專利名稱：用于捕獲循環(huán)細(xì)胞的裝置的制作方法
用于捕獲循環(huán)細(xì)胞的裝置本申請(qǐng)要求2009年3月18日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)no. 61/161248和2010年2月 5日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)no. 61/301839的優(yōu)先權(quán)，它們的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本文。獲得本文所述和請(qǐng)求保護(hù)之發(fā)明的工作是在美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院的資助(資助號(hào)CA119347)下進(jìn)行的。美國(guó)政府享有本發(fā)明的一些權(quán)利。
背景技術(shù)：
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及捕獲稀少細(xì)胞的裝置和方法。2.
背景技術(shù)：
癌癥是發(fā)達(dá)國(guó)家的首要死亡原因之一，僅在美國(guó)每年就有超過(guò)500，000人死于癌癥。在美國(guó)，每年有超過(guò)1百萬(wàn)人被診斷出癌癥，并且據(jù)總體估計(jì)，每3個(gè)人中有超過(guò)1人會(huì)在有生之年患某種類型的癌癥。大部分癌癥患者并非死于其原發(fā)腫瘤。事實(shí)上，癌癥患者多死于“轉(zhuǎn)移”——惡性細(xì)胞從身體的一部分?jǐn)U散至另一部分。如果原發(fā)腫瘤被足夠早地檢出，則其通?？赏ㄟ^(guò)手術(shù)、放射、化療或這些治療的某些組合來(lái)消除。與之相反，轉(zhuǎn)移腫瘤難以被檢出，并且隨著轉(zhuǎn)移的進(jìn)展而愈加難以治療。因此，需要開(kāi)發(fā)用于檢測(cè)早期癌轉(zhuǎn)移的方法。脫離原發(fā)腫瘤部位的癌細(xì)胞被稱為“循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell, CTC) "1O CTC代表了作為腫瘤組織來(lái)源之介入性活檢的潛在替代物，以用于檢測(cè)、表征和監(jiān)測(cè)非血液系統(tǒng)癌癥2_4。在過(guò)去十年中，CTC已成為檢測(cè)早期癌轉(zhuǎn)移、預(yù)測(cè)患者預(yù)后以及監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展和癌癥治療效果的新興“生物標(biāo)志物”5。然而，由于CTC在包含大量血細(xì)胞(IO9 個(gè)細(xì)胞/mL)的血液中的豐度極低(每毫升有幾個(gè)至幾百個(gè)細(xì)胞)，因此對(duì)CTC的分離在技術(shù)上存在難度4’6’7。先前從外周血中富集或分選CTC的方法包括流式細(xì)胞術(shù)、免疫磁珠、高通量光學(xué)成像系統(tǒng)和光纖陣列掃描。免疫磁珠純化CTC是目前臨床中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)，并且已成功地從肺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌和胰腺癌患者中鑒定出CTC3’4’8,。然而，該方法以非常低的純度(O. 01 0. )1°和低產(chǎn)率(約20 60%的患者)3分離出少量的CTC(肺癌中，4士對(duì)個(gè)(平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)/ml ；乳腺癌中，11 士 118個(gè)/ml ；前列腺癌中，10士33個(gè)/ ml ；結(jié)直腸癌和胰腺癌中，1 士2個(gè)/ml)3。與免疫磁珠技術(shù)的低靈敏度、選擇性和產(chǎn)率相關(guān)的“生物噪聲”水平限制了其在早期癌癥檢測(cè)和患者對(duì)治療之響應(yīng)的監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用。目前， 免疫磁珠技術(shù)可用作反映大致情況的預(yù)后工具，從而將患者劃分為高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)類型5。微流體芯片實(shí)驗(yàn)室裝置為細(xì)胞分選和稀少細(xì)胞檢測(cè)提供了唯一的機(jī)會(huì)。微流體技術(shù)已成功地用于微流體流式細(xì)胞術(shù)、基于尺寸的連續(xù)分離(continuous size-based s印aration)11和色譜分離12 ；然而這些方法不能處理大體積的樣品(例如，幾毫升全血)13。 還使用微流體技術(shù)從全血樣品中捕獲CTC8’9。但是，現(xiàn)有的CTC捕獲系統(tǒng)需要復(fù)雜的流體處理系統(tǒng)來(lái)使血流通過(guò)裝置。此外，這些系統(tǒng)采用對(duì)于細(xì)胞捕獲來(lái)說(shuō)并非最優(yōu)的微結(jié)構(gòu)來(lái)分離 CTC。
大部分上皮起源的腫瘤(上皮癌)細(xì)胞的表面覆蓋有多種大小和構(gòu)型的納米尺度的微絨毛14。在腺體起源的良性上皮細(xì)胞中，微絨毛是有極性的(即局限在正常細(xì)胞的一面，通常是面向腺體或器官內(nèi)腔的一面)并且具有一致且單一的構(gòu)型。上皮癌細(xì)胞的微絨毛覆蓋整個(gè)細(xì)胞表面，其大小和長(zhǎng)度有所不同，并且有時(shí)形成非常長(zhǎng)之微絨毛的簇。在一些腫瘤(尤其是癌性間皮瘤)中，長(zhǎng)微絨毛的簇代表了惡性細(xì)胞。此外，細(xì)胞表面上還存在大小亦為納米尺度的其它結(jié)構(gòu)，包括板狀偽足、絲狀偽足和脂筏分子團(tuán)。本發(fā)明的一些實(shí)施方案涉及利用細(xì)胞表面上存在的這些納米尺度結(jié)構(gòu)的新型細(xì)胞捕獲裝置。發(fā)明概述參考說(shuō)明書、附圖和實(shí)施例會(huì)明確其它目的和優(yōu)點(diǎn)。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方案的細(xì)胞捕獲裝置具有包含納米結(jié)構(gòu)化表面區(qū)域的基底。 納米結(jié)構(gòu)化表面區(qū)域連接有多個(gè)結(jié)合劑，其能選擇性地捕獲細(xì)胞樣品中的靶細(xì)胞。所述納米結(jié)構(gòu)化表面區(qū)域包含多個(gè)納米結(jié)構(gòu)。納米結(jié)構(gòu)具有縱向尺寸和橫向尺寸，在一些實(shí)施方案中，縱向尺寸是橫向尺寸的至少10倍。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述裝置是微流體裝置。微流體裝置具有連接流動(dòng)層的基底，其形成微流體通道。所述基底具有納米結(jié)構(gòu)化表面區(qū)域，該表面區(qū)域的一部分與運(yùn)行中流過(guò)微流體通道的流體相接觸。所述納米結(jié)構(gòu)化表面區(qū)域包含多個(gè)納米結(jié)構(gòu)，每個(gè)納米結(jié)構(gòu)具有縱向尺寸和橫向尺寸。納米結(jié)構(gòu)化表面區(qū)域連接有多個(gè)結(jié)合劑，其能選擇性地捕獲細(xì)胞樣品中的靶細(xì)胞。本發(fā)明的一些實(shí)施方案還涉及從細(xì)胞樣品中分離把細(xì)胞的方法。該方法包括提供具有至少一個(gè)靶細(xì)胞的細(xì)胞樣品，并將所述細(xì)胞樣品與多個(gè)納米結(jié)構(gòu)相接觸。納米結(jié)構(gòu)連接有多個(gè)結(jié)合劑，其能選擇性地捕獲細(xì)胞樣品中的靶細(xì)胞。本發(fā)明的另一些實(shí)施方案涉及使用本發(fā)明的方法和裝置來(lái)診斷疾病、監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展和評(píng)價(jià)治療效果。本發(fā)明的另一些實(shí)施方案還涉及包含本發(fā)明裝置的試劑盒。


