利用分形結(jié)構(gòu)的表面進(jìn)行循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特異性捕獲的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地涉及利用分形結(jié)構(gòu)的表面進(jìn)行循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特異性捕獲的方法。本發(fā)明是在基片的表面制備出分形結(jié)構(gòu)的表面，然后將腫瘤細(xì)胞表面的特異性抗體固定在所述的具有分形結(jié)構(gòu)的表面上后放置在細(xì)胞培養(yǎng)板中，將待測(cè)樣品滴加到所述的腫瘤細(xì)胞表面的特異性抗體的表面上，然后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，由所述的腫瘤細(xì)胞表面的特異性抗體與所述的分形結(jié)構(gòu)的協(xié)同作用，特異性捕獲待測(cè)樣品中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明的基于分形結(jié)構(gòu)的表面的捕獲方法可用于癌癥相關(guān)的細(xì)胞的捕獲。本發(fā)明所述的方法可以有效提高循環(huán)腫瘤細(xì)胞的捕獲效率，成本低廉，操作簡(jiǎn)單，可用于臨床診斷。
【專利說明】利用分形結(jié)構(gòu)的表面進(jìn)行循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特異性捕獲的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地涉及利用分形結(jié)構(gòu)的表面進(jìn)行循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特異性捕獲的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]癌癥是導(dǎo)致人類死亡的第二大殺手。其中90%的死亡是由轉(zhuǎn)移癌引起的。轉(zhuǎn)移癌主要是由從初始癌變位置脫離的癌細(xì)胞引起的，這部分癌細(xì)胞通過血管或者淋巴管擴(kuò)散到機(jī)體的其他組織或者器官，從而形成轉(zhuǎn)移癌。癌細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)是實(shí)現(xiàn)癌癥轉(zhuǎn)移的最初階段，為最終形成腫瘤的轉(zhuǎn)移病灶提供了可能。這部分進(jìn)入人體外周血中的癌細(xì)胞就是循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Circulating Tumor Cells)。通過檢測(cè)外周血中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞可以有效預(yù)測(cè)癌癥轉(zhuǎn)移的發(fā)生、進(jìn)行癌癥的早期診斷、預(yù)測(cè)癌癥病人的生存幾率以及監(jiān)測(cè)治療的效果等。因此，檢測(cè)血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值，循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)對(duì)于癌癥的早期診斷、病情監(jiān)測(cè)、治療預(yù)后等具有重要意義。
[0003]實(shí)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)的前提是對(duì)血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行捕獲與分離。由于其在血液中的數(shù)量很少(每毫升幾個(gè)到幾十個(gè))，循環(huán)腫瘤細(xì)胞的捕獲與分離仍是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。目前，循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲與分離的方法主要是根據(jù)腫瘤細(xì)胞自身特殊的形貌與生物化學(xué)特征進(jìn)行的，比如尺寸，密度和腫瘤細(xì)胞表面特殊表達(dá)的蛋白質(zhì)。現(xiàn)有的捕獲與分離技術(shù)主要包括ISET(Iso lation by size of epithelial tumor cells)技術(shù)(Am J Pathol2000，156，57 - 63)、密度梯度離心技術(shù)(Cytometry2002, 49，150 - 158)和免疫磁性分離技術(shù)(N Engl J Med 2004，351，781-91)。ISET技術(shù)利用腫瘤細(xì)胞與血細(xì)胞尺寸之間的差異進(jìn)行循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分離，但是該技術(shù)分離純度低，難以滿足實(shí)際需求。密度梯度離心技術(shù)則是基于血液中各種細(xì)胞密度的差異，紅細(xì)胞、中性白細(xì)胞等密度較大的細(xì)胞遷移至底部，腫瘤細(xì)胞則仍處于頂部，從而達(dá)到分離的目的。但是該技術(shù)存在的問題同樣是純度較低，而且在處理與轉(zhuǎn)移的過程中會(huì)不可避免地?fù)p失循環(huán)腫瘤細(xì)胞，進(jìn)而影響捕獲效率。免疫磁性分離技術(shù)是目前研究和應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一，其原理是將特異性抗體修飾在磁性顆粒表面，與循環(huán)腫瘤細(xì)胞表面抗原結(jié)合后在磁場(chǎng)作用下實(shí)現(xiàn)捕獲與分離的目的，該技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)較高的捕獲效率，但是由于其過程復(fù)雜、費(fèi)用較高而限制了其應(yīng)用。
[0004]在最新的生物學(xué)研究領(lǐng)域，王樹濤等(Angew.Chem.1nt.Ed., 2009, 48, 8970 -8973)率先將三維納米結(jié)構(gòu)基片應(yīng)用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)領(lǐng)域。該技術(shù)通過增強(qiáng)細(xì)胞表面的納米組分(例如，微絨毛、絲狀偽足等)與三維納米結(jié)構(gòu)之間的相互作用極大地提高了其捕獲效率。隨后，導(dǎo)電聚合物(Adv.Mater.2011,23，4788-4792)、PDMS (Cancer2012，118，1145-54)和 TiO2 納米纖維(Adv.Mater.2012，24，2756-2760)等都用于三維納米結(jié)構(gòu)的構(gòu)建從而增強(qiáng)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的捕獲效率。由于其捕獲效率高、靈敏度高，這一技術(shù)越來越引起科學(xué)家的關(guān)注。但是該技術(shù)存在成本較高、使用不便等缺點(diǎn)，而且該技術(shù)背后的基本設(shè)計(jì)原則尚不清楚。因此，迫切需求一種新的高效率、高特異性的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的捕獲技術(shù)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種利用分形結(jié)構(gòu)的表面進(jìn)行循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特異性捕獲的方法。
[0006]本發(fā)明的利用分形結(jié)構(gòu)的表面進(jìn)行循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特異性捕獲的方法，其基本原理是在基片的表面制備出所需的分形結(jié)構(gòu)的表面，將腫瘤細(xì)胞表面的特異性抗體固定在該具有所需的分形結(jié)構(gòu)的表面上，將待測(cè)樣品滴加到該腫瘤細(xì)胞表面的特異性抗體的表面上，通過待測(cè)樣品中的腫瘤細(xì)胞表面的特異性抗原與固定在該具有所需的分形結(jié)構(gòu)的表面上的腫瘤細(xì)胞表面的特異性抗體之間的特異性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特異性捕獲，通過待測(cè)樣品中的腫瘤細(xì)胞表面的納米組分(例如:微絨毛、絲狀偽足等)與所述基片表面的分形結(jié)構(gòu)之間的相互作用，提高循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特異性捕獲效率，從而達(dá)到高效、高特異性循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲的目的。
[0007]本發(fā)明的利用分形結(jié)構(gòu)的表面進(jìn)行循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特異性捕獲的方法包括以下步驟:
[0008](I)在基片的表面制備出所需的分形結(jié)構(gòu)的表面；
[0009]所述的分形結(jié)構(gòu)選自枝狀分形結(jié)構(gòu)、花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)或海膽狀分形結(jié)構(gòu)中的一種；
[0010](2)將腫瘤細(xì)胞表面的特異性抗體固定在步驟(1)得到的基片上的具有所需的分形結(jié)構(gòu)的表面上，然后放置在細(xì)胞培養(yǎng)板中；
[0011](3)將待測(cè)樣品滴加到步驟(2)得到的基片上的具有所需的分形結(jié)構(gòu)的表面所固定的腫瘤細(xì)胞表面的特異性抗體的表面上，然后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，由所述的腫瘤細(xì)胞表面的特異性抗體與所述的分形結(jié)構(gòu)的協(xié)同作用，特異性捕獲待測(cè)樣品中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞。
`[0012]所述的基片的材料選自導(dǎo)電金屬、導(dǎo)電無機(jī)非金屬、導(dǎo)電無機(jī)非金屬化合物、非導(dǎo)電無機(jī)非金屬化合物和非導(dǎo)電聚合物中的一種。所述的導(dǎo)電金屬選自金、銀、鉬、IE、銅、鐵、鋅和鋁中的一種。所述的導(dǎo)電無機(jī)非金屬是晶體硅。所述的導(dǎo)電無機(jī)非金屬化合物是氧化銦錫(ITO)玻璃。所述的非導(dǎo)電無機(jī)非金屬化合物是石英或普通玻璃。所述的非導(dǎo)電聚合物選自聚二甲基硅氧烷、聚(甲基)丙烯酸酯、聚氨酯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乳酸和聚乙烯醇中的至少一種。
[0013]所述的分形結(jié)構(gòu)的表面的材料選自金屬、金屬化合物、無機(jī)非金屬、無機(jī)非金屬化合物、導(dǎo)電聚合物和非導(dǎo)電聚合物中的一種。所述的金屬選自金、銀、鉬、鈀、銅、鐵、鋅和鋁中的一種。所述的金屬化合物選自氧化銅、氧化鐵、氧化鋅和二氧化鈦中的一種。所述的無機(jī)非金屬是晶體硅。所述的無機(jī)非金屬化合物是石英。所述的導(dǎo)電聚合物選自聚噻吩、聚吡咯、聚苯胺和聚苯中的一種。所述的非導(dǎo)電聚合物選自聚二甲基硅氧烷、聚(甲基)丙烯酸酯、聚氨酯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乳酸和聚乙烯醇中的至少一種。
[0014]所述的在基片的表面制備出所需的分形結(jié)構(gòu)的表面的方法有多種，包括以下所述的方法:
[0015]在導(dǎo)電金屬基片、導(dǎo)電無機(jī)非金屬基片或?qū)щ姛o機(jī)非金屬化合物基片的表面制備出所述的分形結(jié)構(gòu)的表面為金屬材料的，較佳地是采用電化學(xué)沉積的方法進(jìn)行制備，即采用傳統(tǒng)的三電極體系，以鉬絲或鉬片作為對(duì)電極，以銀/氯化銀電極作為參比電極，以所述的導(dǎo)電金屬基片、所述的導(dǎo)電無機(jī)非金屬基片或所述的導(dǎo)電無機(jī)非金屬化合物基片作為工作電極，以氯金酸水溶液、硝酸銀水溶液、氯鉬酸水溶液、氯鈀酸水溶液、硝酸銅水溶液、氯化亞鐵水溶液、硫酸鋅水溶液或硫酸招水溶液等作為電解液(如以金作為基片可采用氯金酸水溶液作為電解液，還可以選擇其它所述的電解液)，通過調(diào)整工作電壓(-0.1V~-0.5V)以及電解液中相應(yīng)酸根離子的濃度(0.01mol/L~2mol/L)，室溫下電化學(xué)沉積20分鐘~180分鐘，即可在所述的導(dǎo)電金屬基片、所述的導(dǎo)電無機(jī)非金屬基片或所述的導(dǎo)電無機(jī)非金屬化合物基片的表面可分別制備出枝狀分形結(jié)構(gòu)的表面、花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的表面或海膽狀分形結(jié)構(gòu)的表面。
[0016]在導(dǎo)電金屬基片、導(dǎo)電無機(jī)非金屬基片或?qū)щ姛o機(jī)非金屬化合物基片的表面制備出所述的分形結(jié)構(gòu)的表面為導(dǎo)電聚合物材料的，對(duì)于以導(dǎo)電聚合物材料為聚噻吩作為分形結(jié)構(gòu)的表面而言，較佳地采用文獻(xiàn)(于偉利，電沉積制備聚噻吩有序微結(jié)構(gòu)及有機(jī)太陽能電池.吉林大學(xué)，2009.)所述的方法，即可在所述的導(dǎo)電金屬基片、所述的導(dǎo)電無機(jī)非金屬基片或所述的導(dǎo)電無機(jī)非金屬化合物基片的表面制備出花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的表面或海膽狀分形結(jié)構(gòu)的表面；對(duì)于以導(dǎo)電聚合物材料為聚吡咯作為分形結(jié)構(gòu)的表面而言，較佳地采用文獻(xiàn)(王杰，電化學(xué)合成聚吡咯膜的電學(xué)性能與應(yīng)用.西安交通大學(xué)，2008.)所述的方法，即 可在所述的導(dǎo)電金屬基片、所述的導(dǎo)電無機(jī)非金屬基片或所述的導(dǎo)電無機(jī)非金屬化合物基片的表面制備出花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的表面或海膽狀分形結(jié)構(gòu)的表面；對(duì)于以導(dǎo)電聚合物材料為聚苯胺作為分形結(jié)構(gòu)的表面而言，較佳地采用文獻(xiàn)(J.Phys.Chem.C 2010, 114, 8062 - 8067)所述的方法，即可在所述的導(dǎo)電金屬基片、所述的導(dǎo)電無機(jī)非金屬基片或所述的導(dǎo)電無機(jī)非金屬化合物基片的表面制備出海膽狀分形結(jié)構(gòu)的表面；對(duì)于以導(dǎo)電聚合物材料為聚苯作為分形結(jié)構(gòu)的表面而言，較佳地采用文獻(xiàn)(科學(xué)通報(bào)，2003，48, 35-37)所述的方法,即可在所述的導(dǎo)電金屬基片、所述的導(dǎo)電無機(jī)非金屬基片或所述的導(dǎo)電無機(jī)非金屬化合物基片的表面制備出海膽狀分形結(jié)構(gòu)的表面。
[0017]在導(dǎo)電無機(jī)非金屬基片、導(dǎo)電無機(jī)非金屬化合物基片或非導(dǎo)電無機(jī)非金屬化合物基片的表面制備出所述的分形結(jié)構(gòu)的表面為金屬化合物材料的，對(duì)于以金屬化合物為氧化銅作為分形結(jié)構(gòu)的表面而言，較佳地采用文獻(xiàn)(陜西師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2009, 37，60-62)所述的方法，即可在所述的導(dǎo)電無機(jī)非金屬基片、所述的導(dǎo)電無機(jī)非金屬化合物基片或所述的非導(dǎo)電無機(jī)非金屬化合物基片的表面制備出花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的表面或海膽狀分形結(jié)構(gòu)的表面；對(duì)于以金屬化合物為氧化鐵作為分形結(jié)構(gòu)的表面而言，較佳地采用文獻(xiàn)(東北師大學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2012，44，155-157)所述的方法，即可在所述的導(dǎo)電無機(jī)非金屬基片、所述的導(dǎo)電無機(jī)非金屬化合物基片或所述的非導(dǎo)電無機(jī)非金屬化合物基片的表面制備出海膽狀分形結(jié)構(gòu)的表面；對(duì)于以金屬化合物為氧化鋅作為分形結(jié)構(gòu)的表面而言，較佳地采用文獻(xiàn)(Adv.Funct.Mater.，2006, 16，335 - 344)所述的方法，即可在所述的導(dǎo)電無機(jī)非金屬基片、所述的導(dǎo)電無機(jī)非金屬化合物基片或所述的非導(dǎo)電無機(jī)非金屬化合物基片的表面制備出枝狀分形結(jié)構(gòu)的表面或海膽狀分形結(jié)構(gòu)的表面；對(duì)于以金屬化合物為二氧化鈦?zhàn)鳛榉中谓Y(jié)構(gòu)的表面而言，較佳地采用文獻(xiàn)(ACS Nano, 2009, 3，1212-1218)所述的方法，即可在所述的導(dǎo)電無機(jī)非金屬基片、所述的導(dǎo)電無機(jī)非金屬化合物基片或所述的非導(dǎo)電無機(jī)非金屬化合物基片的表面制備出枝狀分形結(jié)構(gòu)的表面或海膽狀分形結(jié)構(gòu)的表面。
