用于使用微流體的多個(gè)單細(xì)胞捕獲和處理的方法、系統(tǒng)和設(shè)備的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明描述了使用微流體的多個(gè)單細(xì)胞捕獲和處理的方法、系統(tǒng)和設(shè)備。提供了用于從較大的細(xì)胞群體中捕獲、分配和/或操縱單個(gè)細(xì)胞同時(shí)產(chǎn)生基因信息和/或涉及每個(gè)單個(gè)細(xì)胞的反應(yīng)，工具和技術(shù)被提供。不同的捕獲配置可被利用以捕獲單個(gè)細(xì)胞，且然后在多室反應(yīng)配置中處理每個(gè)單個(gè)細(xì)胞。一些實(shí)施方案可提供已從細(xì)胞的較大群體中分配的多個(gè)單個(gè)細(xì)胞的特異性靶擴(kuò)增、全基因組擴(kuò)增、全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增、實(shí)時(shí)PCR制備、拷貝數(shù)變化、預(yù)擴(kuò)增、mRNA測(cè)序和/或單體型分析。一些實(shí)施方案可提供其它應(yīng)用。一些實(shí)施方案可被配置用于成像單個(gè)細(xì)胞或關(guān)聯(lián)的反應(yīng)產(chǎn)物作為處理的一部分。在一些情況下，反應(yīng)產(chǎn)物可被收集和/或進(jìn)一步分析。
【專利說明】用于使用微流體的多個(gè)單細(xì)胞捕獲和處理的方法、系統(tǒng)和設(shè)備
[0001]背景
[0002]在過去的幾十年，執(zhí)行生物系統(tǒng)的分子和細(xì)胞分析的能力爆發(fā)式地增長(zhǎng)。特別地，分子和細(xì)胞技術(shù)的出現(xiàn)和改善，諸如DNA測(cè)序、基因克隆、單克隆抗體產(chǎn)生、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、擴(kuò)增技術(shù)(諸如PCR)和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的形成，已經(jīng)加速了這種爆發(fā)增長(zhǎng)。這些技術(shù)已經(jīng)引起鑒定的基因、編碼蛋白、工程化的細(xì)胞類型和研究這些基因、蛋白和細(xì)胞種類的分析的壓倒性的數(shù)量。因?yàn)闃悠?、試劑和流程可能的組合的數(shù)量變得幾乎無法估量，變得越來越明顯的是，甚至新的方法可能是必要的以解決這種復(fù)雜性，尤其是在合理的時(shí)間和金錢的限制內(nèi)。
[0003]概述
[0004]描述了用于使用微流體的多個(gè)單細(xì)胞捕獲和處理的方法、系統(tǒng)和設(shè)備。實(shí)施方案可以提供用于從細(xì)胞的較大群體中捕獲、分配和/或操縱單個(gè)細(xì)胞同時(shí)產(chǎn)生涉及每個(gè)單個(gè)細(xì)胞的遺傳信息和/或反應(yīng)產(chǎn)物。一些實(shí)施方案可提供用于已從細(xì)胞的較大群體中分配的多個(gè)單個(gè)細(xì)胞的特異性靶擴(kuò)增(STA)、全基因組擴(kuò)增(WGA)、全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增(WTA)、實(shí)時(shí)PCR制備和/或單體型分析。一些實(shí)施方案可提供其它應(yīng)用。一些特定的實(shí)施方案提供多個(gè)單個(gè)細(xì)胞的mRNA測(cè)序或預(yù)擴(kuò)增。一些實(shí)施方案可被配置用于成像單個(gè)細(xì)胞或相關(guān)的反應(yīng)產(chǎn)物作為處理的一部分。在一些情形中，反應(yīng)產(chǎn)物可被收集和/或進(jìn)一步分析。
[0005]方法、系統(tǒng)和設(shè)備可包括用于利用微流體捕獲和處理多個(gè)單細(xì)胞的不同的微流體設(shè)備和/或控制器。一些微流體設(shè)備被提供，其可包括多個(gè)捕獲配置和多個(gè)多室反應(yīng)配置。每個(gè)捕獲配置可被配置以從多個(gè)細(xì)胞中捕獲單個(gè)細(xì)胞。然后，每個(gè)多室反應(yīng)配置可被用于在細(xì)胞被裂解后處理每個(gè)細(xì)胞。反應(yīng)產(chǎn)物可從每個(gè)多室反應(yīng)配置收集。微流體控制器也被提供，其可被用于操作微流體設(shè)備以從多個(gè)細(xì)胞中捕獲和處理單個(gè)細(xì)胞。
[0006]一些實(shí)施方案包括用于多個(gè)單細(xì)胞捕獲和處理的微流體設(shè)備。微流體設(shè)備可包括:多個(gè)串聯(lián)耦合的捕獲配置，其中每個(gè)各自捕獲配置被配置以捕獲單細(xì)胞；和多個(gè)多室反應(yīng)配置，其中每個(gè)各自多室反應(yīng)配置與來自多個(gè)捕獲配置的各自捕獲配置耦合，并被配置用于單細(xì)胞處理。
[0007]在一些實(shí)施方案中，每個(gè)各自捕獲配置包括一個(gè)或更多個(gè)限定大小以僅容納單細(xì)胞的物理障礙物。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)各自捕獲配置包括:與輸入通道和輸出通道耦合的一個(gè)或更多個(gè)旁路通道；與輸入通道和輸出通道耦合的引流溝；和/或位于靠近輸入通道和一個(gè)或更多個(gè)旁路通道的連接點(diǎn)且與引流溝耦合的捕獲巢，其中捕獲巢被配置以從多個(gè)細(xì)胞中捕獲單細(xì)胞，使得當(dāng)單細(xì)胞在捕獲巢被捕獲時(shí)，剩余的多個(gè)細(xì)胞被轉(zhuǎn)移到一個(gè)或更多個(gè)旁路通道中的至少一個(gè)。一個(gè)或更多個(gè)旁路通道可包括第一旁路通道和第二旁路通道。第一旁路通道和第二旁路通道可被對(duì)稱地配置。對(duì)稱地配置的第一旁路通道和第二旁路通道可包括第一翼配置和第二翼配置。
[0008]在一些實(shí)施方案中，至少輸入通道或輸出通道被進(jìn)一步配置為集中通道。集中通道可包括在至少水平方向或垂直方向的縮小通道。多個(gè)多室反應(yīng)配置還被配置用于在各自多室反應(yīng)配置的一個(gè)或更多個(gè)閥門可被驅(qū)動(dòng)時(shí)熱循環(huán)。
[0009]一些實(shí)施方案包括一個(gè)或更多個(gè)成像特征，其中每個(gè)各自成像特征允許在各自捕獲巢位點(diǎn)捕獲的單細(xì)胞的成像。一些實(shí)施方案多個(gè)收集孔，其中每個(gè)各自的收集孔與各自多室反應(yīng)配置耦合，且配置以遞送反應(yīng)產(chǎn)物用于進(jìn)一步分析。
[0010]一些實(shí)施方案還包括基因組分析配置，其與每個(gè)各自多室反應(yīng)配置耦合以進(jìn)一步分析來自每個(gè)各自多室反應(yīng)配置的反應(yīng)產(chǎn)物。
[0011]在一些實(shí)施方案中，每個(gè)各自捕獲配置包括配置以從有限稀釋中捕獲單個(gè)細(xì)胞的捕獲室。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)捕獲室被配置以利用隨機(jī)捕獲過程捕獲單個(gè)細(xì)胞。
[0012]在一些實(shí)施方案中，每個(gè)各自捕獲配置包括:捕獲區(qū)室；和/或覆蓋捕獲區(qū)室的離散區(qū)域的結(jié)合伴侶，其中離散部分被限定大小使得僅單細(xì)胞結(jié)合到離散區(qū)域。一些實(shí)施方案包括一個(gè)或更多個(gè)捕獲支持物，其中每個(gè)捕獲支持物包括分布在捕獲支持物的至少一部分的結(jié)合伴侶。一個(gè)或更多個(gè)捕獲支持物可包括一個(gè)或更多個(gè)珠結(jié)構(gòu)。一些實(shí)施方案包括捕獲特征，其被配置以捕獲一個(gè)或更多個(gè)捕獲支持物。
[0013]一些實(shí)施方案包括用于使用微流體的多個(gè)單細(xì)胞捕獲和處理的方法。所述方法可包括:裝載多個(gè)細(xì)胞到微流體設(shè)備中；流動(dòng)多個(gè)細(xì)胞到微流體設(shè)備的第一捕獲配置；從第一捕獲配置的多個(gè)細(xì)胞中捕獲第一單細(xì)胞；流動(dòng)來自多個(gè)細(xì)胞中的第一剩余多個(gè)細(xì)胞到微流體設(shè)備的第二捕獲配置；在第二捕獲配置中從第一剩余多個(gè)細(xì)胞中捕獲第二單細(xì)胞；和/或執(zhí)行至少第一捕獲的單細(xì)胞和第二捕獲的單細(xì)胞的多級(jí)處理，以產(chǎn)生關(guān)于微流體設(shè)備上至少第一捕獲的單細(xì)胞和第二捕獲的單細(xì)胞的各自收集產(chǎn)物。
[0014]捕獲至少第一單細(xì)胞或第二單細(xì)胞可包括利用一個(gè)或更多個(gè)限定大小以僅容納單細(xì)胞的物理障礙物捕獲至少第一單細(xì)胞或第二單細(xì)胞。一些實(shí)施方案包括流動(dòng)來自多個(gè)細(xì)胞的第一剩余多個(gè)細(xì)胞通過第一捕獲配置的一個(gè)或更多個(gè)旁路通道到與第二捕獲配置耦合的流動(dòng)通道，所述第二捕獲配置與第一捕獲配置的第一輸出通道耦合。一些實(shí)施方案包括流動(dòng)來自第一剩余多個(gè)細(xì)胞的第二剩余多個(gè)細(xì)胞，通過一個(gè)或更多個(gè)第二旁路通道到第二捕獲配置的出口，通過第二輸出通道到第三捕獲配置。
[0015]在一些實(shí)施方案中，第一捕獲配置包括:與第一輸入通道和第一輸出通道耦合的一個(gè)或更多個(gè)旁路通道；與第一輸入通道和第一輸出通道耦合的第一引流溝；和/或與第一引流溝耦合且配置以從多個(gè)細(xì)胞中捕獲單個(gè)細(xì)胞的第一捕獲巢。第二捕獲配置可包括:與第二輸入通道和第二輸出通道耦合的多個(gè)旁路通道，其中第二輸入通道與第一捕獲配置的第一輸出通道耦合；與第二輸入通道和第二輸出通道耦合的第二引流溝；和/或與第二引流溝耦合且配置以從第一剩余的多個(gè)細(xì)胞中捕獲單個(gè)細(xì)胞的第二捕獲巢。
[0016]在一些實(shí)施方案中，執(zhí)行至少第一捕獲的單細(xì)胞和第二捕獲的單細(xì)胞的多級(jí)處理以產(chǎn)生關(guān)于微流體設(shè)備上的至少第一捕獲的單細(xì)胞和第二捕獲的單細(xì)胞的各自收集產(chǎn)物，包括在微流體設(shè)備上裂解每個(gè)各自單獨(dú)捕獲的細(xì)胞以釋放每個(gè)各自細(xì)胞的一種或更多種成分。執(zhí)行至少第一捕獲的單細(xì)胞和第二捕獲的單細(xì)胞的多級(jí)處理以產(chǎn)生關(guān)于微流體設(shè)備上的至少第一捕獲的單細(xì)胞和第二捕獲的單細(xì)胞的各自收集產(chǎn)物，可包括流動(dòng)每個(gè)各自捕獲的細(xì)胞的一種或更多種成分到微流體設(shè)備的各自多室反應(yīng)配置用于進(jìn)一步處理。執(zhí)行至少第一捕獲的單細(xì)胞和第二捕獲的單細(xì)胞的多級(jí)處理以產(chǎn)生關(guān)于微流體設(shè)備上的至少第一捕獲的單細(xì)胞和第二捕獲的單細(xì)胞的各自收集產(chǎn)物可包括當(dāng)流動(dòng)一種或更多種成分通過微流體設(shè)備的各自多室反應(yīng)配置一個(gè)或更多個(gè)方面時(shí)執(zhí)行熱循環(huán)程序。執(zhí)行至少第一捕獲的單細(xì)胞和第二捕獲的單細(xì)胞的多級(jí)處理以產(chǎn)生關(guān)于微流體設(shè)備上的至少第一捕獲的單細(xì)胞和第二捕獲的單細(xì)胞的各自收集產(chǎn)物，可包括在微流體設(shè)備中，用一種或更多種試劑洗滌每個(gè)各自捕獲的細(xì)胞。執(zhí)行至少第一捕獲的單細(xì)胞和第二捕獲的單細(xì)胞的多級(jí)處理以產(chǎn)生關(guān)于微流體設(shè)備上的至少第一捕獲的單細(xì)胞和第二捕獲的單細(xì)胞的各自收集產(chǎn)物，可包括在微流體設(shè)備中，用一種或更多種試劑給藥每個(gè)各自捕獲的細(xì)胞。
[0017]執(zhí)行至少第一捕獲的單細(xì)胞和第二捕獲的單細(xì)胞的多級(jí)處理以產(chǎn)生關(guān)于微流體設(shè)備上的至少第一捕獲的單細(xì)胞和第二捕獲的單細(xì)胞的各自收集產(chǎn)物，可包括在微流體設(shè)備內(nèi)執(zhí)行預(yù)擴(kuò)增過程。執(zhí)行至少第一捕獲的單細(xì)胞和第二捕獲的單細(xì)胞的多級(jí)處理以產(chǎn)生關(guān)于微流體設(shè)備上的至少第一捕獲的單細(xì)胞和第二捕獲的單細(xì)胞的各自收集產(chǎn)物，可包括在微流體設(shè)備內(nèi)執(zhí)行mRNA測(cè)序過程。執(zhí)行至少第一捕獲的單細(xì)胞和第二捕獲的單細(xì)胞的多級(jí)處理以產(chǎn)生關(guān)于微流體設(shè)備上的至少第一捕獲的單細(xì)胞和第二捕獲的單細(xì)胞的各自收集產(chǎn)物，可包括在微流體設(shè)備內(nèi)執(zhí)行至少特異性靶擴(kuò)增、全基因組擴(kuò)增、全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增、實(shí)時(shí)PCR制備、拷貝數(shù)變化或單體型分析。執(zhí)行至少第一捕獲的單細(xì)胞和第二捕獲的單細(xì)胞的多級(jí)處理以產(chǎn)生關(guān)于微流體設(shè)備上的至少第一捕獲的單細(xì)胞和第二捕獲的單細(xì)胞的各自收集產(chǎn)物，可包括標(biāo)記來自與各自捕獲的細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的進(jìn)一步處理的反應(yīng)產(chǎn)物用于識(shí)別目的。
[0018]一些實(shí)施方案包括收集來自微流體設(shè)備的多個(gè)收集孔的收集產(chǎn)物。一些實(shí)施方案包括處理收集產(chǎn)物。一些實(shí)施方案包括在微流體設(shè)備內(nèi)成像至少各自捕獲細(xì)胞或收集的產(chǎn)物。
[0019]在一些實(shí)施方案中，捕獲至少第一單細(xì)胞或第二單細(xì)胞包括利用配置以從有限稀釋中捕獲單個(gè)細(xì)胞的捕獲室捕獲至少第一單細(xì)胞或第二單細(xì)胞。捕獲至少第一單細(xì)胞或第二單細(xì)胞可包括利用隨機(jī)捕獲過程捕獲至少第一單細(xì)胞或第二單細(xì)胞。捕獲至少第一單細(xì)胞或第二單細(xì)胞可包括:利用以下捕獲至少第一單細(xì)胞或第二單細(xì)胞:捕獲區(qū)室；和/或覆蓋捕獲區(qū)室的離散區(qū)域的結(jié)合伴侶，其中離散部分被限定大小使得僅單細(xì)胞結(jié)合到離散區(qū)域。捕獲至少第一單細(xì)胞或第二單細(xì)胞可包括:利用一個(gè)或更多個(gè)捕獲支持物捕獲至少第一單細(xì)胞或第二單細(xì)胞，其中每個(gè)捕獲支持物包括分布在捕獲支持物至少一部分上的結(jié)合伴侶。一個(gè)或更多個(gè)捕獲支持物可包括一個(gè)或更多個(gè)珠結(jié)構(gòu)。一些實(shí)施方案還包括捕獲特征，其被配置以捕獲捕獲支持物。
[0020]一些實(shí)施方案包括預(yù)擴(kuò)增方法，其利用配置以從多個(gè)細(xì)胞中捕獲和處理單個(gè)細(xì)胞的微流體設(shè)備。所述方法可包括:利用一種或更多種溶液?jiǎn)?dòng)微流體設(shè)備；流動(dòng)多個(gè)細(xì)胞通過微流體設(shè)備，使得在微流體設(shè)備的單個(gè)捕獲位點(diǎn)從多個(gè)細(xì)胞中捕獲單個(gè)細(xì)胞；裂解在微流體設(shè)備的單個(gè)捕獲位點(diǎn)的多個(gè)捕獲的單個(gè)細(xì)胞；在微流體設(shè)備內(nèi)，在多個(gè)單個(gè)裂解的細(xì)胞上執(zhí)行逆轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生與每個(gè)各自單個(gè)細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；和/或在微流體設(shè)備內(nèi)，在與每個(gè)各自裂解的單個(gè)細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的各自逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上執(zhí)行預(yù)擴(kuò)增以產(chǎn)生與每個(gè)單個(gè)捕獲細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0021]一些實(shí)施方案包括從微流體設(shè)備的多個(gè)收集入口遞送與每個(gè)單個(gè)捕獲細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物到各自收集入口。一些實(shí)施方案包括裝載一種或更多種溶液到微流體設(shè)備。在一些實(shí)施方案中，一種或更多種溶液包括至少一種或更多種試劑或一種或更多種緩沖液。
[0022]一些實(shí)施方案包括裝載多個(gè)細(xì)胞到微流體設(shè)備。一些實(shí)施方案包括成像在微流體設(shè)備上的一個(gè)或更多個(gè)捕獲的單個(gè)細(xì)胞。一些實(shí)施方案包括裝載至少一種或更多種裂解試齊U、一種或更多種逆轉(zhuǎn)錄試劑、或一種或更多種預(yù)擴(kuò)增試劑到微流體設(shè)備。一些實(shí)施方案包括:移除一個(gè)或更多個(gè)收集入口的一個(gè)或更多個(gè)保護(hù)層；和/或從微流體設(shè)備的多個(gè)收集入口的每個(gè)各自收集入口收集預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0023]一些實(shí)施方案包括染色在微流體設(shè)備上的單個(gè)捕獲細(xì)胞的一個(gè)或更多個(gè)。一些實(shí)施方案包括基于染色確定單個(gè)捕獲細(xì)胞的一個(gè)或更多個(gè)為存活或死亡。一些實(shí)施方案包括基于成像確定單個(gè)捕獲細(xì)胞的一個(gè)或更多個(gè)為存活或死亡。
[0024]在一些實(shí)施方案中，利用的微流體設(shè)備包括串聯(lián)耦合的多個(gè)捕獲配置，每個(gè)各自捕獲配置包括:與輸入通道和輸出通道耦合的多個(gè)旁路通道；與輸入通道和輸出通道耦合的引流溝；和/或位于靠近輸入通道和多個(gè)旁路通道的連接點(diǎn)且與引流溝耦合的捕獲巢，其中捕獲巢被配置以從多個(gè)細(xì)胞中捕獲單個(gè)細(xì)胞，使得當(dāng)單個(gè)細(xì)胞在捕獲巢被捕獲時(shí)，剩余的多個(gè)細(xì)胞被轉(zhuǎn)移到多個(gè)旁路通道中的至少一個(gè)，其中捕獲巢包括單個(gè)捕獲位點(diǎn)的一個(gè)。微流體設(shè)備還可以包括多個(gè)多室反應(yīng)配置，其中每個(gè)各自多室反應(yīng)配置與來自多個(gè)捕獲配置中的各自捕獲配置耦合，且被配置用于單細(xì)胞處理。
[0025]一些實(shí)施方案包括預(yù)擴(kuò)增方法，其利用配置以從多個(gè)細(xì)胞中捕獲和處理單個(gè)細(xì)胞的微流體設(shè)備。所述方法可包括:裝載一種或更多種溶液到微流體設(shè)備；利用一種或更多種溶液?jiǎn)?dòng)微流體設(shè)備；裝載多個(gè)細(xì)胞到微流體設(shè)備；流動(dòng)多個(gè)細(xì)胞通過微流體設(shè)備使得在微流體設(shè)備的單個(gè)捕獲位點(diǎn)從多個(gè)細(xì)胞捕獲單個(gè)細(xì)胞；成像在微流體設(shè)備上的捕獲的單個(gè)細(xì)胞的一個(gè)或更多個(gè)；裝載至少一種或更多種裂解試劑、一種或更多種逆轉(zhuǎn)錄試劑、或一種或更多種預(yù)擴(kuò)增試劑到微流體設(shè)備；裂解在微流體設(shè)備的單個(gè)捕獲位點(diǎn)捕獲的多個(gè)單個(gè)細(xì)胞；在微流體設(shè)備內(nèi)，在多個(gè)單個(gè)裂解的細(xì)胞上執(zhí)行逆轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生與每個(gè)各自單個(gè)細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；在微流體設(shè)備內(nèi)，在與每個(gè)各自裂解的單個(gè)細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的各自逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上執(zhí)行預(yù)擴(kuò)增以產(chǎn)生與每個(gè)單個(gè)捕獲細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物；從微流體設(shè)備的多個(gè)收集入口遞送與每個(gè)單個(gè)捕獲細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物到各自收集入口 ；移除一個(gè)或更多個(gè)收集入口的一個(gè)或更多個(gè)保護(hù)層；和/或從微流體設(shè)備的多個(gè)收集入口的每個(gè)各自收集入口收集預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0026]一些實(shí)施方案包括mRNA測(cè)序方法，其利用配置以從多個(gè)細(xì)胞中捕獲和處理單個(gè)細(xì)胞的微流體設(shè)備。所述方法可包括:利用一種或更多種溶液?jiǎn)?dòng)微流體設(shè)備；流動(dòng)多個(gè)細(xì)胞通過微流體設(shè)備，使得在微流體設(shè)備的單個(gè)捕獲位點(diǎn)從多個(gè)細(xì)胞中捕獲單個(gè)細(xì)胞；裂解在微流體設(shè)備的單個(gè)捕獲位點(diǎn)的多個(gè)捕獲的單個(gè)細(xì)胞；在微流體設(shè)備內(nèi)，在多個(gè)單個(gè)裂解的細(xì)胞上執(zhí)行逆轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生與每個(gè)各自單個(gè)細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；和/或在微流體設(shè)備內(nèi)，在與每個(gè)各自裂解的單個(gè)細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的各自逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上執(zhí)行PCR以產(chǎn)生與每個(gè)單個(gè)捕獲細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的PCR產(chǎn)物。
[0027]—些實(shí)施方案包括從微流體設(shè)備的多個(gè)收集入口遞送與每個(gè)單個(gè)捕獲細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的PCR產(chǎn)物到各自收集入口。一些實(shí)施方案包括裝載一種或更多種溶液到微流體設(shè)備。一種或更多種溶液可包括至少一種或更多種試劑或一種或更多種緩沖液。
[0028]一些實(shí)施方案包括裝載多個(gè)細(xì)胞到微流體設(shè)備。一些實(shí)施方案包括成像在微流體設(shè)備上的捕獲的單個(gè)細(xì)胞的一個(gè)或更多個(gè)。一些實(shí)施方案包括裝載至少一種或更多種裂解試劑、一種或更多種逆轉(zhuǎn)錄試劑、或一種或更多種PCR試劑到微流體設(shè)備。一些實(shí)施方案包括:移除一個(gè)或更多個(gè)收集入口的一個(gè)或更多個(gè)保護(hù)層；和/或從微流體設(shè)備的多個(gè)收集入口的每個(gè)各自收集入口收集PCR產(chǎn)物。
[0029]一些實(shí)施方案包括染色在微流體設(shè)備上的單個(gè)捕獲細(xì)胞的一個(gè)或更多個(gè)。一些實(shí)施方案包括基于染色確定單個(gè)捕獲細(xì)胞的一個(gè)或更多個(gè)為存活或死亡。一些實(shí)施方案包括基于成像確定單個(gè)捕獲細(xì)胞的一個(gè)或更多個(gè)為存活或死亡。在一些實(shí)施方案中，PCR產(chǎn)物包括擴(kuò)增的cDNA。
[0030]一些實(shí)施方案包括利用與每個(gè)單個(gè)捕獲細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的PCR產(chǎn)物制備一個(gè)或更多個(gè)文庫(kù)。制備一個(gè)或更多個(gè)文庫(kù)可包括:確定來自與每個(gè)單個(gè)細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的每個(gè)各自收集產(chǎn)物的cDNA濃度；和/或稀釋每個(gè)各自cDNA濃度到預(yù)先確定的濃度范圍內(nèi)。
[0031]一些實(shí)施方案包括制備用于標(biāo)簽化的稀釋的cDNA濃度以產(chǎn)生標(biāo)簽化產(chǎn)物。一些實(shí)施方案包括在標(biāo)簽化產(chǎn)物上執(zhí)行PCR擴(kuò)增以產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。一些實(shí)施方案包括從PCR產(chǎn)物產(chǎn)生一個(gè)或更多個(gè)文庫(kù)池。
[0032]在一些實(shí)施方案中，利用的微流體設(shè)備包括串聯(lián)耦合的多個(gè)捕獲配置，每個(gè)各自捕獲配置包括:與輸入通道和輸出通道耦合的多個(gè)旁路通道；與輸入通道和輸出通道耦合的引流溝；和/或位于靠近輸入通道和多個(gè)旁路通道的連接點(diǎn)且與引流溝耦合的捕獲巢，其中捕獲巢被配置以從多個(gè)細(xì)胞中捕獲單個(gè)細(xì)胞，使得當(dāng)單個(gè)細(xì)胞在捕獲巢被捕獲時(shí)，剩余的多個(gè)細(xì)胞被轉(zhuǎn)移到多個(gè)旁路通道中的至少一個(gè)，其中捕獲巢包括單個(gè)捕獲位點(diǎn)的一個(gè)。微流體設(shè)備還可以包括多個(gè)多室反應(yīng)配置，其中每個(gè)各自多室反應(yīng)配置與來自多個(gè)捕獲配置中的各自捕獲配置耦合，且被配置用于單細(xì)胞處理。
[0033]一些實(shí)施方案包括mRNA測(cè)序方法，其利用配置以從多個(gè)細(xì)胞中捕獲和處理單個(gè)細(xì)胞的微流體設(shè)備。所述方法可包括:裝載一種或更多種溶液到微流體設(shè)備；利用一種或更多種溶液?jiǎn)?dòng)微流體設(shè)備；裝載多個(gè)細(xì)胞到微流體設(shè)備；流動(dòng)多個(gè)細(xì)胞通過微流體設(shè)備使得在微流體設(shè)備的單個(gè)捕獲位點(diǎn)從多個(gè)細(xì)胞中捕獲單個(gè)細(xì)胞；成像在微流體設(shè)備上的一個(gè)或更多個(gè)捕獲的單個(gè)細(xì)胞；裝載至少一種或更多種裂解試劑、一種或更多種逆轉(zhuǎn)錄試劑、或一種或更多種PCR試劑到微流體設(shè)備；裂解在微流體設(shè)備的單個(gè)捕獲位點(diǎn)捕獲的多個(gè)單個(gè)細(xì)胞；在微流體設(shè)備內(nèi)，在多個(gè)單個(gè)裂解的細(xì)胞上執(zhí)行逆轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生與每個(gè)各自單個(gè)細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；在微流體設(shè)備內(nèi)，在與每個(gè)各自裂解的單個(gè)細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的各自逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上執(zhí)行PCR以產(chǎn)生與每個(gè)單個(gè)捕獲細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的PCR產(chǎn)物；遞送與每個(gè)單個(gè)捕獲細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的PCR產(chǎn)物到來自微流體設(shè)備的多個(gè)收集入口的各自收集入口 ；移除一個(gè)或更多個(gè)收集入口的一個(gè)或更多個(gè)保護(hù)層；和/或從微流體設(shè)備的多個(gè)收集入口的每個(gè)各自收集入口收集PCR產(chǎn)物。