圖1提供了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案如何使用納米結(jié)構(gòu)化基底提高細(xì)胞捕獲效率的示意圖。由于納米結(jié)構(gòu)化基底提高了與細(xì)胞表面組分的局部相互作用，因此，與平基底相比，更多的細(xì)胞表面組分附著到納米結(jié)構(gòu)化基底上。圖2A-2C示意了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的硅納米線(SiNW)的制備。圖2A顯示通過(guò)Ag+和HF的化學(xué)蝕刻將SiNW陣列引入到硅晶片上。掃描電子顯微鏡(SEM)圖像顯示清晰可辨的SiNW，其直徑為100 200nm，長(zhǎng)度為約10 μ m。圖2B是將生物素化的上皮細(xì)胞粘附分子抗體(抗-EpCam)移接到硅基底上的示意圖。圖2C顯示通過(guò)濕化學(xué)蝕刻獲得的不同SiNW長(zhǎng)度之SiNW基底的SEM圖像。圖3A 3C比較了平硅基底與本發(fā)明一些實(shí)施方案中的SiNW基底。圖3A顯示捕獲MCF7的SiNW基底和平硅基底的熒光顯微圖像和SEM圖像。圖顯示捕獲Daubi B細(xì)胞的SiNW基底和平硅基底的熒光顯微圖像和SEM圖像。在圖3A和圖;3B中，SiNW基底顯示出比平基底顯著更高的細(xì)胞捕獲效率。圖3C示意，以相近的實(shí)驗(yàn)設(shè)置，在硅晶片上設(shè)計(jì)交替的SiNW和平基底用以比較細(xì)胞捕獲效率的光蝕刻方法。圖3D顯示細(xì)胞捕獲前經(jīng)圖案化之基底的SEM圖像(上圖)以及經(jīng)圖案化之基底上捕獲的細(xì)胞的熒光圖像(下圖)。圖4A和4B顯示捕獲時(shí)間和SiNW長(zhǎng)度對(duì)本發(fā)明一些實(shí)施方案中SiNW基底之捕獲效率的作用。圖4A顯示細(xì)胞捕獲效率和捕獲時(shí)間之間的相關(guān)性。圖4B顯示細(xì)胞捕獲效率和0 20 μ m的不同SiNW長(zhǎng)度之間的相關(guān)性。圖5比較了三種不同基底的細(xì)胞捕獲表現(xiàn)未經(jīng)任何表面修飾的SiNW基底 (SiNW-No)、經(jīng)鏈霉親和素包被的SiNW基底(SiNW-SA)和用抗-EpCAM修飾的SiNW基底 (SiNW-SA-EpCAM)。圖6A 6E顯示本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的微流體裝置。圖6A是微流體細(xì)胞捕獲平臺(tái)的照片。圖6B是包括經(jīng)捕獲劑包被之SiNW基底和覆蓋其上之微流體混沌混合器(chaotic mixer)的整合CTC捕獲平臺(tái)的示意圖。圖6C是混沌混合通道下SiNW模式的光學(xué)圖像。圖 6D是直徑為100 200nm、長(zhǎng)度為約10 μ m的清晰可辨的SiNW的側(cè)視SEM圖像。圖6E顯示細(xì)胞表面組分如何高效地附著到納米結(jié)構(gòu)化基底上，這可能是由于納米結(jié)構(gòu)化基底提高了與細(xì)胞表面組分的局部相互作用。圖7A 7C顯示本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的微流體裝置中流速對(duì)細(xì)胞捕獲的作用。圖 7A顯示微流體裝置中流速與捕獲產(chǎn)率之間的相關(guān)性。圖7B顯示從微通道入口到出口(0 88cm)的捕獲細(xì)胞分布。圖7C是微流體裝置的照片。圖8顯示，在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的微流體裝置中，針對(duì)三種不同癌細(xì)胞系——乳腺癌(MCF7)、前列腺癌(PO)和膀胱癌(T-M)，每毫升PBS摻入100個(gè)細(xì)胞的捕獲產(chǎn)率。圖9顯示，在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的微流體裝置中，比較針對(duì)全血與經(jīng)裂解血液樣品中的多種靶細(xì)胞濃度的捕獲效率。圖表示摻入細(xì)胞數(shù)相對(duì)于所回收的細(xì)胞數(shù)。圖IOA IOD顯示，在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的微流體裝置中，捕獲時(shí)間和SiNW長(zhǎng)度對(duì)捕獲效率的作用。圖IOA顯示細(xì)胞捕獲效率與捕獲時(shí)間之間的相關(guān)性。圖IOB顯示細(xì)胞捕獲效率與0 20 μ m之不同SiNW長(zhǎng)度之間的相關(guān)性。圖IOC顯示，在不同比例的細(xì)胞混合物中捕獲的靶Daudi B細(xì)胞的百分比。圖IOD是利用SiNP基底捕獲的Daudi B細(xì)胞的熒光圖像。每幅圖和誤差線表示3次重復(fù)的平均值士標(biāo)準(zhǔn)差。圖IlA IlC比較了本發(fā)明一些實(shí)施方案之裝置與Cellsearch 技術(shù)的捕獲能力。圖IlA顯示43個(gè)轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者樣品得到的CTC數(shù)。圖IlB顯示在靜態(tài)孵育條件下使用本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的裝置得到的患者樣品之CTC數(shù)。圖IlC顯示使用本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的微流體裝置得到的患者樣品之CTC數(shù)。發(fā)明詳述本發(fā)明的一些實(shí)施方案涉及能從生物樣品中快速且高效地分離出稀少細(xì)胞(例如CTC)的裝置。該裝置包含連接至納米結(jié)構(gòu)的結(jié)合劑。細(xì)胞捕獲由靶細(xì)胞與結(jié)合劑之間的相互作用來(lái)介導(dǎo)。此外，納米結(jié)構(gòu)通過(guò)與細(xì)胞表面組分(如微絨毛、板狀偽足、絲狀偽足和脂筏分子團(tuán))相互作用來(lái)輔助細(xì)胞捕獲。除了精確地識(shí)別和測(cè)量生物樣品中的稀少細(xì)胞外，本發(fā)明一些實(shí)施方案的裝置還可分離出稀少細(xì)胞用以后續(xù)處理。本發(fā)明的一些實(shí)施方案還涉及在研究和臨床中使用所述裝置，包括使用該裝置來(lái)檢測(cè)、診斷和監(jiān)測(cè)疾病。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的裝置和方法能以單個(gè)步驟直接從全血中分選出稀少細(xì)胞。例如，本發(fā)明一些實(shí)施方案的裝置和方法能夠無(wú)需任何其它樣品處理步驟(如稀釋、 離心、紅血細(xì)胞裂解、細(xì)胞固定或細(xì)胞標(biāo)記)來(lái)使用抗凝全血(但不限于此)。這與基于免疫磁珠的系統(tǒng)不同，后者需要多個(gè)“批量”半自動(dòng)制備步驟(離心、清洗和孵育)從而導(dǎo)致顯著量的稀少細(xì)胞受到損失和/或破壞。此外，本發(fā)明一些實(shí)施方案的裝置和方法能分離活的和固定的細(xì)胞，而基于磁珠的方法只可分離固定的非存活細(xì)胞。而且，與需要復(fù)雜流體處理系統(tǒng)的現(xiàn)有微流體CTC捕獲裝備不同，本發(fā)明一些實(shí)施方案的裝置可通過(guò)在裝置中靜態(tài)孵育血液樣品而獲得高的細(xì)胞捕獲效率。本發(fā)明一些實(shí)施方案的裝置和方法的特點(diǎn)還在于它們使用納米結(jié)構(gòu)來(lái)捕獲和分離生物樣品中的循環(huán)細(xì)胞。先前的微流體CTC捕獲裝置使用微結(jié)構(gòu)來(lái)與靶細(xì)胞相互作用。 這些微結(jié)構(gòu)能與大部分細(xì)胞(大小通常為10 30 μ m)相互作用。然而，這些微結(jié)構(gòu)不能與細(xì)胞表面上納米尺度的多種組分(例如微絨毛)相互作用。