[0018]在導(dǎo)電無機(jī)非金屬基片的表面制備出所述的分形結(jié)構(gòu)的表面為無機(jī)非金屬材料的(此時(shí)所述的基片是與所述的分形結(jié)構(gòu)的表面的化學(xué)組成一致)，或者在非導(dǎo)電無機(jī)非金屬化合物基片的表面制備出所述的分形結(jié)構(gòu)的表面為無機(jī)非金屬化合物材料的(此時(shí)所述的基片是與所述的分形結(jié)構(gòu)的表面的化學(xué)組成一致)，均較佳地采用文獻(xiàn)(Macromol.RapidCommun.2005, 26, 1805-1809)所述的方法，即可在所述的導(dǎo)電無機(jī)非金屬基片或所述的非導(dǎo)電無機(jī)非金屬化合物基片的表面制備出花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的表面。
[0019]在非導(dǎo)電聚合物基片的表面制備出所述的分形結(jié)構(gòu)的表面為非導(dǎo)電聚合物材料的(此時(shí)所述的基片是與所述的分形結(jié)構(gòu)的表面的化學(xué)組成一致)，采用文獻(xiàn)(Macromol.Rapid Commun.2005, 26，1805 - 1809)所述的方法，即可在所述的非導(dǎo)電聚合物基片的表面制備出花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的表面；采用文獻(xiàn)(Angew.Chem.1nt.Ed.2002, 41，1221-1223)所述的方法，即可在所述的非導(dǎo)電聚合物基片的表面制備出枝狀分形結(jié)構(gòu)的表面。
[0020]所述的將腫瘤細(xì)胞表面的特異性抗體固定在步驟(1)得到的基片上的具有所需的分形結(jié)構(gòu)的表面上的方法有多種，較佳的固定方法可按照如下步驟進(jìn)行固定:
[0021](a)將一端接有功能基團(tuán)的生物素用去離子水稀釋為2mM的水溶液，室溫下，將表面為具有所需的分形結(jié)構(gòu)的表面的基片浸泡在上述一端接有功能基團(tuán)的生物素的濃度為2mM的水溶液中(表面為具有所需的分形結(jié)構(gòu)的表面的基片在使用前用去離子水沖洗干凈；優(yōu)選浸泡的時(shí)間為12小 時(shí)以上);取出表面為具有所需的分形結(jié)構(gòu)的表面的基片，用去離子水洗漆，干燥；
[0022](b)將鏈霉親和素用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋為10 μ g/mL的鏈霉親和素的磷酸鹽溶液，然后將步驟(a)干燥后得到的表面為具有所需的分形結(jié)構(gòu)的表面的基片浸泡在上述10 μ g/mL的鏈霉親和素的磷酸鹽溶液中，室溫下放置(優(yōu)選室溫下放置30分鐘左右)；取出表面具有為具有所需的分形結(jié)構(gòu)的表面的基片，用磷酸鹽緩沖液洗滌；
[0023](c)將腫瘤細(xì)胞表面的特異性抗體(如抗EpCAM抗體)用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋至10μ g/mL，然后滴加到步驟(b)用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后得到的表面為具有所需的分形結(jié)構(gòu)的表面的基片的表面上(如取25 μ L滴加到表面為具有所需的分形結(jié)構(gòu)的表面的基片的表面上(面積為Icm2))，室溫放置(優(yōu)選室溫下放置30分鐘)。
[0024]所述的將腫瘤細(xì)胞表面的特異性抗體固定在步驟(1)得到的基片上的具有所需的分形結(jié)構(gòu)的表面上，其固定在具有所需的分形結(jié)構(gòu)的表面上的腫瘤細(xì)胞表面的特異性抗體的固定量不少于0.1 μ g/cm2。
[0025]所述的分形結(jié)構(gòu)的表面的表征參數(shù)分維的范圍是:2 <分維< 3。
[0026]所述的腫瘤細(xì)胞表面的特異性抗體為抗EpCAM抗體。
[0027]所述的一端接有功能基團(tuán)的生物素、鏈霉親和素以及抗EpCAM抗體均為市售產(chǎn)
品O
[0028]所述的一端接有功能基團(tuán)的生物素中的功能基團(tuán)為巰基，羧基或者氨基中的一種。
[0029]本發(fā)明建立了一種利用分形結(jié)構(gòu)的表面進(jìn)行循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特異性捕獲的方法，此方法(I)證明了分形結(jié)構(gòu)的表面可以實(shí)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的高效捕獲；(2)特異性強(qiáng)，可以捕獲特異性腫瘤細(xì)胞，減少非特異性腫瘤細(xì)胞的粘附。[0030]本發(fā)明的利用分形結(jié)構(gòu)的表面進(jìn)行循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特異性捕獲的方法可用于癌癥相關(guān)的細(xì)胞的捕獲。所述的方法可以有效提高循環(huán)腫瘤細(xì)胞的捕獲效率，成本低廉，操作簡(jiǎn)單，可用于臨床診斷。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0031]圖1a.本發(fā)明實(shí)施例1制備的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的金表面的表面形貌的大面積掃描電鏡照片；圖1b是具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的金表面的單個(gè)顆粒的掃描電鏡的放大照片。
[0032]圖2.本發(fā)明實(shí)施例1的腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體固定在具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的金表面的基片上的過程示意圖。
[0033]圖3.本發(fā)明實(shí)施例1的捕獲效率柱狀圖。
【具體實(shí)施方式】
[0034]下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不應(yīng)用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0035]實(shí)施例1
[0036]本實(shí)施例所制備的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的金表面的分維為2.73 ;以循環(huán)腫瘤細(xì)胞MCF7和Jurkat T為待 捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞為例，對(duì)本發(fā)明的捕獲體系作進(jìn)一步闡述和驗(yàn)證。利用分形結(jié)構(gòu)的表面進(jìn)行循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特異性捕獲的方法包括以下步驟:
[0037](I)采用電化學(xué)沉積的方法，在晶體硅基片的表面制備出具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的金表面
[0038]采用傳統(tǒng)的三電極體系，鉬絲作為對(duì)電極，銀/氯化銀電極作為參比電極，晶體硅基片作為工作電極，氯金酸水溶液(lmg/mL)作為電解液(氯離子濃度為0.01mo/L)，在工作電壓為-0.5V下電化學(xué)沉積20分鐘即在晶體硅基片的表面制備出具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的金表面。表面形貌的大面積掃描電鏡照片如圖1a所示，單個(gè)顆粒的掃描電鏡的放大照片如圖1b所示。
[0039](2)固定過程如圖2所示，將腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體固定在步驟(1)得到的晶體硅基片上的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的金表面上
[0040](a)將一端接有巰基的生物素用去離子水稀釋為2mM的水溶液，室溫下，將具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的金表面的晶體娃基片浸泡在上述一端接有疏基的生物素的濃度為2mM的水溶液中浸泡12小時(shí)(具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的金表面的晶體硅基片在使用前用去離子水沖洗干凈)；取出具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的金表面的晶體硅基片，用去離子水洗滌，干燥；
[0041](b)將鏈霉親和素用磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液稀釋為10 μ g/mL的磷酸鹽溶液，然后將步驟(a)干燥后得到的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的金表面的晶體硅基片浸泡在鏈霉親和素的磷酸鹽溶液中，室溫下放置30分鐘；取出具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的金表面的晶體硅基片，用磷酸鹽緩沖液洗滌；
[0042](c)將腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋至10μ g/mL，然后取25yL滴加到步驟(b)用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后得到的面積為Icm2的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的金表面的晶體硅基片上，室溫放置30分鐘。
[0043](3)準(zhǔn)備待測(cè)樣品[0044]取MCF7細(xì)胞懸浮液20 μ L，用細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)并計(jì)算其濃度，取一定量上述細(xì)胞懸浮液，用細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM稀釋至I X IO5個(gè)細(xì)胞/mL，混合均勻，室溫下保存。
[0045]取Jurkat T細(xì)胞懸浮液20 μ L，用細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)并計(jì)算其濃度，取一定量上述細(xì)胞懸浮液，用細(xì)胞培養(yǎng)基1640稀釋至IXlO5個(gè)細(xì)胞/mL，混合均勻，室溫下保存。[0046](4)捕獲待測(cè)樣品中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞
[0047]分別將步驟(3)混合均勻后得到的細(xì)胞懸浮液3mL滴加到放置在細(xì)胞培養(yǎng)板(直徑3.5cm)中的步驟(2)得到的晶體硅基片上的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的金表面所固定的腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體的表面上(每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)板放置3個(gè)lcm2的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的金表面的晶體硅基片)，然后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，由腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體與枝狀分形結(jié)構(gòu)的協(xié)同作用，特異性捕獲滴加到步驟(2)得到的晶體硅基片上的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的金表面所固定的腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體的表面上的步驟(3)混合均勻后得到的細(xì)胞懸浮液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，捕獲時(shí)間是45分鐘。
[0048]作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)，固定了腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體的平整金表面也進(jìn)行相同的捕獲待測(cè)樣品中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。
[0049](5)捕獲效果的評(píng)價(jià)
[0050]將捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的金表面的晶體硅基片用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，然后用質(zhì)量濃度為4%的多聚甲醛水溶液浸泡20分鐘，質(zhì)量濃度為
0.4%的Triton-X 100水溶液浸泡10分鐘，2 μ g/mL DAPI水溶液浸泡15分鐘，從而達(dá)到染色的目的。用Nikon倒置熒光顯微鏡10倍下分別拍照(每個(gè)捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的金表面的晶體硅基片選取中間部分10個(gè)不同的位置)，并對(duì)捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的金表面的晶體硅基片上所捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算捕獲效率。
[0051]捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的平整金表面也按上述步驟進(jìn)行，并計(jì)算捕獲效率。
[0052]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的金表面的MCF7細(xì)胞的捕獲效率為63.3%，Jurkat T細(xì)胞的捕獲效率僅為1.2% ;對(duì)照實(shí)驗(yàn)中平整金表面的MCF7細(xì)胞的捕獲效率僅為2.8%，Jurkat T細(xì)胞的捕獲效率僅為0.3%，這些數(shù)據(jù)表明該方法可以實(shí)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的高效特異性捕獲。如圖3所示的捕獲效率柱狀圖。
[0053]實(shí)施例2
[0054]本實(shí)施例所制備的具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的金表面的分維為2.54 ;以循環(huán)腫瘤細(xì)胞MCF7和Daudi為待捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞為例，對(duì)本發(fā)明的捕獲體系作進(jìn)一步闡述和驗(yàn)證。利用分形結(jié)構(gòu)的表面進(jìn)行循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特異性捕獲的方法包括以下步驟:
[0055](I)采用電化學(xué)沉積的方法，在氧化銦錫(ΙΤ0)玻璃基片的表面制備出具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的金表面
[0056]采用傳統(tǒng)的三電極體系，鉬片作為對(duì)電極，銀/氯化銀電極作為參比電極，氧化銦錫(ITO)玻璃基片作為工作電極，氯金酸水溶液(lmg/mL)作為電解液(氯離子濃度為
0.9mo/L)，在工作電壓為-0.15V下電化學(xué)沉積90分鐘即可在氧化銦錫(ITO)玻璃基片的表面制備出具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的金表面。
[0057](2)將腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體固定在步驟(1)得到的氧化銦錫(ITO)玻璃基片上的具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的金表面上[0058](a)將一端接有巰基的生物素用去離子水稀釋為2mM的水溶液，室溫下，將具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的金表面的氧化銦錫(ITO)玻璃基片浸泡在上述一端接有巰基的生物素的濃度為2mM的水溶液中浸泡12小時(shí)(具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的金表面的氧化銦錫(ITO)玻璃基片在使用前用去離子水沖洗干凈)；取出具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的金表面的氧化銦錫(ITO)玻璃基片，用去離子水洗滌，干燥；
[0059](b)將鏈霉親和素用磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液稀釋為10 μ g/mL的磷酸鹽溶液，然后將步驟(a)干燥后得到的具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的金表面的氧化銦錫(ITO)玻璃基片浸泡在鏈霉親和素的磷酸鹽溶液中，室溫下放置30分鐘；取出具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的金表面的氧化銦錫(ITO)玻璃基片，用磷酸鹽緩沖液洗滌；