[0034]一些實(shí)施方案包括微流體控制器，其被配置用于使用微流體設(shè)備的多個(gè)單細(xì)胞處理。微流體控制器可包括:殼體；微流體設(shè)備輸入和輸出模塊，其被配置以加載和卸載微流體設(shè)備到殼體內(nèi)；壓力模塊，其被配置以與微流體設(shè)備耦合以提供控制器壓力到微流體設(shè)備；密封模塊，其被配置以提供一個(gè)或更多個(gè)壓力密封圈(pressure seals)到微流體設(shè)備；和/或熱循環(huán)模塊，其被配置以熱循環(huán)微流體設(shè)備。
[0035]一些實(shí)施方案包括成像模塊，其被配置以成像微流體設(shè)備的一個(gè)或更多個(gè)方面。成像模塊可包括配置用以成像在微流體設(shè)備中的一個(gè)或更多個(gè)捕獲的細(xì)胞的至少顯微鏡或照相機(jī)。成像模塊可包括配置以成像在微流體設(shè)備中的一個(gè)或更多個(gè)反應(yīng)產(chǎn)物的至少顯微鏡或照相機(jī)。在一些實(shí)施方案中，熱循環(huán)模塊被配置以當(dāng)壓力模塊激活微流體設(shè)備內(nèi)的一個(gè)或更多個(gè)閥門時(shí)，熱循環(huán)微流體設(shè)備。
[0036]一些實(shí)施方案包括輸入模塊，其被配置以從微流體控制器的用戶接收輸入。一些實(shí)施方案包括顯示模塊，其被配置以至少提供信息到微流體控制器的用戶或從微流體控制器的用戶接收輸入。
[0037]在一些實(shí)施方案中，配置以與微流體設(shè)備耦合以提供控制器壓力到微流體設(shè)備的壓力模塊被配置以控制在微流體設(shè)備中的壓力，以流動(dòng)多個(gè)細(xì)胞通過微流體設(shè)備，并在微流體設(shè)備內(nèi)在單個(gè)捕獲配置捕獲單個(gè)細(xì)胞。配置以與微流體設(shè)備耦合以提供控制器壓力到微流體設(shè)備的壓力模塊可被配置以在微流體設(shè)備中控制壓力以執(zhí)行在微流體設(shè)備內(nèi)捕獲的多個(gè)單細(xì)胞的多級(jí)處理。
[0038]在一些實(shí)施方案中，被配置以熱循環(huán)微流體設(shè)備的熱循環(huán)模塊被配置以執(zhí)行在微流體設(shè)備內(nèi)捕獲的多個(gè)單細(xì)胞的多級(jí)處理。
[0039]在一些實(shí)施方案中，多級(jí)處理包括預(yù)擴(kuò)增處理。多級(jí)處理可包括mRNA測(cè)序處理。
[0040]在一些實(shí)施方案中，配置以與微流體設(shè)備耦合以提供控制器壓力到微流體設(shè)備的壓力模塊被配置以控制在微流體設(shè)備中的壓力以啟動(dòng)微流體設(shè)備。配置以與微流體設(shè)備耦合以提供控制器壓力到微流體設(shè)備的壓力模塊可被配置以控制在微流體設(shè)備中的壓力，以裝載多個(gè)細(xì)胞進(jìn)入微流體設(shè)備，并在微流體設(shè)備中從多個(gè)細(xì)胞中捕獲多個(gè)單個(gè)細(xì)胞。
[0041]在一些實(shí)施方案中，至少壓力模塊或熱循環(huán)模塊被配置以促進(jìn)在微流體設(shè)備上執(zhí)行至少裂解、逆轉(zhuǎn)錄、PCR或收集。在一些實(shí)施方案中，至少壓力模塊或熱循環(huán)模塊被配置以促進(jìn)在微流體設(shè)備上執(zhí)行至少裂解、逆轉(zhuǎn)錄、預(yù)擴(kuò)增或收集。
[0042]一些實(shí)施方案包括微流體設(shè)備，其被配置用于多個(gè)單細(xì)胞處理。微流體設(shè)備可包括串聯(lián)耦合的多個(gè)捕獲配置。每個(gè)各自捕獲配置可包括:多個(gè)旁路通道，其與輸入通道和輸出通道耦合；引流溝，其與輸入通道和輸出通道耦合；和/或捕獲巢，其位于靠近輸入通道和多個(gè)旁路通道的連接點(diǎn)，且與引流溝耦合。捕獲巢可被配置以從多個(gè)細(xì)胞捕獲單個(gè)細(xì)胞，使得當(dāng)在捕獲巢中單個(gè)細(xì)胞被捕獲時(shí)，剩余細(xì)胞被轉(zhuǎn)移到多個(gè)旁路通道的至少一個(gè)中。微流體設(shè)備可包括多個(gè)多室反應(yīng)配置。每個(gè)各自多室反應(yīng)配置可與來自多個(gè)捕獲配置的各自捕獲配置耦合，并配置用于單細(xì)胞處理。
[0043]在一些實(shí)施方案中，至少輸入通道或輸出通道被進(jìn)一步配置為集中通道。集中通道可包括在至少水平方向或垂直方向的縮小通道。在一些實(shí)施方案中，多個(gè)旁路通道被對(duì)稱地配置。在一些實(shí)施方案中，多室反應(yīng)配置還被配置用于當(dāng)各自多室反應(yīng)配置的一個(gè)或更多個(gè)閥門被驅(qū)動(dòng)時(shí)熱循環(huán)。在一些實(shí)施方案中，微流體設(shè)備還被配置用于成像。
[0044]—些實(shí)施方案包括用于使用微流體的多個(gè)單細(xì)胞處理的方法。所述方法可包括:裝載多個(gè)細(xì)胞到微流體設(shè)備；和/或流動(dòng)多個(gè)細(xì)胞到微流體設(shè)備的至少第一捕獲配置。第一捕獲配置可包括:多個(gè)第一旁路通道，其與第一輸入通道和第一輸出通道耦合；第一引流溝，其與第一輸入通道和第一輸出通道耦合；和/或第一捕獲巢，其與第一引流溝耦合，且被配置以從多個(gè)細(xì)胞捕獲單個(gè)細(xì)胞。所述方法可包括:在第一捕獲巢，從多個(gè)細(xì)胞中捕獲第一單個(gè)細(xì)胞；流動(dòng)來自多個(gè)細(xì)胞的第一剩余細(xì)胞集合通過多個(gè)第一旁路通道的至少一個(gè)到與第一捕獲配置的第一輸出通道耦合的至少第二捕獲配置；和/或流動(dòng)第一剩余細(xì)胞集合到微流體設(shè)備的至少第二捕獲配置中。第二捕獲配置可包括:與第二輸入通道和第二輸出通道耦合的多個(gè)第二旁路通道，其中第二輸入通道與第一捕獲配置的第一輸出通道耦合；與第二輸入通道和第二輸出通道耦合的第二引流溝；和/或與第二引流溝耦合且配置以從第一剩余細(xì)胞集合中捕獲單個(gè)細(xì)胞的第二捕獲巢。所述方法可包括:在第二捕獲巢從第一剩余細(xì)胞集合捕獲第二顆?；蚣?xì)胞；和流動(dòng)來自第一剩余細(xì)胞集合的第二剩余細(xì)胞集合通過多個(gè)第二旁路通道的至少一個(gè)，通過第二輸出通道到第三捕獲配置。
[0045]在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括裂解每個(gè)各自單獨(dú)捕獲的細(xì)胞以釋放每個(gè)各自細(xì)胞的一種或更多種成分。所述方法還包括流動(dòng)每個(gè)各自捕獲的細(xì)胞的一種或更多種成分到各自多室反應(yīng)配置用于進(jìn)一步處理。所述方法還包括，當(dāng)流動(dòng)一種或更多種成分通過各自多室反應(yīng)配置的一個(gè)或更多個(gè)方面時(shí)，執(zhí)行熱循環(huán)程序。所述方法還可包括用一種或更多種試劑洗滌各自捕獲的細(xì)胞。所述方法還可包括用一種或更多種藥劑給藥各自捕獲的細(xì)胞。所述方法還可包括成像各自捕獲的細(xì)胞。
[0046]在一些實(shí)施方案中，方法的進(jìn)一步處理可包括執(zhí)行至少特異性靶擴(kuò)增、全基因組擴(kuò)增、全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增、實(shí)時(shí)PCR制備或單體型分析。所述方法可包括標(biāo)記來自與各自捕獲細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的進(jìn)一步處理中的反應(yīng)產(chǎn)物用于識(shí)別目的。反應(yīng)產(chǎn)物可被輸出并在例如下游系統(tǒng)被分析。
[0047]一些實(shí)施方案可包括微流體控制器，其被配置用于使用微流體設(shè)備的多個(gè)單細(xì)胞處理。微流體控制器可包括:殼體；微流體設(shè)備輸入和輸出模塊，其被配置以加載和卸載微流體設(shè)備到殼體內(nèi)；壓力模塊，其被配置以與微流體設(shè)備耦合以提供控制器壓力到微流體設(shè)備；密封模塊，其被配置以提供一個(gè)或更多個(gè)壓力密封圈到微流體設(shè)備；和/或熱循環(huán)模塊，其被配置以熱循環(huán)微流體設(shè)備。
[0048]在一些實(shí)施方案中，微流體控制器包括成像模塊，其被配置以成像微流體設(shè)備的一個(gè)或更多個(gè)方面。在一些實(shí)施方案中，熱循環(huán)模塊被配置以當(dāng)壓力模塊激活微流體設(shè)備內(nèi)的一個(gè)或更多個(gè)閥門時(shí)，熱循環(huán)微流體設(shè)備。微流體控制器可包括輸入模塊，其被配置以從微流體控制器的用戶接收輸入。微流體控制器可包括顯示模塊，其被配置以至少提供信息到微流體控制器的用戶或從微流體控制器的用戶接收輸入。
[0049]一些實(shí)施方案包括微流體系統(tǒng)，其被配置用于多個(gè)單細(xì)胞處理。微流體系統(tǒng)可包括微流體系統(tǒng)和/或與微流體設(shè)備耦合的微流體控制器。微流體設(shè)備可包括串聯(lián)耦合的多個(gè)捕獲配置。每個(gè)各自捕獲配置可包括:多個(gè)旁路通道，其與輸入通道和輸出通道耦合；弓丨流溝，其與輸入通道和輸出通道耦合；和/或捕獲巢，其位于靠近輸入通道和多個(gè)旁路通道的連接點(diǎn)，且與引流溝耦合。捕獲巢可被配置以從多個(gè)細(xì)胞捕獲單個(gè)細(xì)胞，使得當(dāng)在捕獲巢中單個(gè)細(xì)胞被捕獲時(shí)，剩余細(xì)胞被轉(zhuǎn)移到多個(gè)旁路通道的至少一個(gè)中。微流體設(shè)備可包括多個(gè)多室反應(yīng)配置。每個(gè)各自多室反應(yīng)配置可與來自多個(gè)捕獲配置的各自捕獲配置耦合，并配置用于單細(xì)胞處理。微流體控制器可包括:殼體；微流體設(shè)備輸入和輸出模塊，其被配置以加載和卸載微流體設(shè)備到殼體內(nèi)；壓力模塊，其被配置以與微流體設(shè)備耦合以提供控制器壓力到微流體設(shè)備；密封模塊，其被配置以提供一個(gè)或更多個(gè)壓力密封圈到微流體設(shè)備；和/或熱循環(huán)模塊，其被配置以熱循環(huán)微流體設(shè)備。
[0050]根據(jù)本公開，前述內(nèi)容已相當(dāng)廣泛地概述了實(shí)例的特征和技術(shù)優(yōu)勢(shì)，以便使下面的詳細(xì)描述可以更好地理解。附加的特征和優(yōu)點(diǎn)將在以下描述。所公開的概念和特定實(shí)例可易于被利用，作為修改或設(shè)計(jì)其它用于實(shí)施本公開的相同目的的基礎(chǔ)。這種等價(jià)的構(gòu)造不脫離附加的權(quán)利要求的精神和范圍。被認(rèn)為是本文公開的概念的特點(diǎn)的特征，無論是作為其組織和操作方法，當(dāng)聯(lián)系附圖考慮時(shí)，連同相關(guān)聯(lián)的優(yōu)點(diǎn)將被更好地從下面的描述中理解。每一個(gè)圖被提供僅用于說明和描述的目的，且不是作為權(quán)利要求的范圍的限定。
[0051]附圖概要說明
[0052]本公開的性質(zhì)和優(yōu)點(diǎn)的進(jìn)一步理解可通過參考下面的附圖來實(shí)現(xiàn)。在附圖中，相似的組件或特征可具有相同的參考標(biāo)記。此外，相同類型的各種組件可以由參考標(biāo)記、之后的破折號(hào)和在相似的組件之間進(jìn)行區(qū)分的第二標(biāo)記來區(qū)分。如果只有第一參考標(biāo)記被用在本說明書中，描述可應(yīng)用于具有相同第一參考標(biāo)記的相似組件的任何一個(gè)而不考慮第二參考標(biāo)記。
[0053]圖1示出了根據(jù)各種實(shí)施方案的微流體系統(tǒng)的示意圖；
[0054]圖2示出了根據(jù)各種實(shí)施方案的微流體設(shè)備的示意圖；
[0055]圖3A示出了根據(jù)各種實(shí)施方案的微流體設(shè)備的捕獲配置的示意圖；
[0056]圖3B示出了根據(jù)各種實(shí)施方案的微流體設(shè)備的捕獲配置的顯微圖片；
[0057]圖3C-3K示出了根據(jù)各種實(shí)施方案的微流體設(shè)備的不同捕獲配置；
[0058]圖4示出了根據(jù)各種實(shí)施方案的微流體設(shè)備的串聯(lián)耦合的多個(gè)捕獲配置的顯微圖片；
[0059]圖5A示出了根據(jù)各種實(shí)施方案的微流體設(shè)備的多室反應(yīng)配置的示意圖；
[0060]圖5B示出了根據(jù)各種實(shí)施方案的微流體設(shè)備的多室反應(yīng)配置的示意圖；
[0061]圖5C示出了根據(jù)各種實(shí)施方案的微流體設(shè)備的幾個(gè)多室反應(yīng)配置的示意圖；
[0062]圖6示出了根據(jù)各種實(shí)施方案，用于基于有限稀釋和/或隨機(jī)捕獲的，適用于細(xì)胞處理的微流體設(shè)備的單元小室結(jié)構(gòu)的示意圖；
[0063]圖7示出了根據(jù)各種實(shí)施方案，使用細(xì)胞懸浮液的有限稀釋以獲取每個(gè)單獨(dú)反應(yīng)體積的單細(xì)胞；
[0064]圖8A和圖SB示出了根據(jù)各種實(shí)施方案，與理論分布相比，使用明場(chǎng)成像的芯片中細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果；
[0065]圖9示出了根據(jù)各種實(shí)施方案，熒光細(xì)胞“鬼影”的圖像允許比預(yù)先PCR明場(chǎng)成像檢測(cè)更多細(xì)胞；
[0066]圖10不出了根據(jù)各種實(shí)施方案的明場(chǎng)、突光和泊松分布；
[0067]圖1lA和圖1lB示出了根據(jù)各種實(shí)施方案的示例性的帶捕獲特征和引流溝的單細(xì)胞捕獲配置位點(diǎn)；
[0068]圖12示出了根據(jù)各種實(shí)施方案的單細(xì)胞捕獲配置的不同實(shí)例；
[0069]圖13A提供了根據(jù)各種實(shí)施方案的說明性的捕捉特征不同的擋板組合。
[0070]圖13B和圖13C示出了根據(jù)各種實(shí)施方案的不同捕獲特征/擋板組合的變量和性倉(cāng)泛;
[0071]圖14A和圖14B示出了根據(jù)各種實(shí)施方案，用于使用捕捉功能捕捉單個(gè)、親和試劑包被的磁珠，該磁珠然后可以展示親和性試劑(例如，抗體)，以便捕捉單細(xì)胞的策略；
[0072]圖15A-15G示出了根據(jù)各種實(shí)施方案的用于單細(xì)胞捕獲的另外的捕獲配置；
[0073]圖16示出了根據(jù)各種實(shí)施方案的微流體載體的示意圖；
[0074]圖16A示出了根據(jù)各種實(shí)施方案的微流體設(shè)備的方面；
[0075]圖17示出了根據(jù)各種實(shí)施方案的微流體控制器的示意圖；和
[0076]圖18示出了根據(jù)各種實(shí)施方案，使用微流體用于處理多個(gè)單細(xì)胞的方法的流程圖；
[0077]圖19示出了根據(jù)各種實(shí)施方案，使用微流體用于處理多個(gè)單細(xì)胞的方法的流程圖；
[0078]圖20示出了根據(jù)各種實(shí)施方案，使用微流體用于捕獲和處理多個(gè)單細(xì)胞的方法的流程圖；
[0079]圖20A示出了根據(jù)各種實(shí)施方案，使用微流體用于捕獲和處理多個(gè)單細(xì)胞的方法的流程圖；
[0080]圖20B示出了根據(jù)各種實(shí)施方案，使用微流體用于捕獲和處理多個(gè)單細(xì)胞的方法的流程圖；
[0081]圖21示出了根據(jù)各種實(shí)施方案，使用微流體用于捕獲和預(yù)擴(kuò)增處理多個(gè)單細(xì)胞的方法的流程圖；
[0082]圖21A示出了根據(jù)各種實(shí)施方案，使用微流體用于捕獲和預(yù)擴(kuò)增處理多個(gè)單細(xì)胞的方法的流程圖；
[0083]圖22示出了根據(jù)各種實(shí)施方案，使用微流體用于捕獲和mRNA測(cè)序多個(gè)單細(xì)胞的方法的流程圖；
[0084]圖22A示出了根據(jù)各種實(shí)施方案，使用微流體用于捕獲和mRNA測(cè)序多個(gè)單細(xì)胞的方法的流程圖；
[0085]圖22B示出了根據(jù)各種實(shí)施方案，使用微流體用于捕獲和mRNA測(cè)序多個(gè)單細(xì)胞的方法的流程圖；
[0086]詳細(xì)描述
[0087]描述了用于使用微流體的多單細(xì)胞捕獲和處理的方法、系統(tǒng)和設(shè)備。一些實(shí)施方案提供從細(xì)胞的較大群體中捕獲、分配和/或操縱單個(gè)細(xì)胞，同時(shí)產(chǎn)生基因信息和/或涉及每個(gè)單個(gè)細(xì)胞的反應(yīng)產(chǎn)物。一些實(shí)施方案可提供用于已從細(xì)胞的較大群體中分配的多個(gè)單個(gè)細(xì)胞的特異性靶擴(kuò)增(STA)、全基因組擴(kuò)增(WGA)、全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增(WTA)、實(shí)時(shí)PCR制備和/或單體型分析。一些實(shí)施方案提供其它應(yīng)用。一些特定的實(shí)施方案提供多個(gè)單個(gè)細(xì)胞的mRNA測(cè)序或預(yù)擴(kuò)增，例如。一些實(shí)施方案可被配置用于成像單個(gè)細(xì)胞或關(guān)聯(lián)的反應(yīng)產(chǎn)物作為處理的一部分。在一些情形中，反應(yīng)產(chǎn)物可被收集和/或進(jìn)一步分析。
[0088]方法、系統(tǒng)和設(shè)備可包括用于利用微流體捕獲和處理多個(gè)單細(xì)胞的不同的微流體設(shè)備和/或控制器。一些微流體設(shè)備被提供，其可包括多個(gè)捕獲配置和多個(gè)多室反應(yīng)配置。每個(gè)捕獲配置可被配置以從多個(gè)細(xì)胞中捕獲單個(gè)細(xì)胞。然后，每個(gè)多室反應(yīng)配置可被用于在細(xì)胞被裂解后處理每個(gè)細(xì)胞。反應(yīng)產(chǎn)物可從每個(gè)多室反應(yīng)配置收集。微流體控制器也被提供，其可被用于操作微流體設(shè)備以從多個(gè)細(xì)胞中捕獲和處理單個(gè)細(xì)胞。
[0089]不同的實(shí)施方案的進(jìn)一步的方面可利用如在以下部分描述的方面:(I)微流體系統(tǒng)、(II)流體網(wǎng)絡(luò)物理結(jié)構(gòu)、(III)顆粒、(IV)輸入機(jī)制、(V)定位機(jī)制、(VI)保留機(jī)制、(VII)處理機(jī)制、(VIII)測(cè)定機(jī)制、(IX)釋放機(jī)制、(X)輸出機(jī)制、(XI)細(xì)胞捕獲機(jī)制、(XII)基于顆粒的操作、(XIII)實(shí)施方案。
[0090](I)微流體系統(tǒng)
[0091]在微流體系統(tǒng)中執(zhí)行顆粒，諸如細(xì)胞的操縱和分析。微流體系統(tǒng)通常包括在其中非常小的體積的流體被儲(chǔ)存和操作的任何系統(tǒng)，該非常小的體積通常小于約500 μ L，典型地小于約100 μ L，且更典型地小于大約10 μ L0微流體系統(tǒng)在預(yù)定義路徑攜帶液體通過一個(gè)或更多個(gè)微流體通路。微流體通路可具有小于大約200、100或50 μπι的最小尺寸，通常高度或?qū)挾?。通路在部分II中被更詳細(xì)地描述。
[0092]微流體系統(tǒng)可包括一個(gè)或更多個(gè)通路集合，其互連以形成通常閉合的微流體網(wǎng)絡(luò)。這樣的微流體網(wǎng)絡(luò)可以包括，在網(wǎng)絡(luò)的末端或中間網(wǎng)絡(luò)的，一個(gè)、兩個(gè)或更多的開口，其與外部世界接合。這樣的開口可以接收、存儲(chǔ)和/或分配流體。分配流體可以直接進(jìn)入微流體網(wǎng)絡(luò)或到微流體系統(tǒng)外部位點(diǎn)。這些開口通常在輸入和/或輸出機(jī)制中起作用，更具體地在以下第IV和X部分描述，并且可以包括貯器，更詳細(xì)地在以下第II部分描述。
[0093]微流體系統(tǒng)還可以包括有助于流體、試劑和/或顆粒操縱或分析的任何其它合適的特征或機(jī)制。例如，微流體系統(tǒng)可包括確定流體流量和/或路徑的各方面的調(diào)節(jié)機(jī)制或控制機(jī)制?？蓞⑴c到這種調(diào)節(jié)機(jī)制的閥門和/或泵在以下第二部分被更詳細(xì)的描述?？商鎿Q地，或此外，微流體系統(tǒng)可以包括確定、調(diào)節(jié)和/或感測(cè)流體的溫度、流體壓力、流體流速、光暴露、電場(chǎng)暴露、磁場(chǎng)強(qiáng)度和/或類似物的機(jī)制。因此，微流體系統(tǒng)可包括加熱器、冷卻器、電極、透鏡、光柵、光源、壓力傳感器、壓力變換器、微處理器、微電子器件(microelectronics)和/或等等。此外，每個(gè)微流體系統(tǒng)可以包括一個(gè)或更多個(gè)特征，其充當(dāng)識(shí)別給定系統(tǒng)的編碼。該特征可包括任何可檢測(cè)的形狀或符號(hào)，或形狀或符號(hào)的集合，例如黑色和白色或彩色條形碼、文字、數(shù)字和/或諸如此類，其具有獨(dú)特的位置、身份和/或其它性質(zhì)(諸如光學(xué)性質(zhì))。
[0094]微流體系統(tǒng)可以由任何合適材料或合適材料的組合組成。合適的材料可以包括彈性體，諸如聚二甲基硅氧烷(PDMS);塑料，如聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯等；玻璃；陶瓷；溶膠-凝膠；硅和/或其它非金屬；金屬或金屬氧化物；生物聚合物、混合物和/或顆粒，諸如蛋白(明膠、聚賴氨酸、血清白蛋白、膠原蛋白等)、核酸、微生物等；和/或諸如此類。
[0095]用于微流體系統(tǒng)的示例性材料在以上列出的專利申請(qǐng)的交叉引用下進(jìn)行更詳細(xì)描述，被引入本文作為參考。
[0096]微流體系統(tǒng)，也稱作芯片，可具有任何合適的結(jié)構(gòu)。這種系統(tǒng)可以被制造為單一組件的單一結(jié)構(gòu)，或制造為兩種或更多種組件的多組件結(jié)構(gòu)。兩個(gè)或更多個(gè)組件可以具有任何合適的相對(duì)空間關(guān)系，并且可以通過任何合適的粘合機(jī)制被彼此連接。
[0097]在一些實(shí)施方案中，兩個(gè)或多個(gè)組件可以被制造成相對(duì)薄的層，其可以被配置為面到面?；诠δ?，該相對(duì)薄的層可以具有不同的厚度。例如，一些層的厚度可以是大約10到250 μ m, 20到200 μ m,或大約50到150 μ m，等等。在某些情況下，其它層可以厚得多，給系統(tǒng)提供機(jī)械強(qiáng)度。這樣的其它層的厚度可以是大約0.25到2cm，0.4到1.5cm，或0.5到lcm，等等。一個(gè)或更多個(gè)附加層可以是作為基底層起作用的基本平坦的層，在某些情況下，其提供一些或所有的微流體通道的下壁部分。
[0098]微流體系統(tǒng)的組件可以基于用于系統(tǒng)的期望應(yīng)用和基于制造中使用的材料，通過任何合適的機(jī)制來制造。例如，一個(gè)或更多個(gè)組件可以用合適的模具被模塑、沖壓和/或軋花。這種模具可通過微加工、蝕刻、軟光刻、材料沉積、切割和/或穿孔，等等，由任何合適的材料組成?？商鎿Q地或此外，微流體系統(tǒng)的組件可不用通過蝕刻、微加工、切割、穿孔和/或材料沉積的模具被制造。
[0099]微流體組件可以被單獨(dú)制造、接合并進(jìn)一步適當(dāng)?shù)匦薷摹＠?，?dāng)制造不同層時(shí)，微流體組件可被，通常為面到面的，粘合。這些單獨(dú)的組件可以是表面處理的，例如，用反應(yīng)性化學(xué)物質(zhì)表面處理以改善表面化學(xué)過程，用顆粒結(jié)合劑，用試劑以便于分析，和/或等等。這種表面處理可以被定位到表面的離散部分，或者可以相對(duì)非定位。在一些實(shí)施例中，單獨(dú)的層可以被制造，且然后穿孔和/或切割以產(chǎn)生附加的結(jié)構(gòu)。這種穿孔和/或切割可以在不同的組件已被接合之前和/或之后被執(zhí)行。
[0100]用于制造微流體系統(tǒng)的示例性方法在以上指出的專利申請(qǐng)的交叉引用下進(jìn)行更詳細(xì)描述，其通過參考被弓I入本文。
[0101](II)流體網(wǎng)絡(luò)的物理結(jié)構(gòu)
[0102]微流體系統(tǒng)可包括任何合適的結(jié)構(gòu)用于流體小體積的整合操縱，包括移動(dòng)和/或儲(chǔ)存流體、以及與其相關(guān)聯(lián)的顆粒，用于顆粒分析。結(jié)構(gòu)可以包括通道、貯器和/或調(diào)節(jié)器坐坐寸寸O
[0103]通路通常包含微流體系統(tǒng)中材料(例如，流體、顆粒和/或試劑)可從中穿過、在其上通過或沿其通過的任何合適的路徑、通道或?qū)Ч?。流體交流通路的集合、通常地以通道的形式，可以被共同地稱為微流體網(wǎng)絡(luò)。在某些情況下，通路可以被描述為具有形成基底、頂部和壁的表面。通路可以具有任何合適的尺寸和幾何形狀，包括寬度、高度、長(zhǎng)度和/或橫截面形狀等等，并且可以按照任何合適的路徑，包括線形的、圓形的和/或曲線的等等。通路還可以具有任何合適的表面輪廓，包括凹部、凸部和/或孔，并可以在通道內(nèi)的適當(dāng)位置具有任何合適的表面化學(xué)過程或滲透。合適的表面化學(xué)過程可包括通道形成之前、期間和/或之后的，通過添加和/或用化學(xué)藥品和/或試劑處理的表面改性。
[0104]在某些情況下，通路，且更具體地通道，可以根據(jù)功能被說明。例如，在一個(gè)特定的應(yīng)用中，通路可以根據(jù)材料流動(dòng)的方向、與特定的參考結(jié)構(gòu)，的關(guān)系和/或運(yùn)送材料的類型被描述。因此，通路可以是入口通路(或通道)，其通常攜帶材料到位點(diǎn)，和出口通路(或通道)，通常攜帶材料離開位點(diǎn)。此外，通路可以被稱為顆粒通路(或通道)、試劑通路(或通道)、集中通路(或通道)、灌注通路(或通道)、廢物通路(或通道)和/或諸如此類。
[0105]通路可分支、連接和/或閉端以形成任何合適的微流體網(wǎng)絡(luò)。因此，通路可以在顆粒定位、分揀、保留、處理、檢測(cè)、傳輸、存儲(chǔ)、混合和/或釋放等等中起作用。
[0106]貯器通常包括用于存儲(chǔ)在處理操作之前、期間、之間和/或之后(例如，測(cè)定和/或治療)的材料的任何合適的接受器或室(例如，流體、顆粒和/或試劑)。貯器，也被稱為孔，可以包括輸入、中間和/或輸出貯器。輸入貯器可存儲(chǔ)在輸入材料到芯片的微流體網(wǎng)絡(luò)部分之前的材料(如流體、顆粒和/或試劑)。相比之下，中間貯器可存儲(chǔ)在處理操作期間和/或之間的材料。最后，輸出貯器可存儲(chǔ)從芯片輸出例如，到外部處理器或廢物之前，或在芯片棄置之前的材料。