本發(fā)明一些實(shí)施方案的納米結(jié)構(gòu)通過(guò)與這些納米級(jí)細(xì)胞表面組分的相互作用來(lái)增強(qiáng)與靶細(xì)胞的結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的裝置和方法可以高靈敏度(例如，鑒定為具有CTC的腫瘤患者的百分比)、高特異性(例如，鑒定為不具有CTC的非腫瘤患者的百分比)和高純度(定義為與該裝置截獲的其它細(xì)胞相比裝置截獲的稀少細(xì)胞的百分比)實(shí)現(xiàn)稀少細(xì)胞的捕獲。與先前用于捕獲CTC的裝置和方法相比，所觀察到的靈敏度、特異性和純度水平是出人意料的(參見(jiàn)例如圖10)。在一些實(shí)施方案中，可容易地對(duì)本發(fā)明的裝置和方法進(jìn)行改造(包括變換通量， 變換結(jié)合劑)以適于多種臨床情形中的潛在應(yīng)用，從而允許捕獲任意類型的稀少循環(huán)細(xì)胞。此外，本發(fā)明一些實(shí)施方案的裝置和方法不限于鑒定和分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明一些實(shí)施方案的裝置和方法適用于一定范圍的細(xì)胞學(xué)研究領(lǐng)域中。本發(fā)明一些實(shí)施方案的“一步”可能性和多用性使這些實(shí)施方案可用于即時(shí)使用并快速整合入臨床實(shí)踐中。以下詳細(xì)討論本發(fā)明的一些實(shí)施方案。在所述的實(shí)施方案中，為明確起見(jiàn)使用特定術(shù)語(yǔ)。然而，這些實(shí)施方案不旨在限于所選用的特定術(shù)語(yǔ)。相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到可在不背離本發(fā)明的精神和范圍下使用其它等效組分以及開(kāi)發(fā)其它方法。本文引用的所有參考文獻(xiàn)如同每個(gè)被單獨(dú)并入地那樣通過(guò)引用并入本文中。1.定義為了便于理解本發(fā)明，以下定義一些術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)。除非上下文中另外明確指出，否則本文中無(wú)數(shù)量詞修飾的形式包括復(fù)數(shù)含義。因此，例如“結(jié)合劑”也涉及多于一種結(jié)合劑。術(shù)語(yǔ)“納米結(jié)構(gòu)”是指具有橫向尺寸和縱向尺寸的結(jié)構(gòu)，其中橫向尺寸、縱向尺寸或者橫向和縱向尺寸兩者均小于1mm。納米結(jié)構(gòu)的形狀不是關(guān)鍵的。例如，它可以是任何三維表面，如珠、顆粒、線、管、球等。術(shù)語(yǔ)“診斷”是指鑒定病理狀態(tài)的存在情況或性質(zhì)，包括鑒定具有發(fā)生特定疾病或病癥之風(fēng)險(xiǎn)的患者。診斷方法有不同的靈敏度和特異性。診斷測(cè)定的“靈敏度”是測(cè)試為陽(yáng)性之患病個(gè)體的百分比(“真陽(yáng)性”百分比)。測(cè)定未檢測(cè)出的患病個(gè)體為“假陰性”。未患病并且在測(cè)定中測(cè)試為陰性的對(duì)象稱為“真陰性”。診斷測(cè)定的“特異性”是1減去假陽(yáng)性率，其中“假陽(yáng)性”率定義為未患病但測(cè)試為陽(yáng)性之患者的比例。盡管特定的診斷方法可能不會(huì)提供病癥的確定性診斷，但是如果該方法提供輔助診斷的陽(yáng)性指示就已足夠。術(shù)語(yǔ)“檢測(cè)”等可用于這樣的上下文中檢測(cè)生物標(biāo)志物或者檢測(cè)疾病或病癥(例如當(dāng)獲得陽(yáng)性測(cè)定結(jié)果時(shí))。在后一情形中，認(rèn)為“檢測(cè)”和“診斷”是同義的。
術(shù)語(yǔ)“對(duì)象”、“患者”或“個(gè)體”通常是指人，但本發(fā)明的方法不限于人，并且應(yīng)可用于其它哺乳動(dòng)物(例如貓、犬等)。本文所用“樣品”取其最廣泛的含義。樣品可包括體液(包括血液、血清、血漿、淚液、房水和玻璃液、脊髓液、尿液和唾液)；細(xì)胞或組織制備物的可溶級(jí)分，或細(xì)胞生長(zhǎng)的介質(zhì)。獲得合適的生物樣品的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。本文所用術(shù)語(yǔ)“結(jié)合劑”是指與納米結(jié)構(gòu)化表面區(qū)或該表面之一部分(例如塑料表面的衍生部分)連接并且可以與靶細(xì)胞進(jìn)行特異性相互作用或連接的任何實(shí)體或物質(zhì) (例如分子)?！岸鄠€(gè)結(jié)合劑”可以指一種特定結(jié)合劑的多個(gè)或者指多于一種結(jié)合劑的多個(gè)?！翱贵w”是通過(guò)免疫球蛋白分子可變區(qū)中至少一個(gè)抗原識(shí)別位點(diǎn)識(shí)別并且特異結(jié)合靶標(biāo)(例如蛋白質(zhì)、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂質(zhì)等)的免疫球蛋白分子。本文所用的該術(shù)語(yǔ)取其最廣泛的含義，并包括完整多克隆抗體、完整單克隆抗體、抗體片段(如 Fab、Fab，、F(ab，)2和Fv片段)、單鏈Fv(scFv)突變體、多特異性抗體(如由至少2種完整抗體產(chǎn)生的雙特異性抗體)、雜合抗體、包含抗體部分的融合蛋白以及包含抗原識(shí)別位點(diǎn)的任何其它經(jīng)修飾免疫球蛋白分子，前提是所述抗體顯示期望的生物活性?？贵w可以是免疫球蛋白五種主要類型的任意種IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，或其亞類(同種型)(例如IgGl、 IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)，根據(jù)它們的重鏈恒定區(qū)的性質(zhì)分別稱為α、δ、ε、Y禾口 μ。不同的免疫球蛋白類型具有不同并且公知的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型?？贵w可以是“裸露的(naked)”或綴合至其它分子(如毒素、放射性同位素等)。術(shù)語(yǔ)“抗體片段”是指完整抗體的一部分?？贵w片段的實(shí)例包括但不限于線形抗體；單鏈抗體分子；Fc或Fe’肽、Fab和Fab片段以及由抗體片段形成的多特異性抗體?！半s合抗體”是這樣的免疫球蛋白分子，其中來(lái)自具有不同抗原決定區(qū)之抗體的重鏈和輕鏈對(duì)被組裝在一起，從而可以識(shí)別兩種不同的表位或兩種不同的抗原并通過(guò)所得的四聚體結(jié)合。對(duì)于細(xì)胞而言，“分離”是指從其天然環(huán)境(如實(shí)體瘤中)取出分離的或隔離的細(xì)胞，并且其中至少約30%、50(%、75(%和90%不含天然狀態(tài)下與其一起存在的、但缺少分離該細(xì)胞所依據(jù)之標(biāo)志物的其它細(xì)胞。與靶細(xì)胞“特異性結(jié)合”或顯示“特異性結(jié)合”或者“捕獲”或“選擇性捕獲”靶細(xì)胞的分子(例如結(jié)合劑)是指與另一些物質(zhì)相比，以更長(zhǎng)的持續(xù)時(shí)間和/或更大的親和力與靶細(xì)胞更頻繁、更迅速地反應(yīng)或連接的分子。因此，在特定的實(shí)驗(yàn)條件下，特定的分子與靶細(xì)胞的結(jié)合至少為背景的2倍，并且其基本上不與樣品中存在的其它細(xì)胞和蛋白質(zhì)以顯