[0060](c)將腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋至10μ g/mL，然后取25 μ L滴加到步驟(b)用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后得到的面積為Icm2的具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的金表面的氧化銦錫(ITO)玻璃基片上，室溫放置30分鐘。
[0061](3)準(zhǔn)備待測(cè)樣品
[0062]取MCF7細(xì)胞懸浮液20 μ L，用細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)并計(jì)算其濃度，取一定量上述細(xì)胞懸浮液，用細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM稀釋至I X IO5個(gè)細(xì)胞/mL，混合均勻，室溫下保存。
[0063]取Daudi細(xì)胞懸浮液20 μ L，用細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)并計(jì)算其濃度，取一定量上述細(xì)胞懸浮液，用細(xì)胞培養(yǎng)基1640稀釋至I X IO5個(gè)細(xì)胞/mL，混合均勻，室溫下保存。
[0064](4)捕獲待測(cè)樣品中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞
[0065]分別將步驟(3)混合均勻后得到的細(xì)胞懸浮液3mL滴加到放置在細(xì)胞培養(yǎng)板(直徑3.5cm)中的步驟(2)得到的`氧化銦錫(ITO)玻璃基片上的具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的金表面所固定的腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體的表面上(每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)板放置3個(gè)Icm2的具有花椰菜狀狀分形結(jié)構(gòu)的金表面的氧化銦錫(ITO)玻璃基片)，然后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，由腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體與花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的協(xié)同作用，特異性捕獲滴加到步驟(2)得到的氧化銦錫(ITO)玻璃基片上的具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的金表面所固定的腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體的表面上的步驟(3)混合均勻后得到的細(xì)胞懸浮液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，捕獲時(shí)間是45分鐘。
[0066]作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)，固定了腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體的平整金表面也進(jìn)行相同的捕獲待測(cè)樣品中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。
[0067](5)捕獲效果的評(píng)價(jià)
[0068]將捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的金表面的氧化銦錫(ITO)玻璃基片上用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，然后用質(zhì)量濃度為4%的多聚甲醛水溶液浸泡20分鐘，質(zhì)量濃度為0.4%的Triton-XlOO水溶液浸泡10分鐘，2 μ g/mLDAPI水溶液浸泡15分鐘，從而達(dá)到染色的目的。用Nikon倒置熒光顯微鏡10倍下分別拍照(每個(gè)捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的金表面的氧化銦錫(ITO)玻璃基片選取中間部分10個(gè)不同的位置)，并對(duì)捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的金表面的氧化銦錫(ITO)玻璃基片上所捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算捕獲效率。
[0069]捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的平整金表面也按上述步驟進(jìn)行，并計(jì)算捕獲效率。
[0070]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的金表面的MCF7細(xì)胞的捕獲效率為35.3%，Daudi細(xì)胞的捕獲效率僅為0.9% ;對(duì)照實(shí)驗(yàn)中平整金表面的MCF7細(xì)胞的捕獲效率僅為2.1%，Daudi細(xì)胞的捕獲效率僅為0.2%，這些數(shù)據(jù)表明該方法可以實(shí)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的高效特異性捕獲。
[0071]實(shí)施例3
[0072]本實(shí)施例所制備的具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的金表面的分維為2.23 ;以循環(huán)腫瘤細(xì)胞MCF7和Jurkat T為待捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞為例，對(duì)本發(fā)明的捕獲體系作進(jìn)一步闡述和驗(yàn)證。利用分形結(jié)構(gòu)的表面進(jìn)行循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特異性捕獲的方法包括以下步驟:
[0073](I)采用電化學(xué)沉積的方法，在金基片的表面制備出具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的金表面
[0074]采用傳統(tǒng)的三電極體系，鉬片作為對(duì)電極，銀/氯化銀電極作為參比電極，金基片作為工作電極，氯金酸水溶液(lmg/mL)作為電解液(氯離子濃度為2mo/L)，在工作電壓為-0.1V下電化學(xué)沉積180分鐘即可在金基片的表面制備出具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的金表面的制備。
[0075](2)將腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體固定在步驟(1)得到的金基片上的具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的金表面 上
[0076](a)將一端接有巰基的生物素用去離子水稀釋為2mM的水溶液，室溫下，將具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的金表面的金基片浸泡在上述一端接有巰基的生物素的濃度為2mM的水溶液中浸泡12小時(shí)(具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的金表面的金基片在使用前用去離子水沖洗干凈)；取出具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的金表面的金基片，用去離子水洗滌，干燥；
[0077](b)將鏈霉親和素用磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液稀釋為10 μ g/mL的磷酸鹽溶液，然后將步驟(a)干燥后得到的具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的金表面的金基片浸泡在鏈霉親和素的磷酸鹽溶液中，室溫下放置30分鐘；取出具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的金表面的金基片，用磷酸鹽緩沖液洗漆;
[0078](c)將腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋至10μ g/mL，然后取25yL滴加到步驟(b)用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后得到的面積為Icm2的具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的金表面的金基片上，室溫放置30分鐘。
[0079](3)準(zhǔn)備待測(cè)樣品
[0080]同實(shí)施例1。
[0081](4)捕獲待測(cè)樣品中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞
[0082]分別將步驟(3)混合均勻后得到的細(xì)胞懸浮液3mL滴加到放置在細(xì)胞培養(yǎng)板(直徑3.5cm)中的步驟(2)得到的金基片上的具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的金表面所固定的腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體的表面上(每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)板放置3個(gè)Icm2的具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的金表面的金基片)，然后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，由腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體與海膽狀分形結(jié)構(gòu)的協(xié)同作用，特異性捕獲滴加到步驟(2)得到的金基片上的具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的金表面所固定的腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體的表面上的步驟(3)混合均勻后得到的細(xì)胞懸浮液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，捕獲時(shí)間是45分鐘。
[0083]作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)，固定了腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體的平整金表面也進(jìn)行相同的捕獲待測(cè)樣品中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。
[0084](5)捕獲效果的評(píng)價(jià)
[0085]將捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的金表面的金基片用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，然后用質(zhì)量濃度為4%的多聚甲醛水溶液浸泡20分鐘，質(zhì)量濃度為0.4%的Triton-XlOO水溶液浸泡10分鐘,2 μ g/mL DAPI水溶液浸泡15分鐘,從而達(dá)到染色的目的。用Nikon倒置熒光顯微鏡10倍下分別拍照(每個(gè)捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的金表面的金基片選取中間部分10個(gè)不同的位置)，并對(duì)捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的金表面的金基片上所捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算捕獲效率。
[0086]捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的平整金表面也按上述步驟進(jìn)行，并計(jì)算捕獲效率。
[0087]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的金表面的MCF7細(xì)胞的捕獲效率為30.9%，Jurkat T細(xì)胞的捕獲效率僅為0.7%;對(duì)照實(shí)驗(yàn)中平整金表面的MCF7細(xì)胞的捕獲效率僅為2.5%，Jurkat T細(xì)胞的捕獲效率僅為0.2%，這些數(shù)據(jù)表明該方法可以實(shí)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的高效特異性捕獲。
[0088]實(shí)施例4
[0089]本實(shí)施例所制備的具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的聚吡咯表面的分維為2.51 ;以循環(huán)腫瘤細(xì)胞MCF7和Daudi為待捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞為例，對(duì)本發(fā)明的捕獲體系作進(jìn)一步闡述和驗(yàn)證。利用分形結(jié)構(gòu)的表面進(jìn)行循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特異性捕獲的方法包括以下步驟:
[0090](I)采用文獻(xiàn)(王杰，電化學(xué)合成聚吡咯膜的電學(xué)性能與應(yīng)用.西安交通大學(xué)，2008.)所述的方法即可在氧化銦錫(ITO)玻璃基片的表面制備出具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的聚吡咯表面。
[0091](2)將腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體固定在步驟(1)得到的氧化銦錫(ITO)玻璃基片上的具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的聚吡咯表面上
[0092](a)將一端接有羧基的生物素用去離子水稀釋為2mM的水溶液，室溫下，將具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的聚吡咯表面的氧化銦錫(ITO)玻璃基片浸泡在上述一端接有羧基的生物素的濃度為2mM的水溶液中浸泡12小時(shí)(具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的聚吡咯表面的氧化銦錫(ITO)玻璃基片在使用前用去離子水沖洗干凈);取出具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的聚吡咯表面的氧化銦錫(ITO)玻璃基片，用去`離子水洗滌，干燥；
[0093](b)將鏈霉親和素用磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液稀釋為10 μ g/mL的磷酸鹽溶液，然后將步驟(a)干燥后得到的具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的聚吡咯表面的氧化銦錫(ITO)玻璃基片浸泡在鏈霉親和素的磷酸鹽溶液中，室溫下放置30分鐘；取出具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的聚吡咯表面的氧化銦錫(ITO)玻璃基片，用磷酸鹽緩沖液洗滌；
[0094](c)將腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋至10μ g/mL，然后取25yL滴加到步驟(b)用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后得到的面積為Icm2的具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的聚吡咯表面的氧化銦錫(ITO)玻璃基片上，室溫放置30分鐘。
[0095](3)準(zhǔn)備待測(cè)樣品
[0096]同實(shí)施例2。
[0097](4)捕獲待測(cè)樣品中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞
[0098]分別將步驟(3)混合均勻后得到的細(xì)胞懸浮液3mL滴加到放置在細(xì)胞培養(yǎng)板(直徑3.5cm)中的步驟(2)得到的氧化銦錫(ITO)玻璃基片上的具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的聚吡咯表面所固定的腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體的表面上(每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿放置3個(gè)Icm2的具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的聚吡咯表面的氧化銦錫(ITO)玻璃基片)，然后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，由腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體與花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的協(xié)同作用，特異性捕獲滴加到步驟(2)得到的氧化銦錫(ITO)玻璃基片上的具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的聚吡咯表面所固定的腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體的表面上的步驟(3)混合均勻后得到的細(xì)胞懸浮液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，捕獲時(shí)間是45分鐘。