[0107]貯器的其它方面被包括在以上在交叉引用下標(biāo)出的專利申請(qǐng)中，其通過參考被引入本文。
[0108]調(diào)節(jié)器通常包括用于產(chǎn)生和/或調(diào)節(jié)材料(例如，流體、顆粒和/或試劑)移動(dòng)的任何合適的機(jī)制。適合的調(diào)節(jié)器可以包括閥門、泵和/或電極等等。調(diào)節(jié)器可以通過積極地促進(jìn)流動(dòng)和/或通過限制主動(dòng)或被動(dòng)的流動(dòng)操作。調(diào)節(jié)器介導(dǎo)的合適的功能可以包括流體網(wǎng)絡(luò)的混合、分揀、連接(或分離)，和/或諸如此類。
[0109](III)顆粒
[0110]微流體系統(tǒng)可用于操縱和/或分析顆粒。顆粒通常包含小到足以在與流體相關(guān)聯(lián)的微流體網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部被輸入和操縱，但足夠大以從流體中區(qū)分開的物體。顆粒，如這里使用的，通常是微觀的或接近微觀的，并且可以具有直徑約0.005至100 μ m、0.1至50 μ m或約0.5至30 μπι?？商鎿Q地，或另外地，顆?？梢跃哂屑s10_2°至10_5克，10_16至10_7克或10_14至10_8克的質(zhì)量。示例性顆?？砂?xì)胞、病毒、細(xì)胞器、珠和/或囊泡和其聚集體，諸如二聚體、三聚體等。
[0111]顆粒的一個(gè)實(shí)例是細(xì)胞。細(xì)胞，如這里使用的，通常包括任何自我復(fù)制的、以膜為界的生物實(shí)體或其任何非復(fù)制、以膜為界的后代。非復(fù)制的后代可以是衰老細(xì)胞、終端分化的細(xì)胞、細(xì)胞嵌合體、血清饑餓的細(xì)胞、受感染的細(xì)胞、非復(fù)制的突變體、無核細(xì)胞等。
[0112]在微流體系統(tǒng)中作為顆粒使用的細(xì)胞可具有任何合適的來源、遺傳背景、健康狀態(tài)、固定狀態(tài)、膜的滲透性、預(yù)先處理和/或群體純度，等等。細(xì)胞來源可以是真核、原核、古細(xì)菌等，并且可以是來自動(dòng)物、植物、真菌、原生生物、細(xì)菌和/或諸如此類。細(xì)胞可以是野生型；天然、化學(xué)或病毒的突變體；工程改造的突變體(諸如，轉(zhuǎn)基因)；和/或諸如此類。此外，細(xì)胞可以是生長(zhǎng)的、靜止的、衰老的、轉(zhuǎn)化的和/或永生的，等等，并且細(xì)胞可以是固定的和/或不固定的?；畹幕蛩赖?、固定的或不固定的細(xì)胞可以具有完整的膜、和/或通透的/破壞的膜以允許離子、標(biāo)記、染料、配體等的攝取，或者允許細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的釋放。在通過任何合適的處理步驟引入到微流體系統(tǒng)之前，細(xì)胞可能已被預(yù)先處理。這樣的處理步驟可以包括調(diào)節(jié)劑處理，轉(zhuǎn)染(包括感染、注射、顆粒轟擊、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、共沉淀物轉(zhuǎn)染等)，用分析試劑如染料或標(biāo)記處理和/或等等。此外，細(xì)胞可能是單一培養(yǎng)物，通常作為從單細(xì)胞或非相似的細(xì)胞的小集合衍生的克隆群體；可通過任何合適的機(jī)制，諸如親和結(jié)合、FACS、藥物篩選等進(jìn)行預(yù)先分類；和/或可以是不同的細(xì)胞類型的混合或異質(zhì)群體。
[0113]真核細(xì)胞，S卩，具有一個(gè)或更多個(gè)核的細(xì)胞，或其無核的衍生物，可以從任何合適的來源獲得，包括原代細(xì)胞、建立的細(xì)胞和/或患者樣品。這種細(xì)胞可來自任何細(xì)胞類型或細(xì)胞類型的混合，來自任何發(fā)育階段和/或來自任何基因背景。此外，真核細(xì)胞可以是粘附和/或非粘附的。這種細(xì)胞可來自任何合適的真核有機(jī)體，包括動(dòng)物、植物、真菌和/或原生生物。
[0114]真核細(xì)胞可以是來自動(dòng)物，S卩，脊椎動(dòng)物或無脊椎動(dòng)物。脊椎動(dòng)物可以包括哺乳動(dòng)物，即，靈長(zhǎng)類(例如人、猿、猴等)或非靈長(zhǎng)類(如牛、馬、綿羊、豬、狗、貓、有袋動(dòng)物、哨齒動(dòng)物和/或諸如此類)。非哺乳動(dòng)物的脊椎動(dòng)物包括鳥類、爬行動(dòng)物、魚類(如鱒魚、鮭魚、金魚、斑馬魚等)，和/或兩棲動(dòng)物(如非洲爪蛙(Xenopus)，林蛙(Rana)等屬的蛙)。無脊椎動(dòng)物可以包括節(jié)肢動(dòng)物(諸如蜘蛛綱動(dòng)物、昆蟲(例如果蠅)等)、軟體動(dòng)物(諸如蛤、蝸牛等)、環(huán)節(jié)動(dòng)物(諸如蚯蚓等)、棘皮類動(dòng)物(諸如各種海星，等等)、腔腸動(dòng)物(諸如水母、珊瑚等)、多孔動(dòng)物(海綿)、扁形動(dòng)物(絳蟲)、線形門動(dòng)物(扁蟲)等。
[0115]真核細(xì)胞可以來自任何合適的植物，例如單子葉植物、雙子葉植物、裸子植物、被子植物、蕨類植物、苔蘚、地衣和/或藻類等。示例性的植物可包括植物作物(諸如稻、玉米、小麥、黑麥、大麥、馬鈴薯等)，用于研究的植物(例如，擬南芥、火炬松等)，有園藝價(jià)值的植物(觀賞棕櫚、玫瑰等)，和/或諸如此類。
[0116]真核細(xì)胞可以是任何合適的真菌，包括以下門的成員:壺菌門、接合菌門、子囊菌門、擔(dān)子菌門、半知菌綱和/或酵母。示例性的真菌可包括釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoralis),粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)、蘑燕、馬勃、半知菌、霉菌和/或諸如此類。
[0117]真核細(xì)胞可以來自任何合適的原生生物(原生動(dòng)物)，包括變形蟲、纖毛蟲、鞭毛蟲、球蟲、微孢子蟲、和/或諸如此類。示例性的原生生物可能包括賈第鞭毛蟲、溶組織內(nèi)阿米巴(Entamoeba, histolytica)、隱孢子蟲、和/或福氏耐格里阿米巴(N.fowleri),等等。
[0118]顆?？砂樵?xì)胞，S卩，直接從生物體或自然界獲取的，而沒有后續(xù)擴(kuò)展的體外培養(yǎng)的真核細(xì)胞。例如，細(xì)胞可以從患者樣品中獲得，諸如全血、包裝細(xì)胞(packedcells)、白血細(xì)胞、尿、痰、糞便、粘液、脊髓液、腫瘤、病變組織、骨髓、淋巴、精液、胸水、產(chǎn)前樣品、吸出物、活組織檢查、分解組織(disaggregated tissue)、表皮細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、腎細(xì)胞、前列腺細(xì)胞、肝細(xì)胞、干細(xì)胞、成骨細(xì)胞和/或諸如此類。來自人類志愿者、人類群體的選定成員、法醫(yī)樣品、動(dòng)物、植物和/或自然來源(水，土壤，空氣等)等等的類似的樣品可以被操縱和分析。
[0119]可替換地，或此外，顆?？梢园ㄒ呀⒌恼婧思?xì)胞。這種細(xì)胞可以通過任何合適的處理永生化和/或轉(zhuǎn)化，包括病毒感染、核酸轉(zhuǎn)染、化學(xué)處理、傳代并選擇、輻射暴露和/或諸如此類。這樣建立的細(xì)胞可包括各種世系，諸如成神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成肌細(xì)胞、肌管、成軟骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、上皮細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、腎細(xì)胞、肝細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞，等等。示例性的建立的細(xì)胞系可包括 Rat-1、NIH 3T3、HEK293、C0S1、C0S7、CV-1、C2C12、MDCK, PC12、SAOS, HeLa,Schneider細(xì)胞、Junkat細(xì)胞、SL2,和/或諸如此類。
[0120]顆?？梢允窃思?xì)胞，S卩，自我復(fù)制的、缺乏膜結(jié)合細(xì)胞器的膜結(jié)合微生物，或其非復(fù)制的后代。原核細(xì)胞可以來自任何門，包括產(chǎn)水菌門(Aquificae)、類菌體(Bacteroids)、綠菌綱(Chlorobia)、Chrysogenetes、藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria)、纖維桿菌屬(Fibrobacter)、厚壁菌(Firmicutes)、黃桿菌(Flavobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)、變形菌(Proteobacteria)、鞘脂桿菌門(Sphingobacteria)、螺旋體(Spirochaetes)、熱微菌門(Thermomicrobia)和 / 或 Xenobacteria,等等。這種細(xì)菌可以是革蘭氏陰性的、革蘭氏陽性的、有害的、有益的和/或致病的。示例性的原核細(xì)胞可包括大腸桿菌(E.coli)、鼠傷寒沙門菌(S.typhimurium)、枯草芽孢桿菌(B subtilis)、金黃色葡萄球菌(S.aureus)、產(chǎn)氣莢膜桿菌(C.perfiingens)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)和/或炭疽桿菌(B.anthracis),等等。
[0121]病毒可以作為微流體系統(tǒng)中的顆粒被操縱和/或分析。病毒通常包括細(xì)胞(動(dòng)物、植物、真菌、原生生物和/或細(xì)菌)的任何微觀的/亞微觀的寄生物，其包括蛋白質(zhì)和/或膜衣，并且其沒有宿主細(xì)胞不能復(fù)制。病毒可包括DNA病毒、RNA病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、病毒粒子、類病毒、朊病毒等。示例性病毒可包括HIV、RSV、狂犬病毒、肝炎病毒、愛潑斯坦-巴爾病毒、鼻病毒、噬菌體、引起各種疾病(CJD (海綿狀腦病、庫(kù)魯病、GSS (格-斯-施綜合征)、FFI (致死性家族失眠癥)、彌漫性進(jìn)行性腦灰質(zhì)變性)的朊病毒和/或諸如此類。
[0122]細(xì)胞器可以在微流體系統(tǒng)中被操縱和/或分析。細(xì)胞器通常包括細(xì)胞的任何顆粒組分。例如，細(xì)胞器可包括核、高爾基體、溶酶體、內(nèi)體、線粒體、過氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、吞噬體、液泡、葉綠體等。
[0123]顆粒分析可以用珠執(zhí)行。珠通常包括任何合適的制造的顆粒。珠可以由無機(jī)材料或者化學(xué)、酶促和/或生物合成的材料制成。另外，珠可以具有任何合適的孔隙率，并且可以作為固體或作為凝膠形成。合適的珠組合成分可包括塑料(例如，聚苯乙烯)、葡聚糖、玻璃、陶瓷、溶膠-凝膠、彈性體、硅、金屬和/或生物聚合物(蛋白質(zhì)、核酸等)。珠可以具有任何合適的粒徑或直徑范圍。因此，珠可以是具有窄的直徑范圍的基本上均勻的群體，或珠可以是具有寬的直徑范圍或兩種或更多種不同的直徑的異質(zhì)群體。
[0124]珠可以與任何合適的材料締合。該材料可以包括化合物、聚合物、復(fù)合物、混合物、噬菌體、病毒和/或細(xì)胞，等等。例如，珠可以與特異性結(jié)合對(duì)的成員(見部分VI)，如受體、配體、核酸、化合物文庫(kù)的成員，和/或等等締合。在某些情況下，珠可以是攜帶不同的材料的不同的珠的混合物。不同的珠可能在任何方面會(huì)有所不同，如大小、形狀、相關(guān)聯(lián)的代碼和/或珠運(yùn)送的材料。在一些實(shí)施方案中，該方面可識(shí)別相關(guān)聯(lián)的材料。代碼在下面部分XII進(jìn)一步描述。
[0125]顆粒可以是囊泡。囊泡通常包含由脂質(zhì)包膜限定的任何非細(xì)胞的衍生顆粒。囊泡可在其包膜或內(nèi)部部分包括任何合適的組分。適合的組分可以包括化合物、聚合物、復(fù)合物、混合物、聚集體和/或顆粒，等等。示例性的組分可以包括蛋白質(zhì)、肽、小分子化合物、候選藥物、受體、核酸、配體和/或諸如此類。
[0126](IV)輸入機(jī)制
[0127]微流體系統(tǒng)可以包括與所述微流體網(wǎng)絡(luò)接合的一個(gè)或更多個(gè)輸入機(jī)制。輸入機(jī)制通常包括用于輸入材料(例如，顆粒、流體和/或試劑)到微流體芯片的微流體網(wǎng)絡(luò)的任何合適的機(jī)制，包括選擇性(即，組件經(jīng)組件(component-by-component))和/或散裝機(jī)制(bulk mechanisms)。
[0128]輸入機(jī)制可以從內(nèi)部源，S卩，包含在微流體芯片的貯器，和/或外部源，S卩，與芯片分開，或在芯片外部的貯器接收材料。
[0129]從內(nèi)部源輸入材料的輸入機(jī)制可以使用任何合適的接受器來存儲(chǔ)和分配材料。合適的接受器可以包括在芯片中形成的空間。這種空間可以直接從芯片外部訪問，例如，通過孔從帶流體網(wǎng)絡(luò)的流體連通到芯片的外表面，諸如在頂部表面。接受器可具有相比于流體網(wǎng)絡(luò)的流體容量是相對(duì)大的流體的容量，使得它們不會(huì)很快耗盡。例如，流體容量可以是至少約1、5、10、25、50或100 μ L。因此，材料可以被分配到使用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備的接受器中，如果需要的話，諸如微量吸管、注射器等。
[0130]從外部源輸入材料的輸入機(jī)制也可以使用任何合適的接受器和機(jī)制來存儲(chǔ)和分配材料。然而，如果外部源輸入材料直接到流體網(wǎng)絡(luò)中，外部源可能需要與流體網(wǎng)絡(luò)有效接合，例如使用接觸和/或非接觸式分配機(jī)制。因此，來自外部源的輸入機(jī)制可以使用毛細(xì)管或針來引導(dǎo)流體精確進(jìn)入流體網(wǎng)絡(luò)。可替換地，或此外，來自外部源的輸入機(jī)制可以使用非接觸式分配機(jī)制，如“噴濺”，這可以與噴墨打印機(jī)的動(dòng)作相比。此外，來自外部源的輸入機(jī)制可以使用顆粒的彈道推進(jìn)，例如通過基因槍介導(dǎo)的。
[0131]使用任何合適的促進(jìn)機(jī)制可促進(jìn)和/或調(diào)節(jié)材料到微流體系統(tǒng)的輸入。這種促進(jìn)機(jī)制可包括重力流，例如，當(dāng)輸入存儲(chǔ)的流體高度比輸出存儲(chǔ)更高時(shí)。促進(jìn)機(jī)制還可以包括正壓力來推動(dòng)材料進(jìn)入的流體網(wǎng)絡(luò)，諸如機(jī)械或氣體壓力，或者離心力；朝向輸出機(jī)制拉動(dòng)流體的在輸出機(jī)制的負(fù)壓力；和/或在流體網(wǎng)絡(luò)內(nèi)起作用的定位機(jī)制。定位機(jī)制可包括泵和/或電動(dòng)機(jī)制。定位機(jī)制在下面的在部分V中進(jìn)一步描述。在一些實(shí)施方案中，促進(jìn)機(jī)制可包括懸浮機(jī)制，以在輸入之前保持顆粒如細(xì)胞處于懸浮。
[0132](V)定位機(jī)制
[0133]微流體系統(tǒng)可包括一個(gè)或更多個(gè)定位機(jī)制。定位機(jī)制通常包括用于在輸入之后放置顆粒在芯片上預(yù)先選定的位置的任何機(jī)制，例如，用于保持、生長(zhǎng)、治療和/或測(cè)定，等等。定位機(jī)制可以被分類但不限于通過各種方式，例如，以反映它們的起源和/或操作原理，包括直接和/或間接的，流體介導(dǎo)的和/或非流體介導(dǎo)的，外部的和/或內(nèi)部的，等等。這些分類并不是相互排斥的。因此，給定的定位機(jī)制可以兩種或更多種方式定位顆粒；例如，電場(chǎng)可直接定位顆粒(例如，通過電泳)和間接定位(如通過電滲)。
[0134]定位機(jī)制可起作用以縱向和/或橫向地限定顆粒定位。術(shù)語“縱向定位”表示平行于或沿著微流體通道的長(zhǎng)軸和/或通道內(nèi)流體流動(dòng)流的定位。與此相反，術(shù)語“橫向定位”表示正交于通道的長(zhǎng)軸和/或相關(guān)聯(lián)的主流體流動(dòng)流。通過在彎曲通道中均衡“長(zhǎng)軸”與“切線”，縱向和橫向定位可以被局部限定。
[0135]定位機(jī)制可單獨(dú)和/或組合使用。如果組合使用，機(jī)制可以串聯(lián)使用(即，順序地)和/或并聯(lián)使用(即，同時(shí)地)。例如，間接機(jī)制，諸如如流體流動(dòng)，可被用于粗定位，和直接機(jī)制，如光鑷子可用于最終定位(和/或隨后的保留，如在別處所述)。
[0136]本部分的其余部分描述但不限于各種示例性的定位機(jī)制，大致分為直接和間接機(jī)制。
[0137]直接定位機(jī)制通常包括其中力直接作用于顆粒以在微流體網(wǎng)絡(luò)內(nèi)定位顆粒的任何機(jī)制。直接定位機(jī)制可基于任何合適的機(jī)制，包括光、電、磁和/或基于重力的力，等等。光學(xué)定位機(jī)制，使用光進(jìn)行調(diào)解或至少促進(jìn)顆粒的定位。合適的光學(xué)定位機(jī)制包括“光鑷子”，其使用適當(dāng)?shù)募械暮涂梢苿?dòng)的光源給予定位力到顆粒上。電定位機(jī)制使用電力定位顆粒。合適的電機(jī)制包括“電控”，即，跨一些或全部微流體網(wǎng)絡(luò)應(yīng)用電壓和/或電流，其可以，如上所述，直接(例如，通過電泳)和/或間接通過在流體中離子的運(yùn)動(dòng)(例如，經(jīng)由電滲)移動(dòng)帶電顆粒。磁定位機(jī)制基于磁相互作用使用磁力定位顆粒。合適的磁性機(jī)制包括在流體內(nèi)或周圍應(yīng)用磁場(chǎng)，通過它們與在顆粒內(nèi)、上或周圍的鐵磁性和/或順磁材料的締合定位顆粒。基于重力定位機(jī)制使用重力以定位顆粒，例如，使粘附細(xì)胞與在細(xì)胞培養(yǎng)位置的基底接觸。
[0138]間接定位機(jī)制通常包括其中力間接作用于顆粒，例如，以在微流體網(wǎng)絡(luò)內(nèi)縱向或橫向移動(dòng)顆粒的任何機(jī)制。
[0139]縱向間接定位機(jī)制通?？梢酝ㄟ^沿通道和/或其它通路的流體流動(dòng)被創(chuàng)建和/或調(diào)節(jié)。因此，縱向定位機(jī)制可通過調(diào)節(jié)流量和/或路徑的閥門和/或泵被促進(jìn)和/或調(diào)節(jié)。在一些情況下，縱向的定位機(jī)制可通過電滲定位機(jī)制被促進(jìn)和/或調(diào)節(jié)?？商鎿Q地，或此外，縱向定位機(jī)制可以是基于輸入的，即，通過輸入機(jī)制，諸如壓力或基于重力的機(jī)制，包括通過流體柱的不同高度產(chǎn)生的壓力頭，被促進(jìn)和/或調(diào)節(jié)。
[0140]橫向間接定位機(jī)制通常可以通過在通道交叉點(diǎn)，流體流動(dòng)減少的橫向配置區(qū)域，和/或通道的彎曲的流體流動(dòng)流被創(chuàng)建和/或調(diào)節(jié)?；谙鄬?duì)于運(yùn)送流體離開位點(diǎn)的通道數(shù)量的運(yùn)送流體到位點(diǎn)的通道數(shù)量，通道交叉點(diǎn)可以是統(tǒng)一位點(diǎn)或分開位點(diǎn)。橫向間接定位機(jī)制可基于層狀流、隨機(jī)分配和/或離心力，等等。
[0141]微流體系統(tǒng)中顆粒和/或試劑的橫向定位，可以由基于層狀流動(dòng)的機(jī)制至少部分地介導(dǎo)?；趯訝盍鲃?dòng)的機(jī)制通常包括其中輸入流動(dòng)流在通道內(nèi)部的定位通過在通道內(nèi)部附加流動(dòng)流的存在、不存在和/或定位被確定的任何機(jī)制。這種基于層狀流動(dòng)的機(jī)制可以通過為統(tǒng)一位點(diǎn)的通道交叉點(diǎn)限定，在該處，來自兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)通道的入口流動(dòng)流流向交叉點(diǎn)，統(tǒng)一以形成更小數(shù)量的出口流動(dòng)流，優(yōu)選地為一個(gè)，從交叉點(diǎn)流出。由于在微流體尺度上的流動(dòng)流的層狀流動(dòng)屬性，在它們統(tǒng)一為層狀出口流動(dòng)流后，統(tǒng)一位點(diǎn)可維護(hù)入口流動(dòng)流的相對(duì)分配。因此，基于在其入口通道運(yùn)送顆粒和/或試劑，顆粒和/或試劑可以保持定位于任意選擇的一個(gè)或更多個(gè)層狀流動(dòng)流，從而橫向定位顆粒和/或試劑。
[0142]每個(gè)入口流動(dòng)流的相對(duì)大小(或流量)和定位可確定運(yùn)送顆粒和/或試劑的流動(dòng)流的橫向定位和相對(duì)寬度。例如，用于相對(duì)小的(窄的)、側(cè)翼為兩個(gè)較大的(較寬的)流動(dòng)的顆粒/試劑入口流動(dòng)流，可能在單一出口通道占據(jù)狹窄的中央位置。相比之下，用于相對(duì)大的(寬的)，側(cè)翼為同等大小流動(dòng)流和較小的(較窄的)流動(dòng)流的顆粒/試劑的入口流動(dòng)流，可能會(huì)占據(jù)橫向地偏向較小的流動(dòng)流的較寬的位置。在任一情況下，基于層狀流動(dòng)的機(jī)制可被稱為集中機(jī)制，因?yàn)轭w粒/試劑是“集中”到出口通道的橫截面面積的子集?；趯訝盍鲃?dòng)的機(jī)制可被用于單一地址的顆粒和/或試劑到多個(gè)相異的保留位點(diǎn)。
[0143]基于層狀流動(dòng)的機(jī)制可以是可變機(jī)制以改變顆粒/試劑的橫向定位。如上所述，每個(gè)入口流動(dòng)流的相對(duì)貢獻(xiàn)可以確定顆粒/試劑流動(dòng)流的橫向定位。任何入口流動(dòng)流的改變流動(dòng)可以改變其對(duì)出口流動(dòng)流的貢獻(xiàn)，相應(yīng)地改變顆粒/試劑流動(dòng)流。在極端的情況下，被稱為灌注機(jī)制，基于來自相鄰入口流動(dòng)流的流動(dòng)的存在或不存，試劑(或顆粒)流動(dòng)流可被橫向地移動(dòng)，與保留顆粒(試劑)接觸或隔開。這種機(jī)制還可以用于影響顆粒的可變的或調(diào)節(jié)的橫向定位，例如，引導(dǎo)顆粒到具有不同的橫向定位的保留位點(diǎn)。
[0144]微流體系統(tǒng)中顆粒和/或試劑的橫向定位，可以由隨機(jī)的(或部分的流動(dòng))定位機(jī)制至少部分地介導(dǎo)。隨機(jī)橫向定位機(jī)制通常包括其中至少部分地被隨機(jī)選擇的輸入顆?；蛟噭┑淖蛹?，遠(yuǎn)離主要流動(dòng)流向通道內(nèi)流體流動(dòng)減少的區(qū)域(或者，潛在的，不同通道)側(cè)向分布的任何定位機(jī)制。流動(dòng)減少的區(qū)域可促進(jìn)顆粒保留、治療、檢測(cè)、最小化顆粒損壞和/或促進(jìn)顆粒與基底接觸。隨機(jī)定位機(jī)制可以通過分開的流動(dòng)位點(diǎn)和/或局部加寬通道等等來確定。
[0145]分開的流動(dòng)位點(diǎn)可以通過形成流體流速減小的區(qū)域影響隨機(jī)定位。分開的流動(dòng)位點(diǎn)通常包括來自一個(gè)(優(yōu)選地)或更多個(gè)入口通道的入口流動(dòng)流被分成更多數(shù)量的出口通道，包括兩個(gè)、三個(gè)、或更多通道的任何通道交叉點(diǎn)。這樣分開的位點(diǎn)可遞送隨機(jī)地和/或基于顆粒的特性(諸如質(zhì)量)選擇的顆粒的子集，到流速減小的區(qū)域或在交叉點(diǎn)或其附近形成的半停滯流動(dòng)區(qū)域。由該子集表示的顆粒的部分可以依賴于出口通道相對(duì)于入口通道的相對(duì)流動(dòng)方向。這些流動(dòng)方向通?？梢哉挥谌肟诹鲃?dòng)流，朝向相反的方向，以形成“T型交叉點(diǎn)”。可替換地，出口流動(dòng)方向可以形成小于和/或大于90度的角。
[0146]具有兩個(gè)或更多個(gè)出口通道的分開的流動(dòng)定位機(jī)制，可以用作分配流動(dòng)機(jī)制。特別地，運(yùn)送到通道交叉點(diǎn)的流體、顆粒和或試劑可以根據(jù)通過兩個(gè)或更多個(gè)出口通道的流體流動(dòng)被分配。因此，進(jìn)入到兩個(gè)或更多個(gè)通道的顆?；蛟噭┑臄?shù)量或容量比例，可以通過通道的相對(duì)大小和/或通過通道的流體的流速調(diào)節(jié)，流體的流速繼而可被閥門或其它合適的流動(dòng)調(diào)節(jié)機(jī)制調(diào)節(jié)。在第一組實(shí)施方案中，出口通道可以是非常不相等的大小，使得只有一小部分顆粒和/或試劑被引導(dǎo)到較小的通道。在第二組實(shí)施方案中，閥門可被用于形成試劑的所需稀釋。在第三組實(shí)施方案中，閥門可被用于有選擇地引導(dǎo)顆粒到兩種或更多種流體路徑中的一個(gè)。
[0147]局部拓寬的通道可以通過產(chǎn)生主流動(dòng)流的側(cè)面的減小的流速的區(qū)域，促進(jìn)隨機(jī)定位。減小的流速可在減小的流速的區(qū)域沉積輸入的顆粒的子集。這種拓寬的通道可包括以一定的角度彎或彎曲的非線性通道?？商鎿Q地，或此外，拓寬的區(qū)域可以通過在通道壁的凹部、交叉通道的室和/或類似物中形成，特別是在彎的或彎曲的通道的外邊緣。
[0148]顆粒和/或試劑的橫向定位，也可以由基離心定位機(jī)制至少部分地介導(dǎo)。在離心定位機(jī)制下，顆?？赡軙?huì)經(jīng)歷由速度的變化確定的離心力，例如，由移動(dòng)通過彎曲的流體路徑。顆粒的大小和/或密度可確定速度變化率，分配不同的顆粒大小和/或密度到不同的橫向定位。
[0149](VI)保留機(jī)制
[0150]微流體系統(tǒng)可包括一個(gè)或更多個(gè)保留機(jī)制。保留機(jī)制通常包括用于保留(或保持、捕捉或俘獲)在微流體網(wǎng)絡(luò)的預(yù)先選擇的位置或區(qū)域的顆粒的任何合適的機(jī)制，包括單個(gè)或串聯(lián)和/或并聯(lián)操作的多個(gè)機(jī)制。保留機(jī)制可作用以克服由流體流動(dòng)施加的定位力。此外，保留機(jī)制，也稱為捕獲或俘獲機(jī)制，可保留任何適當(dāng)數(shù)量的顆粒，包括單個(gè)顆?；蝾w粒團(tuán)/群體。合適的保留機(jī)制可基于與流動(dòng)耦合的物理障礙物、化學(xué)反應(yīng)、真空力、循環(huán)流體流動(dòng)、重力、離心力、磁力、電力和/或光學(xué)上產(chǎn)生的力，等等。
[0151]保留機(jī)制可能是選擇性或非選擇性的。選擇性的機(jī)制可能是部分選擇性的，即，保留不超過全部(子集)的輸入的顆粒。可替換地，或此外，選擇性的機(jī)制可以是顆粒依賴性的，即，基于輸入的顆粒的一個(gè)或更多個(gè)屬性保留顆粒，例如大小、表面化學(xué)、密度、磁特性、電荷、光學(xué)屬性(諸如折射率)和/或諸如此類。
[0152]保留機(jī)制可至少部分上基于顆粒與在微流體網(wǎng)絡(luò)配置的任何合適的物理障礙物的接觸。這種顆粒-障礙物接觸通常沿流體流動(dòng)方向限制縱向的顆粒運(yùn)動(dòng)，產(chǎn)生流動(dòng)輔助保留。流動(dòng)輔助的顆粒-障礙物接觸也可能限制邊到邊/正交(垂直)的運(yùn)動(dòng)。合適的物理障礙物可以通過從通道或其它通路(即，壁、頂部和/或底部)的任何部分的向內(nèi)突起的內(nèi)側(cè)延伸形成。例如，突起可以是固定和/或可移動(dòng)的，包括柱、桿、塊、凸塊、壁和/或部分/完全關(guān)閉的閥門，等等。一些物理障礙物，諸如閥門，可以是可移動(dòng)或可調(diào)節(jié)的?？商鎿Q地，或此外，物理障礙物可以由形成在通道或其它通路中的凹部或者由流體可滲透膜限定。其它物理障礙物可以基于通道的橫截面尺寸來形成。例如，大小可選擇性的通道可保留太大無法進(jìn)入通道的顆粒。(大小可選擇性的通道也可被稱為過濾器通道、微通道或者顆粒限制性或顆粒選擇性通道。)