著量結(jié)合。本文所用的“轉(zhuǎn)移”是指癌從初始部位向身體其它區(qū)域擴(kuò)散或轉(zhuǎn)移、同時(shí)在新的部位產(chǎn)生類似癌性病變的過(guò)程?！稗D(zhuǎn)移”的細(xì)胞是失去與鄰近細(xì)胞的粘附接觸并經(jīng)血流或淋巴從患病初始部位遷移以侵襲鄰近機(jī)體結(jié)構(gòu)的細(xì)胞。2.裝置本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的裝置在圖1、2A和2B中示意顯示。裝置(100和200)包含具有納米結(jié)構(gòu)化表面區(qū)域(104和204)的基底(102和202)。多個(gè)結(jié)合劑(106和206)連接至所述基底的所述納米結(jié)構(gòu)化表面區(qū)域。納米結(jié)構(gòu)化表面區(qū)域包含多個(gè)納米結(jié)構(gòu)(如納米結(jié)構(gòu)108和納米結(jié)構(gòu)208)，其每個(gè)均具有縱向尺寸和橫向尺寸。當(dāng)將樣品置于裝置上時(shí)，生物細(xì)胞(110和210)被協(xié)作作用的結(jié)合劑和多個(gè)納米結(jié)構(gòu)選擇性地捕獲。所使用的結(jié)合劑將取決于被靶向的生物細(xì)胞類型。常規(guī)的結(jié)合劑適用于本發(fā)明的一些實(shí)施方案。結(jié)合劑的非限制性實(shí)例包括抗體、核酸、寡肽或多肽、細(xì)胞受體、配體、適配體、生物素、親和素、配位復(fù)合物、合成的聚合物和碳水化合物。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，使用常規(guī)方法將結(jié)合劑連接至納米結(jié)構(gòu)化表面區(qū)域。所采用的方法將取決于結(jié)合劑和用于構(gòu)成裝置的材料。連接方法的非限制性實(shí)例包括結(jié)合劑或與該試劑連接或化學(xué)結(jié)合 (例如通過(guò)自組裝的單層或硅烷化學(xué))的化合物的非特異性表面吸附。在一些實(shí)施方案中， 用鏈霉親和素包被納米化結(jié)構(gòu)表面區(qū)域，并且結(jié)合劑被生物素化(其通過(guò)與鏈霉親和素分子相互作用而輔助與納米化表面區(qū)域的連接)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，納米結(jié)構(gòu)增加了基底的表面面積并且增加了給定細(xì)胞與結(jié)合劑接觸的可能性。在這些實(shí)施方案中，納米結(jié)構(gòu)可以通過(guò)與細(xì)胞表面組分(如微絨毛、板狀偽足、絲狀偽足和脂筏分子團(tuán))相互作用而增強(qiáng)與靶細(xì)胞的結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，納米結(jié)構(gòu)具有等于其橫向尺寸的縱向尺寸，其中橫向尺寸和縱向尺寸均小于Iymjp 為納米尺度。在另一些實(shí)施方案中，納米結(jié)構(gòu)的縱向尺寸為其橫向尺寸的至少10倍。在又一些實(shí)施方案中，納米結(jié)構(gòu)的縱向尺寸為其橫向尺寸的至少20倍、50倍或100倍。在一些實(shí)施方案中，橫向尺寸小于1 μ m。在另一些實(shí)施方案中，橫向尺寸為1 500nm。在又一些實(shí)施方案中，橫向尺寸為30 400nm。在又一些實(shí)施方案中，橫向尺寸為50 250nm。在一些實(shí)施方案中，縱向尺寸為至少Iym長(zhǎng)。在另一些實(shí)施方案中，縱向尺寸為1 50 μ m 長(zhǎng)。在另一些實(shí)施方案中，縱向尺寸為1 25μπι長(zhǎng)。在又一些實(shí)施方案中，縱向尺寸為 5 IOym長(zhǎng)。在又一些實(shí)施方案中，縱向尺寸為至少6 μ m長(zhǎng)。納米結(jié)構(gòu)的形狀不是關(guān)鍵的。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，納米結(jié)構(gòu)是球或珠。在另一些實(shí)施方案中，納米結(jié)構(gòu)是線、絲或管。在又一些實(shí)施方案中，多個(gè)納米結(jié)構(gòu)包含一個(gè)或多個(gè)納米線、納米纖維、納米管、納米柱、納米球或納米顆粒。裝置的精確幾何結(jié)構(gòu)將由測(cè)定決定。裝置可以包含或不包含允許光學(xué)或目視檢查納米結(jié)構(gòu)表面的區(qū)域。在一些實(shí)施方案中，可以通過(guò)靜態(tài)孵育血液樣品來(lái)實(shí)現(xiàn)高的細(xì)胞捕獲效率。圖6B示意本發(fā)明微流體裝置的一個(gè)實(shí)施方案(600)。該微流體裝置(600)具有連接至基底(604)以形成微流體通道(606)的流動(dòng)層(602)。在這種裝置(600)中，基底 (604)之納米化結(jié)構(gòu)表面區(qū)域的一部分將與流經(jīng)微流體通道的流體相接觸。微流體裝置包含至少一個(gè)流體輸入微通道(608)。然而微流體裝置不限于僅有一個(gè)輸入微通道。在一些實(shí)施方案中，微流體裝置可以包含兩個(gè)或更多個(gè)輸入通道以及兩個(gè)或更多個(gè)流體連通的流體源。微流體裝置還具有一個(gè)或多個(gè)排出流體的輸出微通道(610)?？梢胙b置的流體的非限制性實(shí)例包括清洗緩沖液(例如用于除去非特異結(jié)合的細(xì)胞或未使用的試劑)、裂解試劑或標(biāo)記試劑(例如細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)染料)。在一些實(shí)施方案中，將本發(fā)明的裝置設(shè)計(jì)為具有允許接近全部或細(xì)胞可結(jié)合之區(qū)域的可移除覆蓋物。 使用這些裝置，可以將試劑(例如標(biāo)記試劑或裂解試劑)施加到特定區(qū)域。還可以從這些裝置中取出各細(xì)胞。在另一些實(shí)施方案中，裝置具有多于一個(gè)的輸入微通道和輸出微通道以允許將多于一種的流體引入裝置中(通常在不同的時(shí)間)。通過(guò)具有多個(gè)輸入微通道和相應(yīng)的輸出微通道，可以將流體同時(shí)引入裝置從而在特定區(qū)域處理所結(jié)合的細(xì)胞。這些區(qū)域的大小可以根據(jù)輸入微通道和輸出微通道的位置以及輸入微通道和輸出微通道的相對(duì)體積流速來(lái)調(diào)整。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，輸入微通道與泵(61 連接以控制進(jìn)入微流體通道的樣品和試劑的流動(dòng)。常規(guī)的流體泵能在適用于本發(fā)明一些實(shí)施方案的裝置中產(chǎn)生所需的剪切應(yīng)力。泵的非限制性實(shí)例包括注射泵、蠕動(dòng)泵和真空泵。在一些實(shí)施方案中，使用常規(guī)方法將泵與裝置連接。可以將裝置配置為在任何給定通道中具有基本恒定的剪切應(yīng)力或者在給定通道中具有變化的剪切應(yīng)力。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知如何根據(jù)待處理之流體的體積和類型以及期望的流體流速來(lái)選擇和配置用于本發(fā)明的泵。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的裝置包含混沌混合器。常規(guī)的混沌混合器適用于本發(fā)明的一些實(shí)施方案。在一些實(shí)施方案中，流動(dòng)層具有帶紋理的表面以在微流體通道中引起混沌流(chaotic flow)。該混沌流增加了生物細(xì)胞與基底之納木結(jié)構(gòu)化表面區(qū)域接觸的可能性，從而增加了納米結(jié)構(gòu)化表面區(qū)域上的結(jié)合劑與樣品中的靶生物細(xì)胞相互作用和結(jié)合的可能性。在一些實(shí)施方案中，所述帶紋理的表面具有相對(duì)于流體流動(dòng)主要方向取向以混合循環(huán)流體的多個(gè)結(jié)構(gòu)。帶紋理表面可以形成多種幾何形狀，包括例如矩形、圓形和拋物線形。可以將所述形狀組合成周期或隨機(jī)的排布。在一些實(shí)施方案中，所述形狀可以包括多個(gè)形成鯡魚骨圖案的“Λ”形狀。本文所用術(shù)語(yǔ)“鯡魚骨圖案”具有其通常含義短平行線的列(例如兩列)，其中一列中的所有線條向一個(gè)方向傾斜，而相鄰列的所有線條向另一方向傾斜?？梢栽趲Ъy理表面上形成以便于流體混合的圖案的其它細(xì)節(jié)在Mook等題為 "LAMINAR MIXING APPARATUS AND METHODS” 的美國(guó)專利申請(qǐng)公布 2004/(^62223 中描述。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的裝置使用常規(guī)技術(shù)制造。所使用的制造技術(shù)將取決于用于制造裝置的材料。制造技術(shù)的非限制實(shí)例包括塑模、光蝕刻、電子束光刻、軟光刻、電鑄和機(jī)械加工。