[0099]作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)，固定了腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體的平整聚吡咯表面也進(jìn)行相同的捕獲待測(cè)樣品中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。
[0100](5)捕獲效果的評(píng)價(jià)
[0101]將捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的聚吡咯表面的氧化銦錫(ITO)玻璃基片用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，然后用質(zhì)量濃度為4%的多聚甲醛水溶液浸泡20分鐘，質(zhì)量濃度為0.4%的Triton-XlOO水溶液浸泡10分鐘，2 μ g/mL DAPI水溶液浸泡15分鐘，從而達(dá)到染色的目的。用Nikon倒置熒光顯微鏡10倍下分別拍照(每個(gè)捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的聚吡咯表面的氧化銦錫(ΙΤ0)玻璃基片選取中間部分10個(gè)不同的位置)，并對(duì)捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的聚吡咯表面的氧化銦錫(ΙΤ0)玻璃基片上所捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算捕獲效率。
[0102]捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的平整聚吡咯表面也按上述步驟進(jìn)行，并計(jì)算捕獲效率。
[0103]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的聚吡咯表面的MCF7細(xì)胞的捕獲效率為38.8%，Daudi細(xì)胞的捕獲效率僅為0.7% ;對(duì)照實(shí)驗(yàn)中平整聚吡咯表面的MCF7細(xì)胞的捕獲效率僅為2.1%，Daudi細(xì)胞的捕獲效率僅為0.2%，這些數(shù)據(jù)表明該方法可以實(shí)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的高效特異性捕獲。
[0104]實(shí)施例5
[0105]本實(shí)施例所制備的具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的聚苯表面的分維為2.41 ;以循環(huán)腫瘤細(xì)胞MCF7和Daudi為待捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞為例，對(duì)本發(fā)明的捕獲體系作進(jìn)一步闡述和驗(yàn)證。利用分形結(jié)構(gòu)的表面進(jìn)行循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特異性捕獲的方法包括以下步驟:
[0106](1)采用文獻(xiàn)(科學(xué)通報(bào)，2003, 48，35_37)所述的方法即可在氧化銦錫(ITO)玻璃基片的表面制備出具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的聚苯表面。
[0107](2)將腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體固定在步驟(1)得到的氧化銦錫(ITO)玻璃基片上的具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的聚苯表面上
[0108](a)將一端接有羧基的生物素用去離子水稀釋為2mM的水溶液，室溫下，將具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的聚苯表面的氧化銦錫(ITO)玻璃基片浸泡在上述一端接有羧基的生物素的濃度為2mM的水溶液中浸泡12小時(shí)(具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的聚苯表面的氧化銦錫(ITO)玻璃基片在使用前用去離子水沖洗干凈)；取出具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的聚苯表面的氧化銦錫(ITO)玻璃基片，用去離子水洗滌，干燥；
[0109](b)將鏈霉親和素用磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液稀釋為10 μ g/mL的磷酸鹽溶液，然后將步驟(a)干燥后得到的具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的聚苯表面的氧化銦錫(ITO)玻璃基片浸泡在鏈霉親和素的磷酸鹽溶液中，室溫下放置30分鐘；取出具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的聚苯表面的氧化銦錫(ITO)玻璃基片，用磷酸鹽緩沖液洗滌；
[0110](C)將腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋至lOyg/mL，然后取25yL滴加到步驟(b)用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后得到的面積為Icm2的具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的聚苯表面的氧化銦錫(ITO)玻璃基片上，室溫放置30分鐘。
[0111](3)準(zhǔn)備待測(cè)樣品[0112]同實(shí)施例2。
[0113](4)捕獲待測(cè)樣品中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞
[0114]分別將步驟(3)混合均勻后得到的細(xì)胞懸浮液3mL滴加到放置在細(xì)胞培養(yǎng)板(直徑3.5cm)中的步驟(2)得到的氧化銦錫(ITO)玻璃基片上的具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的聚苯表面所固定的腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體的表面上(每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿放置3個(gè)Icm2的具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的聚苯表面的氧化銦錫(ITO)玻璃基片)，然后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，由腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體與海膽狀分形結(jié)構(gòu)的協(xié)同作用，特異性捕獲滴加到步驟(2)得到的氧化銦錫(ITO)玻璃基片上的具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的聚苯表面所固定的腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體的表面上的步驟(3)混合均勻后得到的細(xì)胞懸浮液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，捕獲時(shí)間是45分鐘。
[0115]作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)，固定了腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體的平整聚苯表面也進(jìn)行相同的捕獲待測(cè)樣品中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。
[0116](5)捕獲效果的評(píng)價(jià)
[0117]將捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的聚苯表面的氧化銦錫(ITO)玻璃基片上用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，然后用質(zhì)量濃度為4%的多聚甲醛水溶液浸泡20分鐘，質(zhì)量濃度為0.4%的Triton-XlOO水溶液浸泡10分鐘，2 μ g/mLDAPI水溶液浸泡15分鐘，從而達(dá)到染色的目的。用Nikon倒置熒光顯微鏡10倍下分別拍照(每個(gè)捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的聚苯表面的氧化銦錫(ITO)玻璃基片選取中間部分10個(gè)不同的位置)，并對(duì)捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的聚苯表面的氧化銦錫(ITO)玻璃基片上所捕獲的循 環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算捕獲效率。
[0118]捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的平整聚苯表面也按上述步驟進(jìn)行，并計(jì)算捕獲效率。
[0119]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的聚苯表面的MCF7細(xì)胞的捕獲效率為37.8%, Daudi細(xì)胞的捕獲效率僅為0.5% ;對(duì)照實(shí)驗(yàn)中平整聚苯表面的MCF7細(xì)胞的捕獲效率僅為2.3%，Daudi細(xì)胞的捕獲效率僅為0.3%，這些數(shù)據(jù)表明該方法可以實(shí)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的高效特異性捕獲。
[0120]實(shí)施例6
[0121]本實(shí)施例所制備的具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的聚苯胺表面的分維為2.41 ;以循環(huán)腫瘤細(xì)胞MCF7和Daudi為待捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞為例，對(duì)本發(fā)明的捕獲體系作進(jìn)一步闡述和驗(yàn)證。利用分形結(jié)構(gòu)的表面進(jìn)行循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特異性捕獲的方法包括以下步驟:
[0122](1)采用文獻(xiàn)(1 Phys.Chem.C 2010, 114，8062-8067)所述的方法即可在氧化銦錫(ITO)玻璃基片的表面制備出具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的聚苯胺表面。
[0123](2)將腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體固定在步驟(1)得到的氧化銦錫(ITO)玻璃基片上的具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的聚苯胺表面上
[0124](a)將一端接有羧基的生物素用去離子水稀釋為2mM的水溶液，室溫下，將具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的聚苯胺表面的氧化銦錫(ITO)玻璃基片浸泡在上述一端接有羧基的生物素的濃度為2mM的水溶液中浸泡12小時(shí)(具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的聚苯胺表面的氧化銦錫(ITO)玻璃基片在使用前用去離子水沖洗干凈);取出具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的聚苯胺表面的氧化銦錫(ITO)玻璃基片，用去離子水洗滌，干燥；
[0125](b)將鏈霉親和素用磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液稀釋為10 μ g/mL的磷酸鹽溶液，然后將步驟(a)干燥后得到的具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的聚苯胺表面的氧化銦錫(ITO)玻璃基片浸泡在鏈霉親和素的磷酸鹽溶液中，室溫下放置30分鐘；取出具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的聚苯胺表面的氧化銦錫(ΙΤ0)玻璃基片，用磷酸鹽緩沖液洗滌；
[0126](c)將腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋至10μ g/mL，然后取25yL滴加到步驟(b)用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后得到的面積為Icm2的具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的聚苯胺表面的氧化銦錫(ITO)玻璃基片上，室溫放置30分鐘。
[0127](3)準(zhǔn)備待測(cè)樣品
[0128]同實(shí)施例2。
[0129](4)捕獲待測(cè)樣品中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞
[0130]分別將步驟(3)混合均勻后得到的細(xì)胞懸浮液3mL滴加到放置在細(xì)胞培養(yǎng)板(直徑3.5cm)中的步驟(2)得到的氧化銦錫(ITO)玻璃基片上的具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的聚苯胺表面所固定的腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體的表面上(每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿放置3個(gè)Icm2的具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的聚苯胺表面的氧化銦錫(ITO)玻璃基片)，然后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，由腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體與海膽狀分形結(jié)構(gòu)的協(xié)同作用，特異性捕獲滴加到步驟(2)得到的氧化銦錫(ITO)玻璃基片上的具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的聚苯胺表面所固定的腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體的表面上的步驟(3)混合均勻后得到的細(xì)胞懸浮液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，捕獲時(shí)間是45分鐘。
[0131]作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)，固定了腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體的平整聚苯胺表面也進(jìn)行相同的捕獲待測(cè)樣品中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。
[0132](5)捕獲效果的評(píng)價(jià)
`[0133]將捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的聚苯胺表面的氧化銦錫(ITO)玻璃基片上用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，然后用質(zhì)量濃度為4%的多聚甲醛水溶液浸泡20分鐘，質(zhì)量濃度為0.4%的Triton-XlOO水溶液浸泡10分鐘，2 μ g/mL DAPI水溶液浸泡15分鐘，從而達(dá)到染色的目的。用Nikon倒置熒光顯微鏡10倍下分別拍照(每個(gè)捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的聚苯胺表面的氧化銦錫(ΙΤ0)玻璃基片選取中間部分10個(gè)不同的位置)，并對(duì)捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的聚苯胺表面的氧化銦錫(ΙΤ0)玻璃基片上所捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算捕獲效率。
[0134]捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的平整聚苯胺表面也按上述步驟進(jìn)行，并計(jì)算捕獲效率。
[0135]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的聚苯胺表面的MCF7細(xì)胞的捕獲效率為40.1%，Daudi細(xì)胞的捕獲效率僅為0.9% ;對(duì)照實(shí)驗(yàn)中平整聚苯胺表面的MCF7細(xì)胞的捕獲效率僅為1.8%，Daudi細(xì)胞的捕獲效率僅為1.2%，這些數(shù)據(jù)表明該方法可以實(shí)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的高效特異性捕獲。
[0136]實(shí)施例7