[0153]物理障礙物和大小可選擇性通道的其它方面都在下面部分XIII中描述。
[0154]化學(xué)保留機(jī)制可以基于化學(xué)相互作用保留顆粒?；瘜W(xué)相互作用可以是共價(jià)和/或非共價(jià)的相互作用，包括離子的、靜電的、疏水的、范德華力和/或金屬配位相互作用，等等?；瘜W(xué)相互作用可以選擇性地和/或非選擇性地保留顆粒。選擇性和非選擇性的保留可以基于顆粒和通道表面之間的特異性和/或非特異性的化學(xué)相互作用。
[0155]化學(xué)相互作用可以是特異性的。特異性的機(jī)制可使用特異性結(jié)合對(duì)(SBP)，例如，具有分別布置在顆粒和通道的表面的第一和第二 SBP組分。示例性SBP可包括生物素/抗生物素蛋白、抗體/抗原、外源凝集素/碳水化合物等。這些和另外的示例性SBP在以下表I中被列出，且第一和第二的指定是任意的。SBP組分可以在網(wǎng)絡(luò)形成之前、期間和/或之后被局部布置在微流體網(wǎng)內(nèi)部。例如，在基底和流體層組件被接合之前，基底和/或流體層組件的表面可以用SBP組件的粘合/附著局部地修改?？商鎿Q地，或此外，在網(wǎng)絡(luò)形成后，SBP組件可以被局部地與微流體網(wǎng)絡(luò)相關(guān)聯(lián)，例如，通過SBP組件與網(wǎng)絡(luò)的局部化學(xué)反應(yīng)(諸如通過局部光照明的催化)。
[0156]化學(xué)相互作用也可以是相對(duì)非特異性的。非特異性相互作用機(jī)制可能依賴于微流體網(wǎng)絡(luò)的表面化學(xué)的局部差異。如上所述，這種局部差異可以在通道/微流體網(wǎng)絡(luò)形成之前、期間和/或之后被創(chuàng)建。局部差異可能由于局部化學(xué)反應(yīng)，例如，以創(chuàng)建疏水性或親水性區(qū)域，和/或材料的局部結(jié)合。結(jié)合的材料可包括聚-L-賴氨酸、聚-D-賴氨酸、聚乙烯亞胺、白蛋白、明膠、膠原蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白、巢蛋白、玻連蛋白、原纖蛋白、彈性蛋白、肝素、硫酸角質(zhì)素、硫酸乙酰肝素、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸和/或細(xì)胞外基質(zhì)提取物/混合物，等等。
[0157]可替換地或此外，其它保留機(jī)制可以使用基于物理障礙物和/或基于化學(xué)相互作用的保留。這些機(jī)制的一些或所有，和/或上面描述的機(jī)制，可以至少部分地依靠顆粒和通道之間的摩擦，以協(xié)助保留。
[0158]保留機(jī)制可基于真空力、流體流動(dòng)和/或重力?；谡婵盏谋Ａ魴C(jī)制可施加拉顆粒與通道表面緊密接觸的力，例如，使用朝向通道外部的力。真空的施加和/或顆粒保留，可以通過通道或其它通路的壁的孔徑/孔口協(xié)助。相比之下，基于流體流動(dòng)的保留機(jī)制可產(chǎn)生保留顆粒的流體流動(dòng)路徑，例如環(huán)。這些流體流動(dòng)路徑可以由不具有出口(例如，通過閥門關(guān)閉和活性泵)的封閉環(huán)形通道來形成，和/或通過諸如其在凹槽內(nèi)部由通常環(huán)形流體流動(dòng)產(chǎn)生的渦流來形成?；谥亓Φ谋Ａ魴C(jī)制可保留靠住通路的底部表面的顆粒，從而結(jié)合摩擦來限制顆粒運(yùn)動(dòng)?；谥亓Φ谋Ａ艨赏ㄟ^凹部和/或減少的流速來促進(jìn)。
[0159]保留機(jī)制可基于離心力、磁力和/或光產(chǎn)生的力。基于離心力的保持機(jī)制可能通過推顆粒抵靠通路表面來保留顆粒，通常通過施加力在顆粒上，其通常與流體流動(dòng)正交。這種力可通過微流體芯片的離心分離和/或通過流體流動(dòng)路徑內(nèi)的顆粒運(yùn)動(dòng)被施加?；诖帕Φ谋Ａ魴C(jī)制可使用產(chǎn)生的外部和/或內(nèi)部的到微流體系統(tǒng)的磁場(chǎng)保留顆粒。磁場(chǎng)可以與顆粒的鐵磁性和/或順磁性部分交互。例如，珠可以至少部分地由鐵磁性材料組成，或者細(xì)胞可包括表面結(jié)合或內(nèi)在化的鐵磁性顆粒?；陔娏Φ谋Ａ魴C(jī)制可使用電場(chǎng)保留帶電顆粒和/或群體。相比之下，基于光產(chǎn)生力的操作的保留機(jī)制可以使用光來保留顆粒。這種機(jī)制可以基于光學(xué)鑷子的原理等等來操作。
[0160]保留機(jī)制的另一種形式是盲填充通道，其中通道有入口，但是固定地或短暫地沒有出口。例如，當(dāng)微流體設(shè)備是由氣體可滲透材料諸如PDMS制成時(shí)，存在于閉端通道的氣體可以逸出，或當(dāng)被通過入口的液體的流入敦促時(shí)被通過該氣體可滲透材料強(qiáng)制到通道的外部。這是盲填充的優(yōu)選實(shí)例。盲填充可以與具有入口和被閥門開關(guān)的出口的通道或室一起使用。在本實(shí)例中，當(dāng)出口閥關(guān)閉而通過入口填充通道或室時(shí)，填充氣體的通道或室的盲填充發(fā)生。如果該入口還具有閥門，然后在盲填充完成后該閥可以被關(guān)閉，并且然后所述出口可以被打開以暴露所述通道或室的內(nèi)容于另一個(gè)通道或室。如果第三入口與該通道或室連通，該第三入口可引入另一種流體、氣體或液體進(jìn)入通道或室以使待排出的盲填充液體以測(cè)定數(shù)量從通道或室被排出。結(jié)果類似于HPLC的樣品循環(huán)系統(tǒng)。保留機(jī)制的其他方面在部分V和XIII中被描述。
[0161](VII)處理機(jī)制
[0162]處理機(jī)制通常包括用于暴露顆粒于試劑和/或物理?xiàng)l件的任何合適的機(jī)制，包括流體介導(dǎo)的和非流體介導(dǎo)的機(jī)制。
[0163]顆?？杀槐┞队谠噭?。試劑通常包括在微流體系統(tǒng)中接觸顆?；蝾w粒群體的任何化學(xué)物質(zhì)、化合物、離子、聚合物、材料、復(fù)合體、混合物、聚集體和/或生物顆粒，等等。試劑可以在顆粒分析中發(fā)揮作用，包括作為化學(xué)/生物調(diào)節(jié)劑(相互作用的試劑)、檢測(cè)/分析試劑、溶劑、緩沖液、介質(zhì)、洗滌液和/或等等進(jìn)行操作。
[0164]化學(xué)調(diào)節(jié)劑或生物調(diào)節(jié)劑可包括被測(cè)試用于與顆粒的相互作用的任何試劑。相互作用通常包括與顆粒的特異性結(jié)合和/或?qū)︻w粒(或調(diào)節(jié)劑)的任何可檢測(cè)的基因型和/或表型效應(yīng)。可能合適的相互作用和基因型/表型效應(yīng)的其它方面在以下部分XII被描述。
[0165]化學(xué)調(diào)節(jié)劑可包括與受體相互作用的配體(例如，拮抗劑、激動(dòng)劑、激素等)。配體可以是小分子化合物、多肽、蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂質(zhì)等。配體和受體的其它方面，以及它們?cè)跍y(cè)定相互作用中的使用，或?qū)π盘?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響，在如下部分XII被描述。
[0166]可替換地，或此外，化學(xué)調(diào)節(jié)劑可以是核酸。核酸可以是DNA、RNA、肽核酸、修飾的核酸和/或它們的混合物，并且可以是單、雙和/或三鏈的。核酸可以通過化學(xué)合成、酶促合成和/或生物合成來生產(chǎn)，并且可以是質(zhì)粒、片段、正義/反義表達(dá)載體、報(bào)告基因、用于基因組整合/修改的載體(如靶向核酸/載體(用于敲除/敲低/敲入(knockoutdownin))、病毒載體、反義寡核苷酸、dsRNA、siRNA、核酶和/或諸如此類。核酸試劑還可以包括促進(jìn)核酸被細(xì)胞的攝取的轉(zhuǎn)染試劑，諸如脂質(zhì)體試劑(例如，Iipofectamine),沉淀形成劑(諸如磷酸鈣)、DMS0、聚乙二醇、包裝核酸的病毒外殼和/或等等。
[0167]調(diào)節(jié)劑可以是各種各樣的化學(xué)物質(zhì)和/或生物實(shí)體。各種各樣的化學(xué)調(diào)節(jié)劑可以是離子(如I丐、鈉、鉀、鋰、氫(pH)、氯、氟、碘等)、溶解的氣體(NO、CO2, O2等)、碳水化合物、脂類、有機(jī)物、聚合物等。在一些實(shí)施方案中，生物調(diào)節(jié)劑可暴露于細(xì)胞，例如，以感染細(xì)胞、測(cè)定細(xì)胞-細(xì)胞相互作用等。生物調(diào)節(jié)劑可包括任何細(xì)胞、病毒或細(xì)胞器，如在以上部分III中所述。
[0168]試劑可以是檢測(cè)/分析試劑。檢測(cè)/分析試劑通常包括與顆粒接觸以促進(jìn)處理顆粒(或顆粒組件)用于檢測(cè)顆粒(或組件)的預(yù)先存在的或新創(chuàng)建的方面的任何試劑。檢測(cè)/分析試劑可包括染料、酶、底物、輔因子和/或SBP組分(見上文部分VI的表I)，等等。染料，也稱為標(biāo)記，通常包括任何光學(xué)可檢測(cè)的試劑。適合的染料可以是發(fā)光體、熒光團(tuán)、發(fā)色體、發(fā)色團(tuán)和/或諸如此類。這種染料可以結(jié)合到，或者可以是，SBP組分；可作為酶的底物；可內(nèi)在地標(biāo)記細(xì)胞或細(xì)胞結(jié)構(gòu)(例如，DNA染料、膜染料、運(yùn)輸染料(trafficking dye)等)；可以用作指示劑染料(諸如鈣指示劑、PH指示劑等)；和/或諸如此類。酶可以在顆粒分析中通過將染料摻入到產(chǎn)物和/或通過產(chǎn)生隨后可以用染料進(jìn)行檢測(cè)的產(chǎn)物，等等進(jìn)行操作。合適的酶可包括聚合酶(RNA和/或DNA)，熱穩(wěn)定的聚合酶(諸如Taq、VENT等)、過氧化物酶(諸如HRP)、磷酸酶(諸如堿性磷酸酶)、激酶、甲基化酶、連接酶、蛋白酶、半乳糖苷酶(諸如半乳糖苷酶、葡糖醛酸酶等)、轉(zhuǎn)移酶(諸如氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶)、氧化還原酶(諸如螢光素酶)和/或核酸(諸如DNA酶、RNA酶等)等等。SBP成員，如抗體、洋地黃毒苷、核酸等，可直接結(jié)合到染料、酶和/或其它SBP組分；可以非共價(jià)結(jié)合到染料和/或酶(預(yù)結(jié)合的或在附加的暴露步驟中結(jié)合的)；和/或等等。檢測(cè)/分析試劑其它的方面，包括這些試劑可以在其中使用的分析的類型，在以下部分XII中描述。
[0169]處理機(jī)制可使用流體介導(dǎo)機(jī)制以暴露顆粒于試劑。試劑可以被帶到顆粒，例如，當(dāng)顆粒被保留時(shí)，或顆?？梢员粠У皆噭?，當(dāng)該試劑出現(xiàn)(并任選保留)在流體網(wǎng)絡(luò)的特定部分時(shí)。
[0170]流體介導(dǎo)機(jī)制可以是基于流動(dòng)的、基于場(chǎng)的和/或被動(dòng)的，等等?；诹鲃?dòng)處理機(jī)制可以通過例如由重力流動(dòng)或主動(dòng)流動(dòng)(泵送)介導(dǎo)的流體流動(dòng)操作，以運(yùn)送試劑到顆粒，或反之亦然。在一些實(shí)施方案中，基于流動(dòng)處理機(jī)制可以通過橫向調(diào)節(jié)(一側(cè)到另一側(cè))的定位來操作，如以上/以下部分V和X中所述，以精確調(diào)節(jié)試劑(或顆粒)到顆粒(或試齊IJ)的暴露。相比之下，基于場(chǎng)的機(jī)制可以通過移動(dòng)帶有電場(chǎng)的試劑(或顆粒)組合顆粒和試劑。電場(chǎng)可以產(chǎn)生任何適當(dāng)?shù)碾妱?dòng)效應(yīng)，諸如電泳、介電泳、電滲等。可替換地，或此外，試劑可以通過試劑的擴(kuò)散與顆粒結(jié)合。
[0171]在微流體系統(tǒng)中的顆粒可以暴露于使用非流體介導(dǎo)機(jī)制的物理調(diào)節(jié)劑/條件。然而，這些“非流體介導(dǎo)的”機(jī)制可以使用流體的屬性，以幫助它們的操作，諸如通過流體熱能或壓力轉(zhuǎn)移到顆粒。物理調(diào)節(jié)劑/條件可以被應(yīng)用到來自微流體系統(tǒng)外部和/或內(nèi)部源的顆粒。示例性的物理調(diào)節(jié)劑/條件可以包括熱能(熱)、輻射(光)、輻射(粒子)、電場(chǎng)、磁場(chǎng)、壓力(包括聲音)、重力場(chǎng)等。
[0172]處理機(jī)制可以作用于任何合適的顆粒，包括在以上部分III描述的任何顆粒。顆?？梢允峭暾?、通透的和/或裂解的。因此，處理機(jī)制可作用于釋放的細(xì)胞組分。顆?？梢栽陉嚵兄斜惶幚恚瑹o論是串聯(lián)，例如，使用共享的處理機(jī)制，和/或并聯(lián)，例如，使用不同的和/或共享的處理機(jī)制。
[0173]處理機(jī)制的其它方面在以上部分V中(定位試劑/液體/顆粒)及以下部分XIII中被描述。
[0174](VIII)測(cè)定機(jī)制
[0175]通過微流體系統(tǒng)操縱的顆?？梢栽谝粋€(gè)或更多個(gè)測(cè)定位點(diǎn)通過一個(gè)或更多個(gè)測(cè)定機(jī)制進(jìn)行分析。測(cè)定機(jī)制通常包括用于檢測(cè)預(yù)先選擇顆?；蝾w粒特性(例如，由顆粒、顆粒組分和/或分析產(chǎn)物等等提供的)的任何合適的裝置或方法。測(cè)定位點(diǎn)通常包括在其中系統(tǒng)的內(nèi)部和/或外部執(zhí)行測(cè)定的任何合適的顆粒位置或多個(gè)位置。
[0176]測(cè)定機(jī)制可以采用任何合適的檢測(cè)方法來定性和/或定量的分析樣品。合適的檢測(cè)方法可包括光譜法、電方法、流體動(dòng)力學(xué)方法、成像方法和/或生物的方法，等等，特別是適于或適合于顆粒分析的那些。這些方法可以包括單個(gè)或多個(gè)值的檢測(cè)，與時(shí)間有關(guān)或與時(shí)間無關(guān)的(例如，穩(wěn)定狀態(tài)或端點(diǎn))的值，和/或平均的或(在時(shí)間上和/或空間上)分布的值，等等。這些方法可以測(cè)定和/或輸出模擬和/或數(shù)字的值。
[0177]光譜方法通常包括光(或波狀粒子)的任何屬性的檢測(cè)，特別是通過樣品相互作用而變化的屬性。合適的光譜方法可包括吸收、發(fā)光(包括光致發(fā)光、化學(xué)發(fā)光和電化學(xué)發(fā)光)、磁共振(包括細(xì)胞核和電子自旋共振)、散射(包括光散射、電子散射和中子散射)、衍射、圓二色性和光學(xué)旋轉(zhuǎn)，等等。合適的光致發(fā)光方法可以包括熒光強(qiáng)度(FLINT)、熒光偏振(FP)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)、熒光壽命(FLT)、全內(nèi)反射熒光(TIRF)、熒光相關(guān)光譜(FCS)、熒光漂白后恢復(fù)(FRAP)、熒光激活細(xì)胞分選(FACS)，以及它們的磷光和其它類似物，等等。
[0178]電方法一般包括任何電參數(shù)的檢測(cè)。合適的電參數(shù)可包括電流、電壓、電阻、電容和/或功率，等等。
[0179]流體動(dòng)力學(xué)方法通?？砂w粒(或其組分或衍生物)和其鄰居(例如，其它的顆粒)、溶劑(包括任何基質(zhì))和/或微流體系統(tǒng)等等之間的相互作用的檢測(cè)，并可用于表征分子大小和/或形狀，或用于分離樣品為其組分。合適的流體動(dòng)力學(xué)方法可以包括色譜法、沉淀、粘度測(cè)定法和電泳等等。
[0180]成像方法通?？砂臻g分布信號(hào)的檢測(cè)，通常用于可視化樣品或其組分，包括光學(xué)顯微術(shù)和電子顯微術(shù)，等等。
[0181]生物方法一般可包括被顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)、介導(dǎo)和/或影響的一些生物活性的檢測(cè)，該檢測(cè)通常使用如上文所述的另一種方法。合適的生物方法在以下部分XII中詳細(xì)描述。
[0182]測(cè)定機(jī)制可以被用于在微流體系統(tǒng)內(nèi)部和/或外部的任何合適的檢測(cè)位點(diǎn)檢測(cè)顆粒和/或顆粒的特性。
[0183]合適的內(nèi)部檢測(cè)位點(diǎn)可能包括微流體系統(tǒng)(芯片)內(nèi)或上的任何位點(diǎn)。這些位點(diǎn)可包括通道、室和/或陷阱，及其部分。顆?；蝾w粒特性可在顆粒(或釋放的組分/分析產(chǎn)物)是靜止的或移動(dòng)時(shí)被檢測(cè)。顆粒保留后，靜止的顆?？梢员挥龅?，例如，在細(xì)胞室中生長(zhǎng)的細(xì)胞。顆粒保留之前和/或之后，或在限制到區(qū)域時(shí)，移動(dòng)顆?？杀挥龅?。特別地，顆粒可以通過任何合適的定位機(jī)制移動(dòng)通過檢測(cè)位點(diǎn)，例如，通過流體流動(dòng)(基于流動(dòng)的檢測(cè))。
[0184]合適的外部檢測(cè)位點(diǎn)可以包括任何遠(yuǎn)離或獨(dú)立于微流體系統(tǒng)的位點(diǎn)。外部的檢測(cè)位點(diǎn)可以用于在從微流體系統(tǒng)去除顆粒(或顆粒組分)之后，檢測(cè)顆?；蝾w粒的特性。這些外部位點(diǎn)可代替內(nèi)部位點(diǎn)和/或除了內(nèi)部位點(diǎn)以外使用，允許顆粒(或顆粒組分)被進(jìn)一步操縱和/或檢測(cè)。這些進(jìn)一步的操縱和/或檢測(cè)的方法可以與在微流體系統(tǒng)中所執(zhí)行的操縱和/或方法重疊，但優(yōu)選是補(bǔ)充的，包括質(zhì)譜、電泳、離心分離、PCR擴(kuò)增、導(dǎo)入生物體、在臨床治療中使用和/或細(xì)胞培養(yǎng)物，等等。
[0185]測(cè)定方法可直接和/或間接(例如，經(jīng)由報(bào)告分子)檢測(cè)和/或監(jiān)測(cè)顆粒的任何合適的特性。合適的特性可包括顆粒的身份、數(shù)目、濃度、位置(絕對(duì)或相對(duì))、組成、結(jié)構(gòu)、序列和/或活性等。所檢測(cè)的特性可包括分子或超分子的特性，諸如存在/不存在、濃度、定位、結(jié)構(gòu)/修飾、構(gòu)象、形態(tài)、活性、數(shù)目和/或DNA、RNA、蛋白質(zhì)、酶、脂類、碳水化合物、離子、代謝物、細(xì)胞器、添加的試劑(結(jié)合)和/或其復(fù)合物的運(yùn)動(dòng)，等等。所檢測(cè)的特性還可以包括細(xì)胞特性，諸如任何合適的細(xì)胞基因型或表型，包括形態(tài)、生長(zhǎng)、凋亡、壞死、裂解、活/死、在細(xì)胞周期的位置、信號(hào)途徑的活性、分化、轉(zhuǎn)錄活性、基底附著、細(xì)胞-細(xì)胞相互作用、翻譯活性、復(fù)制活性、轉(zhuǎn)化、熱休克反應(yīng)、運(yùn)動(dòng)性、鋪展(spreading)、膜的完整性和/或神經(jīng)突向外生長(zhǎng)，等等。
[0186]檢測(cè)到的特性的其它方面和它們?cè)陬w粒分析中的使用在以下部分XII和XIII中被描述。
[0187](IX)釋放機(jī)制
[0188]微流體系統(tǒng)可包括任何合適的數(shù)目的顆粒釋放機(jī)制。釋放機(jī)制通常包括，用于允許保留的顆粒從其被保留的預(yù)先選定的位點(diǎn)/區(qū)域移出的任何機(jī)制，包括移除、克服和/或使得保留顆粒的保留機(jī)制無效。適合的釋放機(jī)制可至少基于保留力被選擇。釋放之后，顆粒(或顆粒組分)可具有任何合適的目的地。
[0189]釋放機(jī)制可由移除保留力來操作。因此，由特定機(jī)制保留的顆?？赏ㄟ^終止該機(jī)制被釋放。例如，通過化學(xué)相互作用/結(jié)合保留的顆粒可通過裂解鍵，諸如用蛋白酶(如胰蛋白酶)或以其它方式破壞相互作用，諸如用改變的離子性條件(例如，用EDTA)或pH，或與過量的SBP成員，而釋放。相似地，通過物理障礙物保留顆粒，諸如關(guān)閉的閥門，可通過移動(dòng)/移除障礙物而釋放。此外，通過流體流動(dòng)、真空、光、電場(chǎng)、磁場(chǎng)和/或離心力保留的顆粒可通過移除/重定向相關(guān)流動(dòng)、力、場(chǎng)等被釋放。
[0190]釋放機(jī)制可以通過克服有較大力量的保持力操作。因此，顆?？赏ㄟ^施加大于保留力的力的任何定位機(jī)制被釋放。例如，保留顆?？赏ㄟ^釋放流動(dòng)被釋放。釋放流動(dòng)可以是在散裝流體流動(dòng)的方向增加的流速，例如，當(dāng)顆粒被弱保留(諸如通過重力/摩擦，或弱的化學(xué)相互作用)時(shí)?？商鎿Q地，釋放流動(dòng)可以與保留流動(dòng)相反地起作用，例如與保留流動(dòng)正交或相反。例如，釋放流動(dòng)可重新定位顆粒以在脫離與保留的物理障礙物的接觸?？商鎿Q地，或此外，保留的顆?？赏ㄟ^能夠產(chǎn)生足夠大的力的任何其它合適的定位機(jī)制被釋放，如在以上部分V中所描述的其。
[0191]釋放機(jī)制可由使得顆粒上的保留力無效來操作。這樣的釋放機(jī)制可通過顆粒的釋放組件來操作。例如，保留的細(xì)胞可被裂解以釋放胞內(nèi)組分，產(chǎn)生裂解液，或珠可被處理以釋放相關(guān)聯(lián)的材料和/或以破碎/分解珠。裂解通常包括細(xì)胞表面的膜的完整性的任何部分或完全的破壞，并且可以通過溫度、洗滌劑、配體、化學(xué)處理、離子強(qiáng)度的變化、電場(chǎng)等產(chǎn)生。
[0192]釋放的顆粒和/或顆粒組分可具有任何合適的目的地。合適的直接目的地可包括圍繞顆粒的定位機(jī)制和/或流體。釋放之后，顆粒可用定位機(jī)制非選擇性地或選擇性地重新定位。選擇性的定位可以基于測(cè)得的特性定位顆粒。定位可以是到第二保留機(jī)制(和/或培養(yǎng)室)，檢測(cè)機(jī)制(諸如基于流動(dòng)的機(jī)制)，和/或輸出機(jī)制。圍繞顆粒的流體對(duì)于顆粒組分(如細(xì)胞裂解物和/或珠組分)可以是合適的目的地以與檢測(cè)/分析試劑接觸?？商鎿Q地，細(xì)胞裂解物和/或珠組分可以作為完整顆粒被重新定位。
[0193]釋放機(jī)制和釋放顆粒/組分的目的地的其它方面在以下部分XIII中被描述。
[0194](X)輸出機(jī)制
[0195]微流體系統(tǒng)可以包括與微流體網(wǎng)絡(luò)接合的一個(gè)或更多個(gè)輸出機(jī)制。輸出機(jī)制通常包括用于從微流體系統(tǒng)或其部分輸出材料(例如，流體、顆粒和/或試劑)的任何合適的機(jī)制，包括選擇性和/或散裝機(jī)制。輸出機(jī)制可以引導(dǎo)輸出的材料到任何合適的位置，諸如內(nèi)部和/或外部溝渠(sink)。溝渠通常包括用于接收輸出的材料以棄置(例如，廢物位點(diǎn))或用于進(jìn)一步研究或操縱(例如，收集位點(diǎn))的任何接受器或其它位點(diǎn)。來自微流體系統(tǒng)的材料的輸出可以使用任何合適的促進(jìn)機(jī)制促進(jìn)和/或調(diào)節(jié)，諸如內(nèi)部壓力源和/或外部真空源。輸出機(jī)制可以包括選擇機(jī)制，例如過濾器，其基于一些標(biāo)準(zhǔn)選擇輸出的材料，諸如材料是顆?；蛄黧w。
[0196](XI)細(xì)胞培養(yǎng)機(jī)制
[0197]細(xì)胞可以用在微流體系統(tǒng)中的細(xì)胞培養(yǎng)機(jī)制培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)機(jī)制通常包括用于使細(xì)胞生長(zhǎng)，包括維持和/或繁殖的任何合適的機(jī)制。合適的細(xì)胞在以上部分III中被描述。
[0198]微流體系統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)機(jī)制可包括在其中培養(yǎng)細(xì)胞的一個(gè)或更多個(gè)培養(yǎng)室?；诒慌囵B(yǎng)的細(xì)胞的數(shù)量、細(xì)胞的大小、在細(xì)胞上執(zhí)行的分析和/或細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn)，等等，培養(yǎng)室可以具有任何合適的大小、形狀、組成和/或與微流體系統(tǒng)的其它方面的關(guān)系。培養(yǎng)室的大小可以僅足夠大以容納給定細(xì)胞大小的一個(gè)細(xì)胞、幾個(gè)細(xì)胞或更多(2到50)，或許多細(xì)胞(50到1000或更多)。因此，培養(yǎng)室可以由通路的選定部分、整個(gè)通路或一組通路限定。在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)室可以由基本上擴(kuò)大的通道來形成。培養(yǎng)室可以具有允許所關(guān)注的細(xì)胞進(jìn)入室的任何合適的高度。這個(gè)高度可以大于、小于和/或等于微流體網(wǎng)絡(luò)的其它部分。一些或所有的培養(yǎng)室的表面，諸如壁、頂部和/或基底，可被處理或修改以促進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)的方面，特別是特異性或非特異性的細(xì)胞附著、細(xì)胞存活、細(xì)胞生長(zhǎng)和/或細(xì)胞分化(或其缺乏)，等等。通路處理的合適的方法和處理劑在以上部分VI中關(guān)于化學(xué)保留機(jī)制被描述。
[0199]細(xì)胞培養(yǎng)機(jī)制可以使用任何適當(dāng)?shù)沫h(huán)境控制機(jī)制在任何合適的環(huán)境條件下培養(yǎng)細(xì)胞。合適的環(huán)境條件可包括所期望的氣體組成、溫度、介質(zhì)交換的速度和頻率，和/或諸如此類。環(huán)境控制機(jī)制可以在微流體系統(tǒng)的內(nèi)部和/或外部操作。內(nèi)部機(jī)制可包括隨行的加熱器、氣體導(dǎo)管和/或介質(zhì)貯器。外部機(jī)制可包括大氣控制和/或溫度控制的培養(yǎng)箱/熱源，和/或系統(tǒng)外部的介質(zhì)源。當(dāng)系統(tǒng)是至少部分地由透氣的材料如硅橡膠制成時(shí)，大氣控制的培養(yǎng)箱可能更適合。介質(zhì)，包括氣體調(diào)節(jié)介質(zhì)，可由任何合適的輸入機(jī)制，包括手動(dòng)移液、自動(dòng)移液、非接觸式噴吐(spitting)等從外部源引入。在一些實(shí)施方案中，芯片可以用介質(zhì)進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，然后可以在引入細(xì)胞和/或其它生物材料之前將介質(zhì)丟棄。
[0200](XII)基于顆粒的操作
[0201]微流體系統(tǒng)可用于顆粒的操作。顆粒操作通常包括用于執(zhí)行所期望的功能或分析單一操作的任何合適的序列。單一操作可以由每個(gè)上述部分IV到X中描述的機(jī)制等等執(zhí)行。
[0202]微流體系統(tǒng)可用于任何合適的細(xì)胞分析或方法，包括細(xì)胞、細(xì)胞的選擇(通過選擇性保留)、處理和/或測(cè)定的任何組合，如以上部分II1、V1、VII和VIII中分別描述的。