材料的非限制性實(shí)例包括玻璃、石英、聚合物(例如聚苯乙烯、硅酮如聚二甲基硅氧烷(PDMS)、環(huán)氧樹(shù)脂、聚甲基丙烯酸甲酯、尿烷、多糖、聚交酯(polylactide)和聚四氟乙烯(Teflon))、硅和其它半導(dǎo)體和金屬(例如鋁、鈦和鋼)。材料還可以為無(wú)機(jī)氧化物(例如鋅氧化物、硅氧化物、鈦氧化物和鋁氧化物)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，微流體裝置通過(guò)軟光刻制成。例如，可以在具有所需圖案的基底上施加聚二甲基硅氧烷(PDMS)層。該層可包被抗蝕劑(resist)，暴露于光圖案并被蝕刻以產(chǎn)生形成流體通道的結(jié)構(gòu)(例如，以預(yù)定的圖案)?？梢允褂眠B續(xù)的包被、暴露和蝕刻步驟來(lái)產(chǎn)生更復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。3.使用方法在一些實(shí)施方案中，使用本發(fā)明的裝置來(lái)從樣品中分離稀少細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，稀少細(xì)胞是外周血中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞。在另一些實(shí)施方案中，稀少細(xì)胞是外周血中的生物體(例如細(xì)菌、病毒、原生生物和真菌)。在又一些實(shí)施方案中，稀少細(xì)胞是在正常情況下不存在于血液中的非血細(xì)胞(例如，內(nèi)皮細(xì)胞或胎兒細(xì)胞)，甚至是造血起源細(xì)胞(例如血小板、鐮刀形紅細(xì)胞和白細(xì)胞的亞型)。可以使用本發(fā)明一些實(shí)施方案的裝置檢測(cè)的癌包括前列腺癌、肺癌、腺癌、腺瘤、 腎上腺癌、基底細(xì)胞癌、骨癌、腦癌、乳腺癌、支氣管癌、宮頸發(fā)育不良、結(jié)腸癌、表皮樣癌、尤因肉瘤(Ewing's sarcoma)、膽囊癌、膽囊結(jié)石腫瘤、巨細(xì)胞瘤、多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、頭癌、 增生、增生性角膜神經(jīng)瘤、原位癌、腸節(jié)細(xì)胞神經(jīng)瘤、胰島細(xì)胞瘤、卡波西肉瘤(Kaposi’ ssarcoma)、腎癌、喉癌、平滑肌瘤、肝癌、惡性類癌、惡性高鈣血癥、惡性黑素瘤、馬方綜合征樣體征腫瘤(marfanoid habitus tumor)、髓樣癌、轉(zhuǎn)移性皮膚癌、粘膜神經(jīng)瘤、蕈樣肉芽腫病、頸癌、神經(jīng)組織癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、骨原性肉瘤、骨肉瘤、卵巢腫瘤、胰腺癌、甲狀旁腺癌、 嗜鉻細(xì)胞瘤、原發(fā)性腦腫瘤、直腸癌、腎細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、精原細(xì)胞瘤、 皮膚癌、小細(xì)胞肺腫瘤、軟組織肉瘤、鱗狀細(xì)胞癌、胃癌、甲狀腺癌、局部皮膚病變、網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤(veticulum cell sarcoma)或維爾姆斯瘤(Wilm’ s tumor)。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合劑是抗上皮細(xì)胞粘附分子抗體(抗-EpCAM抗體)。由于EpCAM經(jīng)常被肺、結(jié)直腸、乳房、 前列腺、頭頸和肝起源的癌過(guò)表達(dá)，所以它提供了對(duì)從未分級(jí)分離之血液中捕獲CTC的特異性，從而可以提供與腫瘤(甚至臨床上被認(rèn)為是局部的腫瘤)相關(guān)的臨床和診斷信息。除了從樣品中分離生物細(xì)胞的方法以外，本發(fā)明的一些實(shí)施方案還提供了可使用所分離細(xì)胞提供其它信息的方法。在一些實(shí)施方案中，使用本發(fā)明方法和裝置分離的細(xì)胞可以用其它體外測(cè)定進(jìn)一步測(cè)定。在一些實(shí)施方案中，對(duì)使用本發(fā)明方法和裝置分離的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)?？捎糜谝恍?shí)施方案中的細(xì)胞計(jì)數(shù)的常規(guī)方法包括例如光學(xué)檢測(cè)(例如目視檢查、自動(dòng)計(jì)數(shù)、基于顯微鏡的檢測(cè))、FACS和電學(xué)檢測(cè)(如Coulter計(jì)數(shù)器)。細(xì)胞計(jì)數(shù)可用于診斷疾病、監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展以及監(jiān)測(cè)或確定治療效果。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)或其它分析平臺(tái)對(duì)使用本發(fā)明方法和裝置分離的細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)分析。這些分析利于診斷并向臨床醫(yī)生提供重要信息。在一些實(shí)施方案中，可以裂解使用本發(fā)明之方法和裝置分離的細(xì)胞，并且可以測(cè)量所述細(xì)胞或其部分的一種或多種特性?？梢栽诹呀饧?xì)胞中測(cè)量的生物學(xué)特性的非限制性實(shí)例包括mRNA表達(dá)、蛋白質(zhì)表達(dá)和DNA定量。此外，在一些實(shí)施方案中，可以使用常規(guī)技術(shù)(例如FISH或PCR)對(duì)細(xì)胞DNA進(jìn)行測(cè)序或鑒定某些序列特性(例如多態(tài)性和染色體異常)。在一些實(shí)施方案中，裂解細(xì)胞并仍使其結(jié)合于裝置上。使用本發(fā)明一些實(shí)施方案的裝置和方法獲得的高純度樣品使得能夠利用裝置裂解細(xì)胞并獲得有用的遺傳信息。在一些實(shí)施方案中，不經(jīng)裂解測(cè)定本發(fā)明方法分離的細(xì)胞。用于測(cè)定未裂解之細(xì)胞的方法的非限制實(shí)例包括使用細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)染色；觀察不同培養(yǎng)基中的形態(tài)或生長(zhǎng)特性；以及鑒定細(xì)胞表面上的生物標(biāo)志物。在另一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)所分離的細(xì)胞以獲得富集的分離細(xì)胞群，而后用于后續(xù)的體外測(cè)定。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，可以從分離細(xì)胞獲得的信息包括特定基因組DNA、 cDNA或mRNA序列的鑒定或定量；細(xì)胞表面標(biāo)志物(例如癌干細(xì)胞上的⑶133、⑶44、⑶M、 上皮特異性抗原(印ithelial-specific antigen，ESA)、Nanog和BMI1)的鑒定或定量；以及指示特定腫瘤類型或存在的蛋白質(zhì)或其它細(xì)胞內(nèi)含物的鑒定或定量。在一些實(shí)施方案中，可以分析CTC以確定組織起源、疾病的階段或嚴(yán)重程度或者對(duì)特定治療的敏感性。在一些實(shí)施方案中，使用本發(fā)明的方法和裝置來(lái)評(píng)估在消除腫瘤的藥物、放射或手術(shù)治療后循環(huán)中的殘留癌細(xì)胞。在另一些實(shí)施方案中，在數(shù)年內(nèi)定期地使用本發(fā)明之方法和裝置來(lái)評(píng)估患者循環(huán)中腫瘤細(xì)胞的存在和數(shù)目，以作為疾病發(fā)生、復(fù)發(fā)和/或進(jìn)展的指示。本發(fā)明的一些實(shí)施方案還提供了用于實(shí)施本文所述方法的試劑盒。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒包含本發(fā)明的裝置。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒包含與本發(fā)明裝置一起使用的試劑。在又一些實(shí)施方案中，所述試劑盒包含從哺乳動(dòng)物對(duì)象中獲取樣品(例如體液)以及使用試劑盒來(lái)診斷哺乳動(dòng)物對(duì)象之癌癥或者監(jiān)測(cè)施用給患癌癥之哺乳動(dòng)物對(duì)象的治療效果的說(shuō)明。通過(guò)參照以下非限制性實(shí)施例可以進(jìn)一步理解本發(fā)明的一些實(shí)施方案。很明顯， 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在不背離本公開(kāi)內(nèi)容的精神的前提下可以對(duì)材料和方法進(jìn)行諸多變動(dòng)。