[0137]本實(shí)施例所制備的具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的聚噻吩表面的分維為2.51 ;以循環(huán)腫瘤細(xì)胞MCF7和Daudi為待捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞為例，對(duì)本發(fā)明的捕獲體系作進(jìn)一步闡述和驗(yàn)證。利用分形結(jié)構(gòu)的表面進(jìn)行循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特異性捕獲的方法包括以下步驟:
[0138](I)采用文獻(xiàn)(于偉利，電沉積制備聚噻吩有序微結(jié)構(gòu)及有機(jī)太陽能電池.吉林大學(xué)，2009.)所述的方法即可在金基片的表面制備出具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的聚噻吩表面。
[0139](2)將腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體固定在步驟(1)得到的金基片上的具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的聚噻吩表面上
[0140](a)將一端接有羧基的生物素用去離子水稀釋為2mM的水溶液，室溫下，將具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的聚噻吩表面的金基片浸泡在上述一端接有羧基的生物素的濃度為2mM的水溶液中浸泡12小時(shí)(具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的聚噻吩表面的金基片在使用前用去離子水沖洗干凈)；取出具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的聚噻吩表面的金基片，用去離子水洗滌，干燥；
[0141](b)將鏈霉親和素用磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液稀釋為10 μ g/mL的磷酸鹽溶液，然后將步驟(a)干燥后得到的具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的聚噻吩表面的金基片浸泡在鏈霉親和素的磷酸鹽溶液中，室溫下放置30分鐘；取出具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的聚噻吩表面的金基片，用磷酸鹽緩沖液洗滌；
[0142](c)將腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋至10μ g/mL，然后取25yL滴加到步驟(b)用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后得到的面積為Icm2的具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的聚噻吩表面的金基片上，室溫放置30分鐘。
[0143](3)準(zhǔn)備待測(cè)樣品
[0144]同實(shí)施例2。
[0145](4)捕獲待測(cè)樣品中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞
[0146]分別將步驟(3)混合均勻后得到的細(xì)胞懸浮液3mL滴加到放置在細(xì)胞培養(yǎng)板(直徑3.5cm)中的步驟(2)得到 的金基片上的具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的聚噻吩表面所固定的腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體的表面上(每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿放置3個(gè)Icm2的具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的聚噻吩表面的金基片)，然后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，由腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體與花椰菜狀狀分形結(jié)構(gòu)的協(xié)同作用，特異性捕獲滴加到步驟(2)得到的金基片上的具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的聚噻吩表面所固定的腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體的表面上的步驟(3)混合均勻后得到的細(xì)胞懸浮液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，捕獲時(shí)間是45分鐘。
[0147]作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)，固定了腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體的平整聚噻吩表面也進(jìn)行相同的捕獲待測(cè)樣品中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。
[0148](5)捕獲效果的評(píng)價(jià)
[0149]將捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的聚噻吩表面的金基片上用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，然后用質(zhì)量濃度為4%的多聚甲醛水溶液浸泡20分鐘，質(zhì)量濃度為0.4%的Triton-XlOO水溶液浸泡10分鐘,2 μ g/mL DAPI水溶液浸泡15分鐘,從而達(dá)到染色的目的。用Nikon倒置熒光顯微鏡10倍下分別拍照(每個(gè)捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的聚噻吩表面的金基片選取中間部分10個(gè)不同的位置)，并對(duì)捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的聚噻吩表面的金基片上所捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算捕獲效率。
[0150]捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的平整聚噻吩表面也按上述步驟進(jìn)行，并計(jì)算捕獲效率。
[0151]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的聚噻吩表面的MCF7細(xì)胞的捕獲效率為39.8%，Daudi細(xì)胞的捕獲效率僅為0.9% ;對(duì)照實(shí)驗(yàn)中平整聚噻吩表面的MCF7細(xì)胞的捕獲效率僅為2.3%，Daudi細(xì)胞的捕獲效率僅為0.8%，這些數(shù)據(jù)表明該方法可以實(shí)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的高效特異性捕獲。
[0152]實(shí)施例8[0153]本實(shí)施例所制備的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的氧化鋅表面的分維為2.81 ;以循環(huán)腫瘤細(xì)胞MCF7和Jurkat T為待捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞為例，對(duì)本發(fā)明的捕獲體系作進(jìn)一步闡述和驗(yàn)證。利用分形結(jié)構(gòu)的表面進(jìn)行循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特異性捕獲的方法包括以下步驟:
[0154](I)采用文獻(xiàn)(Adv.Funct.Mater.，2006, 16，335 - 344)所述的方法即可在普通玻璃基片的表面制備出具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的氧化鋅表面。
[0155](2)將腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體固定在步驟(1)得到的普通玻璃基片上的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的氧化鋅表面上
[0156](a)將一端接有羧基的生物素用去離子水稀釋為2mM的水溶液，室溫下，將具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的氧化鋅表面的普通玻璃基片浸泡在上述一端接有羧基的生物素的濃度為2mM的水溶液中浸泡12小時(shí)(具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的氧化鋅表面的普通玻璃基片在使用前用去離子水沖洗干凈)；取出具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的氧化鋅表面的普通玻璃基片，用去離子水洗滌，干燥；
[0157](b )將鏈霉親和素用磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液稀釋為10 μ g/mL的磷酸鹽溶液，然后將步驟(a)干燥后得到的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的氧化鋅表面的普通玻璃基片浸泡在鏈霉親和素的磷酸鹽溶液中，室溫下放置30分鐘；取出具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的氧化鋅表面的普通玻璃基片，用磷酸鹽緩沖液洗滌；
[0158](c)將腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋至10μ g/mL，然后取25yL滴加到步驟(b)用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后得到的面積為Icm2的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的氧化鋅表面的普通玻璃基片上，室溫放置30分鐘。
[0159](3)準(zhǔn)備待測(cè)樣品
[0160]同實(shí)施例1。
[0161](4)捕獲待測(cè)樣品中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞
[0162]分別將步驟(3)混合均勻后得到的細(xì)胞懸浮液3mL滴加到放置在細(xì)胞培養(yǎng)板(直徑3.5cm)中的步驟(2)得到的普通玻璃基片上的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的氧化鋅表面所固定的腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體的表面上(每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)板放置3個(gè)Icm2的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的氧化鋅表面的普通玻璃基片)，然后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，由腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體與枝狀分形結(jié)構(gòu)的協(xié)同作用，特異性捕獲滴加到步驟(2)得到的普通玻璃基片上的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的氧化鋅表面所固定的腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體的表面上的步驟(3)混合均勻后得到的細(xì)胞懸浮液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，捕獲時(shí)間是45分鐘。
[0163]作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)，固定了腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體的平整氧化鋅表面也進(jìn)行相同的捕獲待測(cè)樣品中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。
[0164](5)捕獲效果的評(píng)價(jià)
[0165]將捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的氧化鋅表面的普通玻璃基片用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，然后用質(zhì)量濃度為4%的多聚甲醛水溶液浸泡20分鐘，質(zhì)量濃度為0.4%的Triton-XlOO水溶液浸泡10分鐘,2 μ g/mL DAPI水溶液浸泡15分鐘,從而達(dá)到染色的目的。用Nikon倒置熒光顯微鏡10倍下分別拍照(每個(gè)捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的氧化鋅表面的普通玻璃基片選取中間部分10個(gè)不同的位置)，并對(duì)捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的氧化鋅表面的普通玻璃基片上所捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算捕獲效率。[0166]捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的平整氧化鋅表面也按上述步驟進(jìn)行，并計(jì)算捕獲效率。
[0167]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的氧化鋅表面的MCF7細(xì)胞的捕獲效率為65.3%，Jurkat T細(xì)胞的捕獲效率僅為1.1% ;對(duì)照實(shí)驗(yàn)中平整氧化鋅表面的MCF7細(xì)胞的捕獲效率僅為2.4%, Jurkat T細(xì)胞的捕獲效率僅為1.3%，這些數(shù)據(jù)表明該方法可以實(shí)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的高效特異性捕獲。
[0168]實(shí)施例9
[0169]本實(shí)施例所制備的具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的氧化銅表面的分維為2.21 ;以循環(huán)腫瘤細(xì)胞MCF7和Jurkat T為待捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞為例，對(duì)本發(fā)明的捕獲體系作進(jìn)一步闡述和驗(yàn)證。利用分形結(jié)構(gòu)的表面進(jìn)行循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特異性捕獲的方法包括以下步驟:
[0170](I)采用文獻(xiàn)(陜西師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2009，37，60-62)所述的方法即可在普通玻璃基片的表面制備出具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的氧化銅表面。
[0171](2)將腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體固定在步驟(1)得到的普通玻璃基片上的具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的氧化銅表面上
[0172](a)將一端接有羧基的生物素用去離子水稀釋為2mM的水溶液，室溫下，將具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的氧化銅表面的普通玻璃基片浸泡在上述一端接有羧基的生物素的濃度為2mM的水溶液中浸泡12小時(shí)(具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的氧化銅表面的普通玻璃基片在使用前用去離子水沖洗干凈)；取出具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的氧化銅表面的普通玻璃基片，用去離子水洗漆，干燥；
[0173](b)將鏈霉親和素用磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液稀釋為10 μ g/mL的磷酸鹽溶液，然后將步驟(a)干燥后得到的具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的氧化銅表面的普通玻璃基片浸泡在鏈霉親和素的磷酸鹽溶液中，室溫下放置30分鐘；取出具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的氧化銅表面的普通玻璃基片，用磷酸鹽緩沖液洗滌；
`[0174](c)將腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋至10μ g/mL，然后取25yL滴加到步驟(b)用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后得到的面積為Icm2的具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的氧化銅表面的普通玻璃基片上，室溫放置30分鐘。
[0175](3)準(zhǔn)備待測(cè)樣品
[0176]同實(shí)施例1。
[0177](4)捕獲待測(cè)樣品中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞
