmMed,4(1):6(2004),動(dòng)脈粥樣硬化或再狹窄相關(guān)靶標(biāo)，例如MIF(Chen等，ArtenosclerThromhVaseBiol,24(4):709-14(2004),哮喘相關(guān)輩巴標(biāo)，例如IL-18(Hata等，IntImmunol,Oct.11,2004Epubaheadofprint),肉芽腫性疾病相關(guān)靶標(biāo)，例如TNF-a(Ulbricht等，ArthritisRheum,50(8):2717-8(2004)，神經(jīng)病相關(guān)靶標(biāo)，例如氨曱?；疎PO(紅細(xì)胞生成素)(Leist等，Science305(5681):164-5(2004)或惡病質(zhì)相關(guān)靶標(biāo)，例如IL-6和TNF-a。其它耙標(biāo)包括C5a、LPS、IFN-y、B7;CD2、CD4、CD14、CD18、CDlla、CDllb、CD〗]c、CD14、CD18、CD27、CD29、CD38、CD40L、CD52、CD64、CD83、CD147、CD154?？梢酝ㄟ^(guò)針對(duì)CD18、CD11b或CD11c的抗體，在某種程度上抑制某些微生物抗原(包括LPS)對(duì)單核細(xì)胞的活化，因此涉及p2-整聯(lián)蛋白(Cuzzola等，JImmunol2000;164:5871-5876;Medvedev等，JImmunoll998;160:4535-4542)。已經(jīng)知道CD83在巨細(xì)胞動(dòng)脈炎(GCA)中起作用，這是一種影響中動(dòng)脈到大動(dòng)脈(主要是主動(dòng)脈弓顱外分枝及其主動(dòng)脈本身)的全身性脈管炎，導(dǎo)致血管狹窄并隨后造成組織缺血以及失明、中風(fēng)和主動(dòng)脈弓綜合征的嚴(yán)重并發(fā)癥(Weyand和Goronzy,NEnglJMed2003;349:160-169;Hunder禾口Valente，載于InflammatoryDiseasesofBloodVessels.G.S.Hoffman禾口C.M.Weyand主編，MarcelDekker,NewYork,2002;255-26"。發(fā)現(xiàn)抗CD幻的抗體在人GCA的SCID小鼠模型中能消除脈管炎(Ma-Krupa等，JExpMed2004;199:173-183),向這些研究人員表明，樹(shù)突細(xì)胞(當(dāng)激活時(shí)表達(dá)CD83)在GCA中是重要的抗原加工細(xì)胞。在這些研究中，他們使用小鼠抗CD83Mab(IgGl克隆HB15e，來(lái)自ResearchDiagnostics)。CD154是TNF家族成員，在CD4-陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞表面表達(dá)，已經(jīng)報(bào)道了針對(duì)CD154的人源化單克隆抗體在活動(dòng)性系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者中產(chǎn)生明顯的臨床益處(Grammar等，JClinInvest2003;112:1506-1520)。也表明該抗體可用于其它自身免疫性疾病(Kelsoe,JClinInvest2003;112:1480-1482)。實(shí)際上，也報(bào)道了該抗體在難治性免疫血小板減少性紫癜患者中是有效的(Kuwana等，Blood2004;103:1229-1236)。在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中，重組白介素-1受體拮抗劑IL-IRa即阿那白滯素(anakmra)(Kineret)已經(jīng)顯示出活性(Cohen等，AnnRheumDis2004;63:1062-8;Cohen,RheumDisClinNorthAm2004;30:365-80)。在治療這些患者(至今需要同時(shí)用曱氨蝶呤治療)方面的一個(gè)改進(jìn)，就是將阿那白滯素與一種或多種抗促炎效應(yīng)物細(xì)胞因子或抗促炎效應(yīng)物趨化因子(如上表所示)結(jié)合起來(lái)使實(shí)。實(shí)際上，在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的抗體治療的綜述中，Taylor(CurrOpinPharmacol2003;3:323-328)指出，除了TNF之外，還可使用針對(duì)以下細(xì)胞因子的其它抗體IL-1、IL-6、IL-8、IL-15、IL-17和IL-18。某些更優(yōu)選靶標(biāo)的組合包括下文所述的組合。這是優(yōu)選組合的實(shí)例，但并非是窮盡性的。<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table>穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可以是含有至少兩種分離的抗體和/或受體或它們的配體的混合物，其結(jié)合不同靶標(biāo)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，靶標(biāo)選自先天免疫系統(tǒng)的促炎效應(yīng)物、凝固因子、補(bǔ)體因子和補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白，以及與炎性障礙或免疫失調(diào)障礙、與病理性血管生成或癌癥或傳染性疾病特異性相關(guān)的靶標(biāo)。穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可結(jié)合受體或結(jié)合其靶分子，例如對(duì)于LPS,IL-1、IL-IO、IL-6、MIF、HMGB1、TNF、IFN、組織因子、凝血酶、CD14、CD27和CD134。它們?cè)S多在血液中同時(shí)以受體和可溶性形式存在。穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)的結(jié)合導(dǎo)致從血中快速清除，然后由穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)的第二組分靶向另一細(xì)胞(例如巨噬細(xì)胞)，用于通過(guò)細(xì)胞、尤其是溶酶體進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)和降解。這在第二靶向組分是針對(duì)由巨噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞表達(dá)的內(nèi)化抗原(例如CD74)時(shí)，特別有效。這與Hansen在美國(guó)專(zhuān)利6,458,933中公開(kāi)的內(nèi)容一致，但是集中在炎性細(xì)胞因子和其它免疫調(diào)節(jié)分子和受體(對(duì)于免疫失調(diào)疾病)和癌癥抗原(對(duì)于這些癌癥的免疫治療)。用于治療癌癥的優(yōu)選穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)包含針對(duì)CD55和任何以上癌癥抗原的抗體、針對(duì)CD46和任何以上癌癥抗原的抗體、針對(duì)CD59和任何以上癌癥抗原的抗體、針對(duì)MIF和任何以上癌癥抗原的抗體、針對(duì)NF-kB和任何以上癌癥抗原的抗體，以及針對(duì)IL-6和任何以上癌癥抗原(并非IL4)的抗體。穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可以與一種或多種第二治療藥聯(lián)用。這第二治療藥可以是影響先天免疫系統(tǒng)組分的藥物?；蛘撸捎绊戇m應(yīng)性免疫系統(tǒng)的組分。第二治療藥也可以是影響凝血、癌癥或自身免疫性疾病的組分，例如細(xì)胞毒性藥物。可以用藥盒形式提供帶有診斷試劑或治療藥的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)，用于人或哺乳動(dòng)物治療和診斷用途，所述結(jié)構(gòu)在藥學(xué)上可接受的注射用溶媒中，所述溶媒優(yōu)選生理pH和濃度的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)。優(yōu)選的制劑是無(wú)菌的，尤其是人用制劑。這類(lèi)藥盒的任選組分包括穩(wěn)定劑、緩沖劑、標(biāo)記用試劑、放射性同位素、順磁化合物、用于提高清除率的第二抗體，以及常規(guī)注射器、柱、小瓶(管)等。噬菌體展示在某些替代實(shí)施方案中，可用本領(lǐng)域眾所周知的噬菌體展示技術(shù)，來(lái)確定用于構(gòu)建DDD和/或AD結(jié)構(gòu)域的結(jié)合肽。例如，可以通過(guò)針對(duì)DDD二聚體的噬菌體展示淘選，鑒定能結(jié)合DDD結(jié)構(gòu)域、并因此可替代天然存在的AD序列的肽，并選擇具有高結(jié)合親和性的噬菌體?？梢酝ㄟ^(guò)針對(duì)所選靶標(biāo)的噬菌體展示淘選，來(lái)檢測(cè)其它類(lèi)型的結(jié)合肽，所述肽對(duì)特定靶分子具有選擇性或特異性。用于產(chǎn)生多樣化肽群體的各種噬菌體展示方法和技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，美國(guó)專(zhuān)利第5,223,409、5,622,699和6,068,829號(hào)(所述各專(zhuān)利通過(guò)引用結(jié)合到本文中)公開(kāi)了制備噬菌體文庫(kù)的方法。噬菌體展示技術(shù)包括對(duì)噬菌體進(jìn)行遺傳操作，使得小肽可以表達(dá)在其表面(Smith和Scott,1985,Science228:1315-1317;Smith和Scott,1993,Meth.Enzymol.21:228-257)。最近十幾年來(lái)，在噬菌體展示肽文庫(kù)的構(gòu)建和用該肽文庫(kù)分離肽配體的篩選方法的開(kāi)發(fā)方面已有很大進(jìn)展。例如，使用肽文庫(kù)可以表征許多蛋白質(zhì)內(nèi)的相互作用位點(diǎn)和受體-配體結(jié)合基序，所述蛋白質(zhì)例如參與炎癥反應(yīng)的抗體或介導(dǎo)細(xì)胞粘附的整if關(guān)蛋白。該方法也已用于鑒定新的肽配體，這可導(dǎo)致對(duì)肽模擬藥物或造影劑的開(kāi)發(fā)(Arap等，1998a,Science279:377-380)。除了肽之外，更大的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域(例如單鏈抗體)也可展示在噬菌體顆粒表面(Arap等，1998a)。可以通過(guò)淘選，來(lái)分離對(duì)給定靶分子具有選擇性的靶向氨基酸序列(Pasqualmi和Ruoslahti,1996,Nature380:364-366;Pasqualmi，1999，TheQuart.J.Nucl.Med.43:159-162)。簡(jiǎn)而言之，將含有推定靶向肽的噬菌體文庫(kù)暴露給靶分子，收集含有結(jié)合噬菌體的樣品?？蓪蟹肿舆B接在例如96孔板的微量滴定孔底部。可以洗脫與靶標(biāo)連接的噬菌體，然后通過(guò)在宿主菌中培養(yǎng)而擴(kuò)增。在某些實(shí)施方案中，可以在幾輪淘選之間在宿主菌中使噬菌體增殖。細(xì)菌不被噬菌體裂解，而是分泌多拷貝噬菌體，這些噬菌體展示特定插入物。如有必要，可再次將擴(kuò)增的噬菌體暴露給靶分子，并收集起來(lái)用于進(jìn)一步多輪淘選。可以進(jìn)行多輪淘選，直至得到選擇性或特異性結(jié)合物群體?？梢詫?duì)噬菌體基因組中靶向肽插入物的相應(yīng)DNA進(jìn)行測(cè)序，從而確定肽的氨基酸序列。然后可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)化學(xué)技術(shù)產(chǎn)生經(jīng)鑒定的靶向肽作為合成肽(Ar叩等,1998a,Smith等，1985)。適體在某些實(shí)施方案中，構(gòu)建體形成的前體可包括適體。構(gòu)建和測(cè)定適體結(jié)合特性的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，這類(lèi)技術(shù)參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第5,582，981、5,595,877和5,637,459號(hào)，所述各專(zhuān)利通過(guò)引用結(jié)合到本文中?？捎煤铣?、重組和純化等任何已知方法制備適體，適體最少需要約3個(gè)核苷酸、優(yōu)選至少5個(gè)核苷酸以達(dá)到特異性結(jié)合?？梢允褂眯蛄卸逃?0個(gè)堿基的適體，盡管優(yōu)選10、20、30或40個(gè)核苦酸的適體。適體需含有賦予結(jié)合特異性的序列，但也可以用側(cè)翼區(qū)來(lái)延伸或其它衍生方式來(lái)延伸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，適體的結(jié)合序列可以鄰接引物-結(jié)合序列，以便用PCR或其它擴(kuò)增技術(shù)來(lái)擴(kuò)增適體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，側(cè)翼序列可包含這樣的特定序列該序列優(yōu)先識(shí)別或結(jié)合一個(gè)部分，使適體更牢固地固定在基質(zhì)上?？梢越?jīng)分離、測(cè)序和/或擴(kuò)增或合成，使適體成為常規(guī)DNA或RNA分子?；蛘?，目標(biāo)適體可包含經(jīng)修飾的寡聚體。適體中通常存在的任何羥基都可被膦酸酯基團(tuán)取代，磷酸酯基被標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基保護(hù)起來(lái)，或者被活化以便與其它核苷酸額外連接，或者可以與固體支持物綴合。一種或多種磷酸二酯鍵可以被其它連接基團(tuán)置換，例如P(O)O被以下基團(tuán)置換P(O)S、P(0)NR2、P(O)R、P(O)OR'、CO或CNR2，其中R是H或烷基(1-20C),而R'是烷基(1-20C);另外，該基團(tuán)可通過(guò)o或s與相鄰核苷酸連接。寡聚體中并非所有連接都要相同。能結(jié)合特定目標(biāo)靶的適體的制備和篩選方法是眾所周知的，例如美國(guó)專(zhuān)利第5,475,096號(hào)和美國(guó)專(zhuān)利第5,270,163號(hào)，所述各專(zhuān)利通過(guò)引用結(jié)合到本文中。技術(shù)通常包括從候選適體混合物中進(jìn)行選擇并逐步重復(fù)結(jié)合，將結(jié)合的適體與未結(jié)合適體分離開(kāi)來(lái)并擴(kuò)增。因?yàn)樵诨旌衔镏?，?duì)應(yīng)于最高親和力適體來(lái)說(shuō)只有少量序列(可能僅有一分子適體)存在，通常最好是設(shè)定劃分標(biāo)準(zhǔn)，使得在分離期間，保留混合物中有效量的適體(約5-50%)。每輪都濃縮了對(duì)耙標(biāo)具有高親和性的適體?？芍貜?fù)3-6輪選擇和擴(kuò)增循環(huán)，以產(chǎn)生能以高親和力和高特異性結(jié)合靶標(biāo)的適體。Avimcrs在某些實(shí)施方案中，本文所述的前體、組分和/或復(fù)合物可包含一種或多種avimer序列。Avimer是一類(lèi)結(jié)合蛋白，在對(duì)不同靶分子的親和力和特異性方面有點(diǎn)類(lèi)似于抗體。通過(guò)體外外顯子改組和噬菌體展示，從人胞外受體結(jié)構(gòu)域中開(kāi)發(fā)得到Avimer。(Silverman等，2005,Nat.Biotechnol.23:1493-94;Silverman等，2006,Nat.Biotechnol.24:220)。所得多結(jié)構(gòu)域蛋白包含多個(gè)獨(dú)立結(jié)合結(jié)構(gòu)域，與單一表位結(jié)合蛋白相比，多結(jié)構(gòu)域蛋白表現(xiàn)出改進(jìn)的親和力(在某些情況下低于毫微摩爾級(jí))和特異性。(出處同上)。在不同實(shí)施方案中，avimer可與例如AD和/或DDD序列連接，用于本文要求保護(hù)的方法和組合物。有關(guān)avimer的構(gòu)建和使用方法的更多細(xì)節(jié)公開(kāi)于例如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布號(hào)20040175756、20050048512、20050053973、20050089932和20050221384,所述各文獻(xiàn)的實(shí)施例部分通過(guò)引用結(jié)合到本文中。蛋白質(zhì)和肽在本文要求保護(hù)的方法和組合物的范圍內(nèi)，可以使用各種多肽或蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)可包含抗體或含有抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段。在其它實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)或肽可以是效應(yīng)物分子，例如酶、激素、細(xì)胞因子、結(jié)合蛋白或毒素。本文所用的蛋白質(zhì)、多肽或肽通常是指但不限于大于約200個(gè)氨基酸到自基因翻譯出的全長(zhǎng)序列的蛋白質(zhì)；大于約100個(gè)氨基酸的多肽；和/或約3至約100個(gè)氨基酸的肽。為了方便起見(jiàn)，術(shù)語(yǔ)"蛋白質(zhì)，，、"多肽"和"肽"在本文可互換使用。因此，術(shù)語(yǔ)"蛋白質(zhì)或肽"包括氨基酸序列，所述序列包含天然蛋白質(zhì)中存在的20種常見(jiàn)氨基酸中的至少一種，或至少一個(gè)修飾的或稀有氨基酸。本文所用的"氨基酸殘基"是指本領(lǐng)域已知的任何天然存在的氨基酸、任何氨基酸衍生物或任何氨基酸模擬物。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)或肽殘基是連續(xù)的，沒(méi)有任何非氨基酸間插在氨基酸殘基序列中。在其它實(shí)施方案中，序列可包含一個(gè)或多個(gè)非氨基酸部分。在具體實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)或肽殘基序列可以間插一個(gè)或多個(gè)非氨基酸部分。因此，術(shù)語(yǔ)"蛋白質(zhì)或肽"包括這樣的氨基酸序列其包含天然蛋白質(zhì)中存在的20種常見(jiàn)氨基酸中的至少一種，或至少一個(gè)修飾或稀有氨基酸，包括但不限于2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、p-丙氨酸、P-氨基-丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、哌咬酸(pipendmicacid)、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基異丁酸、3-氨基異丁酸、2-氨基庚二酸、2，4-二氨基丁酸、鎖鏈素、2,2'-二氨基庚二酸、2,3-二氨基丙酸、N-乙基天冬酰胺、羥基賴(lài)氨酸、另'卜羥基賴(lài)氨酸、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸、異鎖鏈素、另'卜異亮氨酸、N-甲基甘氨酸、肌氨酸、N-甲基異亮氨酸、6-N-曱基賴(lài)氨酸、N-甲基纈氨酸、正纈氨酸、正亮氨酸和鳥(niǎo)氨酸。