[0203]細(xì)胞分析可在添加或不添加調(diào)節(jié)劑下表征細(xì)胞。細(xì)胞分析可測(cè)定細(xì)胞的基因型、表型和/或與調(diào)節(jié)劑的相互作用。這些分析可表征單個(gè)細(xì)胞和/或細(xì)胞群體/任何合適尺寸的細(xì)胞團(tuán)。細(xì)胞可以在添加的調(diào)節(jié)劑不存在時(shí)被表征以限定細(xì)胞本身的一個(gè)或更多個(gè)特性?？商鎿Q地，或此外，細(xì)胞可以在添加的調(diào)節(jié)劑的存在時(shí)，被表征以測(cè)定細(xì)胞和調(diào)節(jié)劑之間的相互作用。此外，細(xì)胞可以暴露于試劑的選定的濃度，或試劑的多個(gè)濃度。在其它實(shí)施方案中，細(xì)胞被暴露于試劑的濃度梯度以確定這些細(xì)胞是否會(huì)通過增加此類試劑的量被吸引或排斥。
[0204]在其它實(shí)施方案中，細(xì)胞的數(shù)量可以通過第一填充具有至少一個(gè)入口的測(cè)定室被測(cè)定出來，所述入口具有至少一個(gè)閥門，其中閥門被打開，細(xì)胞被引入到室，優(yōu)選通過盲填充閉端室，或通過開放到與室連接的出口的出口閥門，所述出口具有用于防止細(xì)胞從室退出的保留機(jī)制。然后細(xì)胞數(shù)量的測(cè)定被轉(zhuǎn)移到用于培養(yǎng)的培養(yǎng)區(qū)域。
[0205]在其它實(shí)施方案中，第一類型的細(xì)胞在與第二類型的細(xì)胞流體連通下生長(zhǎng)，其中第一類型的細(xì)胞受第二類型的細(xì)胞的存在的影響，優(yōu)選作為共同培養(yǎng)或供給類型關(guān)系。第一類型的細(xì)胞和第二類型的細(xì)胞通過保留機(jī)制保持彼此分開，雖然流體，優(yōu)選液體，被允許以與每個(gè)細(xì)胞類型接觸連接，使得使亞細(xì)胞或生物化學(xué)材料在細(xì)胞類型之間可以互換。
[0206]基因型分析可在微流體系統(tǒng)中的細(xì)胞上進(jìn)行以測(cè)定細(xì)胞的基因組成?；蛐头治隹梢栽谌魏魏线m的細(xì)胞或細(xì)胞群體上進(jìn)行，例如，患者樣品、產(chǎn)前樣品(如胚胎、胎兒、絨毛等)、實(shí)驗(yàn)操作的細(xì)胞(例如轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞)和/或等等。這種基因型方面可以包括細(xì)胞核和/或線粒體基因的拷貝數(shù)數(shù)量(諸如復(fù)制、缺失、擴(kuò)增和/或諸如此類)和/或結(jié)構(gòu)(諸如重排、融合、重復(fù)數(shù)量(諸如二核苷酸、三聯(lián)體重復(fù)、端粒重復(fù)等)、突變、基因/假基因、特異性等位基因，單核苷酸多態(tài)性的存在/不存在/身份/頻率、整合位點(diǎn)、染色體/附加體、和/或諸如此類)和/或基因組區(qū)域和/或染色體區(qū)域(如端粒、著絲粒、重復(fù)序列等)。用于基因型分析的方法可包括原位核酸雜交(在完整細(xì)胞/核上)或與從細(xì)胞中釋放出來的DNA，例如，通過裂解細(xì)胞從細(xì)胞中釋放出來的DNA雜交。核酸與核酸的雜交可以在雜交(諸如通過用聚合酶的引物延伸、用末端轉(zhuǎn)移酶的修飾等)后用染料標(biāo)記的探針、特異性結(jié)合對(duì)標(biāo)記的探針(參見部分VI)、攜帶能量轉(zhuǎn)移對(duì)(諸如“分子信標(biāo)”)的莖環(huán)探針和/或用酶標(biāo)記的探針執(zhí)行。可替換地，或此外，用于基因型分析的方法可包括聚合酶介導(dǎo)的核酸擴(kuò)增，例如，通過熱循環(huán)(PCR)或通過等溫鏈置換的方法。在一些實(shí)施方案中，基因型測(cè)定可使用電泳以協(xié)助對(duì)核酸的分析。相關(guān)基于基因的分析可采用相似的分析方法和合適的探針或DNA染料(諸如碘化丙啶、H echst等)，測(cè)定基因區(qū)域、基因、染色體區(qū)域、整個(gè)染色體或基因組的其它方面。這些其它方面可包括總DNA含量(例如2N、4N、8N等，以測(cè)定二倍體、四倍體或多倍體基因型和/或細(xì)胞周期分布)，特異性染色體的數(shù)量或位置，和/或特異性基因的位置(諸如靠近核膜、另一個(gè)細(xì)胞核結(jié)構(gòu)，等等)。
[0207]基于基因組成和/或環(huán)境影響，諸如調(diào)節(jié)劑的存在，可進(jìn)行表型分析以在微流體系統(tǒng)中表征細(xì)胞。這些分析可以測(cè)定整個(gè)細(xì)胞、細(xì)胞器或細(xì)胞、和/或內(nèi)源(天然)或外源(外來)細(xì)胞成分/組分的任何方面。
[0208]整個(gè)細(xì)胞或整個(gè)細(xì)胞群體的方面可包括數(shù)量、大小、密度、形態(tài)、分化狀態(tài)、鋪展、運(yùn)動(dòng)、翻譯活性、轉(zhuǎn)錄活性、有絲分裂活性、復(fù)制活性、轉(zhuǎn)化、一種或多種信號(hào)通路的狀態(tài)、處理的存在/不存在，完整的/裂解的、活/死，凋亡或壞死的頻率/程度，附著到基底(或通路)的存在/不存在/效率、生長(zhǎng)速率、細(xì)胞周期分布、修復(fù)DNA的能力、熱休克反應(yīng)、細(xì)胞-細(xì)胞接觸的性質(zhì)和/或頻率，等。
[0209]細(xì)胞器的方面可包括細(xì)胞的(或細(xì)胞群體的)細(xì)胞核、細(xì)胞表面的膜、溶酶體、線粒體、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、過氧化物酶體、核膜、核內(nèi)體、分泌顆粒、細(xì)胞骨架、軸突和/或突起等等的數(shù)量、大小、形狀、分布、活性等。
[0210]細(xì)胞成分/組分的方面可包括任何核酸、多肽、碳水化合物、脂質(zhì)、離子、小分子、激素、代謝物和/或其復(fù)合體等等的存在/不存在或水平、定位、移動(dòng)、活性、修飾、結(jié)構(gòu)等。可以，例如，使用和不使用調(diào)節(jié)劑測(cè)定相對(duì)于其它細(xì)胞或細(xì)胞群體的存在/不存在或水平。定位可以是相對(duì)于整個(gè)細(xì)胞或單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞器或組分。例如，定位可以是細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、膜締合的、細(xì)胞表面締合的、細(xì)胞外、線粒體、內(nèi)體、溶酶體、過氧化物酶體和/或等等。示例性的細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核的定位可以包括在這兩個(gè)定位之間易位的轉(zhuǎn)錄因子，諸如NF-K B、NFAT、類固醇受體、核激素受體和/或STAT等等。移動(dòng)可以包括細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸諸如蛋白靶向到特定的細(xì)胞器、內(nèi)吞作用、胞吐作用、再循環(huán)等。示例性的移動(dòng)可包括細(xì)胞表面受體或相關(guān)的蛋白質(zhì)(諸如，GPCR、受體酪氨酸激酶、抑制蛋白和/或諸如此類)組成型的或響應(yīng)于配體結(jié)合的內(nèi)吞作用?；钚钥梢园üδ苄缘幕蚬鈱W(xué)的活性，諸如酶活性、熒光性和/或諸如此類，例如，通過激酶、磷酸酶、甲基化酶、脫甲基酶、蛋白酶、核酸酶、脂肪酶、報(bào)告蛋白(例如半乳糖苷酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、螢光素酶、葡糖醛酸酶、綠色熒光蛋白(和相關(guān)的衍生物)等)和/或等等。修飾可包括任何合適的共價(jià)連接基團(tuán)的存在/不存在、定位和/或水平。這種修飾可以包括磷酸化、甲基化、泛素化、羧化和/或法尼基化，等等。結(jié)構(gòu)可包括初級(jí)結(jié)構(gòu)，例如加工(諸如切割或連接)后，二級(jí)結(jié)構(gòu)或三級(jí)結(jié)構(gòu)(例如，構(gòu)象)，和/或四級(jí)結(jié)構(gòu)(諸如，與細(xì)胞內(nèi)、上或周圍的伴侶的締合)。測(cè)定修飾和/或結(jié)構(gòu)的方法可包括特異性結(jié)合劑(諸如抗體等)，在體內(nèi)或體外摻入標(biāo)記的試劑，能量轉(zhuǎn)移測(cè)定(諸如FRET)，表面等離子體共振和/或酶片段互補(bǔ)或雙雜交分析，等等。
[0211]核酸可以包括基因組DNA、線粒體DNA、病毒DNA、細(xì)菌DNA，噬菌體DNA、合成DNA、轉(zhuǎn)染的DNA、報(bào)告基因的DNA等?？商鎿Q地，或此外，核酸可包括總RNA、hnRNA、mRNA、tRNA、siRNA、dsRNA、snRNA、核酶、結(jié)構(gòu)RNA、病毒RNA、細(xì)菌的RNA、基因特異性RNA、報(bào)告RNA(由報(bào)告基因表達(dá))，和/或諸如此類。用于分析核酸的方法可包括任何以上列出的基因分析技術(shù)。此外，用于分析核酸的方法可包括核糖核酸酶保護(hù)分析。
[0212]多肽可包括任何蛋白質(zhì)、肽、糖蛋白、蛋白脂質(zhì)等。示例性多肽包括受體、配體、酶、轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄輔因子、核糖體組分、調(diào)節(jié)蛋白、細(xì)胞骨架蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、通道、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、報(bào)告蛋白(諸如上文列出的由報(bào)告基因表達(dá)的那些)，和/或諸如此類。用于測(cè)定多肽的方法可包括酶測(cè)定法和/或使用特異性結(jié)合組分(例如抗體、凝集素等)，等等。特異性結(jié)合組分在部分VI中描述。
[0213]碳水化合物、脂類、離子、小分子和/或激素可包括任何化合物、聚合物或復(fù)合物。例如，碳水化合物可以包括單糖、二糖和多糖、糖脂、糖蛋白、蛋白聚糖等。脂質(zhì)可以包括膽固醇和/或肌醇脂質(zhì)(例如，磷脂酰肌醇)，等等；離子可包括韓、鈉、氯、鉀、鐵、鋅、氫、鎂、重金屬、和/或錳，等等；小分子和/或激素可以包括代謝物和/或第二信使(諸如cAMP或cGMP,等等)和/或諸如此類。
[0214]相互作用通常包括調(diào)節(jié)劑與細(xì)胞或細(xì)胞群體的任何特異性結(jié)合，或細(xì)胞特性響應(yīng)于調(diào)節(jié)劑的任何可檢測(cè)的變化。特異性結(jié)合是主要是與細(xì)胞中、上或周圍的給定伴侶的任何結(jié)合。特異性結(jié)合可具有對(duì)給定伴侶的約KT3M或更低的結(jié)合系數(shù)，優(yōu)選的為約10_4M、10_6M或10_8M和更低的特異性結(jié)合系數(shù)。可替換地，相互作用可以是響應(yīng)于調(diào)節(jié)劑的表型或基因型特性的任何變化，如上面所描述的。
[0215]相互作用分析可使用任何合適的測(cè)定方法執(zhí)行。例如，調(diào)節(jié)劑可以被標(biāo)記，諸如用光學(xué)可檢測(cè)的染料，并且與細(xì)胞相互作用后可以二次標(biāo)記。染料與細(xì)胞或多個(gè)細(xì)胞的結(jié)合從而可以被量化?？商鎿Q地，或此外，細(xì)胞可以被處理或以其它方式進(jìn)行處理以實(shí)現(xiàn)由調(diào)節(jié)劑接觸產(chǎn)生的表型特征的測(cè)定，如在以上部分VIII中所描述的。
[0216]可用調(diào)節(jié)劑的文庫(kù)篩選細(xì)胞和/或細(xì)胞群體，以確定相互作用調(diào)節(jié)劑和/或帶期望的相互作用能力的調(diào)節(jié)劑，諸如期望的表型影響(諸如報(bào)告基因響應(yīng)、改變天然基因/蛋白的表達(dá)水平、電生理影響等)和/或結(jié)合系數(shù)。文庫(kù)通常包括共享共同的特點(diǎn)，諸如結(jié)構(gòu)或功能的兩個(gè)或更多個(gè)組分(調(diào)節(jié)劑)的集合。因此，文庫(kù)可以包括兩個(gè)或更多個(gè)小分子、兩種或更多種核酸、兩種或更多種病毒、兩種或更多種噬菌體、兩種或更多種不同類型的細(xì)胞、兩種或更多種肽、和/或兩種或更多種蛋白質(zhì)，等等。
[0217]細(xì)胞和/或群體的微流體分析可測(cè)定信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性?；钚钥梢韵鄬?duì)于活性的任意水平，相對(duì)于其它細(xì)胞和/或群體(見下文)和/或作為與細(xì)胞與調(diào)節(jié)劑相互作用的量度(參見上文)被測(cè)量。
[0218]信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通常包括在細(xì)胞內(nèi)的信息的任何流動(dòng)。在許多情況下，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通過膜傳遞配體或其它調(diào)節(jié)劑形式的細(xì)胞外信息，以產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)信號(hào)。細(xì)胞外的信息可以至少部分地通過結(jié)合到細(xì)胞表面受體觸發(fā)在膜上或膜附近的事件起作用，細(xì)胞表面受體諸如G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)、通道-偶聯(lián)受體、受體酪氨酸激酶、受體絲氨酸/蘇氨酸激酶和/或磷酸酶受體，等等。這些事件可以包括通道活性、受體群集、受體的內(nèi)吞作用、受體的酶活性(例如，激酶活性)和/或第二信使產(chǎn)生(例如cAMP、cGMP、甘油二酯、磷脂酰肌醇等)的變化。這種事件可能會(huì)導(dǎo)致調(diào)節(jié)事件級(jí)聯(lián)，諸如磷酸化/去磷酸化、復(fù)合物形成、降解和/或等等，其可能最終地導(dǎo)致改變的基因表達(dá)。在其它情況下，調(diào)節(jié)劑通過膜并直接結(jié)合到細(xì)胞內(nèi)受體，例如細(xì)胞核受體(諸如類固醇激素受體(GR、ER、PR、MR等)、類視黃酸受體、類視黃醇X受體(RXR)、甲狀腺激素受體、過氧化物酶體增殖激活受體(PPAR)和/或外源性受體，等等)。因此，信息的這種流動(dòng)的任何合適的方面可被測(cè)定以監(jiān)測(cè)的特定信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
[0219]測(cè)量的活性可至少部分地基于分析的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的類型。因此，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分析可以測(cè)定配體結(jié)合；受體的內(nèi)化；改變膜的電流；受體與另一因子諸如以下的締合:抑制蛋白、小G-蛋白樣蛋白諸如rac或rho和/或諸如此類丐的水平；激酶，例如蛋白激酶A、蛋白激酶C、鈣調(diào)蛋白激酶、肌球蛋白輕鏈激酶、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶、PI3激酶等；cAMP水平；磷脂酶C活性，蛋白質(zhì)例如，NF-κ B、核受體和/或STAT的亞細(xì)胞分布，等等?？商鎿Q地，或此外，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分析可以測(cè)定報(bào)告信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性的天然靶基因和/或外來的報(bào)告基因的表達(dá)。如上所述，表達(dá)可以被測(cè)定為RNA、蛋白質(zhì)、代謝物或酶活性的不存在/存在或水平，等等。
[0220]基于細(xì)胞的分析可用于比較細(xì)胞和/或細(xì)胞群體的基因型、表型、和/或調(diào)節(jié)劑相互作用。細(xì)胞和/或群體可在不同的微流體系統(tǒng)或相同的微流體系統(tǒng)中被比較。在相同的微流體系統(tǒng)中的比較，可以使用并行配置來平行進(jìn)行。
[0221]微流體系統(tǒng)可用于執(zhí)行單細(xì)胞分析，其通常包括優(yōu)選地或必要地在一個(gè)細(xì)胞上一次執(zhí)行的任何分析。單細(xì)胞分析的例子包括膜片鉗分析、單細(xì)胞PCR、單細(xì)胞熒光原位雜交(FISH)、蛋白的亞細(xì)胞分布和/或分化分析(轉(zhuǎn)變?yōu)椴煌募?xì)胞類型)。在某些情況下，單細(xì)胞分析可以在兩個(gè)或更多個(gè)細(xì)胞的保留組中，通過測(cè)定該組中的一個(gè)成員的個(gè)體特征執(zhí)行。在其他情況下，單細(xì)胞分析可能需要單細(xì)胞的保留，例如，當(dāng)分析之前細(xì)胞被裂解時(shí)。
[0222]微流體系統(tǒng)可用于分選或選擇單細(xì)胞和/或細(xì)胞群體。分選/選擇的細(xì)胞或群體可通過隨機(jī)機(jī)制、大小、密度、磁屬性、細(xì)胞表面特性(即，附著到基底上的能力)、生長(zhǎng)和/或存活的能力和/或基于細(xì)胞或群體的測(cè)定特性(諸如響應(yīng)于配體、特異性表型和/或諸如此類)來選擇。在微流體系統(tǒng)中操縱和/或分析期間，細(xì)胞和/或群體可以進(jìn)行不止一次分選。特別地，異質(zhì)性的細(xì)胞群體，諸如血液樣品或臨床活檢、部分轉(zhuǎn)染或分化的細(xì)胞群體、分解組織、天然樣品、法醫(yī)樣品等可被分選/選擇。
[0223]微流體系統(tǒng)可執(zhí)行細(xì)胞的存儲(chǔ)和/或維持功能。因此，細(xì)胞可以被引入到微流體系統(tǒng)，并被長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)，諸如超過一周、一個(gè)月、三個(gè)月和/或一年。使用用于細(xì)胞的存儲(chǔ)和/或維持的微流體系統(tǒng)可消耗更少量的介質(zhì)和空間，并且可以維持細(xì)胞處于比其它存儲(chǔ)/維持方法生命力更強(qiáng)的狀態(tài)。微流體系統(tǒng)中存儲(chǔ)和維持細(xì)胞的其它方面包含在以上部分XI中。
[0224]微流體系統(tǒng)可被用于任何合適的基于病毒、基于細(xì)胞器、基于珠和/或基于泡囊的分析和/或方法。這些分析可以測(cè)定調(diào)節(jié)劑(化合物、混合物、聚合物、生物分子、細(xì)胞等)與任何這些其它顆粒中/上存在或締合的一種或多種材料(化合物、聚合物、混合物、細(xì)胞等)的結(jié)合(或效應(yīng))。可替代地，或此外，這些分析可測(cè)定活性(例如，酶活性)、光學(xué)性質(zhì)(例如，化學(xué)發(fā)光、熒光或吸光，等等)的變化，和/或相互作用引起的構(gòu)象變化。
[0225]在一些實(shí)施方案中，珠可包括可檢測(cè)的編碼。這樣的編碼可以由具有可檢測(cè)的性質(zhì)的一種或更多種材料來賦予，可檢測(cè)的性質(zhì)諸如光學(xué)性質(zhì)(例如，頻譜、強(qiáng)度和或熒光激發(fā)/發(fā)射、吸收率、反射率、折射率等的程度)。一種或更多種材料可以提供非空間信息或可具有有助于編碼每個(gè)編碼的方面的離散空間位置。編碼可以允許不同的樣品，諸如細(xì)胞、化合物、蛋白質(zhì)和/或諸如此類，與具有不同的編碼的珠締合。然后，不同的樣品可被組合，一起分析，并通過讀出每個(gè)珠上的編碼來識(shí)別。用于細(xì)胞締合的珠的合適的分析可包括任何上述的細(xì)胞分析。
[0226]用于執(zhí)行本部分中描述的一些分析的合適的方案被包括在Joe Sambrook和DavidRussell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual (3rd ed.2000),其在此引入作為參考。
[0227](XIII)實(shí)施方案
[0228]下面的實(shí)例描述選擇的方面和實(shí)施方案，包括用于利用微流體的多個(gè)單顆粒諸如單細(xì)胞處理的方法、系統(tǒng)和設(shè)備。這些實(shí)例被包括，用于說明而不旨在限制或限定本發(fā)明的整個(gè)范圍。
[0229]轉(zhuǎn)到圖1，微流體系統(tǒng)100被示出，其被配置用于捕獲多個(gè)單個(gè)細(xì)胞并處理它們。系統(tǒng)100包括微流體設(shè)備110，其可以與微流體控制器120耦合。系統(tǒng)100可以被配置以處理數(shù)量級(jí)范圍從數(shù)十、數(shù)百甚至數(shù)千個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞群體。系統(tǒng)100可以捕獲來自細(xì)胞的更大群體的單個(gè)或單細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，這些單個(gè)細(xì)胞可以利用不同的試劑被成像和/或刺激。單個(gè)捕獲的細(xì)胞可利用包括，但不限于以下的多種多步化學(xué)方法或過程進(jìn)行處理:特異性靶序列擴(kuò)增(STA)、逆轉(zhuǎn)錄特異性靶序列擴(kuò)增(RT-STA)、基因組DNA的STA、全基因組擴(kuò)增(WGA)、全甲基化組擴(kuò)增、全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增(WTA)、實(shí)時(shí)PCR制備、預(yù)擴(kuò)增、mRNA測(cè)序；RNA測(cè)序、拷貝數(shù)變化(CNV)、多模式應(yīng)用(DNA/RNA ;蛋白質(zhì)/RNA)、蛋白質(zhì)的應(yīng)用、樣品處理器的應(yīng)用和/或單體型分析。然后反應(yīng)產(chǎn)物可以輸出用于附加的分析和/或處理。
[0230]一些實(shí)施方案可以被配置以加載數(shù)百個(gè)細(xì)胞進(jìn)入微流體設(shè)備。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，至少200個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞(直徑5-25um)可被加載和分配，使得96室的每個(gè)可以包含最多一個(gè)細(xì)胞。一些實(shí)施方案可以允許用于分配的細(xì)胞的成像。例如，其它實(shí)施方案可以包括更多或更少的室和分配更多或更少的細(xì)胞。細(xì)胞可以被限制或捕獲，使得其基底溶液/介質(zhì)可以被替換為另一試劑。多步反應(yīng)可在每一個(gè)96分配的樣品上執(zhí)行。靶應(yīng)用包括但不限于:特異性靶擴(kuò)增(STA);逆轉(zhuǎn)錄特異性靶擴(kuò)增(RT-STA);基因組DNA的STA;全基因組擴(kuò)增(WGA);全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增(WTA);全甲基化組擴(kuò)增；預(yù)擴(kuò)增；mRNA測(cè)序；RNA測(cè)序；實(shí)時(shí)熒光定量PCR準(zhǔn)備；拷貝數(shù)變化(CNV);多模式應(yīng)用(DNA/RNA、蛋白質(zhì)/RNA);蛋白質(zhì)應(yīng)用；樣品處理器的應(yīng)用；或單體型分析。在一些實(shí)施方案中，微流體設(shè)備可被設(shè)計(jì)為使得單細(xì)胞或它們的組分(DNA、RNA、染色體等)可在多個(gè)步驟中進(jìn)行化學(xué)操縱(例如:細(xì)胞裂解、RNA的逆轉(zhuǎn)錄和預(yù)擴(kuò)增用于加載基因表達(dá)微流體設(shè)備)。經(jīng)處理的樣品可以從微流體設(shè)備中輸出。
[0231]一些實(shí)施方案可以被配置以加載具有定義的大小范圍的最少200個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的群體。大小范圍可以足夠大以包括大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞。不同類的微流體設(shè)備或集成流體回路(IFC)可被利用以覆蓋分類的所有主要大小，例如，5-15um和15_25um。僅僅通過舉例的方式，在200個(gè)細(xì)胞中，捕獲效率可以是>50%，定義為96個(gè)捕獲位點(diǎn)中超過4個(gè)將包含一個(gè)細(xì)胞。在500個(gè)細(xì)胞中，捕獲效率可以>80%。在一些實(shí)施方案中，在應(yīng)用釋放的捕獲方案可能需要處理來自組織培養(yǎng)的懸浮細(xì)胞(例如K562)和附著細(xì)胞(例如，HUVEC)。一些實(shí)施方案可包括ADP格式，其包括從組織樣品中分離的細(xì)胞或從LCM或FFPE樣品中分離的細(xì)胞或細(xì)胞核。在一些實(shí)施方案中，IFC可從用于單個(gè)反應(yīng)的群體中捕捉96個(gè)單細(xì)胞。一些實(shí)施方案可被配置以驗(yàn)證每個(gè)反應(yīng)中單細(xì)胞的存在。要求可以是分辨細(xì)胞的不存在和兩個(gè)細(xì)胞對(duì)比一個(gè)細(xì)胞的存在。一些實(shí)施方案可以允許用戶在裂解之前用至少單一生物試劑誘導(dǎo)長(zhǎng)達(dá)某一時(shí)間周期，諸如6小時(shí)。在一些實(shí)施方案中，用戶可具有裂解之前成像細(xì)胞的能力。一些實(shí)施方案可以被配置以執(zhí)行WTA和/或WGA。這些可以使用商購(gòu)的可用試劑。一些實(shí)施方案可以從每個(gè)細(xì)胞中收集數(shù)量充足的足以用于后續(xù)NGS文庫(kù)制備的單個(gè)材料。
[0232]一些實(shí)施方案可以被配置用于文庫(kù)制備。實(shí)施方案可以使用商購(gòu)的試劑自動(dòng)地從gDNA和cDNA制備多個(gè)例如96個(gè)測(cè)序就緒的文庫(kù)。每個(gè)文庫(kù)可以使用NGS索引唯一地索引?？偟脑噭┫目梢缘扔诨蛐∮谠诤暧^尺度的單個(gè)樣品的制備。實(shí)施方案包括:分配樣品和試劑進(jìn)入IFC ;放置IFC在微流體控制器；后處理并用標(biāo)準(zhǔn)的移液管從IFC中收集產(chǎn)物；和/或在克隆擴(kuò)增之前執(zhí)行單一純化和定量步驟。一些實(shí)施方案支持STA工作流程。
[0233]一些實(shí)施方案可以被配置用于單體型分析。例如，一些實(shí)施方案可以以4個(gè)gDNA樣品開始。起始材料包括:基因組DNA ;染色體懸浮液疋粘粒文庫(kù)；和/或全細(xì)胞。一些實(shí)施方案可產(chǎn)生4個(gè)唯一的序列就緒文庫(kù)，其允許研究者對(duì)人類基因組的至少90%進(jìn)行單體型分析。對(duì)于非人類基因組可能需要附加的重復(fù)。
[0234]圖2示出了根據(jù)各種實(shí)施方案的微流體設(shè)備110-a的實(shí)例。微流體設(shè)備110_a可以是圖1中的微流體設(shè)備110的實(shí)例。在一些實(shí)施方案中，微流體設(shè)備110-a可被稱為微流體芯片。在一些實(shí)施例中，微流體設(shè)備110-a可以與微流體載體(未示出)耦合。
[0235]微流體設(shè)備110-a可以包括多個(gè)捕獲配置210，諸如特異性捕獲配置210_1、210-j、210K、210-l、210-m和/或210_n。在一些實(shí)施方案中捕獲配置210可被稱為捕獲模塊。捕獲配置210可彼此串聯(lián)耦合或以菊花鏈方式連接。每個(gè)捕獲配置210可以被配置以當(dāng)細(xì)胞團(tuán)或群體流動(dòng)通過相應(yīng)的捕獲配置210時(shí)捕獲單個(gè)細(xì)胞。未被特異性捕獲配置例如諸如捕獲配置210-1捕獲的細(xì)胞,然后可以流動(dòng)到隨后的捕獲配置,例如諸如捕獲210-j,其中單個(gè)或單顆粒和/或細(xì)胞可被捕獲，和等等，向下通過一系列捕獲配置210。