[0178]分別將步驟(3)混合均勻后得到的細(xì)胞懸浮液3mL滴加到放置在細(xì)胞培養(yǎng)板(直徑3.5cm)中的步驟(2)得到的普通玻璃基片上的具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的氧化銅表面所固定的腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體的表面上(每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)板放置3個(gè)Icm2的具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的氧化銅表面的普通玻璃基片)，然后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，由腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體與海膽狀分形結(jié)構(gòu)的協(xié)同作用，特異性捕獲滴加到步驟(2)得到的普通玻璃基片上的具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的氧化銅表面所固定的腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體的表面上的步驟(3)混合均勻后得到的細(xì)胞懸浮液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，捕獲時(shí)間是45分鐘。
[0179]作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)，固定了腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體的平整氧化銅表面也進(jìn)行相同的捕獲待測(cè)樣品中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。
[0180](5)捕獲效果的評(píng)價(jià)
[0181]將捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的氧化銅表面的普通玻璃基片用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，然后用質(zhì)量濃度為4%的多聚甲醛水溶液浸泡20分鐘，質(zhì)量濃度為0.4%的Triton-XlOO水溶液浸泡10分鐘,2 μ g/mL DAPI水溶液浸泡15分鐘,從而達(dá)到染色的目的。用Nikon倒置熒光顯微鏡10倍下分別拍照(每個(gè)捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的氧化銅表面的普通玻璃基片選取中間部分10個(gè)不同的位置)，并對(duì)捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的氧化銅表面的普通玻璃基片上所捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算捕獲效率。
[0182]捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的平整氧化銅表面也按上述步驟進(jìn)行，并計(jì)算捕獲效率。
[0183]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的氧化銅表面的MCF7細(xì)胞的捕獲效率為35.3%，Jurkat T細(xì)胞的捕獲效率僅為1.4% ;對(duì)照實(shí)驗(yàn)中平整氧化銅表面的MCF7細(xì)胞的捕獲效率僅為2.4%, Jurkat T細(xì)胞的捕獲效率僅為1.3%，這些數(shù)據(jù)表明該方法可以實(shí)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的高效特異性捕獲。
[0184]實(shí)施例10
[0185]本實(shí)施例所制備的具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的氧化鐵表面的分維為2.23 ;以循環(huán)腫瘤細(xì)胞MCF7和Jmkat T為待捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞為例，對(duì)本發(fā)明的捕獲體系作進(jìn)一步闡述和驗(yàn)證。利用分形結(jié)構(gòu)的表面進(jìn)行循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特異性捕獲的方法包括以下步驟:
[0186](I)采用文獻(xiàn)(東北師大學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2012，44，155-157)所述的方法即可在普通玻璃基片的表面制備出具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的氧化鐵表面。
[0187](2)將腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體固定在步驟(1)得到的普通玻璃基片上的具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的氧化鐵表面上
[0188](a)將一端接有羧基的生物素用去離子水稀釋為2mM的水溶液，室溫下，將具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的氧化鐵表面的`普通玻璃基片浸泡在上述一端接有羧基的生物素的濃度為2mM的水溶液中浸泡12小時(shí)(具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的氧化鐵表面的普通玻璃基片在使用前用去離子水沖洗干凈)；取出具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的氧化鐵表面的普通玻璃基片，用去離子水洗漆，干燥；
[0189](b)將鏈霉親和素用磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液稀釋為10 μ g/mL的磷酸鹽溶液，然后將步驟(a)干燥后得到的具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的氧化鐵表面的普通玻璃基片浸泡在鏈霉親和素的磷酸鹽溶液中，室溫下放置30分鐘；取出具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的氧化鐵表面的普通玻璃基片，用磷酸鹽緩沖液洗滌；
[0190](c)將腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋至10μ g/mL，然后取25yL滴加到步驟(b)用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后得到的面積為Icm2的具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的氧化鐵表面的普通玻璃基片上，室溫放置30分鐘。
[0191](3)準(zhǔn)備待測(cè)樣品
[0192]同實(shí)施例1。
[0193](4)捕獲待測(cè)樣品中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞
[0194]分別將步驟(3)混合均勻后得到的細(xì)胞懸浮液3mL滴加到放置在細(xì)胞培養(yǎng)板(直徑3.5cm)中的步驟(2)得到的普通玻璃基片上的具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的氧化鐵表面所固定的腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體的表面上(每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)板放置3個(gè)Icm2的具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的氧化鐵表面的普通玻璃基片)，然后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，由腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體與海膽狀分形結(jié)構(gòu)的協(xié)同作用，特異性捕獲滴加到步驟(2)得到的普通玻璃基片上的具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的氧化鐵表面所固定的腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體的表面上的步驟(3)混合均勻后得到的細(xì)胞懸浮液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，捕獲時(shí)間是45分鐘。
[0195]作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)，固定了腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體的平整氧化鐵表面也進(jìn)行相同的捕獲待測(cè)樣品中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。
[0196](5)捕獲效果的評(píng)價(jià)
[0197]將捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的氧化鐵表面的普通玻璃基片用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，然后用質(zhì)量濃度為4%的多聚甲醛水溶液浸泡20分鐘，質(zhì)量濃度為0.4%的Triton-XlOO水溶液浸泡10分鐘,2 μ g/mL DAPI水溶液浸泡15分鐘,從而達(dá)到染色的目的。用Nikon倒置熒光顯微鏡10倍下分別拍照(每個(gè)捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的氧化鐵表面的普通玻璃基片選取中間部分10個(gè)不同的位置)，并對(duì)捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的氧化鐵表面的普通玻璃基片上所捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算捕獲效率。
[0198]捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的平整氧化鐵表面也按上述步驟進(jìn)行，并計(jì)算捕獲效率。
[0199]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該具有海膽狀分形結(jié)構(gòu)的氧化鐵表面的MCF7細(xì)胞的捕獲效率為29.3%，Jurkat T細(xì)胞的捕獲效率僅為1.5% ;對(duì)照實(shí)驗(yàn)中平整氧化鐵表面的MCF7細(xì)胞的捕獲效率僅為2.1%，Jmkat T細(xì)胞的捕獲效率僅為0.3%，這些數(shù)據(jù)表明該方法可以實(shí)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的高效特異性捕獲。
[0200]實(shí)施例11 [0201]本實(shí)施例所制備的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的二氧化鈦表面的分維為2.83 ;以循環(huán)腫瘤細(xì)胞MCF7和Jurkat T為待捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞為例，對(duì)本發(fā)明的捕獲體系作進(jìn)一步闡述和驗(yàn)證。利用分形結(jié)構(gòu)的表面進(jìn)行循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特異性捕獲的方法包括以下步驟:
[0202](I)采用文獻(xiàn)(ACS Nano, 2009, 3，1212 - 1218)所述的方法即可在普通玻璃基片的表面制備出具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的二氧化鈦表面。
[0203](2)將腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體固定在步驟(1)得到的普通玻璃基片上的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的二氧化鈦表面的基片上
[0204](a)將一端接有羧基的生物素用去離子水稀釋為2mM的水溶液，室溫下，將具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的二氧化鈦表面的普通玻璃基片浸泡在上述一端接有羧基的生物素的濃度為2mM的水溶液中浸泡12小時(shí)(具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的二氧化鈦表面的普通玻璃基片在使用前用去離子水沖洗干凈)；取出具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的二氧化鈦表面的普通玻璃基片，用去離子水洗漆，干燥；
[0205](b)將鏈霉親和素用磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液稀釋為10 μ g/mL的磷酸鹽溶液，然后將步驟(a)干燥后得到的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的二氧化鈦表面的普通玻璃基片浸泡在鏈霉親和素的磷酸鹽溶液中，室溫下放置30分鐘；取出具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的二氧化鈦表面的普通玻璃基片，用磷酸鹽緩沖液洗滌；
[0206](c)將腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋至10μ g/mL，然后取25yL滴加到步驟(b)用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后得到的面積為Icm2的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的二氧化鈦表面的普通玻璃基片上，室溫放置30分鐘。
[0207](3)準(zhǔn)備待測(cè)樣品
[0208]同實(shí)施例1。[0209](4)捕獲待測(cè)樣品中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞
[0210]分別將步驟(3)混合均勻后得到的細(xì)胞懸浮液3mL滴加到放置在細(xì)胞培養(yǎng)板(直徑3.5cm)中的步驟(2)得到的普通玻璃基片上的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的二氧化鈦表面所固定的腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體的表面上(每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)板放置3個(gè)Icm2的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的二氧化鈦表面的普通玻璃基片)，然后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，由腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體與枝狀分形結(jié)構(gòu)的協(xié)同作用，特異性捕獲滴加到步驟(2)得到的普通玻璃基片上的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的二氧化鈦表面所固定的腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體的表面上的步驟(3)混合均勻后得到的細(xì)胞懸浮液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，捕獲時(shí)間是45分鐘。
[0211]作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)，固定了腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體的平整二氧化鈦表面也進(jìn)行相同的捕獲待測(cè)樣品中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。
[0212](5)捕獲效果的評(píng)價(jià)
[0213]將捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的二氧化鈦表面的普通玻璃基片用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，然后用質(zhì)量濃度為4%的多聚甲醛水溶液浸泡20分鐘，質(zhì)量濃度為0.4%的Triton-XlOO水溶液浸泡10分鐘,2 μ g/mL DAPI水溶液浸泡15分鐘,從而達(dá)到染色的目的。用Nikon倒置熒光顯微鏡10倍下分別拍照(每個(gè)捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的二氧化鈦表面的普通玻璃基片選取中間部分10個(gè)不同的位置)，并對(duì)捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的二氧化鈦表面的普通玻璃基片上所捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算捕獲效率。
[0214]捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的平整二氧化鈦表面也按上述步驟進(jìn)行，并計(jì)算捕獲效率。