或者，除了天然存在的L-氨基酸之外，蛋白質(zhì)或肽還可包含一種或多種D-氨基酸。產(chǎn)生摻入D-氨基酸的肽的方法公開(kāi)于例如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布號(hào)20O50025709,McBride等(2004年6月14日申請(qǐng))?？刹捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法制備蛋白質(zhì)或肽，所述方法包括通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)表達(dá)蛋白質(zhì)、多肽或肽，從天然來(lái)源分離出蛋白質(zhì)或肽，或者化學(xué)合成蛋白質(zhì)或肽。先前已經(jīng)公開(kāi)了對(duì)應(yīng)于不同基因的核苷酸和蛋白質(zhì)、多肽和肽序列，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道，可以在計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù)中找到它們。一個(gè)這樣的數(shù)據(jù)庫(kù)就是國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)的Genbank禾口GenPept凄t才居庫(kù)。采用本文所公開(kāi)的技術(shù)或本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知技術(shù)，可以擴(kuò)增和/或表達(dá)已知基因的編碼區(qū)。或者，各種市售的蛋白質(zhì)、多肽和肽制劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。肽模擬物多肽制備的另一實(shí)施方案是采用肽模擬物。模擬物是含肽分子，其模擬蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)組件。參見(jiàn)例如Johnson等，"PeptideTurnMimetics"載于BIOTECHNOLOGYANDPHARMACY,Pezzuto等主編，ChapmanandHall，NewYork(1993),所述文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。使用肽模擬物的基本原理是，蛋白質(zhì)肽主鏈的存在，主要能適應(yīng)氨基酸側(cè)鏈，以便于分子的相互作用，例如抗體與抗原的以采用這些原理來(lái)改造第二代分子，所述分子具有本文所公開(kāi)的結(jié)合肽的許多天然特性，但也具有改變或改進(jìn)的特性，例如通過(guò)胃或腸的吸收增加和/或提高了體內(nèi)穩(wěn)定性或活性。融合蛋白不同實(shí)施方案可涉及融合蛋白。這些分子通常具有肽的全部或重要部分，其在N-端或C-端與第二多肽或蛋白質(zhì)的全部或部分連接。例如，融合可用來(lái)自其它物種的前導(dǎo)序列，以^^在異源宿主中進(jìn)行蛋白質(zhì)的重組表達(dá)。另一可用的融合包括加入免疫活性區(qū)，例如抗體表位。而另一有用的融合形式可包括連接用于純化的部分，例如FLAG表位(Prickett等，1989,Biotechniques7:580-589;Castrucci等，1992,JVirol66:4647-46)。融合蛋白的另一用途涉及本文要求4呆護(hù)的束縛復(fù)合物的組分構(gòu)建，例如提供與第一單體連接的DDD序列和與第二單體連接的AD序列。融合蛋白的制備方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。按照以下實(shí)施例所述，這些蛋白質(zhì)可通過(guò)如下方式制備例如通過(guò)使用雙官能交聯(lián)劑的化學(xué)連接，通過(guò)從頭合成完整融合蛋白，或者通過(guò)將編碼第一蛋白質(zhì)或肽的DNA序列與編碼第二肽或蛋白質(zhì)的DNA序列連接在一起，再進(jìn)行完整融合蛋白的表達(dá)。合成肽按照常規(guī)技術(shù)，可以合成完整或部分蛋白質(zhì)或肽，可以是在溶液中或在固體支持物上合成。各種自動(dòng)合成儀是市售的，可按照已知方案來(lái)使用。參見(jiàn)例如Stewart和Young，(1984,SolidPhasePeptideSynthesis,第2版，PierceChemicalCo.);Tam等(1983,丄Am.Chem.Soc,105:6442);Memfield(1986,Science,232:341-347);和Barany和Merrifield(1979,ThePeptides,GrossandMeienhofer主編，AcademicPress,NewYork,第1-284頁(yè))。按照這些方法，可以容易地合成通常約6至約35-50個(gè)氨基酸的短肽序列。或者，可以采用重組DNA技術(shù)，其中將編碼目標(biāo)肽的核苷酸序列插入表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染到合適宿給予肽要求保護(hù)的方法和/或組合物的不同實(shí)施方案涉及給予患者的一種或多種基于肽的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的任何途徑給予，包括但不限于口服、鼻腔、口腔含化劑、吸入、直腸、陰道、局部、正位(orthotopic)、皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、動(dòng)月永內(nèi)、鞘內(nèi)或"l爭(zhēng)脈內(nèi)注射?？诜o予患者的未修飾的肽可在消化道中降解，根據(jù)序列和結(jié)構(gòu)可表現(xiàn)出穿過(guò)腸道內(nèi)襯的吸收差。然而，肽的化學(xué)修飾方法是眾所周知的，所迷方法使肽對(duì)內(nèi)源性蛋白酶降解的壽文感性更低或者更容易通過(guò)消化道吸收(參見(jiàn)例如Blondelle等，l"5,Biophys.J.69:604-11;Ecker和Crooke，1995,Biotechnology13:35卜69;Goodman和Ro,1995，BURGER'SMEDICINALCHEMISTRYANDDRUGDISCOVERY,第I巻，Wollf編著，JohnWiley&Sons;Goodman和Shao,1996,Pure&Appl.Chem.68:1303-08)。也已描述了肽類(lèi)似物文庫(kù)的制備方法，所述肽例如含有D-氨基酸的肽；由模擬肽結(jié)構(gòu)的有機(jī)分子組成的肽模擬物；或類(lèi)肽(peptoid)，例如插烯型類(lèi)肽(vmylogousp印toid);該方法可用于構(gòu)建適于口服給予患者的基于肽的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)。在某些實(shí)施方案中，標(biāo)準(zhǔn)肽鍵連接可以被一種或多種替代連接基團(tuán)置換，所述基團(tuán)例如CH2-NH、CH2-S、CH2-CH2、CH-CH、CO-CH2、CHOH-CH2等。肽模擬物的制備方法是眾所周知的(例如Hmby,1982，LifeSci31:189-99;Holladay等,1983，TetrahedronLett.24:4401-04;Jenmngs隱White等，1982,TetrahedronLett.23:2533;Almqmest等，1980,丄Med.Chem.23:1392-98;Hudson等，1979,Int.J.Pept.Res.14:177-185;Spatola等，1986,LifeSci38:]243-49;美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,169,862、5,539,085、5,576,423、5,051,448、5,559,103,所述各文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。與其肽類(lèi)似物相比，肽模擬物表現(xiàn)出穩(wěn)定性提高和/或體內(nèi)吸收增加?；蛘?，可經(jīng)口服給予肽，使用N端和/或C端封端(capping)以防止外肽酶活性。例如，C-端可以用酰胺肽去于端，而N-端可以通過(guò)肽的乙?；舛?。也可將肽環(huán)化以阻斷外肽酶，例如通過(guò)形成環(huán)酰胺、二硫化物、醚、硫化物等。也可通過(guò)用D-氨基酸替代天然存在的L-氨基酸，而使肽穩(wěn)定化，尤其是在已知內(nèi)肽酶起作用的位置上發(fā)生取代。內(nèi)肽酶結(jié)合和切割序列是本領(lǐng)域已知的，已經(jīng)描述了摻入D-氨基酸的肽的制備和使用方法(例如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布號(hào)20050025709，McBnde等，2004年6月14日申請(qǐng)，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。在某些實(shí)施方案中，肽和/或蛋白質(zhì)可以通過(guò)與蛋白酶抑制劑和/或肽酶抑制劑共同配制，經(jīng)口服給予?？诜o予治療用肽的其它方法公開(kāi)于Mehta("OraldeliveryandRecombinantproductionofpeptidehormones",June2004,BioPharmInternational)。可以腸溶衣的固體劑型主合予肽和貝武形劑，所述賦形劑調(diào)節(jié)腸道蛋白水解活性并增加肽穿過(guò)腸壁而轉(zhuǎn)運(yùn)。用該技術(shù)，完整肽的相對(duì)生物利用度范圍為給藥劑量的1%-10%。使用含有膽酸鈉和蛋白酶抑制劑的腸溶衣微膠嚢劑，已經(jīng)成功將胰島素給予狗(Ziv等，1994,J.BoneMiner.Res.18(增刊2):792-94。用?；舛緣A作為滲透增強(qiáng)劑和腸溶衣，已經(jīng)完成了口服給予肽(￡11(^扭1^00-55,RohmPharmaPolymers,參見(jiàn)Mehta,2004)。用于口服給予肽的賦形劑通常包括一種或多種腸道蛋白酶抑制劑/肽酶抑制劑以及去垢劑或其它試劑，以提高肽的溶解度或吸收，它們可以包裝在腸溶衣膠囊或片劑中(Mehta,2004)。膠嚢中可以包含有機(jī)酸，一旦膠嚢在腸道中溶解時(shí)，這些有機(jī)酸就可酸化腸道并抑制腸道蛋白酶活性(Mehta,2004)?？诜o予肽的另一替代方法包括與基于綴合聚乙二醇(PEG)的兩親寡聚體綴合，該兩親寡聚體增加吸收和對(duì)酶促降解的抗性(Soltero和Ekwuribe,2001,Pharm.Technol.6:110)。在又一些實(shí)施方案中，可以通過(guò)與某些蛋白質(zhì)(例如IgGl的Fc區(qū))綴合而修飾肽，用于口服或吸入給藥(參見(jiàn)實(shí)施例3_7)。肽-Fc綴合物的制備和使用方法公開(kāi)于例如Low等(2005,Hum.Reprod.20:1805-13)和Dumont等(2005,J.Aerosol.Med.18:294-303),所述各文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。Low等(200"公開(kāi)了采用在CHO細(xì)胞中的重組表達(dá)，將FSH的a和(3亞基與IgGlFc區(qū)(單鏈或異型二聚體形式)綴合。Fc綴合的肽通過(guò)新生Fc受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)吸收到肺或腸道上皮細(xì)胞中。與天然肽相比，F(xiàn)c綴合的肽表現(xiàn)出穩(wěn)定性提高，體內(nèi)吸收增加。還觀察到異型二聚體綴合物要比單鏈形式的活性高。交聯(lián)劑在某些實(shí)施方案中，可以使用本領(lǐng)域已知的各種交聯(lián)劑，使蛋白質(zhì)、肽或其它大分子共價(jià)交聯(lián)，所述交聯(lián)劑例如同型-雙官能交聯(lián)劑、雜雙官能交聯(lián)劑和/或光活化交聯(lián)劑。這類(lèi)試劑的非限制性實(shí)例包括雙亞氨酸酯(bisimidates);1,5-二氟-2,4-(二硝基苯)；辛二酸的N-羥基琥珀酰亞胺酯；酒石酸二琥珀酰亞胺酯；二曱基-3,3'-二硫-雙亞氨丙酸酯(bispropionimidate);N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡"定基二硫)丙酸酯；4-(溴氨基乙基)-2-硝基苯疊氮；和4-疊氮基乙二醛。在一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，碳二亞胺交聯(lián)劑，例如DCCD或EDC,可用于將酸性殘基與氨基或其它基團(tuán)交聯(lián)。這些試劑可以改性以連接不同類(lèi)型的標(biāo)"i己，例如熒光標(biāo)記。雙官能交聯(lián)劑已經(jīng)廣泛用于各種目的。攜帶兩個(gè)相同官能團(tuán)的同型雙官能試劑已經(jīng)證明能高效誘導(dǎo)相同或不同大分子或大分子的亞基間的交聯(lián)，并將多肽配體與其特異性結(jié)合位點(diǎn)連接。雜雙官能試劑含有兩個(gè)不同官能團(tuán)。通過(guò)利用兩個(gè)不同官能團(tuán)的不同反應(yīng)性，可以有選擇性地、按順序控制交聯(lián)。按官能團(tuán)的特異性，可將雙官能交聯(lián)劑分為例如氨基、巰基、胍基、吲哚基、羧基特異性基團(tuán)。其中，針對(duì)游離氨基的試劑尤其常用，因?yàn)樗鼈兪鞘惺鄣?，容易合成并且它們可用于溫和反?yīng)條件。大部分雜雙官能交聯(lián)劑都含有伯氨基反應(yīng)基團(tuán)和巰基反應(yīng)基團(tuán)。在另一實(shí)例中，已經(jīng)描述了雜雙官能交聯(lián)劑及其使用方法(美國(guó)專(zhuān)利5,889,155)。交聯(lián)劑將親核酰肼殘基與親電子馬來(lái)酰亞胺殘基連接起來(lái)，在一個(gè)實(shí)例中讓醛與游離巰基偶聯(lián)。這些交聯(lián)劑可以改性以交聯(lián)不同官能團(tuán)?？贵w不同實(shí)施方案可涉及靶標(biāo)的抗體配體。本文所用的術(shù)語(yǔ)"抗體"是指具有抗原結(jié)合區(qū)的抗體樣分子，包括抗體片段，例如Fab'、Fab、F(ab')2、單域抗體(DAB)、Fv、scFv(單鏈Fv)等。各種基于抗體的構(gòu)建體和片段的制備和使用技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的?？贵w的制備和表征方法也是本領(lǐng)域眾所周知的(參見(jiàn)例如Harlowe和Lane,1988,Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory)。所用的抗體也可以是市售的，得自各種已知來(lái)源。例如，各種抗體分泌的雜交瘤系可得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,ATCC,Manassas,VA)?？贵w片段的制備要求保護(hù)的方法和/或組合物的某些實(shí)施方案可涉及抗體片段。這類(lèi)抗體片段可用常規(guī)方法由胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整抗原而獲得。例如，抗體片段可通過(guò)將抗體用胃蛋白酶酶促切割而得到，以提供5S片段(稱(chēng)為F(ab')2)。該片段還可用巰基還原劑切割，并且任選將封閉基團(tuán)用于來(lái)自二硫鍵分解得到的巰基，以產(chǎn)生3.5SFab'單價(jià)片段?；蛘撸梦傅鞍酌傅拿复偾懈町a(chǎn)生兩個(gè)單價(jià)Fab片段和Fc片段?？贵w片段的示例性制備方法公開(kāi)于美國(guó)專(zhuān)利第4,036,945號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第4,331，647號(hào)；Nisonoff等,1960,Arch.Biochem.Biophys.,89:230;Porter,1959,Biochem.J.,73:119;Edelman等，1967,METHODSINENZYMOLOGY,第422頁(yè)(AcademicPress)和Coligan等(編著)，1991,CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY,(JohnWiley&Sons)。也可采用切割抗體的其它方法，例如分離重鏈以形成單價(jià)輕鏈-重鏈片段、進(jìn)一步切割片段或其它酶促、化學(xué)或遺傳技術(shù)，只要片段能結(jié)合被完整抗體識(shí)別的抗原。例如，F(xiàn)v片段包括Vh和Vl鏈的締合。該締合可以是非共價(jià)的，參見(jiàn)Inbar等，l972,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA,69:2659。或者，可變《連可以由分子間二辟"建連接或由化學(xué)試劑(例如戊二醛)交聯(lián)。參見(jiàn)Sandhu,l992,Cnt.Rev.Biotech.,12:437。優(yōu)選的Fv片段包含由肽接頭連接的VJ連和V^鏈。通過(guò)構(gòu)建包含DNA序列的結(jié)構(gòu)基因，制備這些單鏈抗原結(jié)合蛋白(sFv),所述DNA序列編碼VH區(qū)和VL區(qū)，這兩區(qū)由寡核苷酸接頭序列連接。將結(jié)構(gòu)基因插入到表達(dá)載體中，隨后導(dǎo)入宿主細(xì)胞例如大腸桿菌內(nèi)。重組宿主細(xì)胞合成單一多肽鏈，其具有接頭肽連接兩個(gè)V區(qū)。sFv的制備方法是本領(lǐng)域眾所周知的。參見(jiàn)Whitlow等，1991,Methods:ACompaniontoMetnodsinEnzymology2:97;Bird等，1988,Science,242:423;美國(guó)專(zhuān)利第4,946,778號(hào)；Pack等，1993,Bio/Technology,11:1271和Sandhu，1992,Cnt.Rev.Biotech.,12:437。另一形式的抗體片段是編碼單個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的肽。通過(guò)構(gòu)建目標(biāo)抗體CDR的編碼基因可以得到CDR肽("最小識(shí)別單元")。通過(guò)例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)制備這類(lèi)基因，再由產(chǎn)生抗體的細(xì)胞的RNA合成可變區(qū)。參見(jiàn)Larrick等，l"l,Methods:ACompaniontoMethodsinEnzymology2:106;Ritter等(編著)，1995,MONOCLONALANTIBODIES:PRODUCTION,ENGINEERINGANDCLINICALAPPLICATION,第166-179頁(yè)(CambridgeUniversityPress);Birch等(編著)，1995,MONOCLONALANTIBODIES:PRINCIPLESANDAPPLICATIONS,第137-185頁(yè)(Wiley畫(huà)Liss，Inc)。嵌合抗體和人源化抗體嵌合抗體是其中人抗體可變區(qū)已經(jīng)被例如小鼠抗體的可變區(qū)取代的重組蛋白，所述重組蛋白包含小鼠抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。當(dāng)給予患者時(shí)，嵌合抗體表現(xiàn)出免疫原性降低，穩(wěn)定性增加。