實(shí)施例應(yīng)理解，本文所述的實(shí)施例和實(shí)施方案僅用于舉例說(shuō)明，并且基于其，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會(huì)想到多種改變或變動(dòng)，并且這些改變和變動(dòng)涵蓋在本申請(qǐng)的精神和范圍內(nèi)。實(shí)施例1SiNW基底的制備和表面修飾如下制備納米結(jié)構(gòu)化細(xì)胞捕獲基底。首先，使用濕化學(xué)蝕刻法將直徑約100 200nm的緊密捆扎的納米線(SiNW)引入硅晶片(例如lcmX2cm)上。將硅基底的表面處理成親水性。在室溫下，將硅晶片分別在丙酮和乙醇中超聲10分鐘和5分鐘，從而從雜質(zhì)中去除有機(jī)潤(rùn)滑脂。然后，在沸騰的Piranha溶液(4 1 (體積/體積)H2SO4M2O2)和RCA 溶液(1 1 5(體積/體積/體積)ΝΗ3/Η202/Η20)中加熱每個(gè)去潤(rùn)滑脂的硅基底1小時(shí)， 并用去離子(deionized，DI)水漂洗硅基底幾次。通過(guò)濕蝕刻方法處理潔凈的硅基底。用 Teflon瓶作為容器，在室溫下使用由去離子水、HF和硝酸銀組成的蝕刻混合物。HF和硝酸銀的濃度分別為4.6M和0.2M。蝕刻時(shí)間根據(jù)所需的納米線長(zhǎng)度而有所不同。蝕刻后，在沸騰的王水(3 1(體積/體積)HCVHNO3)中浸沒(méi)基底15分鐘以去除銀膜。最后，用去離子水漂洗基底，并在氮?dú)庵懈稍?，以用于表面修飾。可以通過(guò)采用不同的蝕刻時(shí)間來(lái)控制這些化學(xué)蝕刻的SiNW的長(zhǎng)度。結(jié)果，我們能夠獲得SiNW長(zhǎng)度為1 25 μ m的一系列SiNW 基底(圖2C)。在制備SiNW基底后，采用NHS-馬來(lái)酰亞胺化學(xué)(圖2B)向SiNW表面上引入鏈霉親和素。用(體積/體積)3-巰基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液在室溫下修飾基底12小時(shí)，或者用4% (體積/體積)3-巰基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液在室溫下修飾基底45分鐘。然后用偶聯(lián)劑N-馬來(lái)酰亞胺丁酰氧基琥珀酰亞胺酯(GMBS，0.25mM)處理基底30分鐘，使GMBS粘附到基底上。然后，用10 μ g/mL鏈霉親和素在室溫下處理基底30 分鐘使其固定到GMBS上。用IXPBS沖洗基底以去除過(guò)量的鏈霉親和素，將鏈霉親和素包被的SiNW基底在PBS緩沖液(pH = 7. 2)的存在下在4°C儲(chǔ)存多至6個(gè)月。在臨用于細(xì)胞捕獲實(shí)驗(yàn)前，將生物素化的抗-EpCAM(R&D)引入鏈霉親和素包被的基底上。實(shí)施例2比較利用SiNW基底和平基底捕獲之細(xì)胞的形態(tài)使用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察納米尺度的細(xì)胞/基底相互作用。為了維持固定于基底之細(xì)胞的形態(tài)，通過(guò)戊二醛固定、四氧化鋨處理和脫水來(lái)處理樣品。簡(jiǎn)言之，在基底上孵育細(xì)胞M小時(shí)后，將細(xì)胞用緩沖于0. IM 二甲胂酸鈉的1. 5 4%戊二醛固定G°C，1 小時(shí))。然后用四氧化鋨后固定(post-fix)細(xì)胞1小時(shí)，用丹寧酸作為媒染劑。經(jīng)一系列醇濃度(30% ,50^^70%和90% )使樣品脫水，用0. 5%乙酸雙氧鈾對(duì)樣品染色，然后進(jìn)一步脫水(96%、100<%和100(%的醇)。在六甲基二硅氮烷(HDMQ中進(jìn)行最后一次脫水而后空氣干燥。干燥后，用金噴覆樣品，然后用加速電壓為IOkeV的Hitachi S800場(chǎng)發(fā)射SEM檢測(cè)?？捎脽晒怙@微鏡觀察細(xì)胞。通過(guò)以1000 1250、80 100和5 20個(gè)細(xì)胞/mL 的細(xì)胞濃度將DiD染色的MCF7乳腺癌細(xì)胞摻入兔血來(lái)制備對(duì)照樣品。在IcmX 2cm的基底上添加25 μ L經(jīng)生物素化的抗-EpCAM (10 μ g/mL,(在含有1 % (重量/體積)BSA和0. 09 % (重量/體積)疊氮化鈉的PBS中)，并孵育30分鐘。用PBS清洗基底。在基底上加入ImL 樣品并孵育45分鐘(37°C，5% C02)。用PBS清洗基底，并用4%多聚甲醛(PFA)的PBS溶液固定基底上捕獲的細(xì)胞20分鐘。為染色和觀察所捕獲的細(xì)胞，將0. 9mL的0. 2% Triton X-100的PBS溶液加至基底并孵育10分鐘。然后向基底上加入DAPI溶液(1 XDAPI試劑的ImL去離子水溶液)并孵育5分鐘。用PBS清洗基底，將基底反轉(zhuǎn)到標(biāo)準(zhǔn)蓋玻片上。用 Nikon TE2000熒光顯微鏡成像并計(jì)數(shù)細(xì)胞。采用顏色、亮度和形態(tài)特征(包括細(xì)胞大小、形狀和細(xì)胞核大小)鑒定潛在的CTC并排除細(xì)胞碎片和非特異性細(xì)胞。顯示雙染色(紅色 DiD+和藍(lán)色DAPI+)并具有某些表型形態(tài)學(xué)特征的細(xì)胞被記為CTC，DAPI+細(xì)胞被記為非特異性細(xì)胞。如圖3A右側(cè)所示，與利用SiNW基底捕獲的細(xì)胞相比，利用平Si基底捕獲的細(xì)胞顯示顯著不同的形態(tài)。圖3A中的插圖是利用平Si基底(上圖)和SiNW基底(下圖)捕獲之細(xì)胞的典型形態(tài)。在平基底上，有圍繞細(xì)胞中央部分(通常包括細(xì)胞核和核周細(xì)胞器) 的板狀偽足連成的薄層。這些結(jié)果表明，盡管細(xì)胞難于附著于平Si基底上，但是細(xì)胞一旦與平Si基底連接即開(kāi)始伸展。與之不同的是，在SiNW基底上，細(xì)胞伸出的許多絲狀偽足在三維(3D)空間中與納米線連接，其使用它們的頂部或中部“抓住”納米線。并且絲狀偽足也如SiNW的橫向尺寸一樣是納米尺度的(約100 150nm)。盡管SiNW是不動(dòng)的，但細(xì)胞表面組分可以自行排布，使得細(xì)胞和基底之間更緊密地局部相互作用。因此，SiNW有利于細(xì)胞捕獲，并且導(dǎo)致對(duì)與平Si基底和SiNW基底相連的細(xì)胞所觀察到的不同形態(tài)。我們還用Daudi B細(xì)胞(即癌性B細(xì)胞)作為靶細(xì)胞以及包被有抗-⑶20的納米結(jié)構(gòu)捕獲Daudi B細(xì)胞來(lái)確認(rèn)了這些結(jié)果。這些結(jié)果在圖:3B中顯示并與使用MCF7乳腺癌細(xì)胞時(shí)觀察到的結(jié)果一致。我們還比較了鄰近放置的SiNW基底和平Si基底的結(jié)合效率。用光蝕刻與化學(xué)蝕刻方法組合在硅基底上施加圖案(圖3C左圖)。我們使用和不用納米線制備帶圖案的基底(圖3D上部)。在與上述類似的表面修飾和細(xì)胞捕獲過(guò)程后，在熒光顯微鏡下觀察帶圖案的基底。在這些實(shí)驗(yàn)中，我們使用MCF7乳腺癌細(xì)胞和包被有抗-EpCAM的納米結(jié)構(gòu)。如圖3D下部所示，與納米線區(qū)域相比，在平區(qū)域上觀察到顯著較少的細(xì)胞。這些結(jié)果與以上獲到的結(jié)果一致，并提供了基于納米線的表面與平表面相比可表現(xiàn)出增強(qiáng)的細(xì)胞捕獲效果的進(jìn)一步證據(jù)。