[0215]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的二氧化鈦表面的MCF7細(xì)胞的捕獲效率為69.3%，Jurkat T細(xì)胞的捕獲效率僅為1.9% ;對(duì)照實(shí)驗(yàn)中平整二氧化鈦表面的MCF7細(xì)胞的捕獲效率僅為2.1%, Jurkat T細(xì)胞的捕獲效率僅為0.6%，這些數(shù)據(jù)表明該方法可以實(shí)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的高效特異性捕獲。
[0216]實(shí)施例12
[0217]本實(shí)施例所制備的具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的晶體硅表面的分維為2.51 ;以循環(huán)腫瘤細(xì)胞MCF7和Daudi為待捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞為例，對(duì)本發(fā)明的捕獲體系作進(jìn)一步闡述和驗(yàn)證。利用分形結(jié)構(gòu)的表面進(jìn)行循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特異性捕獲的方法包括以下步驟:
[0218](I)采用文獻(xiàn)(Macromol.Rapid Commun.2005, 26，1805 - 1809)所述的方法即可在晶體硅基片的表面制備出具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的晶體硅表面。
[0219](2)將腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體固定在步驟(1)得到的晶體硅基片上的具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的晶體硅表面上
[0220](a)將一端接有羧基的生物素用去離子水稀釋為2mM的水溶液，室溫下，將具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的晶體硅表面的晶體硅基片浸泡在上述一端接有羧基的生物素的濃度為2mM的水溶液中浸泡12小時(shí)(具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的晶體硅表面的晶體硅基片在使用前用去離子水沖洗干凈)；取出具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的晶體硅表面的晶體硅基片，用去離子水洗漆，干燥；
[0221](b)將鏈霉親和素用磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液稀釋為10 μ g/mL的磷酸鹽溶液，然后將步驟(a)干燥后得到的具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的晶體硅表面的晶體硅基片浸泡在鏈霉親和素的磷酸鹽溶液中，室溫下放置30分鐘；取出具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的晶體硅表面的晶體硅基片，用磷酸鹽緩沖液洗滌；
[0222](c)將腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋至10μ g/mL，然后取25yL滴加到步驟(b)用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后得到的面積為Icm2的具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的晶體硅表面的晶體硅基片上，室溫放置30分鐘。
[0223](3)準(zhǔn)備待測(cè)樣品
[0224]同實(shí)施例2。
[0225](4)捕獲待測(cè)樣品中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞
[0226]分別將步驟(3)混合均勻后得到的細(xì)胞懸浮液3mL滴加到放置在細(xì)胞培養(yǎng)板(直徑3.5cm)中的步驟(2)得到的晶體硅基片上的具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的晶體硅表面所固定的腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體的表面上(每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)板放置3個(gè)Icm2的具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的晶體硅表面的晶體硅基片)，然后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，由腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體與花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的協(xié)同作用，特異性捕獲滴加到步驟(2)得到的晶體硅基片上的具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的晶體硅表面所固定的腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體的表面上的步驟(3)混合均勻后得到的細(xì)胞懸浮液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，捕獲時(shí)間是45分鐘。
[0227]作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)，固定了腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體的平整晶體硅表面也進(jìn)行相同的捕獲待測(cè)樣品中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。
[0228](5)捕獲效果的評(píng)價(jià)
[0229]將捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的晶體硅表面的晶體硅基片用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗 3次，然后用質(zhì)量濃度為4%的多聚甲醛水溶液浸泡20分鐘，質(zhì)量濃度為0.4%的Triton-XlOO水溶液浸泡10分鐘,2 μ g/mL DAPI水溶液浸泡15分鐘,從而達(dá)到染色的目的。用Nikon倒置熒光顯微鏡10倍下分別拍照(每個(gè)捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的晶體硅表面的晶體硅基片選取中間部分10個(gè)不同的位置)，并對(duì)捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的晶體硅表面的晶體硅基片上所捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算捕獲效率。
[0230]捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的平整晶體硅表面也按上述步驟進(jìn)行，并計(jì)算捕獲效率。
[0231]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的晶體硅表面的MCF7細(xì)胞的捕獲效率為41.3%，Daudi細(xì)胞的捕獲效率僅為1.5% ;對(duì)照實(shí)驗(yàn)中平整金表面的MCF7細(xì)胞的捕獲效率僅為2.6%，Daudi細(xì)胞的捕獲效率僅為0.7%，這些數(shù)據(jù)表明該方法可以實(shí)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的高效特異性捕獲。
[0232]實(shí)施例13
[0233]本實(shí)施例所制備的具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的石英表面的分維為2.57 ;以循環(huán)腫瘤細(xì)胞MCF7和Daudi為待捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞為例，對(duì)本發(fā)明的捕獲體系作進(jìn)一步闡述和驗(yàn)證。利用分形結(jié)構(gòu)的表面進(jìn)行循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特異性捕獲的方法包括以下步驟:
[0234](I)采用文獻(xiàn)(Macromol.Rapid Commun.2005, 26，1805 - 1809)所述的方法即可在石英基片的表面制備出具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的石英表面。
[0235](2)將腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體固定在步驟(1)得到的石英基片上的具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的石英表面上
[0236](a)將一端接有羧基的生物素用去離子水稀釋為2mM的水溶液，室溫下，將具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的石英表面的石英基片浸泡在上述一端接有羧基的生物素的濃度為2mM的水溶液中浸泡12小時(shí)(具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的石英表面的石英基片在使用前用去離子水沖洗干凈)；取出具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的石英表面的石英基片，用去離子水洗滌，干燥；
[0237](b)將鏈霉親和素用磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液稀釋為10 μ g/mL的磷酸鹽溶液，然后將步驟(a)干燥后得到的具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的石英表面的石英基片浸泡在鏈霉親和素的磷酸鹽溶液中，室溫下放置30分鐘；取出具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的石英表面的石英基片，用磷酸鹽緩沖液洗滌；
[0238](c)將腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋至10μ g/mL，然后取25yL滴加到步驟(b)用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后得到的面積為Icm2的具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的石英表面的石英基片上，室溫放置30分鐘。
[0239](3)準(zhǔn)備待測(cè)樣品
[0240]同實(shí)施例2。
[0241](4)捕獲待測(cè)樣品中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞
[0242]分別將步驟(3)混合均勻后得到的細(xì)胞懸浮液3mL滴加到放置在細(xì)胞培養(yǎng)板(直徑3.5cm)中的步驟(2)得到的石英基片上的具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的石英表面所固定的腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體的表面上(每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿放置3個(gè)Icm2的具有花椰菜狀狀分形結(jié)構(gòu)的金表面的石英基片)，然后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，由腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體與花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的協(xié)同作用，特異性捕獲滴加到步驟(2)得到的石英基片上的具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的石英表面所固定的腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體的表面上的步驟(3)混合均勻后得到的細(xì)胞懸浮液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，捕獲時(shí)間是45分鐘。
[0243]作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)，固定了腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體的平整石英表面也進(jìn)行相同的捕獲待測(cè)樣品中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。
[0244](5)捕獲效果的評(píng)價(jià)`
[0245]將捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的石英表面的石英基片上用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，然后用質(zhì)量濃度為4%的多聚甲醛水溶液浸泡20分鐘，質(zhì)量濃度為0.4%的Triton-XlOO水溶液浸泡10分鐘,2 μ g/mL DAPI水溶液浸泡15分鐘,從而達(dá)到染色的目的。用Nikon倒置熒光顯微鏡10倍下分別拍照(每個(gè)捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的石英表面的石英基片選取中間部分10個(gè)不同的位置)，并對(duì)捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的石英表面的石英基片上所捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算捕獲效率。
[0246]捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的平整石英表面也按上述步驟進(jìn)行，并計(jì)算捕獲效率。
[0247]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該具有花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)的石英表面的MCF7細(xì)胞的捕獲效率為51.7%，Daudi細(xì)胞的捕獲效率僅為1.9% ;對(duì)照實(shí)驗(yàn)中平整石英表面的MCF7細(xì)胞的捕獲效率僅為2.4%，Daudi細(xì)胞的捕獲效率僅為1.2%，這些數(shù)據(jù)表明該方法可以實(shí)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的高效特異性捕獲。
[0248]實(shí)施例14
[0249]本實(shí)施例所制備的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的聚乙烯醇表面的分維為2.81 ;以循環(huán)腫瘤細(xì)胞MCF7和Jurkat T為待捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞為例，對(duì)本發(fā)明的捕獲體系作進(jìn)一步闡述和驗(yàn)證。利用分形結(jié)構(gòu)的表面進(jìn)行循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特異性捕獲的方法包括以下步驟:[0250](I)采用文獻(xiàn)(Angew.Chem.1nt.Ed.2002, 41，1221-1223)所述的方法即可在聚乙烯醇基片的表面制備出具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的聚乙烯醇表面。
[0251](2)將腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體固定在步驟(1)得到的聚乙烯醇基片上的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的聚乙烯醇表面上
[0252](a)將一端接有氨基的生物素用去離子水稀釋為2mM的水溶液，室溫下，將具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的聚乙烯醇表面的聚乙烯醇基片浸泡在上述一端接有氨基的生物素的濃度為2mM的水溶液中浸泡12小時(shí)(具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的聚乙烯醇表面的聚乙烯醇基片在使用前用去離子水沖洗干凈)；取出具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的聚乙烯醇表面的聚乙烯醇基片，用去離子水洗漆，干燥；
[0253](b)將鏈霉親和素用磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液稀釋為10 μ g/mL的磷酸鹽溶液，然后將步驟(a)干燥后得到的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的聚乙烯醇表面的聚乙烯醇基片浸泡在鏈霉親和素的磷酸鹽溶液中，室溫下放置30分鐘；取出具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的聚乙烯醇表面的聚乙烯醇基片，用磷酸鹽緩沖液洗滌；