嵌合抗體的構(gòu)建方法是本領(lǐng)域眾所周知的(例如Leung等，I994,Hybndoma13:469)?？梢允骨逗蠁慰寺】贵w人源化，即通過(guò)將來(lái)自小鼠免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區(qū)的小鼠CDR轉(zhuǎn)移到人抗體相應(yīng)可變區(qū)。嵌合單克隆抗體中的小鼠構(gòu)架區(qū)(FR)也用人FR序列取代。為了保護(hù)人源化單克隆的穩(wěn)定性和抗原特異性，一種或多種人FR殘基可以用小鼠相應(yīng)殘基取代。人源化單克隆抗體可用于患者的治療性治療。通過(guò)選擇性修飾CDR序列也可提高人源化抗體對(duì)靶標(biāo)的親和性(WO0029584Al)。產(chǎn)生人源化單克隆抗體的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的。(參見(jiàn)例如Jones等，1986，Nature,321:522;Riechmann等，Nature,1988,332:323;Verhoeyen等，1988,Science,239:1534;Carter等，1992,Proc.Nat'lAcad.Sci.USA,89:4285;Sandhu,Crit.Rev.Biotech.,1992,12:437;Tempest等，1991,Biotechnology9:266;Singer等，J.Immun.,1993,150:2844)。其它實(shí)施方案可涉及非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)抗體。在狒狒中產(chǎn)生治療上有用的抗體的通用技術(shù)可參見(jiàn)例如Goldenberg等，WO91/11465(簡(jiǎn))和Losman等，Int.丄Cancer46:310(1990)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體可以是人單克隆抗體。這類(lèi)抗體得自轉(zhuǎn)基因小鼠，已對(duì)這些小鼠進(jìn)行改造，以在響應(yīng)抗原性攻擊時(shí)產(chǎn)生特定人抗體。在該技術(shù)中，將人重鏈和輕鏈基因座元件導(dǎo)入源自胚胎干細(xì)胞系的小鼠品系中，該類(lèi)胚胎干細(xì)胞系含有定向破壞的內(nèi)源重鏈和輕鏈基因座。轉(zhuǎn)基因小鼠可合成對(duì)人抗原具有特異性的人抗體，而且小鼠可用于產(chǎn)生分泌人抗體的雜交瘤。從轉(zhuǎn)基因小鼠獲得人抗體的方法參見(jiàn)Green等，NatureGenet.7:13(I994),Lonberg等，Nature368:856(1994)和Taylor等，Int.Immun.6:579(1994)。人抗體用組合方法或經(jīng)人免疫球蛋白基因座轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物來(lái)產(chǎn)生完整人抗體的方法是本領(lǐng)域已知的(例如Mancini等，2004,NewMicrobiol.27:315-28;Conrad和Scheller,2005,Comb.Chem.HighThroughputScreen.8:117隱26;Brekke和Loset,2003,Curr.Opm.Phamacol.3:544-50;所述各文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。與嵌合抗體或人源化抗體相比，這樣的完整人抗體有望表現(xiàn)出更少的副作用并且象內(nèi)源性人抗體一樣在體內(nèi)起作用。在某些實(shí)施方案中，要求在一個(gè)替代方案中，如上所述的噬菌體展示技術(shù)可用于產(chǎn)生人抗體(例如Dantas-Barbosa等，2005,Genet.Mol.Res.4:126-40，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。人抗體可以由正常人或表現(xiàn)出特定疾病狀態(tài)例如癌癥的病人來(lái)產(chǎn)生(Dantas-Barbosa等，2005)。由患病個(gè)體來(lái)構(gòu)建人抗體的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)于針對(duì)疾病相關(guān)抗原的抗體，循環(huán)抗體庫(kù)(repertoire)可以?xún)?yōu)先。在該方法的一個(gè)非限制性實(shí)例中，Dantas-Barbosa等(2005)構(gòu)建了來(lái)自骨肉瘤患者的人Fab抗體片段的噬菌體展示文庫(kù)。一般來(lái)說(shuō)，總RNA得自循環(huán)血淋巴細(xì)胞(出處同上)。從屮y和K鏈抗體庫(kù)克隆重組Fab庫(kù)，并將其插入噬菌體展示文庫(kù)(出處同上)。采用針對(duì)重鏈和輕鏈免疫球蛋白序列的特定引物，將RNA轉(zhuǎn)化為cDNA并用于制備FabcDNA文庫(kù)(Marks等，1991,J.Mol.Biol.222:581-97,所述文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。按照以下文獻(xiàn)所述方法構(gòu)建文庫(kù)Andris-Widhopf等(2000,載于PhageDisplayLaboratoryManual,Barbas等(主編)，第1版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY第9.1-9.22頁(yè)，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。最終Fab片段用限制性?xún)?nèi)切核酸酶消化，插入到噬菌體基因組中，制備噬菌體展示文庫(kù)。這樣的文庫(kù)可以用如上所述的標(biāo)準(zhǔn)噬菌體展示方法來(lái)篩選。技術(shù)人員將會(huì)知道該技術(shù)僅僅是示例性的，任何通過(guò)噬菌體展示來(lái)制備和篩選人抗體或抗體片段的已知方法都可使用。在另一替代方案中，使用如上所述的標(biāo)準(zhǔn)免疫方案，經(jīng)基因工程改造以產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可用于產(chǎn)生針對(duì)幾乎任何免疫原性靶標(biāo)的抗體。這類(lèi)系統(tǒng)的非限制性實(shí)例是來(lái)自Abgemx(Fremont,CA)的XenoMouse(例如Green等，1999,J.Immunol.Methods231:11-23,所述文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。在XenoMouse⑧和類(lèi)似動(dòng)物中，小鼠抗體基因已經(jīng)被鈍化并被功能性人抗體基因取代，而小鼠免疫系統(tǒng)的其余部分仍保留完整d用種系配置的YAC(酵母人工染色體)轉(zhuǎn)化XenoMouse,所述YAC含有部分人IgH和IgK基因座，包含大部分可變區(qū)序列，輔助基因和調(diào)節(jié)序列。人可變區(qū)庫(kù)可用于產(chǎn)生能產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞，所述細(xì)胞可用已知技術(shù)加工成雜交瘤。用耙抗原免疫的XenoMouse⑧將由正常免疫應(yīng)答產(chǎn)生人抗體，可以收獲這類(lèi)抗體和/或通過(guò)如上所述的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)制備。XenoMouse⑧的各種品系都是可得的，它們每個(gè)都能產(chǎn)生不同類(lèi)別的抗體。這類(lèi)人抗體可以通過(guò)化學(xué)交聯(lián)或其它已知方法與其它分子偶聯(lián)。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的人抗體已經(jīng)顯示出具有治療潛力，同時(shí)又保留正常人抗體的藥代動(dòng)力學(xué)特性(Green等，1999)。技術(shù)人員將會(huì)知道，要求保護(hù)的組合物和方法不限于使用XenoMouse系統(tǒng)，也可使用經(jīng)基因工程改造以產(chǎn)生人抗體的任何轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。用于克隆、基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)的栽體在某些實(shí)施方案中，可以使用表達(dá)載體來(lái)表達(dá)肽或蛋白質(zhì)，例如融合蛋白，然后再對(duì)其進(jìn)行純化和使用。表達(dá)需要的合適信號(hào)是由載體提供的，包括各種調(diào)節(jié)元件，例如來(lái)自病毒或哺乳動(dòng)物來(lái)源的增強(qiáng)子/啟動(dòng)子，它們驅(qū)動(dòng)目標(biāo)基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)。也已知道設(shè)計(jì)用于優(yōu)化信使RNA在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定性和可翻譯性的元件。調(diào)節(jié)元件術(shù)語(yǔ)"表達(dá)構(gòu)建體"或"表達(dá)載體"是指包括含有基因產(chǎn)物編碼核酸的任何類(lèi)型的遺傳構(gòu)建體，其中部分或全部核酸編碼序列能夠被轉(zhuǎn)錄。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼基因產(chǎn)物的核酸處于啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制之下。"啟動(dòng)子"是指由這樣的DNA序列所述DNA序列是由細(xì)胞合成機(jī)器識(shí)別的、或?qū)牒铣蓹C(jī)器中的，所述DNA序列是啟動(dòng)基因的特異性轉(zhuǎn)錄所必需的。術(shù)語(yǔ)"處于轉(zhuǎn)錄控制之下"是指啟動(dòng)子相對(duì)于核酸來(lái)說(shuō)處于正確位置和方向，以控制RNA聚合酶啟動(dòng)和基因表達(dá)。用于控制目標(biāo)核酸序列表達(dá)的特定啟動(dòng)子并不認(rèn)為是重要的，只要它能指導(dǎo)核酸在中靶細(xì)胞中的表達(dá)。因此當(dāng)靶向人體細(xì)胞時(shí)，優(yōu)選將核酸編碼區(qū)放置在啟動(dòng)子附近并處于啟動(dòng)子控制之下，使其能在人體細(xì)胞中表達(dá)。一般來(lái)說(shuō)，這類(lèi)啟動(dòng)子可包括人或病毒啟動(dòng)子。在不同實(shí)施方案中，人巨細(xì)胞病毒(CMV)即時(shí)早期基因啟動(dòng)子、SV40早期啟動(dòng)子、勞斯肉瘤病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列、大鼠胰島素啟動(dòng)子和甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動(dòng)子，都可用于得到目標(biāo)編碼序列的高水平表達(dá)。也包括使用本領(lǐng)域熟知的其它病毒啟動(dòng)子或哺乳動(dòng)物細(xì)胞啟動(dòng)子或噬菌體啟動(dòng)子，以達(dá)到目標(biāo)編碼序列的表達(dá)，只要表達(dá)水平足以滿足預(yù)定目的。當(dāng)使用cDNA插入序列時(shí)，通常包含聚腺苷酸化信號(hào)，以引起基因轉(zhuǎn)錄物的適當(dāng)聚腺苷酸化。對(duì)于本發(fā)明的成功實(shí)施來(lái)說(shuō)，并不認(rèn)為聚腺普酸化信號(hào)的特性是關(guān)鍵性的，任何這類(lèi)序列都可使用，例如人生長(zhǎng)激素和SV40聚腺苷酸化信號(hào)。也考慮到表達(dá)構(gòu)建體元件是終止子。這些元件可起到增加信使水平并減少?gòu)臉?gòu)建體到其它序列的閱讀的作用。選捧標(biāo)記在某些實(shí)施方案中，可通過(guò)在表達(dá)構(gòu)建體中包含標(biāo)記，在體外或體內(nèi)鑒定含有核酸構(gòu)建體的細(xì)胞。這類(lèi)標(biāo)記賦予細(xì)胞可鑒定的變化，便于容易鑒定含有表達(dá)構(gòu)建體的細(xì)胞。通常包含的藥物選擇標(biāo)記目的在于克隆和轉(zhuǎn)化子的選擇。例如，賦予以下藥物抗性的基因是有用的選^i奪標(biāo)記新霉素、嘌羅霉素、潮霉素、DHFR、GPT、零霉素(zeocin)和組氨醇?；蛘?，可以使用酶，例如單純皰滲病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)。也可使用免疫學(xué)標(biāo)記。并不認(rèn)為所用的選擇標(biāo)記是重要的，只要它能與編碼基因產(chǎn)物的核酸同所引用的所有參考文獻(xiàn)，包括專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)，全都通過(guò)引用結(jié)合到本文中。實(shí)施例提供以下實(shí)施例，用于說(shuō)明而非限制要求保護(hù)的本發(fā)明。由3個(gè)Fab亞基組成的非共價(jià)a2b復(fù)合物的制備方法實(shí)施例1.產(chǎn)生模塊Fab亞基的通用策略產(chǎn)生了融合蛋白形式的Fab模塊，其中含有DDD或AD序列。對(duì)每種Fab融合蛋白都開(kāi)發(fā)了獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。模塊一旦產(chǎn)生后，如有必要可以純化模塊，或者保留在細(xì)胞培養(yǎng)上清液中。任何(Fab-DDD)2模塊在產(chǎn)生出來(lái)之后，都可與任何Fab-AD模塊結(jié)合產(chǎn)生雙特異性三價(jià)Fab(bsTF)。質(zhì)粒載體pdHL2已用于產(chǎn)生各種抗體和基于抗體的構(gòu)建體。參見(jiàn)Gillies等，JImmunolMethods(1989)，125:191-202;Losman等，Cancer(Phila)(l997),80:2660_6。雙順?lè)醋硬溉閯?dòng)物表達(dá)載體指導(dǎo)IgG重鏈和輕鏈的合成。對(duì)于許多不同IgG-pdHL2構(gòu)建體來(lái)說(shuō)，載體序列大部分都相同，僅在可變區(qū)(VH和VJ序列中存在差異。采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的分子生物學(xué)工具，可將這些IgG表達(dá)載體轉(zhuǎn)化成Fab-DDD或Fab-AD表達(dá)載體。為了產(chǎn)生Fab-DDD表達(dá)載體，將重鏈的鉸鏈、CH2和CH3區(qū)的編碼序列，用編碼鉸鏈的前4個(gè)殘基、14個(gè)殘基的Gly-Ser接頭和人RIIa前44個(gè)殘基的序列取代(稱(chēng)為DDD1,圖1)。為了產(chǎn)生Fab-AD表達(dá)載體，將IgG的鉸鏈、CH2和CH3區(qū)的序列，用編碼鉸鏈的前4個(gè)殘基、15個(gè)殘基的Gly-Ser接頭和17殘基合成AD(稱(chēng)為^^-/》的序列取代(稱(chēng)為AD1,圖2),所述序列用生物信息學(xué)和肽陣列技術(shù)來(lái)產(chǎn)生，并表現(xiàn)出以很高的親和力與RIIoc二聚體結(jié)合(0.4nM)。參見(jiàn)Alto等，Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.(2003),100:4445-50。設(shè)計(jì)了兩個(gè)穿梭載體，以便將如上所述的IgG-pdHL2載體轉(zhuǎn)化成Fab-DDD1或Fab-AD1表達(dá)載體。CH1的制備通過(guò)PCR擴(kuò)增CH1區(qū)，用pdHL2質(zhì)粒載體作為模板。PCR左引物由CH1區(qū)上游(5')和SacII限制性?xún)?nèi)切核酸酶位點(diǎn)組成，它是CH1編碼序列的5'。右引物由編碼鉸鏈的前4個(gè)殘基的序列(PKSC)、接著是GGGGS以及包含BamHI限制位點(diǎn)的最后兩個(gè)密碼子(GS)組成。CH1左引物的5'5，gaacctcgcggacagttaag-3，(seqIDn0:5)CHI+G4S-Bam右5，ggatcctccgccgccgcagctcttaggtti;cttgtccaccttggtgttgctgg-3，(seqidno:6)將410bpPCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pGemTPCR克隆載體(Promega,Inc.)中，篩選以T7(5')方向插入的克隆。(G4S)2DDD1的構(gòu)建由SigmaGenosys(Haverhill,UK)合成雙《連體寡核苷酸(稱(chēng)為(G4S)2DDD1)以編碼DDD1的氨基酸序列，DDD1之前是接頭肽的11個(gè)殘基，其中包含BamHI限制位點(diǎn)的前兩個(gè)密碼子。終止密碼子和Eagl限制位點(diǎn)附加在3'端。所編碼的多肽序列如下所示。GSGGGGSGGGGSHIOIPPGLTELLOGYTVEVLROOPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQIDNO:7)合成了兩個(gè)寡核苷酸(稱(chēng)為RIIA1-44上鏈和RIIA1-44下鏈)，在其3'端有30堿基對(duì)的重疊(SigmaGenosys),結(jié)合以包含174bpDDD1序列的中間154石成基對(duì)。將寡核苷酸退火，用Taq聚合酶進(jìn)行引物延伸反應(yīng)。RIIA1-44上鏈5,GTGGCGGGTCTGGCGGAGGTGGCAGCCACATCCAGATCCCGCCGGGGCTCACGGAGCTGCTGCAGGGCTACACGGTGGAGGTGCTGCGACAG-3，(SEQIDNO:8)RIIA1-44下鏈AGGCGGCTGCTGTCGCAGCACCTCCACCGTGTAGCCCTG-3'(SEQ1DNO:9)引物延伸后，通過(guò)PCR擴(kuò)增雙鏈體，使用以下引物G4SBam-左5'陽(yáng)GGATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGT-3，(SEQIDNO:IO)1-44stopEag右5'-CGGCCGTCAAGCGCGAGCTTCTCTCAGGCG-3'(SEQIDNO:11)將該擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pGemT中，篩選以T7("方向插入的克隆。(G4S)2-AD1的構(gòu)建合成了雙鏈體寡核苷酸(稱(chēng)為(G4SVAD1)(SigmaGenosys)以編碼AD1的氨基酸序列，AD1之前是接頭肽的11個(gè)殘基，其中包含BamHI限制位點(diǎn)的前兩個(gè)密碼子。終止密碼子和Eagl限制位點(diǎn)附加在3'端。所編碼的多肽序列如下所示。GSGGGGSGGGGSOIEYLAKOrVDNAIOOA(SEQIDNO:12)合成兩個(gè)互補(bǔ)重疊寡核苷酸(稱(chēng)為AKAP-IS上鏈和AKAP-IS下鏈)。