實(shí)施例3捕獲時(shí)間對(duì)細(xì)胞捕獲效率的影響為了確定實(shí)現(xiàn)最大細(xì)胞捕獲所需的最短時(shí)間，我們檢測(cè)了不同孵育時(shí)間下10 μ m SiNW和平Si基底(包被有抗-EpCAM)兩者的細(xì)胞捕獲表現(xiàn)。測(cè)試了 3種表達(dá)EpCAM的癌細(xì)胞(即MCF7、U87腦癌細(xì)胞和PC3前列腺癌細(xì)胞)。圖4A總結(jié)了孵育時(shí)間與基底所固定之細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系。在SiNW基底存在時(shí)，無(wú)論檢測(cè)何種類型的細(xì)胞，均在45分鐘的孵育時(shí)間時(shí)達(dá)到最大細(xì)胞捕獲。在45分鐘的時(shí)間點(diǎn)，與平Si基底相比，IOym SiNW顯示出10倍的更佳之細(xì)胞捕獲效率。對(duì)于平Si基底，觀察到連續(xù)增加的細(xì)胞數(shù)。然而，與利用SiNW 基底所觀察到的相比，平Si基底的總細(xì)胞捕獲數(shù)顯著更低。我們通過(guò)利用三種不同的基底(無(wú)任何表面修飾的SiNW(SiNW-No)、具有鏈霉親和素包被的SiNW基底(SiNW-SA)和用抗-EpCAM修飾的SiNW基底(SiNW-SA-EpCAM))進(jìn)行類似的細(xì)胞捕獲實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)此高捕獲產(chǎn)率是否由于SiNW的非特異性相互作用所致。利用 SiNW-No和SiNW-SA基底捕獲之細(xì)胞數(shù)少于利用SiNW基底捕獲之細(xì)胞數(shù)的5% (圖幻。因此，利用SiNW基底的高細(xì)胞捕獲產(chǎn)率是由于SiNW和細(xì)胞表面組分之間的物理局部相互作用以及抗-EpCAM與細(xì)胞表面上之EpCAM之間的化學(xué)識(shí)別的協(xié)作作用所致。實(shí)施例4SiNW長(zhǎng)度對(duì)細(xì)胞捕獲效率的影響我們?cè)诩?xì)胞捕獲實(shí)驗(yàn)中使用了 SiNW長(zhǎng)度為4、6、8、10和20 μ m的一系列SiNW基底。在SiNW基底和平基底上靜態(tài)孵育含有癌細(xì)胞系(即MCF7、U87腦癌細(xì)胞或PC3前列腺癌細(xì)胞)的樣品。在兩種基底上均包被抗-EpCAM，如圖4B所示，增加的SiNW縱向尺寸使所捕獲的細(xì)胞數(shù)增加。當(dāng)SiNW的長(zhǎng)度大于6μπι時(shí)實(shí)現(xiàn)最大細(xì)胞捕獲效率。實(shí)施例5從摻雜的全血樣品中靜態(tài)捕獲CTC我們測(cè)試了我們的裝置進(jìn)行靜態(tài)細(xì)胞捕獲的能力。通過(guò)以1000、100和5個(gè)細(xì)胞 /mL血液的細(xì)胞密度將表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)的U87細(xì)胞摻入兔血來(lái)制備人工的含CTC之血液樣品。在10 μ m EpCAM包被的SiNW基底上孵育所摻雜的樣品45分鐘。如表1所示，我們的方法具有高捕獲產(chǎn)率(> 40%)、高特異性(>40%)和高靈敏度(> 90%)。這些結(jié)果表明，本發(fā)明的裝置比現(xiàn)有領(lǐng)先技術(shù)(即具有非常低靈敏度(約20 60% )和非常低特異性(約0. )的免疫磁珠法)表現(xiàn)更佳。
權(quán)利要求
1.用于捕獲生物細(xì)胞的裝置，其包含包含納米結(jié)構(gòu)化表面區(qū)域的基底；和連接至所述基底之所述納米結(jié)構(gòu)化表面區(qū)域的多個(gè)結(jié)合劑，其中所述納米結(jié)構(gòu)化表面區(qū)域包含多個(gè)納米結(jié)構(gòu)，每個(gè)所述納米結(jié)構(gòu)具有縱向尺寸和橫向尺寸，所述縱向尺寸至少10倍于所述橫向尺寸，并且其中生物細(xì)胞被協(xié)作作用的所述結(jié)合劑和所述多個(gè)納米結(jié)構(gòu)選擇性地捕獲。
2.權(quán)利要求1的裝置，其中所述基底是硅基底，并且所述多個(gè)納米結(jié)構(gòu)是硅納米線或納米纖維。
3.權(quán)利要求1的裝置，其中所述基底是金屬基底，并且所述多個(gè)納米結(jié)構(gòu)是金屬納米線或納米纖維。
4.權(quán)利要求3的裝置，其中所述金屬基底包含鈦、鋁或鋼中的至少一種。
5.權(quán)利要求1的裝置，其中所述基底是無(wú)機(jī)氧化物基底，并且所述多個(gè)納米結(jié)構(gòu)是無(wú)機(jī)氧化物納米線或納米纖維。
6.權(quán)利要求5的裝置，其中所述無(wú)機(jī)氧化物基底包含鋅氧化物、硅氧化物、鈦氧化物或鋁氧化物中的至少一種。
7.權(quán)利要求1的裝置，其中所述基底是聚合物基底，并且所述多個(gè)納米結(jié)構(gòu)是聚合物納米線或納米纖維。
8.權(quán)利要求7的裝置，其中所述聚合物基底包含聚甲基丙烯酸甲酯、多糖或聚交酯中的至少一種。
9.權(quán)利要求2 8中任一項(xiàng)的裝置，其中所述納米線或納米纖維與所述基底的主體部分形成整體。
10.權(quán)利要求2 9中任一項(xiàng)的裝置，其中所述納米線或納米纖維沉積于所述基底上。
11.權(quán)利要求1 10中任一項(xiàng)的裝置，其中所述縱向尺寸至少為6μπι長(zhǎng)。
12.權(quán)利要求1 11中任一項(xiàng)的裝置，其中所述橫向尺寸大于30nm并且小于400nm。
13.權(quán)利要求1 12中任一項(xiàng)的裝置，其中所述基底的所述納米結(jié)構(gòu)化表面區(qū)域包被有鏈霉親和素，所述結(jié)合劑是生物素化的并且連接至所述包被有鏈霉親和素之基底的所述納米結(jié)構(gòu)化表面區(qū)域。
14.權(quán)利要求1 13中任一項(xiàng)的裝置，其中所述多個(gè)結(jié)合劑包含DNA、肽、適配體和抗體中的一種或多種。
15.權(quán)利要求1 13中任一項(xiàng)的裝置，其中所述多個(gè)結(jié)合劑包含多個(gè)針對(duì)腫瘤細(xì)胞的過(guò)表達(dá)抗體。
16.權(quán)利要求1 13中任一項(xiàng)的裝置，其中所述多個(gè)結(jié)合劑是多個(gè)抗上皮細(xì)胞粘附分子抗體(抗-EpCAM)。
17.權(quán)利要求1 13中任一項(xiàng)的裝置，其中所述多個(gè)結(jié)合劑是多個(gè)針對(duì)免疫細(xì)胞的抗體。
18.權(quán)利要求1 17中任一項(xiàng)的裝置，其還包含連接至所述基底的流動(dòng)層以形成微流體通道，從而在運(yùn)行時(shí)所述基底之所述納米結(jié)構(gòu)化表面區(qū)域的至少一部分與流經(jīng)所述微流體通道的流體相接觸，其中所述用于捕獲生物細(xì)胞的裝置是微流體裝置。
19.權(quán)利要求18的裝置，其中所述流動(dòng)層包含帶紋理的表面，其引起混沌流以增加所述生物細(xì)胞與所述基底之所述納米結(jié)構(gòu)化表面區(qū)域接觸從而被捕獲的可能性。
20.權(quán)利要求19的裝置，其中所述帶紋理的表面包含多個(gè)相對(duì)于流體流動(dòng)之主要方向取向的結(jié)構(gòu)。
21.權(quán)利要求20的裝置，其中所述多個(gè)結(jié)構(gòu)以鯡魚骨狀圖案取向。
22.權(quán)利要求18 21中任一項(xiàng)的裝置，其中所述流動(dòng)層包含彈性材料聚合物。
23.權(quán)利要求22的裝置，其中所述彈性材料聚合物包括硅酮聚合物、聚二甲基硅氧烷 (PDMS)和聚四氟乙烯(Teflon)中的一種或多種。
24.用于捕獲生物細(xì)胞的微流體裝置，其包含包含納米結(jié)構(gòu)化表面區(qū)域的基底；連接至所述基底以形成微流體通道的流動(dòng)層，從而在運(yùn)行時(shí)所述基底之所述納米結(jié)構(gòu)化表面區(qū)域的至少一部分與流經(jīng)所述微流體通道的流體相接觸；和連接至所述基底之所述納米結(jié)構(gòu)化表面區(qū)域的多個(gè)結(jié)合劑，其中所述納米結(jié)構(gòu)化表面區(qū)域包含多個(gè)納米結(jié)構(gòu)，每個(gè)所述納米結(jié)構(gòu)具有縱向尺寸和橫向尺寸，并且其中生物細(xì)胞被協(xié)作作用的所述結(jié)合劑和所述多個(gè)納米結(jié)構(gòu)選擇性地捕獲。