[0236]在一些實(shí)施方案中，相應(yīng)的捕獲配置210內(nèi)的單獨(dú)捕獲的細(xì)胞可以利用不同的試劑被洗滌和/或刺激。一些實(shí)施方案可以被配置為使得所捕獲的細(xì)胞也可以被成像。微流體設(shè)備ΙΙΟ-a可以包括一個(gè)或更多個(gè)流動(dòng)通道240，其可用于引入不同的試劑到捕獲配置210。一些實(shí)施方案可包括多個(gè)流動(dòng)通道240。
[0237]每個(gè)相應(yīng)的捕獲配置210可以與多室反應(yīng)配置220耦合，并且更具體地多室反應(yīng)配置220-1、220-j、220K、220-l、220-m和/或220_n。捕獲細(xì)胞和/或顆粒在特異捕獲配置，諸如捕獲配置210-1可以被傳輸?shù)较嚓P(guān)聯(lián)的多室反應(yīng)配置220-1用于處理。對(duì)于多室反應(yīng)配置220可能發(fā)生的處理可包括，但不限于，特異性靶擴(kuò)增、RT-STA, mRNA-SEQ、預(yù)擴(kuò)增、WMA、多模式應(yīng)用、蛋白應(yīng)用、樣品處理器的應(yīng)用、全基因組擴(kuò)增、全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增、實(shí)時(shí)PCR制備、拷貝數(shù)變化或單體型分析。在一些實(shí)施方案中，可存在多室反應(yīng)配置220的一個(gè)或更多個(gè)室之間的活性混合。熱循環(huán)也可能作為處理的一部分出現(xiàn)，其可能作為室之間可能發(fā)生的活性混合而發(fā)生。然后，所得的反應(yīng)產(chǎn)物可被提供給輸出配置230，并且更具體地輸出配置230-1、230-j、230-k、230-1、230-m和/或230_n。在某些情況下，輸出配置230可能被稱為收集配置、收集孔和/或收集入口。各自多室反應(yīng)配置220、各自捕獲配置210和/或流動(dòng)通道240的不同室之間的流動(dòng)，可以利用不同的閥和/或泵結(jié)構(gòu)(未示出)來控制。流動(dòng)通道240可被用于引入溶液，諸如試劑和/或緩沖液進(jìn)入微流體設(shè)備110-a。流動(dòng)通道245-1可被用于引入細(xì)胞到微流體設(shè)備110-a。在一些情況下，流動(dòng)通道245_i可被耦合到捕獲配置210的兩側(cè)。在某些情況下，附加的流動(dòng)通道245-j可以被用于提供捕獲配置210、多室反應(yīng)室220和輸出配置的兩個(gè)單獨(dú)的組。
[0238]在一些實(shí)施方案中，微流體設(shè)備110可以被配置用于多個(gè)單細(xì)胞捕獲和處理。在一些實(shí)施方案中，微流體設(shè)備110-a可以包括串聯(lián)耦合的多個(gè)捕獲配置210捕獲配置。每個(gè)各自捕獲配置210可以被配置以捕獲單細(xì)胞。微流體設(shè)備I ΙΟ-a可以包括多室反應(yīng)配置220。每個(gè)各自多室反應(yīng)配置220可與來自多個(gè)捕獲配置210的各自捕獲配置210耦合，并可配置用于單細(xì)胞處理。
[0239]在一些實(shí)施方案中，每個(gè)各自捕獲配置210包括一個(gè)或更多個(gè)限定大小以僅容納單細(xì)胞的物理障礙物。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)各自捕獲配置210包括:與輸入通道和輸出通道耦合的一個(gè)或更多個(gè)旁路通道；與輸入通道和輸出通道耦合的引流溝；和/或位于靠近輸入通道和一個(gè)或更多個(gè)旁路通道的連接點(diǎn)且與引流溝耦合的捕獲巢，其中捕獲巢被配置以從多個(gè)細(xì)胞中捕獲單細(xì)胞，使得當(dāng)單細(xì)胞在捕獲巢被捕獲時(shí)，剩余的細(xì)胞的收集被轉(zhuǎn)移到一個(gè)或更多個(gè)旁路通道中的至少一個(gè)。在一些情況下，一個(gè)或更多個(gè)旁路通道包括第一旁路通道和第二旁路通道。第一旁路通道和第二旁路通道可被對(duì)稱地配置。對(duì)稱地配置的第一旁路通道和第二旁路通道可包括第一翼配置和第二翼配置。在一些實(shí)施方案中，至少輸入通道或輸出通道被進(jìn)一步配置為集中通道。集中通道可包括在至少水平方向或垂直方向的縮小通道。
[0240]在一些實(shí)施方案中，當(dāng)各自多室反應(yīng)配置220的一個(gè)或更多個(gè)閥門被驅(qū)動(dòng)時(shí)，多室反應(yīng)配置220還被配置用于熱循環(huán)。在某些情況下，微流體設(shè)備110-a可以包括一個(gè)或更多個(gè)成像特征。每個(gè)各自成像特征可以允許捕獲的單細(xì)胞在各自捕獲巢位點(diǎn)的成像。一些實(shí)施方案包括多個(gè)收集孔。例如，每個(gè)輸出配置230可以包括收集孔。每個(gè)各自收集孔可與各自多室反應(yīng)配置220耦合，并且可被配置以遞送反應(yīng)產(chǎn)物用于進(jìn)一步分析。
[0241]微流體設(shè)備110-a的一些實(shí)施方案可包括基因組分析配置，其與每個(gè)各自多室反應(yīng)配置220耦合以進(jìn)一步分析來自每個(gè)各自多室反應(yīng)配置220的反應(yīng)產(chǎn)物。
[0242]在一些實(shí)施方案中，每個(gè)各自捕獲配置210包括配置以從有限稀釋中捕獲單個(gè)細(xì)胞的捕獲室。每個(gè)捕獲室可被配置以利用隨機(jī)捕獲過程捕獲單個(gè)細(xì)胞。
[0243]在一些實(shí)施方案中，每個(gè)各自捕獲配置210可包括:捕獲區(qū)室；和/或覆蓋捕獲區(qū)室的離散區(qū)域的結(jié)合伴侶，其中離散部分被限定大小使得僅單顆粒結(jié)合到離散區(qū)域。
[0244]在一些實(shí)施方案中，每個(gè)各自捕獲配置210可以包括一個(gè)或更多個(gè)捕獲支持物。每個(gè)捕獲支持物可以包括分布在至少捕獲支持物的部分的結(jié)合伴侶。一個(gè)或更多個(gè)捕獲支持物可包括一個(gè)或更多個(gè)珠結(jié)構(gòu)。一些實(shí)施方案可包括捕獲特征，其被配置以捕獲支持物。
[0245]一般而言，本文所描述的不同的微流體設(shè)備可用彈性材料諸如硅橡膠制造，以及用于微流體設(shè)備及其組件的設(shè)計(jì)的方法已被在科學(xué)和專利文獻(xiàn)中詳細(xì)地描述。見，例如 Unger 等(2000)Science 288:113-116 ；U.S.Pat.Nos.US 6，960，437(Nucleicacid amplificat1n utilizing microfluidic devices) ；6, 899,137 (Microfabricatedelastomeric valve and pump systems) ；6, 767, 706 (Integrated active fluxmicrofluidic devices and methods) ；6, 752, 922(Microfluidic chromatography)；6,408,878(Microfabricated elastomeric valve and pump systems) ；6,645, 432(Microfluidic devices including three-dimens1nalIy arrayed channel networks);美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?2004/0115838 ；2005/0072946 ；2005/0000900 ；2002/0127736 ；2002/0109114 ；2004/0115838 ；2003/0138829 ；200210164816 ；2002/0127736 ；和 2002/0109114 ；PCT 公布號(hào) WO 2005/084191 ；W0 05/030822A2 ；和 W001101025 ；Quake&Scherer,2000，"From micro to nanofabricat1n with soft materials〃Science 290:1536-40 ；Unger 等，2000，"Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayersoft Iithography^Science 288:113-116 ；Thorsen 等，2002，〃Micro fluidiclarge-scale integrat1n"Science 298:580-584 ;Chou 等，2000，"MicrofabricatedRotary Pump^B1medicaI Microdevices3:323-330 ；Liu 等，2003，"Solvingthe〃world-to_chip〃interface problem with a microfluidic matrix〃AnalyticalChemistry 75，4718-23, Hong 等，2004，〃A nanoliter-scale nucleic acid processorwith parallel architecture ^Nature B1technology 22:435-39,全部為了所有目的通過參考并入。
[0246]圖3A示出了根據(jù)各種實(shí)施方案的捕獲配置210-a的實(shí)例。捕獲配置210_a可以是圖2中的一般捕獲配置210和/或具體捕獲配置210-1、210-j、210k、210-l、210-m和/或210-n的實(shí)例。捕獲配置210-a可以包括不同的組件或方面。例如,捕獲配置210_a可以包括輸入通道310和輸出通道350。輸入通道310可以被配置以集中含有細(xì)胞的溶液，使得它們可以集中和/或引向捕獲位點(diǎn)，諸如捕獲巢330。這可以被稱為前端集中。一些實(shí)施方案可以包括用于輸出通道350的后端集中。捕獲配置210-a可以包括捕獲位點(diǎn)335和/或捕獲巢330。當(dāng)在捕獲巢330和/或捕獲位點(diǎn)335捕獲時(shí)，捕獲巢330和/或捕獲位點(diǎn)335可以被配置為使得可保護(hù)捕獲細(xì)胞和/或顆粒不被流動(dòng)流體包括其它細(xì)胞或顆粒拋下。捕獲結(jié)構(gòu)210-a也可以被配置以創(chuàng)建圍繞捕獲位點(diǎn)335的停滯點(diǎn)，以促進(jìn)捕獲單個(gè)細(xì)胞。捕獲配置210-a可以包括引流溝340。弓丨流溝340可以是足夠小的通道，其中細(xì)胞不穿過它，但足夠大以允許液體流過它。引流溝340可以耦合到捕獲巢330、輸入通道310和/或輸出通道350，以促進(jìn)在捕獲巢330捕獲單個(gè)細(xì)胞。一些實(shí)施方案中包括多個(gè)旁路通道，諸如旁路通道320-a和320-b。旁路通道320可允許溶液，其可包括其它細(xì)胞，流動(dòng)到已被捕獲細(xì)胞和/或顆粒占用的捕獲巢330的任一側(cè)，并進(jìn)入旁路通道320的至少一個(gè)，其可促進(jìn)保護(hù)單個(gè)捕獲細(xì)胞和/或顆粒不被從捕捉巢330拋棄。通過旁路通道320的流動(dòng)還可促進(jìn)單個(gè)細(xì)胞和/或顆粒在捕獲巢330被捕獲，而不是允許多個(gè)細(xì)胞在細(xì)胞巢330被捕獲。在一些實(shí)施方案中，旁路通道320可以對(duì)稱地進(jìn)行配置。旁路通道320可被配置成不同的安排，包括但不限于與旁路通道320-a和320-b顯示的“翼”形安排。
[0247]捕獲配置21 Ο-a可被用于捕獲單個(gè)細(xì)胞和/或顆粒。例如，細(xì)胞可以流動(dòng)從右到左通過輸入通道310進(jìn)入捕獲配置210-a。細(xì)胞可獲得集中到捕獲位點(diǎn)335的中央。在捕獲位點(diǎn)335 —些液體可以流動(dòng)通過引流溝340，一些圍繞側(cè)面流動(dòng)進(jìn)入旁路通道320-a/320-b中。如果細(xì)胞進(jìn)入捕獲巢330和/或引流溝340，它可被捕獲并填充引流溝通道，僅僅停止通過引流溝通道的流動(dòng)。剩下的細(xì)胞和/或顆粒的溶液可以繞過阻擋的捕獲位點(diǎn)335、通過旁路通道320-a/320-b，并進(jìn)入下一個(gè)捕獲配置210的下游。
[0248]圖3B示出了捕獲配置諸如圖3A的捕獲配置210_a的顯微照片210_b。特別值得注意的是，細(xì)胞337被示出為在捕獲位點(diǎn)335和/或捕獲巢330被捕獲。
[0249]圖3C-3K示出了根據(jù)不同的實(shí)施方案的不同的捕獲配置210-k-c、210-k_d、210-k-e、210-k-f、210-k-g、210-k-h、210-k-1、210-k-j 和 /o 或 210_k_k。這些捕獲配置210-k通?？砂ú东@巢(或捕獲位點(diǎn))、引流溝和/或一個(gè)或更多個(gè)旁路通道。
[0250]圖4示出了多個(gè)捕獲配置210的系統(tǒng)400的顯微圖片。根據(jù)不同的實(shí)施方案，捕獲配置210被示出為彼此串聯(lián)耦合或以菊花鏈方式連接。系統(tǒng)400可以是圖1的微流體設(shè)備110和/或圖2的微流體設(shè)備110-a的方面的實(shí)例。
[0251]設(shè)計(jì)捕獲配置210作為微流體裝置110的一部分時(shí)，不同的考慮可能需要考慮。例如，在流動(dòng)流的中心的細(xì)胞可以最有效地捕獲。這可能會(huì)影響輸入通道的設(shè)計(jì)，諸如圖3A或圖3B的輸入通道310。較短的引流溝通道，諸如圖3A或圖3B的引流溝340，可以更有效地捕獲。在一些情況下，小細(xì)胞可擠過捕獲引流溝340。在一些實(shí)施方案中，更窄的集中通道或輸入通道310可提高效率。深的捕獲巢330可以捕獲多個(gè)細(xì)胞，而在淺的捕捉巢330被捕捉的細(xì)胞可以輕松移動(dòng)。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)停滯點(diǎn)或捕獲位點(diǎn)335可以是被捕獲的單個(gè)細(xì)胞直徑的近似1.5倍時(shí)，效率可被達(dá)到。在一些實(shí)施方案中，通過引流溝的流動(dòng)比例可以被調(diào)整以促進(jìn)捕獲各個(gè)細(xì)胞。
[0252]圖5A示出了根據(jù)各種實(shí)施方案的多室反應(yīng)配置220-c的實(shí)例。多室反應(yīng)配置220-c可以是圖2的多室反應(yīng)配置220的實(shí)例。圖5A還示出了捕獲配置210-c，其可以與多室反應(yīng)配置220-c耦合。根據(jù)各種實(shí)施方案，多室反應(yīng)配置220-c可以包括不同組件或方面。多室反應(yīng)配置220-c可被配置以執(zhí)行不同的處理，包括，但不限于，STA、RT-STA、mRNA-SEQ、預(yù)擴(kuò)增、WMA、多模式應(yīng)用、蛋白的應(yīng)用、樣品處理器的應(yīng)用、WTA、WGA、實(shí)時(shí)PCR制備、CNV和/或單體型分析。多室反應(yīng)配置220-c可被配置以執(zhí)行多個(gè)反應(yīng)步驟，其可包括活性混合。
[0253]多室反應(yīng)配置220-c可以包括大量的閥門520，其可以被用來控制溶液通過多室反應(yīng)配置220-c的流動(dòng)。在一些實(shí)施方案中，泵530，諸如蠕動(dòng)泵，可以被包括在多室反應(yīng)配置220-c中，以促進(jìn)溶液通過多室反應(yīng)配置220-c的傳輸。泵530可以包括多個(gè)閥門520 ；在本實(shí)例中，泵530可包括三個(gè)閥門。一個(gè)或更多個(gè)泵530可位于不同的位置。
[0254]多室反應(yīng)配置220-c也可包括多個(gè)反應(yīng)室510。在一些實(shí)施方案中，捕獲配置210-c可考慮反應(yīng)室510的一個(gè)。僅僅通過舉例的方式，閥門520-d、520-e、520-f和520-g可分別用于控制反應(yīng)室510-a、510-b、510-1和510_j之間的直接流動(dòng)。附加的閥門，諸如閥門520-h-520-o，以不同的組合，可用于混合和/或循環(huán)來自一個(gè)或更多個(gè)反應(yīng)室510的溶液。附加閥門520-a和/或520-b可以控制不同的捕獲配置之間的流動(dòng)。閥門520_b可以被用來控制溶液諸如試劑到捕獲配置210-c的流動(dòng)。多室反應(yīng)配置220-c可被配置以在熱循環(huán)期間混合和/或循環(huán)溶液。在某些情況下，反應(yīng)產(chǎn)物可被遞送540到輸出配置(未示出)可被稱為收集配置、收集孔和/或收集入口。
[0255]圖5B示出了根據(jù)各種實(shí)施方案的多室反應(yīng)配置220-d的另一個(gè)實(shí)例。多室反應(yīng)配置220-d可以是圖2的多室反應(yīng)配置220和/或圖5的多室反應(yīng)配置220_c的一個(gè)實(shí)例。圖5B還示出了捕獲配置210-d，其可以與多室反應(yīng)配置220-d耦合。根據(jù)各種實(shí)施方案，多室反應(yīng)配置220-d可以包括不同組件或方面。多室反應(yīng)配置220-d可被配置以執(zhí)行不同的處理，包括，但不限于，STA、RT-STA, mRNA-SEQ、預(yù)擴(kuò)增、WMA、多模式應(yīng)用、蛋白的應(yīng)用、樣品處理器的應(yīng)用、WTA、WGA、實(shí)時(shí)PCR制備、CNV和/或單體型分析。多室反應(yīng)配置220_d可被配置以執(zhí)行多個(gè)反應(yīng)步驟，其可包括活性混合。
[0256]多室反應(yīng)配置220-d可以包括大量的閥門520，其可以被用來控制溶液通過多室反應(yīng)配置220-d的流動(dòng)。一些實(shí)施方案可以包括一個(gè)或更多個(gè)泵作為多室反應(yīng)配置220-d的一部分，以促進(jìn)溶液通過多室反應(yīng)配置220-d的傳輸。例如，閥門520-z可以包括多個(gè)閥門520以形成蠕動(dòng)泵。一個(gè)或更多個(gè)泵可位于不同的位置。
[0257]多室反應(yīng)配置220-d也可包括多個(gè)反應(yīng)室510。在一些實(shí)施方案中，捕獲配置210-d可考慮反應(yīng)室510的一個(gè)。僅僅通過舉例的方式，閥門520-p、520-q、520-z、520-s、520-t和/或520-u可分別用于控制反應(yīng)室510-c、510-d、510-e、510-k和/或510-1之間的直接流動(dòng)。附加的閥門，諸如閥門520-V、520-w、520-x和/或520-y，以不同的組合，可用于混合和/或循環(huán)來自一個(gè)或更多個(gè)反應(yīng)室510的溶液。附加的閥門520可以控制不同的捕獲配置之間的流動(dòng)。閥門520-p可以被用來控制溶液諸如試劑到捕獲配置210-d的流動(dòng)。多室反應(yīng)配置220-d可被配置以在熱循環(huán)期間混合和/或循環(huán)溶液。在某些情況下，反應(yīng)產(chǎn)物可被遞送540到輸出配置(未示出)可被稱為收集配置、收集孔和/或收集入口。
[0258]此外，反應(yīng)室510和/或捕獲配置210-d包括各種尺寸或體積。在一個(gè)實(shí)施方案中，捕獲配置210-d可以是4.5nl，反應(yīng)室510_c可以是9nl，反應(yīng)室510_d可以是9nl，反應(yīng)室510-e可以是9nl，反應(yīng)室510_k可以是135nl，和/或反應(yīng)室510-1可以是135nl。
[0259]圖5C示出了根據(jù)各種實(shí)施方案的幾個(gè)多室反應(yīng)配置220-1、220_j的實(shí)例。多室反應(yīng)配置220-1/220-j可以是圖2的多室反應(yīng)配置220的實(shí)例。圖5C還示出了捕獲配置210-1/210-j，其可以與多室反應(yīng)配置220-1/220-j耦合。根據(jù)各種實(shí)施方案，多室反應(yīng)配置220-1/220-j可以包括不同組件或方面。多室反應(yīng)配置220-1/220-j可被配置以執(zhí)行不同的處理，包括，但不限于，STA、RT-STA、mRNA-SEQ、預(yù)擴(kuò)增、WMA、多模式應(yīng)用、蛋白的應(yīng)用、樣品處理器的應(yīng)用、WTA、WGA、實(shí)時(shí)PCR制備、CNV和/或單體型分析。多室反應(yīng)配置220_c可被配置以執(zhí)行多個(gè)反應(yīng)步驟，其可包括活性混合。
[0260]多室反應(yīng)配置220-1/220_j可以包括大量的閥門520_i/520_j，其可以被用來控制溶液通過多室反應(yīng)配置220-1/220-j的流動(dòng)。在一些實(shí)施方案中，泵530-1/530-j，諸如蠕動(dòng)泵，可以被包括在多室反應(yīng)配置220-1/220-j中，以促進(jìn)溶液通過多室反應(yīng)配置220-1/220-j的傳輸。泵530-1/530-j可以包括多個(gè)閥門；在本實(shí)例中，泵530_i/530_j可包括三個(gè)閥門。一個(gè)或更多個(gè)泵530-1/530-j可位于不同的位置。
[0261]多室反應(yīng)配置220-1/220_j也可以包括多個(gè)反應(yīng)室510-1-a、510-1-b、510-1_c、510-1-d、510-1-e、510-j-a、510-j-b、510-j-c、510-j-d、510-j-e。在一些實(shí)施方案中，捕獲配置210-1/210-j可考慮反應(yīng)室510-1/510-j的一個(gè)。僅僅通過舉例的方式，閥門520-1-a、520-1-b、520-1-c 和 520-1-d 可分別用于控制反應(yīng)室 510-1-a、510-1-b、510-1_c和510-j-d之間的直接流動(dòng)。相似地，閥門520-j-a、520-j-b、520-j-c和520-j-d可分別用于控制反應(yīng)室510-j -a、510-j -b、510-j -C和510-j -d之間的直接流動(dòng)。附加的閥門，諸如以不同的組合的閥門520-1/520-j，可用于混合和/或循環(huán)來自一個(gè)或更多個(gè)反應(yīng)室510-1/510-j的溶液。附加閥門520-1-m和/或520-j_m可以控制不同的捕獲配置之間的流動(dòng)。閥門520-1-n/520-j-n可以被用來控制溶液諸如試劑到捕獲配置210-1/210-j的流動(dòng)。多室反應(yīng)配置220-1/220-j可被配置以在熱循環(huán)期間混合和/或循環(huán)溶液。在某些情況下，反應(yīng)產(chǎn)物可被遞送輸出通道560-1/560-j可被稱為收集配置、收集孔和/或收集入口。一些實(shí)施方案可包括水合作用室570-1/570-j。
[0262]一些實(shí)施方案利用單細(xì)胞捕獲技術(shù)，其在單獨(dú)的反應(yīng)體積中利用有限稀釋來捕獲細(xì)胞。在這種類型的捕獲中，在優(yōu)先在捕獲位點(diǎn)僅保留單細(xì)胞的微流體設(shè)備中，可能沒有使用任何捕獲特征，例如諸如親和結(jié)合或機(jī)械特征。例如，有限稀釋可通過制備一系列的細(xì)胞懸浮液的稀釋執(zhí)行，并將來自每個(gè)稀釋的等分分布到單獨(dú)的反應(yīng)體積。細(xì)胞在各反應(yīng)體積的數(shù)量被確定，且然后產(chǎn)生僅具有單細(xì)胞的反應(yīng)體積的最高比例的稀釋被選擇并用于捕獲細(xì)胞以用于本文所描述的參數(shù)測(cè)定。
[0263]在一些實(shí)施方案中，該方法需要使用捕獲技術(shù)以增加僅具有一個(gè)細(xì)胞的期望的單獨(dú)反應(yīng)體積的比例高于使用諸如有限稀釋的方法實(shí)現(xiàn)的比例(即，高于約33%)。在這些實(shí)施方案的變型中，捕獲被優(yōu)化，使得僅具有一個(gè)細(xì)胞的單獨(dú)反應(yīng)體積的期望比例各自為單獨(dú)反應(yīng)體積的總數(shù)的至少約35 %、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少15約55 %、至少約60 %、至少約65 %、至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90%或至少約95%。在具體實(shí)施方案中，僅具有一個(gè)細(xì)胞的單獨(dú)反應(yīng)體積的預(yù)期比例每個(gè)落在由以上列出的任何兩個(gè)百分?jǐn)?shù)界定的范圍內(nèi)。僅具有一個(gè)細(xì)胞的單獨(dú)反應(yīng)體積的期望比例每個(gè)可通過經(jīng)驗(yàn)或統(tǒng)計(jì)方法來確定，取決于特定的捕獲技術(shù)(例如，有限稀釋以符合泊松分布的方式產(chǎn)生僅具有一個(gè)細(xì)胞的反應(yīng)體積)。一些實(shí)施方案采用一些措施以增加僅具有一個(gè)細(xì)胞的單獨(dú)反應(yīng)體積的期望比例高于約33%。在特別的實(shí)施方案中，優(yōu)化的單細(xì)胞捕獲可以被實(shí)現(xiàn)，例如，使用在每一反應(yīng)體積(捕獲位點(diǎn))排除多于一個(gè)細(xì)胞的保留的基于大小的機(jī)制。
[0264]圖6示出了顯示在芯片上過程的適用于基于有限稀釋和/或隨機(jī)捕獲的細(xì)胞處理的微流體設(shè)備的單元小室結(jié)構(gòu)的示意圖。對(duì)于單細(xì)胞分析，微流體設(shè)備可被設(shè)計(jì)以促進(jìn)被分析的特定顆粒的加載和捕獲。圖6示出用于分析細(xì)胞諸如哺乳動(dòng)物細(xì)胞的說明性的微流體設(shè)備的單元小室或捕獲結(jié)構(gòu)。每個(gè)單元小室可具有“細(xì)胞通道”(即，樣品區(qū)室)和“分析通道”(即，分析區(qū)室)。細(xì)胞通道可圍繞裝載的細(xì)胞，尺度為直徑幾十微米到長(zhǎng)度為幾百微米。取決于被分析細(xì)胞的大小，直徑可以是約15 μ m、約20 μ m、約25 μ m、約30 μ m、約35 μ m、約40 μ m或約45 μ m或更多，或可落入具有這些值作為端點(diǎn)的范圍。依靠被分析細(xì)胞的大小，長(zhǎng)度可以是約 60 μ m、約 90 μ m、約 120 μ m、約 150 μ m、約 170 μ m、約 200 μ m、約 230 μ m、約260 μ m、約290 μ m或更多，或可落入具有這些值作為端點(diǎn)的范圍。在說明性的微流體設(shè)備中，用于裝載細(xì)胞諸如哺乳動(dòng)物細(xì)胞的單元小室，可以是約30 μ mX 170 μ m。這種設(shè)備可被裝備以提供，或促進(jìn)提供在裝載之后加熱細(xì)胞通道以裂解細(xì)胞。如圖6所示，設(shè)備可包括從用于進(jìn)行反應(yīng)諸如核酸擴(kuò)增的細(xì)胞通道分離出的分析通道。170 μ mX 170 μ m封鎖閥門可被用于關(guān)閉細(xì)胞通道。
[0265]圖7示出獲取每個(gè)單獨(dú)反應(yīng)體積(微流體設(shè)備或“芯片”的室)的單細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液的有限稀釋的使用。細(xì)胞密度的理論的分布(泊松分布)被示出。圖8A和圖SB示出了與理論分布(圖8B)相比，使用明場(chǎng)(圖8A)成像的芯片中的細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果?；诿鲌?chǎng)成像，在芯片中的細(xì)胞密度接近但低于泊松分布，這個(gè)趨勢(shì)在更高細(xì)胞密度加劇。圖9顯示了熒光細(xì)胞“鬼影”的圖像，允許比預(yù)先PCR明場(chǎng)成像檢測(cè)更多細(xì)胞，使細(xì)胞密度更接近于圖10所示的泊松分布。