AKAP-IS上鏈5'GGATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGTGGCAGCCAGATCGAGTACCTGGCCAAGCAGATCGTGGACAACGCCATCCAGCAGGCCTGACGGCCG-3'(SEQIDNO:13)AKAP-IS下鏈GATCTGGCTGCCACCTCCGCCAGACCCGCCACCTCCGGATCC-3，(SEQIDNO:14)通過(guò)PCR擴(kuò)增雙鏈體，使用以下引物G4SBam-左5，-GGATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGT-3，(SEQIDNO:15)AKAP-ISstopEag右5，-CGGCCGTCAGGCCTGCTGGATG-3，(SEQIDNO:16)將該擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pGemT載體中，篩選以T7("方向插入的克隆。將DDD1與CHI連接用BamHI和Notl限制酶從pGemT上切下編碼DDD1序列的190bp片段，與CHl-pGemT上的相同位點(diǎn)連接，產(chǎn)生穿梭載體CHl-DDDl匿pGemT。將ADl與CHI連接用BamHI和Notl限制酶從pGemT上切下含有ADl序列的110bp片段，與CHl-pGemT上的相同位點(diǎn)連接，產(chǎn)生穿梭載體CHl-ADl漏pGemT。將CH1-DDD1或CH1-AD1克隆到基于pdHL2的載體中使用該模塊設(shè)計(jì)，將CH1-DDD1或CH1-AD1摻入到pdHL2載體的任何IgG構(gòu)建體中。完整重鏈恒定區(qū)用以上一個(gè)構(gòu)建體取代，即通過(guò)從pdHL2上除去SacII/Eagl限制片段(CH1-CH3)并將其用CH1-DDD1或CH1-AD1的SacII/Eagl片段取代，所述CH1-DDD1或CH1-AD1的SacII/Eagl片段是從相應(yīng)pGemT穿梭載體上切割下來(lái)的。N端DDD結(jié)構(gòu)域DDD或AD的位置不限于CH1的羧基端。構(gòu)建體經(jīng)改造，其中DDD1序列連接在VH區(qū)的氨基端。實(shí)施例2:表達(dá)栽體h679-Fd-ADl-pdHL2的構(gòu)建1]679-Fd-ADl-pdHL2是一種產(chǎn)生h679Fab的表達(dá)載體，其中AD1通過(guò)由14個(gè)氨基酸殘基組成的柔性Gly/Ser肽間隔區(qū)與FdCH1區(qū)羧基端連接。通過(guò)用CH1-AD1片段取代SacII/Eagl片段，將含有h679可變區(qū)的基于pdHL2的栽體轉(zhuǎn)化成h679-Fd-ADl-pdHL2，所述CH1-AD1是用SacII和Eagl從CH1-AD1-SV3穿梭載體上切割下來(lái)的。C-DDDl-Fd-hMN-14-pdHL2的構(gòu)建C-DDDl-Fd-hMN-14-pdHL2是一種產(chǎn)生穩(wěn)定二聚體的表達(dá)載體，其包含兩個(gè)拷貝的融合蛋白C-DDDl-Fab-hMN-14,其中DDD1在CH1的羧基端通過(guò)柔性肽間隔區(qū)與hMN-14Fab連接。通過(guò)用SacII和Eagl限制性?xún)?nèi)切核酸酶消化以除去CH1-CH3區(qū)并插入CH1-DDD1片段，將已用于產(chǎn)生hMN-14IgG的質(zhì)粒載體hMN14(I)-pdHL2，轉(zhuǎn)化成C-DDDl-Fd-hMN-14-pdHL2，所述CH1-DDD1片段是用SacII和Eagl從CHl-DDDl-SV3穿梭載體上切割下來(lái)的。N腸DDDl-Fd-hMN-14-pdHL2的構(gòu)建[OMO]N-DDDl-Fd-hMN-14-pdHL2是一種產(chǎn)生穩(wěn)定二聚體的表達(dá)載體，其包含兩個(gè)拷貝的融合蛋白N-DDDl-Fab-hMN-14,其中DDD1在VH的氨基端通過(guò)柔性肽間隔區(qū)與hMN-14Fab連接。如下所示進(jìn)行表達(dá)載體的改造。通過(guò)PCR擴(kuò)增DDD1區(qū)，用如下所示的兩個(gè)引物。DDDl-Nco左5，CCATGGGCAGCCACATCCAGATCCCGCC-3，(SEQIDNO:17)DDDl-G4SBam右G-3'(SEQIDNO:18)作為PCR的結(jié)果，將Ncol限制位點(diǎn)和含有BamHI限制位點(diǎn)的部分接頭(G4S)2的編碼序列分別附加在5'和3'端。將170bpPCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pGemT載體中，篩選以T7(5')方向插入的克隆。用Ncol和Sail限制酶從pGemT載體上切下194bp插入片段并克隆到SV3穿梭載體中，所述載體已用同樣的酶消化而制備，產(chǎn)生中間栽體DDD1-SV3。通過(guò)PCR,使用如下所示的寡核苷酸引物，擴(kuò)增hMN-14Fd序列。hMN-14VH左G4SBam5，-GGATCCGGCGGAGGTGGCTCTGAGGTCCAACTGGTGGAGAGCGG-3'(SEQIDNO:19)CH1-CstopEag5，-CGGCCGTCAGCAGCTCTTAGGTTTCTTGTC-3，(SEQIDNO:20)作為PCR的結(jié)果，將BamHI限制位點(diǎn)和部分接頭(G4S)的編碼序列附加在擴(kuò)增產(chǎn)物的5'端。將終止密碼子和Eagl限制位點(diǎn)附加在3'端。將1043bp擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pGemT中。用BamHI和Eagl限制酶從pGemT上切下hMN-14-Fd插入片段并與DDD1-SV3載體連接，所述載體已用同樣的酶消化制備，產(chǎn)生構(gòu)建體N-DDDl-hMN-14Fd畫(huà)SV3。用Xhol和Eagl限制酶切割N-DDDl-hMN-14Fd序列，將1.28kb插入片段與載體片段連接，所述載體片段是用同樣的酶消化C-hMN-14-pdHL2而制備的。最終的表達(dá)載體是N-DDDl-Fd-hMN-14-pDHL2。實(shí)施例3.h679-Fab-ADl的制備和純化用SalI限制性?xún)?nèi)切核酸酶消化，使h679-Fd-ADl-pdHL2載體線性化，然后通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)染到Sp/EEE骨髓瘤細(xì)胞中。該雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體指導(dǎo)h679K輕鏈和h679Fd-AD1的合成和分泌，它們結(jié)合形成h679Fab-AD1。電穿孔后，將細(xì)胞接種在96孔組織培養(yǎng)板上，用0.05甲氨蝶呤(MTX)選擇轉(zhuǎn)染子克隆。通過(guò)ELISA,使用包被BSA-IMP-260(HSG)綴合物的微量滴定板，篩選克隆的蛋白質(zhì)表達(dá)，并用HRP-綴合的山羊抗人Fab進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)測(cè)定注射稀釋培養(yǎng)基樣品所得的起始斜率，將用HSG(IMP-"9)傳感器芯片的BIAcore分析用于測(cè)定生產(chǎn)率。最高產(chǎn)量的克隆的起始生產(chǎn)率約為30mg/L。經(jīng)一步IMP-291親和色譜，總共從4.5升滾瓶培養(yǎng)物中純化出230mgh679-Fab-ADl。通過(guò)超濾將培養(yǎng)基濃縮約10倍，然后上樣到IMP-291-affigel柱上。用PBS洗滌柱子到基線，用1M咪唑、1mMEDTA、0.1MNaAc(pH4.5)洗脫出h679-Fab-ADl。對(duì)洗出液進(jìn)行SE-HPLC分析顯示，保留時(shí)間為9.63min的單個(gè)尖峰與50kDa蛋白質(zhì)一致。經(jīng)還原型SDS-PAGE分析證明，僅有兩個(gè)條帶代表h679-ADl的多肽組分。實(shí)施例4.N-DDDl-Fab-hMN-14和C-DDDl-Fab-hMN-14的制備和純化通過(guò)電穿孔，將C-DDDl-Fd-hMN-14-pdHL2和N-DDDl-Fd-hMN-14-pdHL2載體轉(zhuǎn)染到Sp2/0衍生的骨髓瘤細(xì)胞中。C-DDDl-Fd-hMN-14-pdHL2是雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體，指導(dǎo)hMN-14K輕鏈和hMN-14Fd-DDD1的合成和分泌，它們結(jié)合形成C-DDDl-hMN-14Fab。N-DDDl-hMN-14-pdHL2是雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體，指導(dǎo)hMN-14K輕鏈和N-DDDl-Fd-hMN-14的合成和分泌，它們結(jié)合形成N-DDDl-Fab-hMN-14。每種融合蛋白通過(guò)DDD1結(jié)構(gòu)域相互作用形成穩(wěn)定的同型二聚體。電穿孔后，將細(xì)胞接種在96孔組織培養(yǎng)板上，用0.05曱氨蝶呤(MTX)選擇轉(zhuǎn)染子克隆。通過(guò)ELISA,使用包被WI2(針對(duì)hMN-14的大鼠抗id單克隆抗體)的微量滴定板，篩選克隆的蛋白質(zhì)表達(dá)，并用HRP-綴合的山羊抗人Fab進(jìn)行檢測(cè)。C-DDDl-Fab-hMN14Fab和N-DDDl-Fab-hMN14Fab克隆最高產(chǎn)量的克隆的起始生產(chǎn)率分別為60mg/L和6mg/L。用AD1-Affigel對(duì)N-DDDl-hMN-14和C-DDDl-hMN-14進(jìn)^f亍親和純化。DDD/AD相互作用用于親和純化含有DDDl的構(gòu)建體。ADl-C是經(jīng)合成制備的肽，由AEM序列和羧基端半胱氨酸殘基組成(參見(jiàn)實(shí)施例6)，用于在巰基與氯乙酸酐反應(yīng)之后將肽與Affigel偶聯(lián)。含有DDD的32結(jié)構(gòu)在中性pH時(shí)與AD1-C-Affigel樹(shù)脂特異性結(jié)合，而在低pH(例如pHl"時(shí)可被洗脫。經(jīng)一步AD1-C親和色譜，總共從1.2升滾瓶培養(yǎng)物中純化出81mgC-DDDl-Fab-hMN-14。通過(guò)超濾將培養(yǎng)基濃縮約10倍，然后上樣到ADl-C-affigel柱上。用PBS洗滌柱子到基線，用0.1M甘氨酸(pH2.5)洗脫出C-DDDl-Fab-hMN-14。對(duì)洗出液進(jìn)行SE-HPLC分析顯示，保留時(shí)間為8.7mm的單個(gè)蛋白質(zhì)峰與107kDa蛋白質(zhì)一致。經(jīng)還原型SDS-PAGE也證實(shí)了其純度，表明在分子大小上僅有兩個(gè)條帶預(yù)期代表C-DDDl-Fab-hMN-14的兩種多肽組分。經(jīng)如上所述的一步ADl-C親和色i普，總共從1.2升滾瓶培養(yǎng)物中純化出10mgN-DDDl-hMN-14。對(duì)洗出液進(jìn)行SE-HPLC分析顯示，保留時(shí)間為8.77mm的單個(gè)蛋白質(zhì)峰類(lèi)似于C-DDD1-Fab-hMN-14,與107kDa蛋白質(zhì)一致。還原型SDS-PAGE顯示僅兩個(gè)條帶代表N-DDDl-Fab-hMN-14的多肽組成。通過(guò)SE-HPLC分析，測(cè)定樣品中C-DDDl-Fab-hMN-14的結(jié)合活性，其中將試驗(yàn)品與不同數(shù)量的WI2混合。將WI2Fab與C-DDDl-Fab-hMN-14按照O.":l的摩爾比混合，制備樣品，顯示3個(gè)峰，代表未結(jié)合C-DDDl-Fab-hMN14(8.71min)、與一個(gè)WI2Fab結(jié)合的C-DDDl-Fab-hMN-14(7.95min)和與兩個(gè)WI2Fab結(jié)合的C-DDDl-Fab-hMN14(7.37min)。當(dāng)分析含有WI2Fab和C-DDDl-Fab-hMN-14的摩爾比為4的樣品時(shí)，僅見(jiàn)一個(gè)峰(7.36分鐘)。這些結(jié)果證明hMN14-Fab-DDDl是二聚體，具有兩個(gè)活性結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)該實(shí)驗(yàn)用N-DDDl-Fab-hMN-14重復(fù)時(shí)，得到非常類(lèi)似的結(jié)果。竟?fàn)幮訣LISA證明C-DDDl-Fab-hMN-14和N-DDDl-Fab-hMN-14與CEA結(jié)合的親合力類(lèi)似于hMN-14IgG,顯著大于單價(jià)hMN-14Fab。ELISA板用含有CEA表位(A3B3)的融合蛋白包被，h.MN-14對(duì)該表位具有特異性。實(shí)施例5.a2b復(fù)合物的形成對(duì)含有等摩爾量的C-DDDl-Fab-hMN-14(作為a。和h679-Fab-ADl(作為b)的混合物進(jìn)行SE-HPLC分析，首次提供了a2b復(fù)合物形成的證據(jù)。當(dāng)分析這種樣品時(shí)，可見(jiàn)單個(gè)峰(保留時(shí)間8.40分鐘)，這與新蛋白的形成是一致的，大于單獨(dú)的h679-Fab-ADl(9.55mm)或C-DDDl-Fab-hMN-14(8.73min)。當(dāng)h顧-14F(ab')2與h679-Fab-AD1或C-DDDl-Fab-hMN-14與679-Fab-NEM混合時(shí)，沒(méi)有觀察到高磁場(chǎng)位移(upfieldshift),證明相互作用是通過(guò)DDD1和AD1結(jié)構(gòu)域特異性介導(dǎo)的。用h679-Fab-ADl和N-DDDl-Fab-hMN-14得到非常類(lèi)似的結(jié)果。BIAcore用于進(jìn)一步證明和表征DDl與AD1融合蛋白間特異性相互作用。該實(shí)驗(yàn)進(jìn)行如下首先讓h679-Fab-ADl或679-Fab-NEM與高密度的偶聯(lián)HSG的(IMP239)傳感器芯片表面結(jié)合，然后再注射C-DDDl-Fab-hMN-14或hMN-14F(ab')2。不出所料，僅h679-Fab-ADl和C-DDDl-Fab-hMN-14的組合，在響應(yīng)單元中產(chǎn)生進(jìn)一步增加(當(dāng)注射后者時(shí))。用N-DDDl-Fab-hMN-14和h679-Fab-AD1得到類(lèi)似結(jié)果。進(jìn)行平衡SE-HPLC實(shí)驗(yàn)，確定相應(yīng)融合蛋白中存在的AD1與DDD1間特異性相互作用的結(jié)合親和性。h679-Fab-ADl與C-DDDl-Fab-hMN-14、N-DDDl-hMN-14和重組人RIIot市售樣品結(jié)合的解離常數(shù)(Kd)分別為15nM、8nM和30nM。其它相關(guān)方法實(shí)施例6.Di-AD1的產(chǎn)生在本實(shí)施例中，經(jīng)合成制備具有如下所示氨基酸序列的小多肽(AD1-C)。艦2-K0IEYLAK0IVDNAI00AKGC-C00HfSE0IDNO:29)在AD1-C中,AD1氨基酸序列(加下劃線部分)鄰接N-端賴(lài)氨酸殘基和羧基端KGC三肽。為了增加溶解度而引入兩個(gè)賴(lài)氨酸(K)殘基，為了增加柔性而將甘氨酸(G)殘基插入在C端半胱氨酸之前。用DMSO處理后，AD1-C氧化成為二聚體，稱(chēng)為Di-AD1，用RP-HPLC純化。Di-AD1的示意結(jié)構(gòu)如下所示(=表示二硫橋)NH2-KOIEYLAKOIVDNAIOOAKGOCGKAOOIANDVIOKALYEIOK-Nm(S￡QIDNO:21)Di-AD1或AD1-C中存在大量官能團(tuán)，可用于進(jìn)一步修飾。例如，Di-AD1和AD1-C分別含有8個(gè)和4個(gè)伯氨基，可用于偶聯(lián)藥物、毒素、蛋白質(zhì)或其它效應(yīng)物。此外，Di-AD1和AD卜C分別具有2個(gè)和1個(gè)酪氨酸殘基，可用于放射性碘化。最終，AD1-C含有游離半胱氨酸殘基，也可用于偶聯(lián)效應(yīng)物或形成含有效應(yīng)物的Di-AD1類(lèi)似物。實(shí)施例7.新的預(yù)靶向方法本發(fā)明的方法適用于新的預(yù)靶向方法。以下提供了預(yù)耙向系統(tǒng)的實(shí)例，它們采用親和力增強(qiáng)系統(tǒng)(LeDo畫(huà)l等，JNuclMed(1989),30:1358-66)而無(wú)須半抗原結(jié)合抗體。C-DDD1-Fab-hMN-14或N-Fab-DDD2-hMN-14的二聚體(按照實(shí)施例4而制備)可用于預(yù)靶向腫瘤。先將107kDa蛋白經(jīng)靜脈內(nèi)給予患者，讓其與腫瘤上的CEA結(jié)合，同時(shí)從血和正常組織中清除掉。稍后，經(jīng)靜脈內(nèi)給予二價(jià)肽，例如攜帶治療用放射性同位素(例如9°Y)或診斷用放射性同位素(例如"'In)的Di-AD1的DOTA綴合物。小肽(~5000Da)，在從血和正常組織中快速清除的同時(shí)，定位在腫瘤上，因?yàn)樗蓄A(yù)期與C-DDD1-Fab-hMN-14特異性相互作用的兩個(gè)AD序列，所述C-DDD1-Fab-hMN-14已由肺瘤保留。經(jīng)SE-HPLC證明C-DDD1-Fab-hMN-14與Di-AD1在體外交聯(lián)。當(dāng)C-DDD1-Fab-hMN-14與Di-AD1混合時(shí)，蛋白質(zhì)峰從8.67min變?yōu)?.95min，表明形成了交聯(lián)結(jié)構(gòu)。當(dāng)hMN-14F(ab')2與Di-AD1混合時(shí)則沒(méi)有這樣的變化，證明交聯(lián)是由DDD1與AD1間的相互作用所介導(dǎo)。為了證實(shí)峰的改變事實(shí)上是因?yàn)镃-DDD1-Fab-hMN-14的特異性交聯(lián)，用DTT還原復(fù)合物以切割Di-AD1的二硫鍵，導(dǎo)致峰又變回8.67min。實(shí)施例8.DDD或AD融合蛋白的親和純化通過(guò)產(chǎn)生DDD或AD蛋白，可開(kāi)發(fā)通用親和純化系統(tǒng)，其具有更低親和力?？?。與RIIa相比，由RIa二聚體形成的DDD與AKAP-IS(AD1)的親和力要低500倍(225nM)。因此，可以產(chǎn)生由前44個(gè)氨基酸殘基形成的RIa二聚體，并與樹(shù)脂偶聯(lián)以制備具有吸引力的親和基質(zhì)，用于任何含有AD1的融合蛋白的純化。自然界存在許多更低親和力(O.lpM)AKAP錨定結(jié)構(gòu)域。必要時(shí)，可引入高度可預(yù)測(cè)的氨基酸取代，進(jìn)一步降低結(jié)合親和性?？梢酝ㄟ^(guò)合成或生物學(xué)方法產(chǎn)生低親和力AD,并與樹(shù)脂偶聯(lián)，用于任何DDD1融合蛋白的親和純化。制備穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)的相關(guān)方法實(shí)施例9.產(chǎn)生由三個(gè)Fab片段組成的二硫化物穩(wěn)定化結(jié)構(gòu)的載體N畫(huà)DDD2國(guó)Fd畫(huà)hMN-14畫(huà)pdHL2N-DDD2-hMN-14-pdHL2是一種產(chǎn)生N-DDD2-Fab-hMN-14的表達(dá)載體，具有DDD2的二聚化和停靠結(jié)構(gòu)域序列，其中DDD2附加在Fd的氨基端(圖4A)。DDD2通過(guò)15個(gè)氨基酸殘基Gly/Ser肽接頭與VH區(qū)偶聯(lián)。DDD2在二聚化和?？啃蛄兄熬哂幸粋€(gè)半胱氨酸殘基，這與DDD1相同。所分泌的融合蛋白由兩個(gè)相同拷貝的hMN-14Fab通過(guò)DDD2結(jié)構(gòu)域的非共價(jià)相互作用連接在一起(圖4B)。如下所述對(duì)表達(dá)載體進(jìn)行改造。合成制備兩個(gè)重疊互補(bǔ)寡核苷酸(DDD2上鏈(DDD2T叩)和DDD2下《il(DDD2Bottom)),其包含DDD2的殘基1-13。