25.權(quán)利要求對(duì)的微流體裝置，其中所述基底是硅基底，并且所述多個(gè)納米結(jié)構(gòu)是硅納米線或納米纖維。
26.權(quán)利要求M的微流體裝置，其中所述基底是金屬基底，并且所述多個(gè)納米結(jié)構(gòu)是金屬納米線或納米纖維。
27.權(quán)利要求沈的微流體裝置，其中所述金屬基底包含鈦、鋁或鋼中的至少一種。
28.權(quán)利要求對(duì)的微流體裝置，其中所述基底是無(wú)機(jī)氧化物基底，并且所述多個(gè)納米結(jié)構(gòu)是無(wú)機(jī)氧化物納米線或納米纖維。
29.權(quán)利要求觀的微流體裝置，其中所述無(wú)機(jī)氧化物基底包含鋅氧化物、硅氧化物、鈦氧化物或鋁氧化物中的至少一種。
30.權(quán)利要求M的微流體裝置，其中所述基底是聚合物基底，并且所述多個(gè)納米結(jié)構(gòu)是聚合物納米線或納米纖維。
31.權(quán)利要求30的微流體裝置，其中所述聚合物基底包含聚甲基丙烯酸甲酯、多糖或聚交酯中的至少一種。
32.權(quán)利要求25 31中任一項(xiàng)的微流體裝置，其中所述納米線或納米纖維與所述基底的主體部分形成整體。
33.權(quán)利要求25 32中任一項(xiàng)的微流體裝置，其中所述納米線或納米纖維沉積于所述基底上。
34.權(quán)利要求M 33中任一項(xiàng)的微流體裝置，其中所述縱向尺寸至少為6μ m長(zhǎng)。
35.權(quán)利要求M 34中任一項(xiàng)的微流體裝置，其中所述橫向尺寸大于30nm并且小于 400nmo
36.權(quán)利要求M 35中任一項(xiàng)的微流體裝置，其中所述基底之所述納米結(jié)構(gòu)化表面區(qū)域包被有鏈霉親和素，所述結(jié)合劑是生物素化的并且連接至所述包被有鏈霉親和素之基底的所述納米結(jié)構(gòu)化表面區(qū)域。
37.權(quán)利要求24 36中任一項(xiàng)的微流體裝置，其中所述多個(gè)結(jié)合劑包含DNA、肽、適配體和抗體中的一種或多種。
38.權(quán)利要求對(duì) 36中任一項(xiàng)的微流體裝置，其中所述多個(gè)結(jié)合劑包含多個(gè)針對(duì)腫瘤細(xì)胞的過(guò)表達(dá)抗體。
39.權(quán)利要求M 36中任一項(xiàng)的微流體裝置，其中所述多個(gè)結(jié)合劑是多個(gè)抗上皮細(xì)胞粘附分子抗體(抗-EpCAM)。
40.權(quán)利要求M 36中任一項(xiàng)的微流體裝置，其中所述多個(gè)結(jié)合劑是多個(gè)針對(duì)免疫細(xì)胞的抗體。
41.權(quán)利要求M的微流體裝置，其中所述流動(dòng)層包含帶紋理的表面，其引起混沌流以增加所述生物細(xì)胞與所述基底之所述納米結(jié)構(gòu)化表面區(qū)域接觸從而被捕獲的可能性。
42.權(quán)利要求41的微流體裝置，其中所述帶紋理的表面包含多個(gè)相對(duì)于流體流動(dòng)之主要方向取向的結(jié)構(gòu)。
43.權(quán)利要求42的微流體裝置，其中所述多個(gè)結(jié)構(gòu)以鯡魚骨狀圖案取向。
44.權(quán)利要求M 43中任一項(xiàng)的裝置，其中所述流動(dòng)層包含彈性材料聚合物。
45.權(quán)利要求44的裝置，其中所述彈性材料聚合物包括硅酮聚合物、聚二甲基硅氧烷 (PDMS)和聚四氟乙烯(Teflon)中的一種或多種。
46.權(quán)利要求M 45中任一項(xiàng)的裝置，其還包含流體輸入微通道。
47.權(quán)利要求M 46中任一項(xiàng)的裝置，其還包含與所述微流體裝置流體連通的泵。
48.從細(xì)胞樣品中選擇性分離生物細(xì)胞的方法，其包括在使所述結(jié)合劑與生物細(xì)胞亞群選擇性結(jié)合的條件下，使所述細(xì)胞樣品與權(quán)利要求 1 47中任一項(xiàng)的裝置接觸，得到所結(jié)合的生物細(xì)胞；以及從所述裝置中去除未結(jié)合的生物細(xì)胞。
49.權(quán)利要求48的方法，其還包括用含水介質(zhì)清洗所捕獲的生物細(xì)胞。
50.權(quán)利要求48或49的方法，其中所述細(xì)胞樣品包括體液、血漿、唾液、脊髓液和尿液中的一種或多種。
51.權(quán)利要求48 50中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物細(xì)胞亞群包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞。
52.從細(xì)胞樣品中選擇性分離至少一個(gè)靶生物細(xì)胞的方法，其包括在使所述靶細(xì)胞與連接至所述納米結(jié)構(gòu)之所述結(jié)合劑有效結(jié)合的條件下，提供包含至少一個(gè)靶生物細(xì)胞的細(xì)胞樣品；以及將所述細(xì)胞樣品與多個(gè)納米結(jié)構(gòu)接觸，從而導(dǎo)致所述靶生物細(xì)胞被捕獲，其中特異性針對(duì)并結(jié)合所述靶生物細(xì)胞的多個(gè)結(jié)合劑與所述納米結(jié)構(gòu)連接；得到所結(jié)合的生物細(xì)胞。
53.權(quán)利要求52的方法，其還包括用含水介質(zhì)清洗所結(jié)合的生物細(xì)胞。
54.權(quán)利要求52或53的方法，其還包括檢測(cè)所述靶生物細(xì)胞的存在情況。
55.權(quán)利要求52 M中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞樣品包括體液、血漿、唾液、脊髓液和尿液中的一種或多種。
56.權(quán)利要求52 55中任一項(xiàng)的方法，其中所述靶生物細(xì)胞包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞。
57.權(quán)利要求52 56中任一項(xiàng)的方法，其中所述多個(gè)結(jié)合劑包括DNA、肽、適配體和抗體中的一種或多種。
58.權(quán)利要求52 56中任一項(xiàng)的方法，其中所述多個(gè)結(jié)合劑包括多個(gè)針對(duì)腫瘤細(xì)胞的過(guò)表達(dá)抗體。
59.權(quán)利要求52 56中任一項(xiàng)的方法，其中所述多個(gè)結(jié)合劑是多個(gè)抗上皮細(xì)胞粘附分子抗體(抗-EpCAM)。
60.權(quán)利要求52 56中任一項(xiàng)的方法，其中所述多個(gè)結(jié)合劑是多個(gè)針對(duì)免疫細(xì)胞的抗體。
61.用于從細(xì)胞樣品中分離至少一個(gè)靶生物細(xì)胞的試劑盒，其包含權(quán)利要求1 47中任一項(xiàng)的裝置。
62.權(quán)利要求61的試劑盒，其還包含從哺乳動(dòng)物對(duì)象中獲取樣品和從所述樣品中分離生物細(xì)胞的說(shuō)明。
63.權(quán)利要求61或62的試劑盒，其中所述靶生物細(xì)胞包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于捕獲稀少細(xì)胞的裝置和方法。使用本文所述的裝置和方法可用于輔助診斷和監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)移癌。
文檔編號(hào)B82B3/00GK102405411SQ201080017232
公開(kāi)日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2010年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月18日
發(fā)明者劉侃, 曾憲榮, 王樹(shù)濤, 王浩 申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)