[0266]在某些實(shí)施方案中，機(jī)械捕獲被單獨(dú)使用或與一個(gè)或更多個(gè)捕獲特征結(jié)合以在每個(gè)單獨(dú)反應(yīng)體積中(即，微流體設(shè)備中的每個(gè)捕獲位點(diǎn))優(yōu)先捕獲單細(xì)胞。例如，每個(gè)捕獲位點(diǎn)可包括限制大小以僅包括一個(gè)細(xì)胞的一個(gè)或更多個(gè)物理障礙物。物理障礙物的形狀可被設(shè)計(jì)以加強(qiáng)細(xì)胞的保留。例如，物理障礙物可被限制大小并配置以形成合適于僅保持一個(gè)細(xì)胞的凹面表面。在這種實(shí)施方案中，物理障礙物可被設(shè)計(jì)以便當(dāng)捕獲位點(diǎn)沒有被細(xì)胞占用時(shí)允許流體流動(dòng)通過捕獲位點(diǎn)，和/或捕獲位點(diǎn)可包括促進(jìn)這種流動(dòng)的引流溝特征。在特別的實(shí)施方案中，微流體設(shè)備包含多個(gè)適合的大小/配置的物理障礙物，借以多個(gè)單個(gè)細(xì)胞被保留在設(shè)備內(nèi)部，每個(gè)物理障礙物保留一個(gè)細(xì)胞。在說明性的實(shí)施方案中，物理障礙物可位于微流體設(shè)備的單獨(dú)區(qū)室內(nèi)部，每個(gè)區(qū)室一個(gè)區(qū)域。區(qū)室可被安排以形成陣列。
[0267]在某些實(shí)施方案中，基于吸引力的捕獲被單獨(dú)使用或與一個(gè)或更多個(gè)捕獲特征例如機(jī)械捕獲組合使用，以在每個(gè)單獨(dú)反應(yīng)體積中(即，微流體設(shè)備中的每個(gè)捕獲位點(diǎn))優(yōu)先捕獲單細(xì)胞。例如，包含用于細(xì)胞組分的結(jié)合伴侶的微流體設(shè)備表面的離散區(qū)域可被限制大小使得僅一個(gè)細(xì)胞可結(jié)合到區(qū)域，使得隨后細(xì)胞的結(jié)合被空間位阻阻擋。在特別的實(shí)施方案中，微流體設(shè)備包含多個(gè)合適大小的區(qū)域，由此多個(gè)單個(gè)細(xì)胞，每個(gè)區(qū)域一個(gè)，在設(shè)備內(nèi)部被保留。在說明性的實(shí)施方案中，這些區(qū)域可位于微流體設(shè)備的單獨(dú)區(qū)室內(nèi)部，每個(gè)區(qū)室一個(gè)區(qū)域。區(qū)室可被安排以形成陣列。
[0268]一種基于親和的、優(yōu)化的單細(xì)胞捕獲方法基于捕獲包括結(jié)合被分析的細(xì)胞的結(jié)合伴侶的捕獲支持物。在說明性的實(shí)施方案中，支持物可以是具有分布在其表面的結(jié)合伴侶的珠，例如如圖14A所示。珠可被使用杯形捕獲特征的機(jī)械捕獲在每個(gè)捕獲位點(diǎn)捕獲以產(chǎn)生單個(gè)固定支持物(例如，珠)。除了固定支持物，在特定實(shí)施方案中，捕獲特征可減少展示結(jié)合伴侶的支持物(例如，珠)的表面區(qū)域。這個(gè)表面可以被充分減少，使得僅一個(gè)細(xì)胞可結(jié)合到展示結(jié)合伴侶的固定支持物(例如，珠)的區(qū)域。在一些實(shí)施方案中，為促進(jìn)細(xì)胞支持物結(jié)合，展示結(jié)合伴侶的固定支持物的區(qū)域面對(duì)細(xì)胞的流動(dòng)路徑。在具體的、說明性的實(shí)施方案中，微流體設(shè)備的流動(dòng)通道包含一系列捕獲特征。承載結(jié)合伴侶(例如細(xì)胞特異性抗體)的珠的懸浮液被輸入到通道以在捕獲位點(diǎn)產(chǎn)生一些列固定的珠。然后，通道被洗滌以移除如在圖14A上示出的任何自由(即，非固定的)的珠。然后，細(xì)胞懸浮液可被輸入到通道。單個(gè)細(xì)胞可結(jié)合到展示結(jié)合伴侶的每個(gè)珠的部分。每個(gè)結(jié)合的細(xì)胞可通過空間位阻防止任何其它細(xì)胞結(jié)合到珠。如圖14B所示，通道的洗滌可移除非結(jié)合細(xì)胞。然后，在捕獲位點(diǎn)之間的閥門可以關(guān)閉以創(chuàng)建單獨(dú)的反應(yīng)體積，每個(gè)包含一個(gè)帶一個(gè)結(jié)合細(xì)胞的捕捉位點(diǎn)。一個(gè)或更多個(gè)集中特征可以被用來引導(dǎo)珠以及細(xì)胞朝向每個(gè)捕獲位點(diǎn)流動(dòng)?？商鎿Q地或此外，捕獲特征可各自包括引流溝特征，當(dāng)捕獲特征沒被珠占用時(shí)，其允許流體流動(dòng)通過捕獲位點(diǎn)。
[0269]在細(xì)胞流動(dòng)通過微流體設(shè)備時(shí)離散地從懸浮液中捕獲單細(xì)胞的一些實(shí)施方案是限定以使得捕獲位點(diǎn)抓住單細(xì)胞、有效地捕獲單細(xì)胞(例如，捕獲通過捕獲位點(diǎn)附近的細(xì)胞的概率是高的)、和/或引導(dǎo)圍繞捕獲位點(diǎn)的剩余的懸浮液的方式引導(dǎo)捕獲位點(diǎn)上細(xì)胞(諸如細(xì)胞或珠)的懸浮液流動(dòng)的微流體幾何形狀。幾何形狀可以是基于大小的，即，捕獲位點(diǎn)是剛好足夠大以包含一個(gè)細(xì)胞(且沒有更多的)，但是仍然允許無細(xì)胞的懸浮液以相當(dāng)?shù)偷牧鲃?dòng)流體阻抗通過位點(diǎn)，使得空的捕獲位點(diǎn)將引導(dǎo)細(xì)胞朝向而不是周圍它流動(dòng)。這可以通過引流溝的使用完成。附加的幾何形狀也可以以增加細(xì)胞靠近到捕獲位點(diǎn)足夠近的可能性的方式集中細(xì)胞的流動(dòng)以獲得高的成功捕獲可能性。這些幾何形狀的變形都集中在捕獲位點(diǎn)和引流溝附近包括引流溝本身控制流體的流動(dòng)阻力，以及改變集中幾何形狀的孔，以試圖定位靠近到捕獲位點(diǎn)的細(xì)胞的流動(dòng)。圖1lA和圖1lB說明了帶捕獲特征和引流溝的捕獲位點(diǎn)的單細(xì)胞捕獲配置的實(shí)例。圖1lA示出了沒有擋板來集中流動(dòng)的位點(diǎn)，然而圖1lB示出了帶有擋板的位點(diǎn)。附加的帶有捕獲位點(diǎn)設(shè)計(jì)的捕獲配置被在圖12中示出。
[0270]在微流體結(jié)構(gòu)內(nèi)部的單細(xì)胞研究可包括隔離單個(gè)細(xì)胞進(jìn)入單個(gè)反應(yīng)分區(qū)(室、液滴、小室)。有限稀釋是用于完成這種隔離的一種方法。細(xì)胞可以以平均每個(gè)分區(qū)少于一個(gè)細(xì)胞的濃度被裝載，并由泊松統(tǒng)計(jì)描述的模式分配到這些分區(qū)。另一個(gè)方法是依靠機(jī)械陷阱以捕獲細(xì)胞。這些陷阱可被設(shè)計(jì)以捕獲給定大小范圍的細(xì)胞。這可能導(dǎo)致來自在該大小內(nèi)的群體的細(xì)胞的偏向選擇。
[0271]對(duì)于一些應(yīng)用，捕獲方法可使用在細(xì)胞表面表達(dá)的生物標(biāo)志物?？贵w可以在微流體設(shè)備的具體位置被模式化，雖然取決于微流體設(shè)備的結(jié)構(gòu)這種方法可能不是簡(jiǎn)單的。一些實(shí)施方案包括用于基于在微流體設(shè)備特定位置初始捕獲單個(gè)的、親和試劑涂覆的珠的單細(xì)胞捕獲的方法。在捕獲位點(diǎn)的開口通過這個(gè)珠提供的表面區(qū)域可提供細(xì)胞結(jié)合可接近的親和試劑的限定表面。珠的大小和捕獲位點(diǎn)可被選擇/設(shè)計(jì)，使得一旦單細(xì)胞結(jié)合到珠，珠的可接近表面區(qū)域的剩余部分被第一結(jié)合細(xì)胞空間阻塞。適當(dāng)大小的珠捕獲位點(diǎn)的選擇也提供寬的細(xì)胞大小范圍的捕獲。只要細(xì)胞大于暴露的捕獲區(qū)域，并表達(dá)適當(dāng)?shù)谋砻鏄?biāo)志物或用于親和試劑的結(jié)合伴侶，它應(yīng)該有可能捕獲該細(xì)胞。
[0272]捕獲幾何形狀可被設(shè)計(jì)以最大化細(xì)胞與表面標(biāo)志物接觸的可能性。例如，在一個(gè)或更多個(gè)通道壁上的擋板可被用于引導(dǎo)珠朝向捕獲特征。圖13A提供不同擋板的組合的說明性捕獲特征。捕獲特征的性能可以通過調(diào)整一個(gè)或更多個(gè)變量被調(diào)整，包括擋板的角度、從捕獲位點(diǎn)到擋板的距離、擋板的長(zhǎng)度、捕獲特征的尺寸和形狀、捕獲特征中引流溝的大小(如果存在)。圖13B和圖13C示出了捕獲特征/擋板組合的變量和性能。在圖13B中，在通道壁上的擋板可被用于引導(dǎo)珠朝向捕獲特征。在圖13C中，捕獲特征可被耦合到在通道壁上的擋板；單個(gè)捕獲特征/擋板組合可位于替換的壁以集中流動(dòng)朝向臨近的捕獲特征/擋板組合。這些組合可位于在使用中可分離(例如，使用閥門)以形成單獨(dú)反應(yīng)室的位點(diǎn)。
[0273]圖14A和圖14B示出了(以簡(jiǎn)化的形式，缺乏擋板)用于使用捕獲特征捕捉單個(gè)、親和試劑包被的磁珠，然后可以展示親和性試劑(例如，抗體)，以便捕捉單個(gè)細(xì)胞的策略。在圖14A-1中，流動(dòng)可在包含捕獲特征的通道開始。在圖14A-2中，抗體結(jié)合珠可朝向捕獲特征流動(dòng)直到珠容納在捕獲特征中，如圖14A-3中所示。然后，通道被洗滌以移除未捕獲的珠。隨后，如在圖14B-1中所示承載細(xì)胞表面標(biāo)志物，其與抗體結(jié)合，可被流入到包含捕獲珠的通道。圖14B-2說明了承載標(biāo)志物的細(xì)胞可如何與被捕獲的珠展示的抗體相互作用或結(jié)合。展示區(qū)域可以被限定，使得結(jié)合的細(xì)胞通過空間位阻抑制其它細(xì)胞與捕獲的珠相互作用，使得只有一個(gè)細(xì)胞結(jié)合到每個(gè)捕獲的珠。然后，通道可被洗滌以移除未結(jié)合細(xì)胞，如在圖14B-3中所示,在每個(gè)捕獲位點(diǎn)留下一個(gè)固定的細(xì)胞。
[0274]圖15A示出了設(shè)計(jì)以在離散位置(龕)捕獲單細(xì)胞的微流體設(shè)備的原理圖。流動(dòng)可以被設(shè)計(jì)成通過龕比通過溢流通道更強(qiáng)。龕包含小的間隙(?3μπι高)；例如，見圖15Β。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入龕時(shí)，其可阻塞龕并阻止任何更多流動(dòng)進(jìn)入龕。流動(dòng)可穿過下一個(gè)未占用龕，直到其也可以被細(xì)胞阻塞。在理論上，在細(xì)胞通過移除通道并出到廢物前每個(gè)龕可捕獲一個(gè)細(xì)胞。例如，對(duì)于更多的細(xì)節(jié)參照?qǐng)D15C、圖15D、圖15Ε、圖15F和圖15G，緩沖液入口可與細(xì)胞入口收斂以便推動(dòng)細(xì)胞到最靠近如圖15D中所示的一系列橫向細(xì)胞捕獲通道的供給通道的一側(cè)。如在圖15Ε中所示的，橫向細(xì)胞捕獲通道的阻力可低于細(xì)胞溢流通道的阻力以引起相對(duì)于進(jìn)入細(xì)胞的溢流通道優(yōu)先的細(xì)胞流動(dòng)進(jìn)入龕。如在圖15F中所示，每個(gè)龕可足夠大以剛好捕獲一個(gè)細(xì)胞。龕間隙可足夠小以便可在操作的壓力/流動(dòng)水平下捕獲細(xì)胞。如果后者可能太高和/或龕間隙可能太大，細(xì)胞可能變形或可能被推動(dòng)通過龕間隙。在龕中細(xì)胞的存在可提高特定回路的阻力，且因此流動(dòng)可能被引導(dǎo)到?jīng)]有細(xì)胞的回路。圖15G示出了在龕中單獨(dú)捕獲的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)。
[0275]圖16示出了根據(jù)各種實(shí)施方案的微流體設(shè)備1600的實(shí)例。微流體設(shè)備1600可被稱為微流體載體和微流體芯片組合。微流體設(shè)備1600包括可以配置用于裝載微流體設(shè)備1600和/或從微流體設(shè)備1600輸出產(chǎn)物和/或控制微流體裝置1600的一個(gè)或更多個(gè)方面的操作的很多端口。其它實(shí)施方案可包括不同的配置。微流體設(shè)備1600可包括控制區(qū)610-a和610_b,其可被用于控制微流體設(shè)備1600的壓力。微流體設(shè)備1600可包括樣品特異性入口和/或輸出620-a和/或620-b。一些實(shí)施方案可包括一個(gè)或更多個(gè)收集試劑端口，諸如630-a、630-b、630-c和/或630_d。一些實(shí)施方案可包括一個(gè)或更多個(gè)水合作用端口，諸如640-a、640-b、640-c和/或640_d。廢物端口 650-a和/或650-b可被提供。此外，細(xì)胞進(jìn)入端口 660和/或細(xì)胞排出端口 670可被提供。此外，一個(gè)或更多個(gè)試劑端口可被提供，諸如 680-a、680-b、680-c、680-d、680-e、680-f、680-g 和 / 或 680_h。微流體設(shè)備1600也可包括微流體芯片或設(shè)備110-b，例如，其可以是圖1和/圖2的微流體設(shè)備的實(shí)例。
[0276]圖16A不出了微流體設(shè)備1600的方面的實(shí)例，其可包括載體通道1610、載體孔1620和/或芯片上通道1630。在一些情況下，細(xì)胞密度和/或介質(zhì)密度可導(dǎo)致細(xì)胞下沉。為了避免在載體孔1620中細(xì)胞從溶液中脫落，一些實(shí)施方案可使用Percol。一些實(shí)施方案可使用更小的載體孔以避免細(xì)胞從溶液中脫落。
[0277]圖17示出了根據(jù)各種實(shí)施方案的微流體控制器1700。微流體控制器1700可以是圖1中的微流體控制器120的實(shí)例。微流體控制器1700可被配置以與在本申請(qǐng)中公開的許多微流體設(shè)備工作，例如，微流體設(shè)備包括圖1和/或圖2的微流體設(shè)備110，和/或圖16的微流體設(shè)備1600。
[0278]微流體控制器1700可包括殼體1705，其可包括多種組件。例如，微流體控制器1700可包括微流體設(shè)備輸入和輸出模塊1710。輸入和輸出模塊1710可被配置以控制傳輸微流體設(shè)備進(jìn)入微流體控制器1700和從其中出來。微流體控制器1700可包括用于從用戶接收輸入的輸入模塊1720和/或用于顯示信息給用戶的顯示模塊。輸入模塊1720和顯示模塊1725可被彼此集成，諸如通過觸摸屏顯示。微流體控制器1700可包括熱循環(huán)模塊1730，其可被用于熱循環(huán)微流體設(shè)備。微流體控制器1700可包括壓力模塊1740，其可被用于提供受壓力的流體，包括空氣，到微流體設(shè)備以驅(qū)動(dòng)閥門或以其它方式控制微流體設(shè)備的操作。壓力模塊1740和熱循環(huán)模塊1730可一起工作，使得當(dāng)熱循環(huán)發(fā)生時(shí)流體設(shè)備可被操作，諸如通過混合程序。微流體控制器1700可包括密封模塊1750以提供一個(gè)或更多個(gè)對(duì)應(yīng)于微流體設(shè)備的壓力密封。在一些實(shí)施方案中，密封模塊1750可包括接口板。
[0279]微流體控制器1700可包括一個(gè)或更多個(gè)計(jì)算機(jī)處理器模塊1770和/或一個(gè)或更多個(gè)存儲(chǔ)器模塊1780，其被用于操作微流體控制器1700的不同方面。
[0280]在一些實(shí)施方案中，微流體控制器1700可包括成像模塊1760，其可用于成像微流體控設(shè)備的一個(gè)或更多個(gè)方面或在微流體控制器內(nèi)部的材料。成像模塊1760可被配置以成像微流體設(shè)備的一個(gè)或更多個(gè)方面。成像模塊1760可包括至少顯微鏡或照相機(jī)，配置用以成像在微流體設(shè)備中的一個(gè)或更多個(gè)捕獲的細(xì)胞。成像模塊1760可包括至少顯微鏡或照相機(jī)，配置以成像在微流體設(shè)備中的一個(gè)或更多個(gè)反應(yīng)產(chǎn)物。
[0281]在一些實(shí)施方案中，熱循環(huán)模塊1730被配置以當(dāng)壓力模塊1740激活微流體設(shè)備內(nèi)部的一個(gè)或更多個(gè)閥門時(shí)，熱循環(huán)微流體設(shè)備。在一些實(shí)施方案中，配置以與微流體設(shè)備耦合以提供控制器壓力到微流體設(shè)備的壓力模塊1740被配置以控制在微流體設(shè)備中的壓力，以流動(dòng)多細(xì)胞通過微流體設(shè)備，并在微流體設(shè)備內(nèi)部以單個(gè)捕獲配置捕獲單個(gè)細(xì)胞。
[0282]配置以與微流體設(shè)備耦合以提供控制器壓力到微流體設(shè)備的壓力模塊1740可被配置以在微流體設(shè)備中控制壓力以執(zhí)行在微流體設(shè)備內(nèi)部捕獲的多個(gè)單細(xì)胞的多級(jí)的處理。被配置以熱循環(huán)微流體設(shè)備的熱循環(huán)模塊1730可被配置以執(zhí)行在微流體設(shè)備內(nèi)部捕獲的多個(gè)單細(xì)胞的多級(jí)的處理。
[0283]在一些情況下，被微流體控制器1700促進(jìn)的多級(jí)處理可包括預(yù)擴(kuò)增處理。在一些情況下，多級(jí)處理可包括mRNA測(cè)序處理。
[0284]配置以與微流體設(shè)備耦合以提供控制器壓力到微流體設(shè)備的壓力模塊1740可被配置以控制在微流體設(shè)備中的壓力以啟動(dòng)微流體設(shè)備。配置以與微流體設(shè)備耦合以提供控制器壓力到微流體設(shè)備的壓力模塊1740可被配置以控制在微流體設(shè)備中的壓力，以裝載多個(gè)細(xì)胞進(jìn)入微流體設(shè)備，并以從在微流體設(shè)備中的多個(gè)細(xì)胞中捕獲多個(gè)單個(gè)細(xì)胞。至少壓力模塊1740或熱循環(huán)模塊1730可被配置以促進(jìn)在微流體設(shè)備上執(zhí)行至少裂解、逆轉(zhuǎn)錄、PCR或收集。在一些實(shí)施方案中，至少壓力模塊1740或熱循環(huán)模塊1730可被配置以促進(jìn)在微流體設(shè)備上執(zhí)行至少裂解、逆轉(zhuǎn)錄、預(yù)擴(kuò)增或收集。
[0285]轉(zhuǎn)到圖18，根據(jù)各種實(shí)施方案，使用微流體用于多個(gè)單細(xì)胞處理的方法1800被示出。方法1800可使用多種不同的系統(tǒng)和/或設(shè)備執(zhí)行，其中系統(tǒng)/或設(shè)備包括但不限于例如圖1和/或圖2的微流體設(shè)備110，和/或圖16的微流體設(shè)備1600，和/或圖1和/或圖17的系統(tǒng)100的微流體控制器120。
[0286]在方框1805，細(xì)胞群體可被裝載到微流體設(shè)備中，其可包括微流體芯片和載體組合。在這些實(shí)施方案中，細(xì)胞群體可包括細(xì)胞群體。在方框1810，來自細(xì)胞群體的單細(xì)胞可被捕獲、洗滌和/或分配。在一些實(shí)施方案中，單捕獲細(xì)胞可被刺激或以其它方式操縱，諸如方框1815中所見。在一些實(shí)施方案中，單捕獲細(xì)胞可被成像，諸如方框1815中所見。
[0287]在方框1825，單捕獲細(xì)胞可被處理。在模塊1830，來自處理的單捕獲細(xì)胞的反應(yīng)產(chǎn)物和/或文庫(kù)可被輸出。在一些實(shí)施方案中，反應(yīng)產(chǎn)物和/或文庫(kù)還可被分析。
[0288]轉(zhuǎn)到圖19，根據(jù)各種實(shí)施方案，使用微流體用于多個(gè)單細(xì)胞處理的方法1900被示出。方法1900可使用多種不同的系統(tǒng)和/或設(shè)備執(zhí)行，其中系統(tǒng)/或設(shè)備包括但不限于例如圖1和/或圖2的微流體設(shè)備110，和/或圖16的微流體設(shè)備1600，和/或圖1和/或圖17的系統(tǒng)100的微流體控制器120。
[0289]在方框1905，多細(xì)胞可被裝載到微流體設(shè)備中。在方框1910，來自多細(xì)胞的單個(gè)細(xì)胞可被捕獲，并在微流體設(shè)備中洗滌。在方框1915，在微流體設(shè)備中，單個(gè)地捕獲和洗滌細(xì)胞可被分配。在方框1920，多個(gè)單個(gè)地捕獲、洗滌和分配細(xì)胞可被裂解。
[0290]在方框1925，關(guān)于在微流體設(shè)備中的多個(gè)單個(gè)地捕獲和裂解細(xì)胞，多步驟化學(xué)過程可執(zhí)行。例如，多步驟化學(xué)過程可包括執(zhí)行第一反應(yīng)(例如，RT-PCT)。在一些實(shí)施方案中，多步驟化學(xué)過程可包括第二反應(yīng)(例如，預(yù)擴(kuò)增)。在方框1930，在微流體設(shè)備中，來自多步驟化學(xué)過程的產(chǎn)物可被收集。
[0291]在一些情況下，方法1900可包括細(xì)胞輸入和多種不同試劑，其可被連續(xù)遞送到不同的反應(yīng)室。
[0292]轉(zhuǎn)到圖20，根據(jù)各種實(shí)施方案，使用微流體用于多個(gè)單細(xì)胞捕獲和處理的方法2000被示出。方法2000可使用多種不同的系統(tǒng)和/或設(shè)備的執(zhí)行，其中系統(tǒng)/或設(shè)備包括但不限于例如圖1和/或圖2的微流體設(shè)備110，和/或圖16的微流體設(shè)備1600，和/或圖1和/或圖17的系統(tǒng)100的微流體控制器120。
[0293]在方框2005，多細(xì)胞可被裝載到微流體設(shè)備中。在方框2010，多細(xì)胞可被流動(dòng)到微流體設(shè)備的第一捕獲配置。在方框2015，來自多細(xì)胞的第一單細(xì)胞可在第一捕獲配置被捕獲。在方框2020，來自多細(xì)胞的第一剩余細(xì)胞可被流動(dòng)到微流體設(shè)備的第二捕獲配置。在方框2025，來自第一剩余細(xì)胞的第二單細(xì)胞可在第二捕獲配置被捕獲。在方框2030，至少第一捕獲的單細(xì)胞和第二捕獲的單細(xì)胞的多級(jí)處理，可被執(zhí)行以產(chǎn)生關(guān)于微流體設(shè)備上的至少第一捕獲的單細(xì)胞和第二捕獲的單細(xì)胞的各自收集產(chǎn)物。
[0294]在一些實(shí)施方案中，在方框2015的捕獲至少第一單細(xì)胞或第二單細(xì)胞可包括利用一個(gè)或更多個(gè)限定大小以僅容納單細(xì)胞的物理障礙物捕獲至少第一單細(xì)胞或第二單細(xì)胞。一些實(shí)施例包括流動(dòng)來自多細(xì)胞的第一剩余多個(gè)細(xì)胞通過第一捕獲配置的一個(gè)或更多個(gè)旁路通道到與第二捕獲配置耦合的流動(dòng)通道，其中第二捕獲配置與第一捕獲配置的第一輸出通道耦合。一些實(shí)施方案包括流動(dòng)來自第一剩余細(xì)胞的第二剩余細(xì)胞，通過一個(gè)或更多個(gè)第二旁路通道到第二捕獲配置的出口，通過第二輸出通道到第三捕獲配置。
[0295]在一些實(shí)施方案中，第一捕獲配置包括:與第一輸入通道和第一輸出通道耦合的一個(gè)或更多個(gè)旁路通道；與第一輸入通道和第一輸出通道耦合的第一引流溝；和/或與第一引流溝耦合且配置以從多細(xì)胞中捕獲單個(gè)細(xì)胞的第一捕獲巢。在一些實(shí)施方案中，第二捕獲配置包括:與第二輸入通道和第二輸出通道耦合的多個(gè)旁路通道，其中第二輸入通道與第一捕獲配置的第一輸出通道耦合；與第二輸入通道和第二輸出通道耦合的第二引流溝；和/或與第二引流溝耦合且配置以從第一剩余的細(xì)胞中捕獲單個(gè)細(xì)胞的第二捕獲巢。
[0296]在一些實(shí)施方案中，在方框2030的執(zhí)行至少第一捕獲的單細(xì)胞和第二捕獲的單細(xì)胞的多級(jí)處理以產(chǎn)生關(guān)于微流體設(shè)備上的至少第一捕獲的單細(xì)胞和第二捕獲的單細(xì)胞的各自收集產(chǎn)物，包括裂解微流體設(shè)備上的每個(gè)各自單獨(dú)捕獲的細(xì)胞以釋放每個(gè)各自細(xì)胞的一種或更多種成分。在方框2030的執(zhí)行至少第一捕獲的單細(xì)胞和第二捕獲的單細(xì)胞的多級(jí)處理以產(chǎn)生關(guān)于微流體設(shè)備上的至少第一捕獲的單細(xì)胞和第二捕獲的單細(xì)胞的各自收集產(chǎn)物，可包括流動(dòng)每個(gè)各自捕獲的細(xì)胞的一種或更多種成分到微流體設(shè)備的各自多室反應(yīng)配置用于進(jìn)一步處理。在方框2030的執(zhí)行至少第一捕獲的單細(xì)胞和第二捕獲的單細(xì)胞的多級(jí)處理以產(chǎn)生關(guān)于微流體設(shè)備上的至少第一捕獲的單細(xì)胞和第二捕獲的單細(xì)胞的各自收集產(chǎn)物，可包括當(dāng)流動(dòng)一種或更多種成分通過微流體設(shè)備的各自多室反應(yīng)配置一個(gè)或更多個(gè)方面時(shí)執(zhí)行熱循環(huán)程序。
[0297]在一些實(shí)施方案中，在方框2030的執(zhí)行至少第一捕獲的單細(xì)胞和第二捕獲的單細(xì)胞的多級(jí)處理以產(chǎn)生關(guān)于微流體設(shè)備上的至少第一捕獲的單細(xì)胞和第二捕獲的單細(xì)胞的各自收集產(chǎn)物，可包括在微流體設(shè)備中用一種或更多種試劑洗滌每個(gè)各自捕獲的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，在方框2030的執(zhí)行至少第一捕獲的單細(xì)胞和第二捕獲的單細(xì)胞的多級(jí)處理以產(chǎn)生關(guān)于微流體設(shè)備上的至少第一捕獲的單細(xì)胞和第二捕獲的單細(xì)胞的各自收集產(chǎn)物，包括在微流體設(shè)備中用一種或更多種試劑給藥每個(gè)各自捕獲的細(xì)胞。
[0298]方法2000的一些實(shí)施方案包括成像在微流體設(shè)備內(nèi)的各自捕獲的細(xì)胞。關(guān)于捕獲細(xì)胞，成像可發(fā)生不同的次數(shù)。
[0299]在一些實(shí)施方案中，在方框2030的執(zhí)行至少第一捕獲的單細(xì)胞和第二捕獲的單細(xì)胞的多級(jí)處理以產(chǎn)生關(guān)于微流體設(shè)備上的至少第一捕獲的單細(xì)胞和第二捕獲的單細(xì)胞的各自收集產(chǎn)物，可包括在微流體設(shè)備內(nèi)部執(zhí)行預(yù)擴(kuò)增過程。在方框2030的執(zhí)行至少第一捕獲的單細(xì)胞和第二捕獲的單細(xì)胞的多級(jí)處理以產(chǎn)生關(guān)于微流體設(shè)備上的至少第一捕獲的單細(xì)胞和第二捕獲的單細(xì)胞的各自收集產(chǎn)物，可包括在微流體設(shè)備內(nèi)部執(zhí)行mRNA測(cè)序處理。
[0300]在一些實(shí)施方案中，在方框2030的執(zhí)行至少第一捕獲的單細(xì)胞和第二捕獲的單細(xì)胞的多級(jí)處理以產(chǎn)生關(guān)于微流體設(shè)備上的至少第一捕獲的單細(xì)胞和第二捕獲的單細(xì)胞的各自收集產(chǎn)物，可包括執(zhí)行微流體設(shè)備內(nèi)部的至少特異性靶擴(kuò)增、全基因組擴(kuò)增、全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增、實(shí)時(shí)PCR制備、拷貝數(shù)變化或單體型分析。在方框2030的執(zhí)行至少第一捕獲的單細(xì)胞和第二捕獲的單細(xì)胞的多級(jí)處理以產(chǎn)生關(guān)于微流體設(shè)備上的至少第一捕獲的單細(xì)胞和第二捕獲的單細(xì)胞的各自收集產(chǎn)物，可包括標(biāo)記來自與各自捕獲的細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的進(jìn)一步處理的反應(yīng)產(chǎn)物用于識(shí)別目的。