將寡核苷酸退火，用T4多核苷酸激酶(PNK)磷酸化，導(dǎo)致在5'和3'端產(chǎn)生突出端(overhang)，這適于分別用限制性?xún)?nèi)切核酸酶Ncol和Pstl進(jìn)行DNA消化后的連接。DDD2上鏈5'CATGTGCGGCCACATCCAGATCCCGCCGGGGCTCACGGAGCTGCTGCA-3'(SEQIDNO:22)DDD2下鏈5，GCAGCTCCGTGAGCCCCGGCGGGATCTGGATGTGGCCGCA-3'(SEC)IDNO:23)將雙鏈體DNA與載體片段DDDl-hMN14Fd-SV3連接起來(lái)(后者是用Ncol和Pstl消化而制備的)，產(chǎn)生中間構(gòu)建體DDD2-hMN14Fd-SV3。用Xhol和Eagl限制性?xún)?nèi)切核酸酶，從中間構(gòu)建體上切下含有DDD2-hMN14Fd編碼序列的1.28kb插入片段，與用相同的酶消化而制備的hMN14-pdHL2載體DNA連接在一起。最終的表達(dá)載體是N-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2(圖5)。C畫(huà)DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2是一種產(chǎn)生C-DDD2-Fab-hMN-14的表達(dá)載體，具有DDD2的二聚化和?？拷Y(jié)構(gòu)域序列，其中DDD2通過(guò)14個(gè)氨基酸殘基Gly/Ser肽接頭附加在Fd的羧基端(圖6A)。所分泌的融合蛋白由兩個(gè)相同拷貝的hMN-14Fab通過(guò)DDD2結(jié)構(gòu)域的非共價(jià)相互作用連接在一起(圖6B)。如下所述對(duì)表達(dá)載體進(jìn)行改造。合成制備兩個(gè)重疊互補(bǔ)殘基1-13。將寡核苷酸退火，用T4PNK磷酸化，導(dǎo)致在5'和3'端產(chǎn)生突出端，這適于分別用限制性?xún)?nèi)切核酸酶BamHI和Pstl進(jìn)行DNA消化后的連接。G4S-DDD2上鏈GGGCTCACGGAGCTGCTGCA-3'(SEQIDNO:24)G4S陽(yáng)DDD2下鏈CCGCCACCTCCG-3，(SEQIDNO:25)將雙鏈體DNA與穿梭載體CHl-DDDl-pGemT連接起來(lái)(后者是用BamHI和Pstl消化而制備的)，產(chǎn)生穿梭載體CH1-DDD2-pGemT。用SacII和Eagl從CHl-DDD2-pGemT上切下507bp片段，與用SacII和Eagl消化而制備的IgG表達(dá)載體hMN14(I)-pdHL2連接在一起。最終的表達(dá)構(gòu)建體是C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2(圖7)。h679國(guó)Fd-AD2-pdHL2設(shè)計(jì)了h679-Fab-AD2作為B與N-DDD2-Fab-hMN-14或C畫(huà)DDD2-Fab-hMN-14配對(duì)。h679-Fd-AD2-pdHL2是一種產(chǎn)生h679-Fab-AD2的表達(dá)載體，具有AD2錨定結(jié)構(gòu)域序列，其中AD2通過(guò)14個(gè)氨基酸殘基Gly/Ser肽接頭附加在CH1區(qū)的羧基端(圖8)。AD2具有兩個(gè)半胱氨酸殘基，其中一個(gè)在AD1錨定結(jié)構(gòu)域序列之前，而另一個(gè)在AD1錨定結(jié)構(gòu)域序列之后。如下所述對(duì)表達(dá)載體進(jìn)行改造。合成制備兩個(gè)重疊互補(bǔ)寡核苷酸(AD2上鏈和AD2下鏈)，其包含AD2的編碼序列和部分接頭序列。將寡核苷酸退火，用T4PNK磷酸化，導(dǎo)致在5'和3'端產(chǎn)生突出端，這適于分別用限制性?xún)?nèi)切核酸酶BamHI和Spel進(jìn)行DNA消化后的連接。AD2上鏈5'GATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGATGTGGCCAGATCGAGTACCTGGCCAAGCAGATCGTGGACAACGCCATCCAGCAGGCCGGCTGCTGAA-3'(SEQIDNO:26)AD2下鏈CGATCTGGCCACATCCGCCAGACCCGCCACCTCCG-3，(SEQIDNO:27)將雙鏈體DNA與穿梭載體CHl-ADl-pGemT連接起來(lái)(后者是用BamHI和Spel消化而制備的)，產(chǎn)生穿梭載體CHI-AD2-pGemT。用SacII和Eagl從穿梭質(zhì)粒上切下含有CH1和AD2編碼序列的429堿基對(duì)片段，與用相同酶消化而制備的h679-pdHL2載體連接在一起。最終的表達(dá)載體是h679-Fd-AD2-pdHL2(圖9)。實(shí)施例10.h679-Fab-AD2的產(chǎn)生通過(guò)電穿孔，將h679-Fd-AD2-pdHL2載體轉(zhuǎn)染到Sp/EEE骨髓瘤細(xì)胞中。該雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體指導(dǎo)h679K輕鏈和h679Fd-AD2的合成和分泌，兩者結(jié)合形成h679-Fab-AD2。在AD兩端的半胱氨酸殘基提供兩個(gè)潛在的反應(yīng)性巰基。電穿孔后，將細(xì)胞接種在96孔組織培養(yǎng)板上，用0.05pM甲氨蝶呤(MTX)選擇轉(zhuǎn)染子克隆。通過(guò)ELISA，使用包被BSA-IMP-260(HSG)綴合物的微量滴定板，篩選克隆的蛋白質(zhì)表達(dá)，并用山羊抗人Fab-HRP進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)測(cè)定注射稀釋培養(yǎng)基樣品所得的起始斜率，將用HSG(IMP-239)傳感器芯片的BIAcore分析用于測(cè)定生產(chǎn)率。最高產(chǎn)量的克隆的起始生產(chǎn)率約50mg/L。經(jīng)一步IMP-291親和色譜，總共從2.9升滾瓶培養(yǎng)物中純化出160mgh679-Fab-AD2。通過(guò)超濾將培養(yǎng)基濃縮約10倍，然后上樣到IMP-29卜affigel柱上。用PBS洗滌柱子到基線，用1M咪唑、1mMEDTA、0.1MNaAc(pH4.5)洗脫出h679-AD2。SE-HPLC分析顯示，保留時(shí)間約為10min的單尖峰與50kDa蛋白質(zhì)一致(圖10)。當(dāng)該物質(zhì)與hMN14-Fab-DDDl混合時(shí)，僅I/3具有反應(yīng)性，因?yàn)樵赟E-HPLC圖譜上明顯可見(jiàn)由二元復(fù)合物產(chǎn)生的一個(gè)新峰。然而，用TCEP還原h(huán)679-Fab-AD2，可得到100%活性。這表明(l)AD2的兩個(gè)半胱氨酸殘基間可形成分子內(nèi)二硫鍵(圖IIA)，阻止了與DDD的結(jié)合但也保護(hù)了巰基不與其他物質(zhì)反應(yīng)；和(2)還原反應(yīng)可打斷該分子內(nèi)二硫橋，產(chǎn)生帶有兩個(gè)游離巰基的DDD-反應(yīng)性錨定結(jié)構(gòu)域(圖IIB)。通過(guò)電穿孔，將N-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2載體轉(zhuǎn)染到Sp/EEE骨髓瘤細(xì)胞中。該雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體指導(dǎo)hMN-14K輕鏈和N-DDD2-hMN-14Fd的合成和分泌，二者結(jié)合形成N-DDD2-hMN14Fab。通過(guò)DDD2可以預(yù)期經(jīng)二聚化形成八2結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生由每個(gè)DDD2中的半胱氨酸殘基提供的兩個(gè)潛在的反應(yīng)性巰基。電穿孔后，將細(xì)胞接種到96孔組織培養(yǎng)板中，用0.05nM曱氨蝶呤(MTX)篩選轉(zhuǎn)染子克隆。通過(guò)ELISA,使用包被WI2(hMN-14抗Id)的微量滴定板，篩選克隆的蛋白質(zhì)表達(dá)，并用山羊抗人Fab-HRP進(jìn)行檢測(cè)。最高產(chǎn)量的克隆的起始生產(chǎn)率約10mg/L。通過(guò)蛋白L親和色譜，總共從1.8升滾瓶培養(yǎng)物中純化出16mgN-DDD2-hMN-14。通過(guò)超濾將培養(yǎng)基濃縮約10倍，然后上樣到蛋白L親和色i普柱上。用PBS洗滌柱子到基線，用1mMEDTA、0.1MNaAc(pH2.5)洗脫出N-DDD2-hMN14,然后立即用Tris-HCl中和。SE-HPLC分析顯示4個(gè)蛋白質(zhì)峰(圖12),其中2個(gè)隨后被鑒定為N-DDD2-Fab-hMN-14的34形式(7.9min)和32形式(8.8mm),另兩個(gè)分別是K鏈的二聚體和單體。該混合物顯示出對(duì)h679-Fab-ADl幾乎沒(méi)有結(jié)合活性，除非加入巰基還原劑(例如TCEP)，將大部分的34形式轉(zhuǎn)變?yōu)?2形式(圖13)。這些數(shù)據(jù)表明(l)通過(guò)DDD2中存在的半胱氨酸連接兩個(gè)a2結(jié)構(gòu)而形成a4，從而阻止與AD的締合但也保護(hù)了巰基不與其它物質(zhì)反應(yīng)(圖14A);和(2)還原反應(yīng)可打斷該分子內(nèi)二硫橋，產(chǎn)生帶有兩個(gè)游離巰基的AD-反應(yīng)性DDD二聚體的32結(jié)構(gòu)(圖14B)。注意這一副產(chǎn)物(a,)由四個(gè)活性Fab亞基組成。即使在高TCEP濃度和長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間時(shí)，約15%的總N-DDD2-Fab-hMN-14仍在還原后保持八4形式(圖13)。這表明，除了二碌u橋外，還有其它才幾制例如結(jié)構(gòu)域交換(domainsw叩ping)也可導(dǎo)致34形式的形成。實(shí)施例12.C-DDD2-Fab-hMN-14的制備通過(guò)電穿孔，將C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2載體轉(zhuǎn)染到Sp/EEE骨髓瘤細(xì)胞中。該雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體指導(dǎo)hMN-14K輕鏈和C-DDD2-Fd-hMN-14的合成和分泌，二者結(jié)合形成C-DDD2-Fab-hMN14。象N-DDD2-Fab-hMN-14—樣，通過(guò)DDD2可以預(yù)期經(jīng)二聚化形成32結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生由每個(gè)DDD2中的半胱氨酸殘基提供的兩個(gè)潛在的反應(yīng)性巰基。電穿孔后，將細(xì)胞接種到96孔組織培養(yǎng)板中，用0.05曱氨蝶呤(MTX)篩選轉(zhuǎn)染子克隆。通過(guò)ELISA，使用包被WI2(固N(yùn)-14抗Id)的微量滴定板，篩選克隆的蛋白質(zhì)表達(dá)，并用山羊抗人Fab-HRP進(jìn)行檢測(cè)。最高產(chǎn)量的克隆的起始生產(chǎn)率約為100mg/L,這比N-DDD2-Fab-hMN-14高出10倍。按照實(shí)施例3所述，通過(guò)蛋白L親和色語(yǔ)，總共從1.8升滾瓶培養(yǎng)物中純化出200mgC-DDD2-hMN-14。蛋白L-純化的C-DDD2-Fab-hMN-14的SE-HPLC分布圖(圖15)類(lèi)似于N-DDD2-Fab-hMN-14。4個(gè)蛋白質(zhì)峰中有兩個(gè)經(jīng)鑒定為C-DDD2-Fab-hMN-14的a4形式(8.40min)和32形式(9.26min),另兩個(gè)分別是K鏈的二聚體和單體。該混合物顯示出對(duì)h679-ADl幾乎沒(méi)有結(jié)合活性，除非加入巰基還原劑(例如TCEP),將大部分的34形式轉(zhuǎn)變?yōu)?2形式(圖16)，然后緊密結(jié)合h679-ADl。這些數(shù)據(jù)表明，C-DDD2-Fab-hMN-14是N-DDD2-hMN-14的功能性等同物。實(shí)施例13.TF1的產(chǎn)生設(shè)計(jì)了h679-Fab-AD2作為B組分與a2組分例如N-DDD2-hMN-Fab-14或C-DDD2-hMN-14配對(duì)，它們一旦結(jié)合將易締合在一起形成a2b結(jié)構(gòu)(圖17A),其還可經(jīng)誘導(dǎo)而通過(guò)二硫鍵共價(jià)結(jié)合(圖17B)。因?yàn)镹-DDD2-和AD2-構(gòu)建體的表征證明，各自的還原作用是達(dá)到完全DDD/AD相互作用所需要的，所以過(guò)程還包括還原步驟。首先，用固定化TCEP作為還原劑，以節(jié)省除去還原劑所需要的時(shí)間。在室溫下還原小時(shí)后，離心除去TCEP-瓊脂糖，將DMSO加入到反應(yīng)液中，終濃度達(dá)10%。BIAcore分析證明是共價(jià)連接a2b復(fù)合物(下文稱(chēng)為T(mén)F1)存在的第一個(gè)證據(jù)。在小規(guī)模反應(yīng)中使用固定化TCEP確定了可行性之后，如下所述對(duì)TF1進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。首先按照大致的化學(xué)計(jì)量濃度將N-DDD2-Fab-hMN-14(蛋白L-純化的)與h679-Fab-AD2(IMP-291-純化的)在含lmMEDTA的PBS(pH7.4)中混合。加入TCEP之前，SE-HPLC未顯示出321)形成的任何證據(jù)(圖18A)。而是具有代表34(7.97mm;200kDa)、a2(8.91mm;100kDa)和b(10.01min;50kDa)的峰。加入5mMTCEP快速導(dǎo)致a2b復(fù)合物的形成，與150kDa蛋白一致的、在8.43mm的新峰證明了這一點(diǎn)(圖18B)。該實(shí)驗(yàn)中顯然有過(guò)量的B，因?yàn)閔679-Fab-AD2(9.72min)所產(chǎn)生的峰仍是明顯的，但是對(duì)于32或a4則未見(jiàn)明顯的峰。還原反應(yīng)1小時(shí)后，針對(duì)幾次更換的PBS進(jìn)行透析過(guò)夜，除去TCEP。所得溶液加入10%DMSO并在室溫下保存過(guò)夜。當(dāng)用SE-HPLC分析時(shí)(圖18C),代表321)的峰明顯變尖，保留時(shí)間稍微降低了0.1min,變?yōu)?.31mm(圖18C)，根據(jù)我們先前的發(fā)現(xiàn)，這表示結(jié)合親和性提高了。該復(fù)合物通過(guò)IMP-291親和色i普進(jìn)一步純化以除去K鏈雜質(zhì)。不出所料，過(guò)量h679-AD2—起被純化出來(lái)，然后用制備型SE-HPLC除去(圖18D)。圖19清楚地證明TF1是高度穩(wěn)定的復(fù)合物。當(dāng)測(cè)定TF1與HSG(IMP-239)傳感器芯片結(jié)合時(shí)，在樣品注射結(jié)束之后所觀察的響應(yīng)未見(jiàn)明顯降低，相比之下，當(dāng)在類(lèi)似條件下測(cè)定含有等摩爾混合物的C-DDDl-Fab-hMN-14和h679-Fab-ADl的溶液時(shí)，在樣品注射期間和剛注射完后，所觀察到的響應(yīng)單元的增加伴隨著可檢測(cè)的下降，表明開(kāi)始形成的a2b結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。此外，盡管隨后注射WI2，在針對(duì)TF1的響應(yīng)單元中引起大幅度的增力口，但是對(duì)于C-DDD1/AD1混合物來(lái)說(shuō)沒(méi)有明顯增加。因WI2與固定在傳感器芯片上的TF1結(jié)合而導(dǎo)致的響應(yīng)單元的額外增加，對(duì)應(yīng)于兩個(gè)完整的功能性結(jié)合位點(diǎn)，其各自是由N-DDD2-Fab-hMN-14的一個(gè)亞基引起的。TF1與WI2的兩個(gè)Fab片段的結(jié)合能力證實(shí)了這一點(diǎn)，如圖20所示。在含有M79-AD2和N-DDDl-hMN14的混合物被還原和氧化成為T(mén)F1后，當(dāng)用BIAcore分析時(shí)，WI2幾乎沒(méi)有額外結(jié)合(圖21),表明二硫鍵穩(wěn)定的a2b復(fù)合物(例如TF1)僅通過(guò)DDD2與AD2的相互作用而形成。對(duì)該過(guò)程進(jìn)行了兩個(gè)改進(jìn)，以減少過(guò)程的時(shí)間和效率。首先，用34/32結(jié)構(gòu)混合物中存在的稍微過(guò)量摩爾數(shù)的N-DDD2-Fab-hMN-14與h679-Fab-AD2反應(yīng)，使得沒(méi)有游離的h679-Fab-AD2存在，而未束縛在h679-Fab-AD2的任何34/32結(jié)構(gòu)以及輕鏈，都用IMP-291親和色i普除去。第二，疏水作用色諳(HIC)代替透析或滲濾，在還原反應(yīng)后用于除去TCEP,這不僅縮短過(guò)程時(shí)間，而且增加了潛在病毒的去除步驟。N-DDD2-Fab-hMN-14與679-Fab-AD2混合，用5mMTCEP在室溫下還原1小時(shí)。溶液加入0.75M^L酸銨，然后上樣到丁基FFHIC柱上。用含0.75M硫酸銨、5mMEDTA的PBS洗柱，以除去TCEP。用PBS從HIC柱上洗脫還原蛋白，加入10%DMSO。在室溫下孵育過(guò)夜后，用IMP-291親和色譜分離出高度純化的TF1(圖22)。無(wú)需額外的純化步驟，例如凝膠過(guò)濾。實(shí)施例14.TF2的產(chǎn)生如下所述，經(jīng)中試生產(chǎn)一批TF2，收率〉90%。將蛋白L-純化的C-DDD2-Fab-hMN-14(200mg)與h679-Fab-AD2(60mg)按照1.4:1的摩爾比混合?？偟鞍诐舛葹?.5mg/ml含有1mMEDTA的PBS。后續(xù)步驟包括TCEP還原、HIC色譜、DMSO氧化和IMP-291親和色譜，都與TF1所述相同。加入TCEP之前，SE-HPLC未顯示出a2b形成的任何證據(jù)(圖24A)。而是具有代表a4(8.40min;215kDa)、a2(9.32min;107kDa)和b(10.33min;50kDa)的峰。加入5mMTCEP快速導(dǎo)致a2b復(fù)合物的形成，正如在8.77min的新峰所證明的那樣(圖24B)，該峰與二元結(jié)構(gòu)所預(yù)期的l57kDa蛋白是一致的。圖25A中的圖"i普顯示從HIC和DMSO處理洗脫后收集的流分量。用IMP-291親和色譜將TF2純化至幾乎均一(圖25C)。對(duì)IMP-291未結(jié)合流分進(jìn)行的SE-HPLC分析證明從產(chǎn)物中除去了a4、a2和游離K鏈(圖25B)。非還原型SDS-PAGE分析證明，大多數(shù)TF2以大的共價(jià)結(jié)構(gòu)形式存在，相對(duì)遷移率類(lèi)似于IgG(圖26A)。額外的條帶表明，在實(shí)驗(yàn)條件下，二硫鍵形成不完全。還原型SDS-PAGE顯示，在非還原型凝膠中明顯的任何額外條帶都與產(chǎn)物相關(guān)(圖26B),因?yàn)閮H一個(gè)代表TF2的組成性多肽的條帶是明顯的。然而，4個(gè)多肽中每一個(gè)的相對(duì)遷移率都非常接近，以致于無(wú)法分辨。MALDI-TOF質(zhì)譜(圖27)揭示了156,434Da的單峰，是在TF2的計(jì)算分子量(157,319Da)的99.5%之內(nèi)。按照TF1所述的BIACORE測(cè)定TF2的功能，結(jié)果見(jiàn)圖28。