[0254](c)將腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋至10μ g/mL，然后取25yL滴加到步驟(b)用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后得到的面積為Icm2的的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的聚乙烯醇表面的聚乙烯醇基片上，室溫放置30分鐘。
[0255](3)準(zhǔn)備待測(cè)樣品
[0256]同實(shí)施例1。
[0257](4)捕獲待 測(cè)樣品中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞
[0258]分別將步驟(3)混合均勻后得到的細(xì)胞懸浮液3mL滴加到放置在細(xì)胞培養(yǎng)板(直徑3.5cm)中的步驟(2)得到的聚乙烯醇基片上的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的聚乙烯醇表面所固定的腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體的表面上(每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)板放置3個(gè)Icm2的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的聚乙烯醇表面的聚乙烯醇基片)，然后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，由腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體與枝狀分形結(jié)構(gòu)的協(xié)同作用，特異性捕獲滴加到步驟(2)得到的聚乙烯醇基片上的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的聚乙烯醇表面所固定的腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體的表面上的步驟(3)混合均勻后得到的細(xì)胞懸浮液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，捕獲時(shí)間是45分鐘。
[0259]作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)，固定了腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體的平整聚乙烯醇表面也進(jìn)行相同的捕獲待測(cè)樣品中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。
[0260](5)捕獲效果的評(píng)價(jià)
[0261]將捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的聚乙烯醇表面的聚乙烯醇基片用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，然后用質(zhì)量濃度為4%的多聚甲醛水溶液浸泡20分鐘，質(zhì)量濃度為0.4%的Triton-XlOO水溶液浸泡10分鐘,2 μ g/mL DAPI水溶液浸泡15分鐘,從而達(dá)到染色的目的。用Nikon倒置熒光顯微鏡10倍下分別拍照(每個(gè)捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的聚乙烯醇表面的聚乙烯醇基片選取中間部分10個(gè)不同的位置)，并對(duì)捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的聚乙烯醇表面的聚乙烯醇基片上所捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算捕獲效率。
[0262]捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的平整聚乙烯醇表面也按上述步驟進(jìn)行，并計(jì)算捕獲效率。
[0263]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的聚乙烯醇表面的MCF7細(xì)胞的捕獲效率為71.5%，Jurkat T細(xì)胞的捕獲效率僅為1.5% ;對(duì)照實(shí)驗(yàn)中平整聚乙烯醇表面的MCF7細(xì)胞的捕獲效率僅為2.5%, Jurkat T細(xì)胞的捕獲效率僅為0.8%，這些數(shù)據(jù)表明該方法可以實(shí)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的高效特異性捕獲。
[0264]實(shí)施例15[0265]本實(shí)施例所制備的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物表面的分維為
2.74 ;以循環(huán)腫瘤細(xì)胞MCF7和Jurkat T為待捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞為例，對(duì)本發(fā)明的捕獲體系作進(jìn)一步闡述和驗(yàn)證。利用分形結(jié)構(gòu)的表面進(jìn)行循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特異性捕獲的方法包括以下步驟:
[0266](I)采用文獻(xiàn)(Angew.Chem.1nt.Ed.2002, 41，1221-1223)所述的方法即可在聚苯乙烯/聚乳酸共聚物基片的表面制備出具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物表面。
[0267](2)將腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體固定在步驟(1)得到的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物基片上的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物表面上
[0268](a)將一端接有氨基的生物素用去離子水稀釋為2mM的水溶液，室溫下，將具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物表面的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物基片浸泡在上述一端接有氨基的生物素的濃度為2mM的水溶液中浸泡12小時(shí)(具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物表面的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物基片在使用前用去離子水沖洗干凈);取出具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物表面的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物基片，用去離子水洗漆，干燥；
[0269](b)將鏈霉親和素用磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液稀釋為10 μ g/mL的磷酸鹽溶液，然后將步驟(a)干燥后得到的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物表面的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物基片浸泡在鏈霉親和素的磷酸鹽溶液中，室溫下放置30分鐘；取出具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物表面的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物基片，用磷酸鹽緩沖液洗滌；
[0270](c)將腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋至10μ g/mL，然后取25yL滴加到步驟(b)用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后得到的面積為Icm2的的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物表面的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物基片上，室溫放置30分鐘。
[0271](3)準(zhǔn)備待測(cè)樣品
[0272]同實(shí)施例1。
[0273](4)捕獲待測(cè)樣品中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞
[0274]分別將步驟(3)混合均勻后得到的細(xì)胞懸浮液3mL滴加到放置在細(xì)胞培養(yǎng)板(直徑3.5cm)中的步驟(2)得到的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物基片上的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物表面所固定的腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體的表面上(每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)板放置3個(gè)Icm2的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物表面的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物基片)，然后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，由腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體與枝狀分形結(jié)構(gòu)的協(xié)同作用，特異性捕獲滴加到步驟(2)得到的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物基片上的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物表面所固定的腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體的表面上的步驟(3)混合均勻后得到的細(xì)胞懸浮液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，捕獲時(shí)間是45分鐘。
[0275]作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)，固定了腫瘤細(xì)胞表面的抗EpCAM抗體的平整聚苯乙烯/聚乳酸共聚物表面也進(jìn)行相同的捕獲待測(cè)樣品中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。
[0276](5)捕獲效果的評(píng)價(jià)
[0277]將捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物表面的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物基片用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，然后用質(zhì)量濃度為4%的多聚甲醛水溶液浸泡20分鐘，質(zhì)量濃度為0.4%的Triton-XlOO水溶液浸泡10分鐘，2 μ g/mLDAPI水溶液浸泡15分鐘，從而達(dá)到染色的目的。用Nikon倒置熒光顯微鏡10倍下分別拍照(每個(gè)捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物表面的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物基片選取中間部分10個(gè)不同的位置)，并對(duì)捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物表面的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物基片上所捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算捕獲效率。
[0278]捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的平整聚苯乙烯/聚乳酸共聚物表面也按上述步驟進(jìn)行，并計(jì)算捕獲效率。
[0279]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該具有枝狀分形結(jié)構(gòu)的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物表面的MCF7細(xì)胞的捕獲效率為67.4%，Jurkat T細(xì)胞的捕獲效率僅為2.1% ;對(duì)照實(shí)驗(yàn)中平整聚苯乙烯/聚乳酸共聚物表面的MCF7細(xì)胞的捕獲效率僅為2.3%，Jurkat T細(xì)胞的捕獲效率僅為1.8%，這些數(shù)據(jù)表明該方法可以實(shí)現(xiàn)`循環(huán)腫瘤細(xì)胞的高效特異性捕獲。
【權(quán)利要求】
1.一種利用分形結(jié)構(gòu)的表面進(jìn)行循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特異性捕獲的方法，其特征是，所述的方法包括以下步驟: (1)在基片的表面制備出分形結(jié)構(gòu)的表面； (2)將腫瘤細(xì)胞表面的特異性抗體固定在步驟(1)得到的基片上的具有分形結(jié)構(gòu)的表面上，然后放置在細(xì)胞培養(yǎng)板中； (3)將待測(cè)樣品滴加到步驟(2)得到的基片上的具有分形結(jié)構(gòu)的表面所固定的腫瘤細(xì)胞表面的特異性抗體的表面上，然后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，由所述的腫瘤細(xì)胞表面的特異性抗體與所述的分形結(jié)構(gòu)的協(xié)同作用，特異性捕獲待測(cè)樣品中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞； 所述的分形結(jié)構(gòu)選自枝狀分形結(jié)構(gòu)、花椰菜狀分形結(jié)構(gòu)或海膽狀分形結(jié)構(gòu)中的一種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是:所述的將腫瘤細(xì)胞表面的特異性抗體固定在步驟(1)得到的基片上的具有分形結(jié)構(gòu)的表面上，其固定在具有分形結(jié)構(gòu)的表面上的腫瘤細(xì)胞表面的特異性抗體的固定量不少于0.1 μ g/cm2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征是:所述的分形結(jié)構(gòu)的表面的表征參數(shù)分維的范圍是:2<分維<3。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征是:所述的腫瘤細(xì)胞表面的特異性抗體為抗EpCAM抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征是:所述的基片的材料選自導(dǎo)電金屬、導(dǎo)電無機(jī)非金屬、導(dǎo)電無機(jī)非金屬化合物、非導(dǎo)電無機(jī)非金屬化合物和非導(dǎo)電聚合物中的一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述 的方法，其特征是:所述的導(dǎo)電金屬選自金、銀、鉬、鈀、銅、鐵、鋅和鋁中的一種； 所述的導(dǎo)電無機(jī)非金屬是晶體硅； 所述的導(dǎo)電無機(jī)非金屬化合物是氧化銦錫玻璃； 所述的非導(dǎo)電無機(jī)非金屬化合物是石英或普通玻璃； 所述的非導(dǎo)電聚合物選自聚二甲基硅氧烷、聚(甲基)丙烯酸酯、聚氨酯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乳酸和聚乙烯醇中的至少一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征是:所述的分形結(jié)構(gòu)的表面的材料選自金屬、金屬化合物、無機(jī)非金屬、無機(jī)非金屬化合物、導(dǎo)電聚合物和非導(dǎo)電聚合物中的一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征是:所述的金屬選自金、銀、鉬、鈀、銅、鐵、鋅和招中的一種； 所述的金屬化合物選自氧化銅、氧化鐵、氧化鋅和二氧化鈦中的一種； 所述的無機(jī)非金屬是晶體硅； 所述的無機(jī)非金屬化合物是石英； 所述的導(dǎo)電聚合物選自聚噻吩、聚吡咯、聚苯胺和聚苯中的一種； 所述的非導(dǎo)電聚合物選自聚二甲基硅氧烷、聚(甲基)丙烯酸酯、聚氨酯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乳酸和聚乙烯醇中的至少一種。
【文檔編號(hào)】C12N5/09GK103667191SQ201210330287
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2012年9月7日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月7日
【發(fā)明者】王樹濤, 張鵬超, 陳立, 江雷 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院化學(xué)研究所