將TF2、C-DDD-hMN-14+h679-ADl(用作非共價(jià)321)復(fù)合物的對(duì)照樣品)或C-DDD2-hMN-14+h679-AD2(用作非還原32和b組分的對(duì)照樣品)稀釋至1)Lig/ml(總蛋白)并通過(guò)固定了HSG的傳感器芯片。對(duì)TF2的響應(yīng)是兩個(gè)對(duì)照樣品反應(yīng)的約2倍，表明對(duì)照樣品中僅有h679-Fab-AD組分與傳感器芯片結(jié)合并保留在其上。隨后注射WI2IgG,證明僅有TF2具有能與h679-Fab-AD緊密結(jié)合的DDD-Fab-hMN-14組分，正如額外的信號(hào)響應(yīng)所示。因WI2與固定在傳感器芯片上的TF2結(jié)合而導(dǎo)致的響應(yīng)單元的額外增加，也對(duì)應(yīng)于兩個(gè)完整的功能性結(jié)合位點(diǎn)，每個(gè)都是由C-DDD2-Fab-hMN-14的一個(gè)亞基引起的。TF2與WI2的兩個(gè)Fab片段的結(jié)合能力證實(shí)了這一點(diǎn)，如圖29所示。通過(guò)竟?fàn)幮訣L1SA測(cè)定TF2的相對(duì)CEA-結(jié)合親合力(圖30)。用含有CEA的A3B3結(jié)構(gòu)域的融合蛋白包被各板(0.5嗎/孔)，所述蛋白被hMN-14識(shí)別。連續(xù)稀釋TF1、TF2和hMN-14IgG,—式四份，在含有綴合HRP的hMN-14IgG(1nM)的孔中孵育。數(shù)據(jù)顯示TF2結(jié)合CEA的親合力與IgG相比至少相等，比TF1強(qiáng)2倍。這毫不奇怪，因?yàn)橄惹霸陬?lèi)似測(cè)定中，與hMN-14IgG相比，發(fā)現(xiàn)C-DDDl-Fab-hMN-14具有更強(qiáng)的CEA-結(jié)合親合力，這反過(guò)來(lái)比N-DDDl-Fab-hMN-14結(jié)合得更緊密。C-DDD-Fab-hMN-14比親本IgG親合力明顯增加的一個(gè)可能的解釋就是前者中的Gly/Ser接頭提供了比IgG更柔性的分子。盡管N-DDD變異體也具有柔性肽接頭，但CEA結(jié)合位點(diǎn)的位置彼此接近并鄰近DDD二聚體，導(dǎo)致親合力下降。將TF1和TF2設(shè)計(jì)成可用于體內(nèi)的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)，其中在血液和組織中會(huì)發(fā)生大量稀釋。用BIACORE評(píng)價(jià)人血清中TF2的穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)圖31。將TF2用新鮮人血清(是從4個(gè)供體合并而獲得的)稀釋至O.lmg/ml并在5%C02、37。C孵育數(shù)天。每天取樣按1:25進(jìn)行稀釋?zhuān)ㄟ^(guò)BIACORE進(jìn)行分析，使用IMP-239HSG傳感器芯片。注射W12IgG,用于定量測(cè)定完整而完全活性的TF2量。將血清樣品與從貯液直接稀釋的對(duì)照樣品進(jìn)行比較。TF2在血清中是高度穩(wěn)定的，7天后仍保持98%的雙特異性結(jié)合活性。TF1在人或小鼠血清中也得到類(lèi)似結(jié)果。實(shí)施例16.TF2在荷瘤小鼠體內(nèi)的生物分布在攜帶皮下(s.c.)人結(jié)腸直腸腺癌異種移植物(LS174T)的雌性無(wú)胸腺棵鼠中，對(duì)TF2進(jìn)行生物分布研究。在組織培養(yǎng)物中擴(kuò)增細(xì)胞，直到細(xì)胞生長(zhǎng)到足以皮下(s.c.)注射50只小鼠，1x107細(xì)胞/小鼠。一周后測(cè)量腫瘤，將小鼠分為每時(shí)間點(diǎn)5只小鼠一組。該研究開(kāi)始時(shí)，平均腫瘤大小為0.141±0.044cm^給所有小鼠都注射40嗎125I-TF2(250pmol,2pCi)。然后，在注射后0.5、2、4、16、24、48和72小時(shí)處死小鼠并進(jìn)行尸檢。該研究總共使用35只小鼠。取出胂瘤以及不同組織并放在Y-計(jì)數(shù)器中，以測(cè)定組織中各時(shí)間點(diǎn)的％注射劑量/克CK)ID/g)。125I-TF2的放射性碘化產(chǎn)生2.7%未結(jié)合同位素，比活1.48mCi/mg。然后將標(biāo)記樣品單獨(dú)進(jìn)行SE-HPLC，以及在與20倍摩爾數(shù)過(guò)量的CEA混合后再進(jìn)行SE-HPLC。約83%TF2在保留時(shí)間為10.1分鐘時(shí)洗脫下來(lái)。在標(biāo)記TF2中有9%聚集物(11丁=9.03min)和8%低分子量物(RT44.37mm)。當(dāng)與CEA混合時(shí)，95%的標(biāo)記TF2變成高分子量物質(zhì)(11丁=7.25min)。這些結(jié)果表明，標(biāo)記制劑對(duì)于給予荷瘤小鼠來(lái)說(shuō)是可接受的。表1列出腫瘤和不同組織中的。/。ID/g計(jì)算值。腫瘤峰攝取發(fā)生在注射后4h(10.3±2.1%ID/g)。在注射后16-24小時(shí)間，腫瘤中的TF2含量沒(méi)有明顯不同(5.3士l.lo/oID/g和5.37±0.7%ID/g),表明在這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間可按血中的數(shù)值給予肽，而不影響腫瘤靶向。TF2從正常組織中的攝取和清除非常類(lèi)似于先前對(duì)TF1進(jìn)行的觀察。TF1和TF2看來(lái)都證實(shí)通過(guò)RES系統(tǒng)(脾和肝)清除。也評(píng)價(jià)了TF2在荷瘤小鼠中的血PK,發(fā)現(xiàn)它們表現(xiàn)出乂又一目;青除。用WmNonlinNonlinearEstimationProgram(v.4.1)t是供的二室分析，對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，所測(cè)參數(shù)見(jiàn)表2。實(shí)施例17.在荷瘤小鼠中用TF2進(jìn)行預(yù)靶向在攜帶皮下(s.c.)人結(jié)腸直腸腺癌異種移植物(LS174T)的雌性無(wú)胸腺棵鼠中，用TF2進(jìn)行預(yù)靶向研究。在組織培養(yǎng)物中擴(kuò)增細(xì)胞，直到細(xì)胞生長(zhǎng)到足以皮下(s.c.)注射55只小鼠，1x107細(xì)胞/小鼠。一周后測(cè)量腫瘤，將小鼠分為每時(shí)間點(diǎn)5只小鼠一組。該研究開(kāi)始時(shí)，平均腫瘤大小為0.105±0.068cm3。給20只小鼠注射80jig125I-TF2(500pmol,2|iCi)，然后在16小時(shí)后給予99mTc-IMP-245(40pCi、92ng、50pmol)。在注射肽后0.5、1、4和24小時(shí)處死小鼠并進(jìn)4亍尸才企。另外，24小時(shí)時(shí)間點(diǎn)組的3只小鼠在注射后1、4和24小時(shí)用y-照相機(jī)照相。作為對(duì)照，3只額外小鼠僅接受99mTc-IMP-245(無(wú)預(yù)輩巴向)并在注射后1、4和24小時(shí)照相，照相后24小時(shí)再進(jìn)行尸檢。取出胂瘤以及不同組織并放在Y-計(jì)數(shù)器中，以測(cè)定組織中各時(shí)間點(diǎn)的Q/。ID/g。測(cè)定125I-TF2和用125I-TF2預(yù)耙向的99mTc-IMP-245的%ID/g值，分別概述于表3和4。在注射肽后前4小時(shí)(或給予TF2后20h)，TF2水平保持相對(duì)不變，范圍為6.7±1.6%ID/g(在注射肽后0.5h,即給予TF2后16.5h)至6.5±1.5%ID/g(在4h時(shí)間點(diǎn)，即給予TF2后20h)。在注射肽后0.5、1、4和24小時(shí)，用TF2預(yù)靶向的IMP誦245的肺瘤攝取值(o/oID/g)為22±3%、30±14%、25±4%和16±3%。對(duì)于正常組織來(lái)說(shuō)，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，在用TF2預(yù)輩巴向的小鼠中，肝、肺和血液中肽含量明顯低于用迄今為止開(kāi)發(fā)的其它預(yù)靶向劑所得到的結(jié)果(Rossi等，ClinCancerRes.2005;ll(增刊19):7122s-7129s)。這些數(shù)據(jù)表明TF2通過(guò)正常器官有效清除，未留下與隨后給予的肽結(jié)合的任何殘余片段。高的胂瘤攝取以及在正常組織的低水平，導(dǎo)致良好的胂瘤:非胂瘤(T/NT)比率(表5),因而確認(rèn)TF2是合適的預(yù)靶向劑，用于將基于di-HSG的效應(yīng)物定位到產(chǎn)生CEA的腫瘤上。實(shí)施例18.用谷胱甘肽氧還系統(tǒng)產(chǎn)生TF2作為以上實(shí)施例13和14中公開(kāi)方法的一個(gè)替代實(shí)施方案，可用谷胱甘肽氧還系統(tǒng)產(chǎn)生穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)(例如TF1或TF2),以形成特異性二硫鍵連接的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)。如下所述，完成了產(chǎn)生TF2的簡(jiǎn)便有效方法。全部過(guò)程都在室溫下進(jìn)行。首先按照大致的化學(xué)計(jì)量濃度將C-DDD2-Fab-hMN-14(蛋白L-純化的)與h679-Fab-AD2(IMP-291-純化的)在含lmMEDTA的PBS(pH7.4)中混合。加入還原型谷胱甘肽至終濃度1mM。30分鐘后，加入氧化型谷胱甘肽至終濃度2mM。BIACORE分析證明，在加入氧化型谷胱甘肽后2分鐘，TF2的形成完成了50%,在4小時(shí)內(nèi)完成100%。按照以上實(shí)施例14所述，用IMP-291親和色i普將TF2純化至幾乎均一。實(shí)施例19.粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)的位點(diǎn)特異性PEG化重組人GM-CSF(14kDa)在臨床上用于治療各種血液病。目前GM-SCF產(chǎn)品的一個(gè)局限是循環(huán)半衰期短，因此為了最佳療效必須每天注射給予患者。已用于延長(zhǎng)蛋白質(zhì)治療藥循環(huán)半衰期的一種方法是用聚乙二醇(PEG)修飾蛋白質(zhì)以增加其有效粒徑。然而，目前將PEG與蛋白質(zhì)綴合(PEG化)的所有方法并非最佳的，并且通常需要修飾目標(biāo)蛋白以達(dá)到位點(diǎn)特異性偶合(Doherty等，BioconjugateChem.2005,16:1291-1298)。即便有這些修飾，綴合收率也是不同的，而所得產(chǎn)物也不是均質(zhì)的。通過(guò)以下概述的DNL技術(shù)可以定量收率實(shí)現(xiàn)GM-CSF的位點(diǎn)特異性PEG化。DDD2序列通過(guò)間隔區(qū)與GM-CSFC-端融合，產(chǎn)生GM-SCF二聚體，創(chuàng)建了一個(gè)AD2?？课稽c(diǎn)，其再與PEG綴合得到PEG-AD2。在用于TF2的所述類(lèi)似條件下，通過(guò)結(jié)合GM-CSF-DDD2和PEG-AD2導(dǎo)致PEG化GM-CSF的形成。注意到，除了延長(zhǎng)循環(huán)半衰期外，PEG化產(chǎn)物中GM-CSF二聚體結(jié)構(gòu)比目前的單體GM-CSF結(jié)構(gòu)具有更高效力。該策略可用于其它細(xì)胞因子(例如重組人IL-2)、酶(例如重組人精氨酸酶)或生物活性肽(例如血小板生成素受體肽激動(dòng)劑，參見(jiàn)Cwirta等，Science1997,276:1696-1699)或那些需要更長(zhǎng)循環(huán)半衰期以改進(jìn)療效的肽模擬物。實(shí)施例20.用于免疫-PCR、LAMP和IDAT的生物分子的位點(diǎn)特異性共價(jià)連接共價(jià)DNA-標(biāo)記抗體可用于放大PCR測(cè)定響應(yīng)(參見(jiàn)Nucl.AcidRes.1995,23:522-529;Nucl.AcidRes.1999,27:4553-4561)。這樣的嵌合體可用綴合化學(xué)方法制得，該方法常導(dǎo)致產(chǎn)物在化學(xué)計(jì)量上不確定，具有未知的連接位點(diǎn)，因而不適于定量測(cè)定。近年來(lái)，已開(kāi)發(fā)了產(chǎn)生確定的DNA-蛋白嵌合體(稱(chēng)為蝌蚪(tadpole))的方法(參見(jiàn)Burbulis等，Nat.Methods2005,2:31-37),并證明能夠檢測(cè)和計(jì)數(shù)少量的分子。蝌蚪方法利用包括內(nèi)含肽(mtein)化學(xué)在內(nèi)的復(fù)雜流程，將雙鏈DNA片段位點(diǎn)特異性地連接目標(biāo)蛋白。本發(fā)明的方法和組合物也可用于將DNA以位點(diǎn)特異性方式與蛋白質(zhì)共價(jià)連接，產(chǎn)生確定組合物的均質(zhì)產(chǎn)物，也比辦枓方法簡(jiǎn)單得多。通過(guò)改變連接的DNA，利用免疫-PCR、LAMP(環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediatedisothermalamplification))(參見(jiàn)Nucl.AcidRes.2000,28:e63)或IDAT(T7RNA聚合酶擴(kuò)增的免疫檢測(cè))技術(shù)(參見(jiàn)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2001,98:5497-5502)，本發(fā)明產(chǎn)生的DNA-蛋白嵌合體可用于檢測(cè)和定量檢測(cè)非常少量(ioo-iooo)的分子。各試劑如下配制。(i)通過(guò)將DDD2與目標(biāo)蛋白(例如hMN-14Fab、hA20Fab等)的結(jié)合結(jié)構(gòu)融合，制備組分A(ii)通過(guò)間隔基團(tuán)，將AD2與所選雙鏈DNA進(jìn)行化學(xué)綴合，制備組分B。許多這類(lèi)可直接用于綴合的DNA片段是市售的。其它的可通過(guò)化學(xué)合成。(in)A與B在巰基還原劑存在的條件下進(jìn)行混合，再氧化，得到最終產(chǎn)物，其組成為一個(gè)拷貝的A和一個(gè)拷貝的B，A含有兩個(gè)相同亞基，每個(gè)亞基都具有耙分子結(jié)合位點(diǎn)，B則通過(guò)合適PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增。實(shí)施例21.具有生物學(xué)功能的納米粒本說(shuō)明書(shū)提供了通用而有效的方法，用于顯示具有特定生物學(xué)功能的惰性生物相容材料。相當(dāng)大的努力都致力于納米粒的合理的表面修飾與包被，以調(diào)節(jié)其藥代動(dòng)力學(xué)特性、毒性、免疫原性和靶向能力。例如，已報(bào)道了綴合抗體或肽的輩巴向納米粒成功實(shí)現(xiàn)體外傳感。然而，對(duì)于體內(nèi)應(yīng)用還存在諸多障礙(WeisslederR等，Nat.Biotechnol.2005;23:1418-1423)。這些挑戰(zhàn)之一是目前化學(xué)技術(shù)有待優(yōu)化，尤其是有關(guān)位點(diǎn)特異性偶聯(lián)，快速表面修飾以及降低成本，這些可按以下概述來(lái)實(shí)現(xiàn)。在EDC(l-乙基-3-(3-二曱氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)和sulfo-NHS(磺基琥珀酰亞胺酯)存在的條件下，通過(guò)C端羧基與環(huán)形AD2反應(yīng)，將在表面修飾的具有游離氨基的納米粒與AD2連接。純化后，該AD2-納米粒與含有已經(jīng)連接DDD2的目標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)的A組分混合，還原，再氧化，得到終產(chǎn)物，該終產(chǎn)物從A獲得耙向能力并保留納米粒的特性。潛在應(yīng)用包括用焚光》茲顆粒進(jìn)行把細(xì)胞體內(nèi)造影以及用大孔徑顆粒把藥物遞送到耙細(xì)胞(Tsapis等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2002;99:12001-12005)。實(shí)施例22.新的用DNL技術(shù)激活的免疫藥物制備允許綴合目標(biāo)細(xì)胞毒性藥物的融合蛋白作為B組分，與制備作為A組分的靶向蛋白偶聯(lián)，產(chǎn)生下述新的免疫藥物。首先，選擇良好表達(dá)的免疫球蛋白人輕鏈作為支架(scafold)或載體蛋白，在其C-端與AD2序列融合。為了避免形成輕鏈二聚體，末端半胱氨酸(它與Fd鏈形成二硫鍵)被絲氨酸取代。此外，至少一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)(三肽序列N-X-T)被改造成到輕鏈以便能添加寡糖，它能以重組方式高收率地制備并純化為單一組分，用作通過(guò)適當(dāng)化學(xué)方法進(jìn)行藥物綴合的底物，例如Shih等所描述的將蒽環(huán)與氨基-葡聚糖綴合(CancerRes.1991;51:4192-4198)。這類(lèi)含有藥物的B-組分可結(jié)合各種A組分，該A組分含有已連接到具有靶向和內(nèi)化功能的結(jié)合結(jié)構(gòu)的DDD2?；蛘撸肁D2衍生的含有藥物的氨基-葡聚糖與合適的A組分組合，以便進(jìn)行靶特異性藥物治療。其它良好表達(dá)的重組分子也可選做藥物綴合的支架或載體蛋白。實(shí)施例23.將病原體靶向嗜中性粒細(xì)胞以殺死病原體最近報(bào)道了包含重組人表面活性蛋白片段D(rfhSP-D)和抗CD89抗體Fab的化學(xué)綴合物，作為廣譜抗感染藥物，潛在用于治療由各種病原體引起的疾病，所述病原體包括曱型流感病毒、白色念珠菌和大腸桿菌(Tacken等，J.Immunol.2004,172:4934-4940)。如下所述，DNL技術(shù)可用于生產(chǎn)穩(wěn)定束縛的復(fù)合物，該復(fù)合物也可將病原體靶向嗜中性粒細(xì)胞以殺死病原體。將含有巻曲螺旋型a-螺;旋頸區(qū)(a-helicalcoiledcoilneckdomain)和C端泮唐識(shí)別區(qū)(CRD)的hSP-D截短片段，在N-端與DDD2融合，產(chǎn)生能通過(guò)CRD多價(jià)結(jié)合病原體的A結(jié)構(gòu)。為了耙向嗜中性粒細(xì)胞上的FcR，將A結(jié)構(gòu)與由抗CD89Fab與AD2融合蛋白組成的B組分連接，產(chǎn)生由兩個(gè)hSP-DCRD和一個(gè)抗CD89Fab組成的穩(wěn)定復(fù)合物。用人表面活性蛋白A(hSP-A)替代hSP-D和其它抗體(例如針對(duì)CD3和CD64的抗體)，可制備類(lèi)似的抗感染藥。實(shí)施例24.用DNL技術(shù)制備的蛋白質(zhì)微陣列蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)的一個(gè)迫切問(wèn)題就是成功開(kāi)發(fā)切實(shí)可行的方法，用于有效地將蛋白質(zhì)固定在玻璃表面，同時(shí)保持這些蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。因?yàn)槿绻皇沁m當(dāng)而穩(wěn)定地連接到合適表面上，蛋白質(zhì)就會(huì)失去活性，所以已經(jīng)測(cè)試了多種策略，看它們?cè)谖㈥嚵兄挟a(chǎn)生均一而穩(wěn)定的蛋白質(zhì)固定化效果。例如，Zhu等人在其酵母菌微陣列的研究工作中，利用Ni-NTA-包被的玻片讓(HisV標(biāo)記的蛋白質(zhì)進(jìn)行位點(diǎn)特異性地連接(Science2001;293:2101-2105)。然而，(HisV標(biāo)記與Ni-NTA間的非共價(jià)相互作用僅允許與這類(lèi)微陣列相容的有限數(shù)量的下游篩選技術(shù)。也已經(jīng)報(bào)道了幾種穩(wěn)定和位點(diǎn)特異性蛋白質(zhì)固定化的替代策略。Mrksich等人將角質(zhì)酶-融合蛋白質(zhì)固定在含有膦酸酯的玻璃表面上，該策略是通過(guò)絲氨酸酯酶角質(zhì)酶與帶有膦酸酯配體的自裝配單層細(xì)胞結(jié)合，然后經(jīng)過(guò)取代反應(yīng)將配體共價(jià)束縛到酶活性位點(diǎn)上(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2002;99:5048-5052)。Kindermann等(J.Am.Chem.Soc.2003;125:7810-781l)報(bào)道的另一方法,是基于人O6-烷基鳥(niǎo)。票呤-DNA烷基轉(zhuǎn)移酶(hAGT)的不常見(jiàn)機(jī)制，該機(jī)制將其底物烷基鳥(niǎo)。票呤或千基鳥(niǎo)。票呤的烷基不可逆地轉(zhuǎn)移給hAGT的反應(yīng)性半胱氨酸殘基。通過(guò)將千基連接到表面，hAGT融合蛋白將其自身以特異性和共價(jià)的方式固定。Yin等(J.Am.Chem.Soc.2004;126:7754-7755)報(bào)道了另一種基于酶的策略，用于固定含有肽載體蛋白(PCP)的融合蛋白，該方法利用固定在表面的磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶(S^)和磷酸泛酰巰基乙胺綴合物。利用截短形式的核糖核酸酶S，Soellner等(J.Am.Chem.Soc.2003;125:11790-11791)證明通過(guò)Staudmger連接固定位點(diǎn)特異性蛋白質(zhì)，其中疊氮化物與硫代亞膦酸酯(phosphinothioester)反應(yīng)生成穩(wěn)定的酰胺。Tan等(B證g.Med.Chem.Lett.2004;14:6067-6070)報(bào)道了改進(jìn)的方法，利用內(nèi)含肽介導(dǎo)的化學(xué)方法使蛋白質(zhì)發(fā)生位點(diǎn)特異性生物素化，隨后固定在包被有抗生物素蛋白的表面而得到蛋白質(zhì)微陣列。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本說(shuō)明書(shū)提供具有幾個(gè)優(yōu)越性的位點(diǎn)特異性和共價(jià)固定蛋白質(zhì)的通用方法更加簡(jiǎn)單、高效、通用等。可通過(guò)下述方法制備蛋白質(zhì)微陣列。在EDC和sulfo-NHS存在的條件下，用環(huán)形AD2處理含有反應(yīng)性氨基的合適表面，通過(guò)其C端羧基共價(jià)連接AD2。AD2-衍生表面隨后與含有親和-識(shí)別域(例如Fab片段)和DDD2的融合蛋白一起孵育，還原并再氧化，引起融合蛋白的共價(jià)和位點(diǎn)特異性固定化。用金包被的玻片也適用于AD2的衍生化。實(shí)施例25.用并非源自PKA和AKAP的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生的多價(jià)、多特異性結(jié)構(gòu)包括兩個(gè)基本策略。第一個(gè)策略是尋找和評(píng)價(jià)適于替代DDD和AD作用的其它天然存在的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域。例如，HNF-la的N端二聚化結(jié)構(gòu)域可替代DDD，而HFN-1二聚化輔因子(DcoH)可替代AD。第二個(gè)策略概述如下。人p53是由不同的功能性結(jié)構(gòu)域組成的模塊蛋白。人p53C端殘基32S355(流程1)稱(chēng)為四聚體化結(jié)構(gòu)域(pS3tet)，在溶液中自動(dòng)形成四聚體，它實(shí)際上是兩個(gè)二聚體的二聚體，其間只有微弱的親和力(Kd2uM)。然而，每個(gè)二聚體中的兩個(gè)單體卻緊密相連，據(jù)報(bào)道Kd小于10.'5M(Brokx等，J.Biol.Chem.2003;278:2327-2332)。因此，預(yù)期含有p53tet的融合蛋白會(huì)形成非常緊密結(jié)合的二聚體，如同含有人PKARIIa的DDD序列的融合蛋白那樣。為了將第二結(jié)構(gòu)與p53tet二聚體連接在一起，通過(guò)酵母2-雜交系統(tǒng)或合適的噬菌體展示文庫(kù)，選擇含有15-50個(gè)殘基的針對(duì)p53tet的結(jié)合肽，Kd^1ILiM。必要時(shí)，用半胱氨酸衍生具有最高親合力(即最低的Kd值)的肽，再與目標(biāo)蛋白融合，就能被穩(wěn)定束綽到p53tet二聚體上。流程IGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQA(SEQIDNO:28)表1.帶有LS174T腫瘤的棵鼠中125I-TF2的腫瘤攝取和組織清除率<table>tableseeoriginaldocumentpage132</column></row><table>表3.帶有LS174T腫瘤的棵鼠中TF2的腫瘤攝取和組織清除率<table>tableseeoriginaldocumentpage133</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage134</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage135</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage136</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage137</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage138</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage139</column></row><table>權(quán)利要求1.一種包含穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)的組合物，所述結(jié)構(gòu)包含a)同型二聚體，所述同型二聚體的每個(gè)第一單體包含與第一前體連接的二聚化和?？拷Y(jié)構(gòu)域(DDD)；b)第二單體，包含與第二前體連接的錨定結(jié)構(gòu)域(AD)，AD與DDD共價(jià)或非共價(jià)連接。2.權(quán)利要求1的組合物，其中AD通過(guò)二硫鍵與DDD結(jié)合。3.權(quán)利要求1的組合物，其中DDD與第一前體共價(jià)結(jié)合，AD與第二前體共價(jià)結(jié)合。4.權(quán)利要求3的組合物，其中第一單體是包含第一前體和DDD的融合蛋白，第二單體是包含第二前體和AD的融合蛋白。5.權(quán)利要求3的組合物，其中第一前體與DDD化學(xué)交聯(lián)，笫二前體與AD化學(xué)交聯(lián)。6.權(quán)利要求l的組合物，其中第一和第二前體選自蛋白質(zhì)、肽、肽模擬物、多核苷酸、RNA/、寡糖、天然或合成聚合物、納米粒、量子點(diǎn)、以及有機(jī)或無(wú)機(jī)化合物。7.權(quán)利要求6的組合物，其中所述蛋白質(zhì)選自細(xì)菌毒素、植物毒素、蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌腸毒素-A、美洲商陸抗病毒蛋白、多花白樹(shù)毒蛋白、白喉毒素、假單胞菌外毒素、假單胞菌內(nèi)毒素、豹蛙酶(Rap)、Rap(N69Q)、PE38、dgA、DT390、PLC、tPA、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、可溶性受體組分、表面活性蛋白D、IL-4、sIL-4R、sIL-13R、VEGF121、TPO、EPO、；容血才全劑、酶、焚光蛋白、sTNFa-R、avimer、scFv、dsFv和納米抗體。8.權(quán)利要求1的組合物，其中第一和笫二前體選自抗體、IgG抗體、抗體片段、單克隆抗體、人源化抗體、人抗體、嵌合抗體、抗體的抗原結(jié)合區(qū)、納米4元體、scFv、scFv-Fc融合物、Fab、Fab'、dsFv、單鏈抗體和F(ab')2。9.權(quán)利要求8的組合物，其中所述抗體片段選自以下抗體的抗體片段hMN-14、L19、hA20、hLL2、L243、hCC49、7E3、hLLl、hPAM4、hRS7、rHl、L49、抗CD14、抗CD111、Humira、REMICADE、Xolair、Synagis⑧和hMN-15。10.權(quán)利要求1的組合物，其中DDD序列來(lái)源于依賴(lài)cAMP的蛋白激酶(PKA)調(diào)節(jié)亞基。11.權(quán)利要求1的組合物，其中AD序列來(lái)源于A-激酶錨定蛋白(AKAP)序列。12.權(quán)利要求1的組合物，其中第一前體和第二前體具有針對(duì)抗原的結(jié)合親和性。13.權(quán)利要求12的組合物，其中第一前體和第二前體具有針對(duì)相同抗原的親和性。14.權(quán)利要求12的組合物，其中第一前體和第二前體具有針對(duì)兩種不同抗原的親和性。15.權(quán)利要求12的組合物，其中所述抗原選自碳酸酐酶IX、曱胎蛋白、A3、A33抗體特異性抗原、Ba733、BrE3-抗原、CA125、CD1、CDla、CD3、CD5、CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD38、CD45、CD74、CD79a、CD80、CD138、結(jié)腸特異性抗原-p(CSAp)、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、CSAp、EGFR、EGP-1、EGP-2、Ep-CAM、Flt-l、Flt-3、葉酸受體、HLA-DR、人絨毛膜促性腺激素(HCG)及其亞基、HER2/neu、低氧誘導(dǎo)因子(HIF-I)、Ia、IL-2、IL-6、IL-8、胰島素生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)、KC4-抗原、KS-l-抗原、KSl-4、Le-Y、巨嗟細(xì)胞抑制因子(MIF)、MAGE、而C1、MUC2、固C3、MUC4、NCA66、NCA95、NCA90、PAM-4抗體特異性抗原、胎盤(pán)生長(zhǎng)因子、p53、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PSMA、RS5、SIOO、TAC、TAG-72、生腱蛋白、TRAIL受體、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、腫瘤壞死抗原、VEGF、ED-B纖連蛋白、17-lA-抗原、血管生成標(biāo)記、癌基因標(biāo)記或癌基因產(chǎn)物。16.權(quán)利要求1的組合物，其中第一前體包含與免疫球蛋白CH1序列連接的免疫球蛋白Vh序列。17.權(quán)利要求16的組合物，其中第一前體與免疫球蛋白輕鏈連接。18.權(quán)利要求17的組合物，其中所述輕鏈包含與CK或CL序列連接的V^序列。19.權(quán)利要求17的組合物，其中第一前體通過(guò)二硫鍵與所述輕鏈連接。20.權(quán)利要求l的組合物，其中第一前體具有腫瘤相關(guān)抗原的結(jié)合位點(diǎn)。21.權(quán)利要求20的組合物，其中所述腫瘤相關(guān)抗原選自碳酸酐酶IX、曱胎蛋白、A3、A33抗體特異性抗原、Ba"3、BrE3-抗原、CA125、CD1、CDla、CD3、CD5、CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD38、CD45、CD74、CD79a、CD80、CD138、結(jié)腸特異性抗原-p(CSAp)、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、CSAp、EGFR、EGP-1、EGP-2、Ep-CAM、Flt-l、Flt-3、葉酸受體、HLA-DR、人絨毛膜促性腺激素(HCG)及其亞基、HER2/neu、低氧誘導(dǎo)因子(HIF-I)、Ia、IL-2、IL-6、IL-8、胰島素生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)、KC4-抗原、KS-l-抗原、KSl-4、Le-Y、巨噬細(xì)胞抑制因子(MIF)、MAGE、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、NCA66、NCA95、NCA90、PAM-4抗體特異性抗原、胎盤(pán)生長(zhǎng)因子、p53、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PSMA、RS5、SIOO、TAC、TAG-72、生腱蛋白、TRAIL受體、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肺瘤壞死抗原、VEGF、ED-B纖連蛋白、17-lA-抗原、血管生成標(biāo)記、癌基因標(biāo)記或癌基因產(chǎn)物。22.權(quán)利要求1的組合物，其中第二前體具有半抗原的結(jié)合位點(diǎn)。23.權(quán)利要求22的組合物，其中所述半抗原與治療藥連接。24.權(quán)利要求23的組合物，其中所述治療藥選自相思豆毒蛋白、金剛烷胺、阿莫西林、兩性霉素B、氨千西;f木、aplidin、阿扎立平、阿那曲唑、氮雜胞苷、氨曲南、阿奇霉素、桿菌肽、復(fù)方新諾明、巴特芬⑧、聯(lián)苯芐唑、博來(lái)霉素、硼替佐米、苔蘚抑素-1、白消安、加利車(chē)霉素、喜樹(shù)堿、10-羥基喜樹(shù)堿、羧千西林、卡泊芬凈、卡莫司汀、頭孢克洛、頭孢唑林、頭孢菌素類(lèi)、頭孢吡肟、頭孢曲松、頭孢噻肟、西樂(lè)葆、苯丁酸氮芥、氯霉素、鹽酸環(huán)丙沙星制劑⑧、順鉑、伊立替康(CPT-ll)、SN-38、卡鉑、克拉曲濱、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、達(dá)卡巴嗪、多西他賽、放線菌素D、葡糖苷酸道諾霉素、柔紅霉素、地塞米松、己烯雌酚、白喉毒素、DNA酶I、多柔比星、2-二氫吡咯多柔比星(2P-DOX)、多西環(huán)素、氰基嗎啉代多柔比星、葡糖苷酸多柔比星、葡糖苷酸表柔比星、炔雌醇、雌莫司汀、雌激素受體結(jié)合劑、依托泊普、葡糖苷酸依托泊苷、磷酸依托泊苷、erythrocyclme、紅霉素、甲硝唑、法尼基-蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑、氟尿苷(FUdR)、3',5'-0-二油?；?FudR(FUdR-dO)、氟達(dá)拉濱、氟他胺、氟尿嘧啶、氟曱睪酮、更昔洛韋、慶大霉素、多花白樹(shù)毒蛋白、吉西他濱、己酸羥孕酮、羥基脲、伊達(dá)比星、異環(huán)磷酰胺、異煙肼、伊曲康唑、卡那霉素、酮康唑、L-天冬酰胺酶、亞葉酸、洛莫司汀、氮芥、醋酸甲羥孕酮、醋酸甲地孕酮、美法侖、巰基嘌呤、6-巰基嘌呤、曱氨蝶呤、米托蒽醌、光輝霉素、絲裂霉素、米托坦、米諾環(huán)素、萘替芬、萘啶酸、新霉素、諾維本、硝基脲、制霉菌素、onconase、苯唑西林、巴龍霉素、青霉素、噴他脒、哌拉西林-三唑巴坦、丁酸苯酯、潑尼松、丙卡巴肼、紫杉醇、噴司他丁、美洲商陸抗病毒蛋白、PSI-341、假單胞菌外毒素、假單胞菌內(nèi)毒素、雷洛昔芬、rapLRl、核糖核酸酶、蓖麻毒蛋白、司莫司汀、利福布汀、利福平、金剛乙胺、鏈霉素、磺胺曱嗯唑、柳氮磺吡啶、葡萄球菌腸毒素-A、鏈佐星、他莫昔芬、紫杉烷類(lèi)、泰素、丙酸睪酮、四環(huán)素、沙利度胺、硫鳥(niǎo)嘌呤、塞替派、替尼泊苷、托泊替康、反鉑、曱氧千啶-磺胺曱噁唑、烏拉莫司汀、伐昔洛韋、萬(wàn)古霉素、velcade、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春瑞濱、長(zhǎng)春新;威、zanamir、zithromycin、反義寡核香酸、干擾RNA或其組合。25.權(quán)利要求22的組合物，其中所述半抗原與造影劑連結(jié)。26.權(quán)利要求25的組合物，其中所述造影劑選自鉻(ni)、錳(II)、鐵(in)、柳)、鈷(n)、鎳(n)、銅(n)、釹(m)、衫(m)、鐿(ni)、釓(ni)、釩(ii)、鋱(iii)、鏑(m)、鈥(ni)、鉺(m)、鑭(m)、金(in)、鉛(n)和鉍(ni)。27.權(quán)利要求22的組合物，其中所述半抗原與造影用或治療用放射性同位素連接。28.權(quán)利要求27的組合物，其中所述放射性同位素選自225Ac、211At、212Bi、213Bi、14C、51Cr、36C1、45Ti、57Co、58Co、62Cu、64Cu、67Cu、166Dy、152Eu、18F、67Ga、68Ga、195mHg、166Ho、3H、mIn、123I、124I、125I、131I、52Fe、59Fe、177Lu、1910s、212Pb、32P、33P、l42Pr、195mPt、223Ra、l86Re、188Re、189Re、47Sc、75Se、mAg、153Sm、89Sr、35S、161Tb、94mTc、99mTc、86Y、卯Y和89Zr。29.權(quán)利要求22的組合物，其中所述半抗原與抗血管生成藥連接。30.權(quán)利要求29的組合物，其中所述抗血管生成藥選自血管生長(zhǎng)抑素、baculostatin、人血管能抑素、乳腺絲抑蛋白、抗VEGF抗體或肽、抗胎盤(pán)生長(zhǎng)因子抗體或肽、抗Flk-l抗體、抗Flt-l抗體或肽、層粘連蛋白肽、纖連蛋白肽、纖溶酶原激活物抑制劑、組織金屬蛋白酶抑制劑、干擾素、白介素12、IP-IO、Gro畫(huà)P、血小板應(yīng)答蛋白、2-曱氧基雌二醇、增殖蛋白相關(guān)蛋白、carboxiamidotriazole、CMIOI、馬立馬司他、戊聚糖多聚硫酸酯、促血管生成素2、干擾素-a、除莠霉素A、PNU145156E、WK催乳素片段、利諾胺、沙利度胺、己酮可可堿、染料木堿、TNP-470、內(nèi)皮生長(zhǎng)抑素、紫杉醇、accutin、血管生長(zhǎng)抑素、西多福韋、長(zhǎng)春新堿、博來(lái)霉素、AGM-1470、血小板因子4和米諾環(huán)素。31.權(quán)利要求22的組合物，其中所述半抗原與光檢測(cè)標(biāo)記連接。32.權(quán)利要求l的組合物，其中第一前體選自細(xì)菌毒素、植物毒素、蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌腸毒素-A、美洲商陸抗病毒蛋白、多花白樹(shù)毒蛋白、白喉毒素、假單胞菌外毒素、假單胞菌內(nèi)毒素、抗gpl20、抗P1GF、抗(3-淀粉狀蛋白、hMN-14、L19、hA20、hLL2、L243、hCC49、7E3、hLLl、hPAM4、hRS7、rHl、L49、豹蛙酶(Rap)、Rap(N69Q)、PE38、dgA、DT390、PLC、tPA、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、可溶性受體組分、表面活性蛋白D、IL-4、sIL-4R、sIL-13R、抗VEGF12I、抗CD14、抗CD川、HUMIRA、REMICADE⑧、XOLAIR⑧、SYNAGIS⑧、hMN-15、TPO、EPO、溶血栓劑、酶、焚光蛋白和sTNFa-R。33.權(quán)利要求1的組合物，其中第二前體選自細(xì)菌毒素、植物毒素、蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌腸毒素-A、美洲商陸抗病毒蛋白、多花白樹(shù)毒蛋白、白喉毒素、假單胞菌外毒素、假單胞菌內(nèi)毒素、溶血栓蛋白、尿激酶、水蛭素、h679、h734、hA20、Sll、P4B6、Rap、Rap(N69Q)、PE38、dgA、DT390、PLC、鏈霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、HRP、AP、GFP、tPA、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、可溶性受體組分、羧肽酶G2、青霉素酰胺酶、P-內(nèi)酰胺酶、胞嘧啶脫氨酶、硝基還原酶、大腸桿菌P-半乳糖香酶、綠色焚光蛋白(GFP)、堿性磷酸酶、辣根過(guò)氧化物酶、鏈霉抗生物素蛋白、人羧基酯酶2、抗gp120、抗P1GF、抗VEGF^、hLLl、hLL2、hPAM4、hRS7、hRl、7E3、ot-CD89、IL-4、sIL誦13R、sIL-4R、志賀樣毒素、白喉毒素、抗CD14、抗CD1U、HUMIRA、REMICADE⑧、XOLA鵬、SYNAGIS、hMN-15、TPO、EPO、溶血栓劑、酶、熒光蛋白和sTNFa-R。34.權(quán)利要求1的組合物，其中第一前體具有針對(duì)以下物質(zhì)的結(jié)合親和性細(xì)胞表面受體、堿性磷酸酶、辣根過(guò)氧化物酶、P-半乳糖苷酶、tpA、鏈激酶、水蛭素、尿激酶、CA19-9、CEA、CEACAM6、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD40、CD74、ED-B纖連蛋白、EGFR、EpCAM/17-lA、GD2、G250、HER2/neu、hTR、II類(lèi)HLA、HMWMAA、HN歸V、IGF1R、IL-2R/Tac、IL-17、MUC1、PSMA、M13外殼蛋白、GpIIb/IIIa、CD74、EGP隱1、IGF1R、CD25/Tac、LeY、間皮素、Erb-B2、EpCAM、GP240、GPII固a、p97、CD3、IL-4R、IL-4、IL-13、VEGFR-2、CD14、CDlll/柄蛋白-l、葉酸受體a、Gpl20、IL-6、IL-5、IL-8、CD154、IgE、LFA-1、(3-類(lèi)胰蛋白酶、CD105/內(nèi)皮糖蛋白、TNFa、RSVF-蛋白、CEA的A1B1、CEA的N結(jié)構(gòu)域、P歸P-1、TAG-72、MUC1、固C2、固C3、MUC4、VEFGR1諸、VEGFR2/KDR或VEGRF3/Flt-4。35.權(quán)利要求1的組合物，其中第二前體具有針對(duì)以下物質(zhì)的結(jié)合親和性IL-17、組胺-琥珀酰-甘氨酸(HSG)、銦-DTPA、CD22、CD20、EGFR、IGF1R、VEFGR1/Fltl、VEGFR2/KDR、VEGRF3/Flt陽(yáng)4、CD3、CD16、CD64、CD89、CD2、腺病毒纖突結(jié)、M13外殼蛋白、GpIIb/IIIa、堿性磷酸酶、辣根過(guò)氧化物酶、P-半乳糖苷酶、tpA、鏈激酶、水蛭素或尿激酶。36.權(quán)利要求1的組合物，其中第一前體具有針對(duì)選自以下的細(xì)胞表面抗原的親和性CEA、ED-B纖連蛋白、CD20、CD22、CD19、EGFR、IGF1R、VEFGR1/Fltl、VEGFR2/KDR、VEGRF3/Flt-4、HER2/腿、CD30、CD33、PfMSP-I、HN/NDV、EpCAM/17畫(huà)lA、hTR、IL-2R/Tac、CA19-9、固C1、II類(lèi)HLA、GD2、G250、TAG誦72、PSMA、CEACAM6、HMWMAA、CD40、M13外殼蛋白和GPIIb/IIIa;第二前體具有針對(duì)選自組胺-琥珀酰-甘氨酸(HSG)和銦-DTPA的半抗原的親和性，或者具有針對(duì)選自以下的細(xì)胞表面抗原的親和性CD22、CD20、EGFR、IGF1R、VEFGR1/Fltl、VEGFR2/KDR、VEGRF3/Flt國(guó)4、CD3、CD16、CD64、CD89、CD2和腺病毒纖突結(jié)。37.權(quán)利要求1的組合物，其中第一前體具有針對(duì)選自M13夕卜殼蛋白和GpIIb/IIIa的細(xì)胞表面抗原的親和性，或者具有針對(duì)選自以下的生物分子的親和性堿性磷酸酶、辣根過(guò)氧化物酶、(3-半乳糖香酶、tpA、鏈激酶、水蛭素和尿激酶；第二前體具有針對(duì)選自M13外殼蛋白和GpIIb/IIIa的細(xì)胞表面抗原的親和性，或者具有針對(duì)選自以下的生物分子的親和性堿性磷酸酶、辣根過(guò)氧化物酶、P-半乳糖香酶、tpA、鏈激酶、水蛭素和尿激酶。38.權(quán)利要求l的組合物，其中第一前體具有針對(duì)以下物質(zhì)的親和性CD3、CD74、CD19、CD22、MUC1、EGP-1、IGF1RCD30、CD25/Tac、LeY、卩-淀粉狀蛋白、間皮素、Erb-B2、EpCAM、GP240、GPIIb/IIIa或p97;第二前體是核糖核酸酶、豹蛙酶、基因工程豹蛙酶、細(xì)菌毒素、植物毒素、PE38、dgA、DT390、磷脂酶C(PLC)、多花白樹(shù)毒蛋白、溶血栓蛋白、tPA、尿激酶或水蛭素。39.權(quán)利要求1的組合物，其中第一前體具有針對(duì)疾病或病癥相關(guān)的任何細(xì)胞表面抗原的親和性；第二前體選自細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、羧肽酶G2、青霉素酰胺酶、p-內(nèi)酰胺酶、胞嘧啶脫氨酶、硝基還原酶、P-半乳糖苷酶、綠色熒光蛋白(GFP)、堿性磷酸酶、辣根過(guò)氧化物酶和鏈霉抗生物素蛋白。40.權(quán)利要求1的組合物，其中第一前體選自核糖核酸酶、細(xì)菌毒素、植物毒素、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和表面活性蛋白D(Sp-D);第二前體具有針對(duì)疾病或病癥相關(guān)的任何細(xì)胞表面抗原的親和性。41.權(quán)利要求1的組合物，其中第一前體選自細(xì)胞表面受體的配體、IL-4、VEGF121、可溶性受體組分、sIL-4R、sIL國(guó)13R、毒素、PE38、志賀樣毒素和白喉毒素；第二前體選自細(xì)胞表面受體的配體、IL-4、VEGF121、可溶性受體組分、sIL-4R、sIL-13R、毒素、PE38、志賀樣毒素和白喉毒素。42.權(quán)利要求1的組合物，其中第一和第二前體相同，并且選自以下物質(zhì)的結(jié)合分子CD14、CDll/柄蛋白-l、葉酸受體a、gpl20、IL-6、IL-5、IL-8、CD154、IgE、LFA-1、(3-類(lèi)胰蛋白酶、CD105/內(nèi)皮糖蛋白、GpIIb/IIIa、TNFa、RSVF-蛋白、CEA的A1B1和CEA的N結(jié)構(gòu)域。43.權(quán)利要求l的組合物，其中第一和笫二前體相同，并且選自細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、可溶性受體組分、tPA、TPO、EPO和sTNFa-R。44.權(quán)利要求1的組合物，所述組合物還包含通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)鍵與所述穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)綴合的一種或多種效應(yīng)物或載體。45.權(quán)利要求44的組合物，其中所述效應(yīng)物是診斷試劑、治療藥、化療藥、放射性同位素、顯像劑、抗血管生成藥、細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子、藥物、前體藥物、酶、結(jié)合分子、細(xì)胞表面受體的配體、螯合劑、免疫調(diào)節(jié)劑、寡核苷酸、激素、光檢測(cè)標(biāo)記、染料、肽、毒素、造影劑、順磁標(biāo)記、超聲標(biāo)記、促凋亡劑、脂質(zhì)體、納米?；蚱浣M合。46.權(quán)利要求44的組合物束縛結(jié)構(gòu)化學(xué)交聯(lián)。47.權(quán)利要求44的組合物效應(yīng)物或兩個(gè)以上載體連才妻。48.權(quán)利要求47的組合物效應(yīng)物是相同或不同的。49.權(quán)利要求44的組合物一種診斷試劑或治療藥。50.—種方法，所述方法包括a)獲取權(quán)利要求1的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)；和b)將所述穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)給予疾病患者；其中所述穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)對(duì)疾病具有治療效果。51.權(quán)利要求50的方法，其中所述疾病是癌癥、增生、糖尿病性一見(jiàn)網(wǎng)膜病、黃斑變性、炎性腸病、節(jié)l殳性回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)病、哮喘、水腫、肺動(dòng)脈高壓、青少年糖尿,其中所述效應(yīng)物或載體與所述穩(wěn)定,其中所述穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)與兩個(gè)以上,其中所述兩個(gè)以上載體或兩個(gè)以上,其中所述一種或多種載體包含至少病、銀屑病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、斯耶格倫綜合征、多發(fā)性硬化、重癥肌無(wú)力、膿毒病、角膜移植排斥、新生血管性青光眼、遺傳性出血性毛細(xì)血管擴(kuò)張、心肌血管生成、斑塊新血管形成、再狹窄、血管創(chuàng)傷后新內(nèi)膜形成、毛細(xì)管擴(kuò)張、血友病性關(guān)節(jié)、血管纖維瘤、慢性炎癥相關(guān)的纖維化、肺纖維化、深部靜脈血栓形成或傷口肉芽形成。52.權(quán)利要求51的方法，其中所述疾病是癌癥，而且第一前體具有針對(duì)腫瘤相關(guān)抗原的結(jié)合親和性。53.權(quán)利要求52的方法，所述方法還包括給予一種或多種抗癌治療與所述穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)聯(lián)用。54.權(quán)利要求53的方法，其中所述治療是化療藥、細(xì)胞因子、肽、免疫調(diào)節(jié)劑、放療、免疫治療、放免治療、局部高溫、激光照射、抗血管生成藥或手術(shù)切除。55.權(quán)利要求51的方法，所述方法還包括給予所述患者能結(jié)合第二前體的半抗原。56.權(quán)利要求55的方法，其中在所述穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)定位到疾病相關(guān)組織之后再給予所述半抗原。57.權(quán)利要求56的方法，其中所述半抗原與選自以下的物質(zhì)連接抗血管生成藥、化療藥、細(xì)胞因子、藥物、前體藥物、毒素、酶、寡核苷酸、放射性同位素、免疫調(diào)節(jié)劑、激素、結(jié)合分子、脂質(zhì)、聚合物、膠束、脂質(zhì)體、納米?；蚱浣M合。58.權(quán)利要求50的方法，其中所述疾病是由真菌引起的。59.權(quán)利要求50的方法，其中所述疾病是由病毒引起的。60.權(quán)利要求50的方法，其中所述疾病是由細(xì)菌引起的。61.權(quán)利要求50的方法，其中所述疾病是自身免疫性疾病。62.權(quán)利要求50的方法，其中所述疾病是神經(jīng)變性性疾病。63.權(quán)利要求62的方法，其中所述疾病是阿爾茨海默病。64.權(quán)利要求63的方法，其中所述穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)具有至少一個(gè)針對(duì)p-淀粉狀蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。65.權(quán)利要求50的方法，其中所述疾病是心肌梗塞、缺血性心臟病、動(dòng)脈粥樣;更化斑塊、脈管炎、移植排斥、特應(yīng)性組織或者因活化粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴樣細(xì)胞、NK細(xì)胞或巨噬細(xì)胞增多所引起的炎癥。66.權(quán)利要求50的方法，其中給予所述穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)以誘導(dǎo)輩巴細(xì)胞群體凋亡。67.權(quán)利要求66的方法，其中所述穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)包含選自以下的抗體或抗體片段組合抗CD74X抗CD20、抗CD74X抗CD22、抗CD22X抗CD20、抗CD20X抗HLA-DR、抗CD19X抗CD20、抗CD20X抗CD80、抗CD2X抗CD25、抗CD8X抗CD25和抗CD2X抗CD147。68.權(quán)利要求66的方法，其中第一前體和/或第二前體具有針對(duì)選自以下抗原的結(jié)合親和性CD2、CD3、CD8、CDIO、CD21、CD23、CD24、CD25、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD48、CD52、CD55、CD59、CD70、CD74、CD80、CD86、CD138、CD147、HLA畫(huà)DR、CEA、CSAp、CA國(guó)125、TAG-72、EFGR、HER2、HER3、HER4、IGF-1R、c-Met、PDGFR、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、TKFR1、TNFR2、NGFR、Fas(CD95)、DR3、DR4、DR5、DR6、VEGF、PIGF、ED-B纖連蛋白、生腱蛋白、PSMA、PSA、碳酸酐酶IX和IL-6。69.—種診斷疾病的方法，所述方法包括a)獲得一種包含同型二聚體的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)，所述同型二聚體的每個(gè)第一單體含有與第一前體連接的二聚化和停靠結(jié)構(gòu)域(DDD)，所述二元復(fù)合物還包含第二單體，第二單體含有與第二前體連接的錨定結(jié)構(gòu)域(AD),AD與DDD共價(jià)連接，其中笫一前體與疾病相關(guān)抗原結(jié)合，第二前體與診斷用半抗原結(jié)合；b)將所述復(fù)合物給予懷疑患有疾病的患者；c)給予同一患者能結(jié)合所述二元復(fù)合物的診斷用半抗原；和d)檢測(cè)與所述二元復(fù)合物結(jié)合的半抗原的存在；其中所述半抗原定位于疾病相關(guān)組織，即診斷所述患者患有所述疾病。70.權(quán)利要求69的方法，其中所述半抗原與放射性核素綴合。71.權(quán)利要求69的方法，其中放射性核素用同位素檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，或者用單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描或正電子發(fā)射斷層掃描來(lái)成像。72.權(quán)利要求69的方法，其中所述疾病是癌癥，而且笫一前體與腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合。73.權(quán)利要求69的方法，其中所述半抗原與磁共振成像(MRI)造影劑綴合，通過(guò)MRI檢測(cè)與二元復(fù)合物結(jié)合的半抗原。74.權(quán)利要求69的方法，其中所述半抗原與超聲成像增強(qiáng)劑綴合，通過(guò)超聲成像檢測(cè)與二元復(fù)合物結(jié)合的半抗原。75.權(quán)利要求74的方法，其中所述超聲成像增強(qiáng)劑是脂質(zhì)體。76.權(quán)利要求69的方法，其中第一前體或第二前體具有針對(duì)CD19、CD20、CD22或IL-17的結(jié)合親和性。77.權(quán)利要求69的方法，所述方法還包括采用體內(nèi)內(nèi)窺鏡檢查、手術(shù)中檢查或者手術(shù)中檢查及治療，來(lái)檢測(cè)結(jié)合半抗原。78.—種體外診斷的方法，所述方法包括a)獲得包含同型二聚體的二元復(fù)合物，所述同型二聚體的每個(gè)第一單體含有與第一前體連接的二聚化和停靠結(jié)構(gòu)域(DDD),所述二元復(fù)合物還包含第二單體，第二單體含有與笫二前體連接的錨定結(jié)構(gòu)域(AD)，AD與DDD共價(jià)連接，其中第一前體與疾病相關(guān)抗原結(jié)合，第二前體與診斷用半抗原結(jié)合；b)將所述復(fù)合物給予來(lái)自懷疑患有疾病的患者的樣品；c)給予能結(jié)合所述二元復(fù)合物的診斷用半抗原；和d)檢測(cè)與所述二元復(fù)合物結(jié)合的半抗原的存在；其中所述半抗原與所述樣品結(jié)合，即診斷所述患者患有所述疾病。79.—種診斷疾病的方法，所述方法包括a)獲得包含同型二聚體的二元復(fù)合物，所述同型二聚體的每個(gè)第一單體含有與第一前體連接的二聚化和?？拷Y(jié)構(gòu)域(DDD)，所述二元復(fù)合物還包含第二單體，第二單體含有與第二前體連接的錨定結(jié)構(gòu)域(AD),AD與DDD共價(jià)連接，其中第一前體與疾病相關(guān)抗原結(jié)合，第二前體包含可檢測(cè)部分；b)將所述復(fù)合物給予來(lái)自懷疑患有疾病的患者；和c)檢測(cè)所述診斷部分的存在；其中所述診斷部分定位于疾病相關(guān)組織，即i貪斷所述患者患有所述疾病。全文摘要本發(fā)明涉及針對(duì)穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)(stablytetheredstructure)的方法和組合物，所述穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)具有明確的組成及多功能性和/或結(jié)合特異性。具體的實(shí)施方案涉及包含第一單體的同型二聚體和第二單體的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)，其中第一單體包含與第一前體連接的二聚化和停靠結(jié)構(gòu)域(dimerizationanddockingdomain)，第二單體包含與第二前體連接的錨定結(jié)構(gòu)域。第一前體和第二前體實(shí)際上可以是任何分子或結(jié)構(gòu)，例如抗體、抗體片段、抗體類(lèi)似物或模擬物、適體、結(jié)合肽、結(jié)合蛋白的片段、蛋白質(zhì)或其它分子的已知配體、酶、可檢測(cè)標(biāo)記或標(biāo)簽、治療藥、毒素、藥物、細(xì)胞因子、白介素、干擾素、放射性同位素、蛋白質(zhì)、肽、肽模擬物、多核苷酸、RNAi、寡糖、天然或合成聚合物、納米粒、量子點(diǎn)(quantumdot)、有機(jī)或無(wú)機(jī)化合物，等等。本文所公開(kāi)的方法和組合物提供以簡(jiǎn)單易純化方式獲得任何二元化合物(與任何單體化合物相連接)或者任何三元化合物。文檔編號(hào)C07K2/00GK101583376SQ200680019839公開(kāi)日2009年11月18日申請(qǐng)日期2006年3月29日優(yōu)先權(quán)日2005年4月6日發(fā)明者D·M·戈登伯格,E·A·羅西,H·C·錢(qián),W·J·麥布賴(lài)德申請(qǐng)人:Ibc藥品公司