[0301]方法2000的一些實(shí)施方案可包括收集來自微流體設(shè)備的多個(gè)收集孔中的收集產(chǎn)物。
[0302]在一些實(shí)施方案中，捕獲至少第一單細(xì)胞或第二單細(xì)胞可包括利用配置以從有限稀釋中捕獲單個(gè)細(xì)胞的捕獲室捕獲至少第一單細(xì)胞或第二單細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，捕獲至少第一單細(xì)胞或第二單細(xì)胞可包括利用隨機(jī)捕獲過程捕獲至少第一單細(xì)胞或第二單細(xì)胞。
[0303]在一些實(shí)施方案中，捕獲至少第一單細(xì)胞或第二單細(xì)胞包括:利用捕獲區(qū)室和/或覆蓋捕獲區(qū)室的離散區(qū)域的結(jié)合伴侶捕獲至少第一單細(xì)胞或第二單細(xì)胞，其中離散部分被限定大小使得僅單細(xì)胞結(jié)合到離散區(qū)域。
[0304]捕獲至少第一單細(xì)胞或第二單細(xì)胞可包括利用一個(gè)或更多個(gè)捕獲支持物捕獲至少第一單細(xì)胞或第二單細(xì)胞，其中每個(gè)捕獲支持物包括分布在捕獲支持物的至少一部分上的結(jié)合伴侶。一個(gè)或更多個(gè)捕獲支持物可包括一個(gè)或更多個(gè)珠結(jié)構(gòu)。一些實(shí)施方案包括捕獲特征，其被配置以捕獲捕獲支持物。
[0305]轉(zhuǎn)到圖20A，根據(jù)各種實(shí)施方案，使用微流體用于多個(gè)單細(xì)胞捕獲和處理的方法2000-a被示出。方法2000-a可使用多種不同的系統(tǒng)和/或設(shè)備執(zhí)行，其中系統(tǒng)/或設(shè)備包括但不限于例如圖1和/或圖2的微流體設(shè)備110，和/或圖16的微流體設(shè)備1600，和/或圖1和/或圖17的系統(tǒng)100的微流體控制器120。方法2000-a可以是方法2000的實(shí)例。
[0306]在方框2005-a，多細(xì)胞可被裝載到微流體設(shè)備中。在方框2010_a，多細(xì)胞可被流動(dòng)到微流體設(shè)備的第一捕獲配置。在方框2015-a，來自多細(xì)胞的第一單細(xì)胞可在第一捕獲配置被捕獲，其中第一捕獲配置包括一個(gè)或更多個(gè)物理障礙物，諸如限定大小以容納僅單細(xì)胞的巢。在方框2040，來自多細(xì)胞的第一剩余多個(gè)細(xì)胞可被流動(dòng)通過第一捕獲配置的一個(gè)或更多個(gè)第一旁路通道到與第二捕獲配置耦合的流動(dòng)通道，其中第二捕獲配置與第一捕獲配置的第一輸出通道耦合。在方框2020-a，來自多細(xì)胞的第一剩余細(xì)胞可被流動(dòng)通過與第二捕獲配置耦合的流動(dòng)通道，到微流體設(shè)備的第二捕獲配置。在方框2025-a，來自第一剩余細(xì)胞的第二單細(xì)胞可在第二捕獲配置被捕獲，其中第一捕獲配置包括一個(gè)或更多個(gè)物理障礙物，諸如限定大小以容納僅單細(xì)胞的巢。在方框2045，來自第一剩余細(xì)胞的第二剩余細(xì)胞可被流動(dòng)通過第二捕獲配置的一個(gè)或更多個(gè)第二旁路通道到與第三捕獲配置耦合的流動(dòng)通道，其中第三捕獲配置與第二捕獲配置的出口耦合。在方框2030-a，至少第一捕獲的單細(xì)胞和第二捕獲的單細(xì)胞的多級(jí)處理，可被執(zhí)行以產(chǎn)生關(guān)于微流體設(shè)備上的至少第一捕獲的單細(xì)胞和第二捕獲的單細(xì)胞的各自收集產(chǎn)物。
[0307]轉(zhuǎn)到圖20B，根據(jù)各種實(shí)施方案，使用微流體用于多個(gè)單細(xì)胞捕獲和處理的方法2000-b被示出。方法2000-b可使用多種不同的系統(tǒng)和/或設(shè)備執(zhí)行，其中系統(tǒng)/或設(shè)備包括但不限于例如圖1和/或圖2的微流體設(shè)備110，和/或圖16的微流體設(shè)備1600，和/或圖1和/或圖17的系統(tǒng)100的微流體控制器120。方法2000-b可以是方法2000的實(shí)例。
[0308]在方框2005-b，多細(xì)胞可被裝載到微流體設(shè)備中。在方框2010-b，多細(xì)胞可被流動(dòng)到微流體設(shè)備的第一捕獲配置。在方框2015-b，來自多細(xì)胞的第一單細(xì)胞可在包括配置以從有限稀釋中捕獲第一單細(xì)胞的捕獲室的第一配置中被捕獲。在方框2020-b，來自多細(xì)胞的第一剩余細(xì)胞可被流動(dòng)到微流體設(shè)備的第二捕獲配置。在方框2025-b，來自第一剩余細(xì)胞的第二單細(xì)胞可在包括配置以從有限稀釋中捕獲第一單細(xì)胞的捕獲室的第二捕獲配置中被捕獲。在方框2030-b，至少第一捕獲的單細(xì)胞和第二捕獲的單細(xì)胞的多級(jí)處理，可被執(zhí)行以產(chǎn)生關(guān)于微流體設(shè)備上的至少第一捕獲的單細(xì)胞和第二捕獲的單細(xì)胞的各自收集產(chǎn)物。在方框2050，可收集來自微流體設(shè)備中的收集產(chǎn)物。
[0309]轉(zhuǎn)到圖21，根據(jù)各種實(shí)施方案，使用配置以從多細(xì)胞捕獲和處理單個(gè)細(xì)胞的微流體設(shè)備的預(yù)擴(kuò)增方法2100被示出。方法2100可使用多種不同的系統(tǒng)和/或設(shè)備執(zhí)行，其中系統(tǒng)/或設(shè)備包括但不限于例如圖1和/或圖2的微流體設(shè)備110，和/或圖16的微流體設(shè)備1600，和/或圖1和/或圖17的系統(tǒng)100的微流體控制器120。
[0310]方法2100可允許用戶捕獲細(xì)胞并使用如本文公開的微流體設(shè)備和/或控制器執(zhí)行靶向預(yù)擴(kuò)增。方法2100可提供捕獲細(xì)胞、生命力染色、成像細(xì)胞、裂解細(xì)胞、執(zhí)行逆轉(zhuǎn)錄和/或預(yù)擴(kuò)增和最后收集擴(kuò)增產(chǎn)物。方法2100可提供評(píng)價(jià)細(xì)胞的RNA內(nèi)容，并收集產(chǎn)生的產(chǎn)物。然后，預(yù)擴(kuò)增的擴(kuò)增子的基因表達(dá)分析可用基因組陣列執(zhí)行。
[0311]預(yù)擴(kuò)增可富集感興趣的位點(diǎn)的樣品，維持位點(diǎn)之間的相對(duì)豐度，和/或允許推導(dǎo)定量Cq信息。然后，在DNA結(jié)合染料(EvaGreen)存在下，定量PCR可被執(zhí)行。定量PCR后立即獲得熔解曲線以允許反應(yīng)質(zhì)量的評(píng)估。
[0312]在方框2105，微流體設(shè)備可被使用一種或更多種溶液?jiǎn)?dòng)。在方框2110，流動(dòng)多個(gè)細(xì)胞通過微流體設(shè)備使得在微流體設(shè)備的單個(gè)捕獲位點(diǎn)從多個(gè)細(xì)胞中捕獲單個(gè)細(xì)胞。在方框2115，多個(gè)捕獲的單個(gè)細(xì)胞可在微流體設(shè)備的單一捕位點(diǎn)被裂解。在方框2120，在微流體設(shè)備內(nèi)，可在多個(gè)單個(gè)裂解的細(xì)胞上執(zhí)行逆轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生與每個(gè)各自單個(gè)細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。在方框2125，在微流體設(shè)備內(nèi)，可在與每個(gè)各自裂解的單個(gè)細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的各自逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上執(zhí)行預(yù)擴(kuò)增以產(chǎn)生與每個(gè)單個(gè)捕獲細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0313]方法2100的一些實(shí)施方案包括從微流體設(shè)備的多個(gè)收集入口遞送與每個(gè)單個(gè)捕獲細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物到各自收集入口。
[0314]方法2100可包括準(zhǔn)備一種或更多種溶液以裝載到微流體設(shè)備。方法2100可包括裝載一種或更多種溶液到微流體設(shè)備。一種或更多種溶液可包括至少一種或更多種試劑或一種或更多種緩沖液。方法2100可包括裝載多個(gè)細(xì)胞到微流體設(shè)備。
[0315]方法2100的一些實(shí)施方案包括成像在微流體設(shè)備上的一個(gè)或更多個(gè)捕獲的單個(gè)細(xì)胞。
[0316]方法2100可包括裝載至少一種或更多種裂解試劑、一種或更多種逆轉(zhuǎn)錄試劑、或一種或更多種預(yù)擴(kuò)增試劑到微流體設(shè)備。方法2100可包括:移除一個(gè)或更多個(gè)收集入口的一個(gè)或更多個(gè)保護(hù)層；和/或從微流體設(shè)備的多個(gè)收集入口的每個(gè)各自收集入口收集預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0317]一些實(shí)施方案包括染色在微流體設(shè)備上的單個(gè)捕獲細(xì)胞的一個(gè)或更多個(gè)。一些實(shí)施方案包括基于染色確定單個(gè)捕獲細(xì)胞的一個(gè)或更多個(gè)為存活或死亡。方法2100可包括基于成像確定單個(gè)捕獲細(xì)胞的一個(gè)或更多個(gè)為存活或死亡。
[0318]轉(zhuǎn)到圖21A，根據(jù)各種實(shí)施方案，使用配置以從多細(xì)胞捕獲和處理單個(gè)細(xì)胞的微流體設(shè)備的預(yù)擴(kuò)增方法2100-a被示出。方法2100-a可使用多種不同的系統(tǒng)和/或設(shè)備執(zhí)行，其中系統(tǒng)/或設(shè)備包括但不限于例如圖1和/或圖2的微流體設(shè)備110，和/或圖16的微流體設(shè)備1600，和/或圖1和/或圖17的系統(tǒng)100的微流體控制器120。方法2100-a可以是方法2100的實(shí)例。
[0319]在方框2130，一種或更多種溶液可被制備以裝載到微流體設(shè)備。一種或更多種溶液可包括多種試劑和/或緩沖液，包括但不限于=RNA釘(RNA spike)、混合引物、裂解試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑、預(yù)擴(kuò)增試劑和/或細(xì)胞染色溶液。RNA釘可包括，但不限于，陣列對(duì)照RNA釘(ArrayControl RNA spike)和/或RNA存儲(chǔ)溶液?；旌弦锟砂?但不限于，引物母液和/或DNA稀釋試劑。裂解試劑可包括，但不限于，單細(xì)胞裂解溶液和/或裂解試劑。RT試劑可包括，但不限于，終止液、單細(xì)胞VILO RT、單細(xì)胞超級(jí)腳本RT (single cell superscript RT)和/或裝載試劑。預(yù)擴(kuò)增試劑可包括，但不限于，單細(xì)胞預(yù)擴(kuò)增試劑、預(yù)擴(kuò)增稀釋試劑。細(xì)胞染色溶液可包括，但不限于細(xì)胞洗滌緩沖液、乙錠同二聚體-1和/或鈣黃綠素AM。一些實(shí)施方案也可使用啟動(dòng)藥劑，諸如封閉試劑和/或預(yù)加載試劑。一些實(shí)施方案還可以利用懸浮試劑。
[0320]在方框2135，一種或更多種溶液可被裝載到微流體設(shè)備。一種或更多種溶液可包括至少一種或更多種試劑或一種或更多種緩沖液。溶液可以用移液器吸取通過不同的端口，諸如在圖16中所示的那些進(jìn)入微流體設(shè)備中。溶液可包括但不限于收集試劑、預(yù)先裝載試劑、封閉試劑和/或細(xì)胞洗滌緩沖液。在方框2105-a，微流體設(shè)備可被使用一種或更多種溶液?jiǎn)?dòng)。
[0321]在方框2140，多細(xì)胞可被裝載到微流體設(shè)備中。在混合懸浮試劑并裝載微流體設(shè)備之前，可產(chǎn)生可包括天然介質(zhì)的細(xì)胞懸浮液。例如，濃度可以是166-250K/ml ;其它濃度可被利用。細(xì)胞混合物可與懸浮試劑組合。例如，試劑與細(xì)胞可以是以一定比例的，諸如4:6。例如，細(xì)胞混合物可被用移液器吸取進(jìn)入不同的端口，諸如那些在圖16中所示的。染色溶液和/或封閉試劑也可被裝載到微流體設(shè)備。在方框2110-a，流動(dòng)多個(gè)細(xì)胞通過微流體設(shè)備使得在微流體設(shè)備的單個(gè)捕獲位點(diǎn)從多個(gè)細(xì)胞中捕獲單個(gè)細(xì)胞。例如，控制器，諸如圖17的控制器可被利用以流動(dòng)細(xì)胞通過微流體設(shè)備，使得細(xì)胞在單個(gè)捕獲位點(diǎn)被捕獲。
[0322]在方框2145，一個(gè)或更多個(gè)捕獲的單個(gè)細(xì)胞可在微流體設(shè)備上被成像。例如，可使用可與微流體設(shè)備兼容的顯微鏡和/或照相機(jī)成像細(xì)胞?？梢栽诓煌臅r(shí)間成像捕獲細(xì)胞，諸如被洗滌之前或之后，或被著色之前或之后。
[0323]在方框2150，至少一種或更多種裂解試劑、一種或更多種逆轉(zhuǎn)錄試劑、或一種或更多種預(yù)擴(kuò)增試劑可被裝載到微流體設(shè)備。例如，收集試劑、裂解試劑、RT試劑和預(yù)擴(kuò)增試劑可被裝載到設(shè)備。圖16可示出包括這些不同試劑可被裝載到微流體設(shè)備的端口的載體的實(shí)例。
[0324]在方框2115-a，多個(gè)捕獲的單個(gè)細(xì)胞可在微流體設(shè)備的單一捕位點(diǎn)被裂解。在方框2120-a，在微流體設(shè)備內(nèi)，可在多個(gè)單個(gè)裂解的細(xì)胞上執(zhí)行逆轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生與每個(gè)各自單個(gè)細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。在方框2125-a，在微流體設(shè)備內(nèi)，可在各自與每個(gè)各自裂解的單個(gè)細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上執(zhí)行預(yù)擴(kuò)增以產(chǎn)生與每個(gè)單個(gè)捕獲細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物。在方框2155，從多個(gè)微流體設(shè)備的多個(gè)收集入口，與每個(gè)單個(gè)捕獲細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物可被遞送到各自收集入口。在一些情況下，控制器，諸如圖17的控制器，可被利用以促進(jìn)執(zhí)行這些步驟。
[0325]在方框2160，從微流體設(shè)備的多個(gè)收集入口的每個(gè)各自收集入口可收集預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物。一些實(shí)施方案包括移除一個(gè)或更多個(gè)收集入口的一個(gè)或更多個(gè)保護(hù)層。保護(hù)層可被利用以躲避污染。收集產(chǎn)物，這可被稱為收集擴(kuò)增子，可在隨后的分析中被分析，諸如利用一個(gè)或更多個(gè)基因組分析陣列和/或控制器的不同基因組分析。在一些情況下，基因組分析陣列可被與微流體設(shè)備集成。
[0326]轉(zhuǎn)到圖22，根據(jù)各種實(shí)施方案，使用配置以從多細(xì)胞捕獲和處理單個(gè)細(xì)胞的微流體設(shè)備的mRNA測(cè)序方法2200被示出。方法2200可使用多種不同的系統(tǒng)和/或設(shè)備執(zhí)行，其中系統(tǒng)/或設(shè)備包括但不限于例如圖1和/或圖2的微流體設(shè)備110，和/或圖16的微流體設(shè)備1600，和/或圖1和/或圖17的系統(tǒng)100的微流體控制器120。
[0327]例如，方法2200可允許用戶捕獲細(xì)胞、轉(zhuǎn)化多聚A+RNA為全長(zhǎng)cDNA,和/或然后執(zhí)行通用cDNA的擴(kuò)增。在cDNA合成期間執(zhí)行的一些實(shí)施方案，包括:捕獲細(xì)胞、生命力染色、成像細(xì)胞、裂解細(xì)胞、進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和長(zhǎng)距離PCR和/或收集擴(kuò)增的cDNA。為了通過mRNASeq進(jìn)行分析，全長(zhǎng)cDNA可以首先被轉(zhuǎn)化成測(cè)序文庫(kù)，并且從cDNA的文庫(kù)產(chǎn)生的最后步驟在mRNA Seq Library Preparat1n for Sequencing Protocol 中被描述。例如，如果需要，也可以通過qPCR執(zhí)行全長(zhǎng)cDNA的直接基因表達(dá)分析。
[0328]一些實(shí)施方案可使用的修改的寡聚物(dT)引物以啟動(dòng)第一條鏈的合成，并且因此可在樣品中選擇用于多聚A+RNA。當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)到達(dá)mRNA的5’端時(shí)，酶的末端轉(zhuǎn)移酶的活性可增加一些非模板脫氧胞苷到cDNA的3’端。模板轉(zhuǎn)換引物可包括在其3’端的一些鳥嘌呤核苷，其與在cDNA上非模板脫氧胞苷堿基配對(duì)以創(chuàng)建延伸的模板。然后，RT可延伸到模板轉(zhuǎn)換引物的末端，產(chǎn)生可包含通用標(biāo)簽序列、mRNA的3’端、多至mRNA的5’端的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本，和/或最后的通用標(biāo)簽序列的反向互補(bǔ)物的單鏈cDNA。不成熟地終止的cDNA、污染的基因組DNA或從不帶多聚A尾的RNA轉(zhuǎn)錄的cDNA在兩端可不包含通用標(biāo)簽，且在長(zhǎng)距離PCR期間將不被指數(shù)地?cái)U(kuò)增。然而，在仍然具有多聚A尾部的低質(zhì)量RNA中出現(xiàn)的分解的RNA可被擴(kuò)增，產(chǎn)生不完全覆蓋轉(zhuǎn)錄本的5’端的更短的cDNA片段。因?yàn)槔缭赾DNA的5’端發(fā)現(xiàn)的通用標(biāo)簽可與在短cDNA的3’端發(fā)現(xiàn)的其自身反向互補(bǔ)物配對(duì)，這可預(yù)防短cDNA的擴(kuò)增，全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本在PCR期間可被富集。
[0329]在方框2205，微流體設(shè)備可被使用一種或更多種溶液?jiǎn)?dòng)。在方框2210，流動(dòng)多個(gè)細(xì)胞通過微流體設(shè)備使得在微流體設(shè)備的單個(gè)捕獲位點(diǎn)從多個(gè)細(xì)胞中捕獲單個(gè)細(xì)胞。在方框2215，多個(gè)捕獲的單個(gè)細(xì)胞可在微流體設(shè)備的單一捕位點(diǎn)被裂解。在方框2220，在微流體設(shè)備內(nèi)，可在多個(gè)單個(gè)裂解的細(xì)胞上執(zhí)行逆轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生與每個(gè)各自單個(gè)細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。在方框2225，在微流體設(shè)備內(nèi)，可在與每個(gè)各自裂解的單個(gè)細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的各自逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上執(zhí)行PCR以產(chǎn)生與每個(gè)單個(gè)捕獲細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的PCR產(chǎn)物。
[0330]方法2200的一些實(shí)施方案包括從微流體設(shè)備的多個(gè)收集入口遞送與每個(gè)單個(gè)捕獲細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的PCR產(chǎn)物到各自收集入口。方法2100可包括裝載一種或更多種溶液到微流體設(shè)備。一種或更多種溶液可包括至少一種或更多種試劑或一種或更多種緩沖液。
[0331]方法2200可包括裝載多個(gè)細(xì)胞到微流體設(shè)備。一些實(shí)施方案包括成像在微流體設(shè)備上的一個(gè)或更多個(gè)捕獲的單個(gè)細(xì)胞。方法2200的一些實(shí)施方案包括裝載至少一種或更多種裂解試劑、一種或更多種逆轉(zhuǎn)錄試劑、或一種或更多種PCR試劑到微流體設(shè)備。
[0332]方法2200的一些實(shí)施方案包括移除一個(gè)或更多個(gè)收集入口的一個(gè)或更多個(gè)保護(hù)層。從微流體設(shè)備的多個(gè)收集入口的每個(gè)各自收集入口可收集PCR產(chǎn)物。
[0333]方法2200可包括染色在微流體設(shè)備上的單個(gè)捕獲細(xì)胞的一個(gè)或更多個(gè)。方法2200可包括基于染色確定單個(gè)捕獲細(xì)胞的一個(gè)或更多個(gè)為存活或死亡。方法2200可包括基于成像確定單個(gè)捕獲細(xì)胞的一個(gè)或更多個(gè)為存活或死亡。
[0334]在一些情況下，PCR產(chǎn)物包括擴(kuò)增的cDNA。一些實(shí)施方案包括利用與每個(gè)單個(gè)捕獲細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的PCR產(chǎn)物制備的一個(gè)或更多個(gè)文庫(kù)。制備的一個(gè)或更多個(gè)文庫(kù)可包括確定來自與每個(gè)單個(gè)細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的每個(gè)各自收集產(chǎn)物的cDNA濃度，和/或稀釋每個(gè)各自cDNA濃度到預(yù)先確定的濃度范圍內(nèi)。一些實(shí)施方案包括準(zhǔn)備用于標(biāo)簽化的稀釋的cDNA濃度以產(chǎn)生標(biāo)簽化產(chǎn)物。一些實(shí)施方案包括在標(biāo)簽化產(chǎn)物上執(zhí)行PCR擴(kuò)增以產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。方法2200可包括產(chǎn)生來自于PCR產(chǎn)物的一個(gè)或更多個(gè)文庫(kù)池。
[0335]轉(zhuǎn)到圖22A，根據(jù)各種實(shí)施方案，使用配置以從多細(xì)胞捕獲和處理單個(gè)細(xì)胞的微流體設(shè)備的mRNA測(cè)序方法2200-a被示出。方法2200_a可使用多種不同的系統(tǒng)和/或設(shè)備執(zhí)行，其中系統(tǒng)/或設(shè)備包括但不限于例如圖1和/或圖2的微流體設(shè)備110，和/或圖16的微流體設(shè)備1600，和/或圖1和/或圖17的系統(tǒng)100的微流體控制器120。方法2200_a可以是方法2200的實(shí)例。
[0336]在方框2230，一種或更多種溶液可被制備以裝載到微流體設(shè)備。一種或更多種溶液可包括至少一種或更多種試劑或一種或更多種緩沖液。例如，溶液可包括，但不限于=RNA釘、裂解試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑、PCR試劑、細(xì)胞染色溶液和/或細(xì)胞混合試劑。在一些實(shí)施方案中，RNA釘可包括RNA存儲(chǔ)溶液和/或陣列對(duì)照RNA釘。RNA釘可作為熱循環(huán)的正對(duì)照。裂解試劑可包括，但不限于，裝載試劑、RNA抑制劑、3’ CDS引物和/或稀釋緩沖液。在一些實(shí)施方案中，RT試劑可包括5X第一鏈緩沖液、二硫蘇糖醇、dNTP試劑和/或逆轉(zhuǎn)錄酶試劑。PCR試劑可包括，但不限于，PCR水、1X優(yōu)勢(shì)2PCR緩沖液(10X advantage 2PCR buffer),50X dNTP試劑、IS PCR引物和/或50X優(yōu)勢(shì)2聚合酶試劑。細(xì)胞試劑可包括，但不限于，細(xì)胞和/或懸浮試劑。例如，細(xì)胞染色溶液可包括細(xì)胞洗漆緩沖液、乙錠同二聚體-1和/或鈣黃綠素AM。
[0337]在方框2235，一種或更多種溶液可被裝載到微流體設(shè)備。僅僅通過示例的方式，在微流體載體中溶液可通過端口被裝載到微流體芯片，諸如在圖16中所示。在方框2205-a，微流體設(shè)備可被使用一種或更多種溶液?jiǎn)?dòng)。啟動(dòng)劑可包括，但不限于，預(yù)裝載試劑、收集試劑和/或封閉試劑。
[0338]在方框2240，多細(xì)胞可被裝載到微流體設(shè)備中。在一些情況下，細(xì)胞可在可包括懸浮試劑的懸浮液中被制備。在一些實(shí)施方案中，在用懸浮試劑混合之前，天然介質(zhì)中濃度可以是在166-250K/ml之間。在微流體載體中細(xì)胞可通過端口被裝載到微流體設(shè)備，例如，諸如在圖16中所示。
[0339]在方框2210-a，流動(dòng)多個(gè)細(xì)胞通過微流體設(shè)備使得在微流體設(shè)備的單個(gè)捕獲位點(diǎn)從多個(gè)細(xì)胞中捕獲單個(gè)細(xì)胞。這可利用控制器，例如，諸如圖17的控制器。
[0340]在方框2245，捕獲的單個(gè)細(xì)胞的一個(gè)或更多個(gè)可在微流體設(shè)備上被成像。細(xì)胞可用可與微流體設(shè)備兼容的顯微鏡和/或照相機(jī)成像。
[0341]在方框2250，至少一種或更多種裂解試劑、一種或更多種逆轉(zhuǎn)錄試劑、或一種或更多種PCR試劑可被裝載到微流體設(shè)備。例如，這可包括，例如，裝載收集試劑、裂解試劑、RT試劑和/或PCR試劑到載體的不同端口，諸如在圖16中所示。
[0342]在方框2215-a，多個(gè)捕獲的單個(gè)細(xì)胞可在微流體設(shè)備的單一捕位點(diǎn)被裂解。在方框2220-a，在微流體設(shè)備內(nèi)，可在多個(gè)單個(gè)裂解的細(xì)胞上執(zhí)行逆轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生與每個(gè)各自單個(gè)細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。在方框2225-a，在微流體設(shè)備內(nèi)，可在與每個(gè)各自裂解的單個(gè)細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上執(zhí)行PCR以產(chǎn)生與每個(gè)單個(gè)捕獲細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的各自PCR產(chǎn)物。控制器，諸如圖17的控制器，可被用于控制這些方框的每個(gè)性能。
[0343]在方框2255，與每個(gè)單個(gè)捕獲細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的PCR產(chǎn)物可從多個(gè)微流體設(shè)備的多個(gè)收集入口被遞送到各自收集入口。在方框2260，從微流體設(shè)備的多個(gè)收集入口的每個(gè)各自收集入口可收集PCR產(chǎn)物。一些實(shí)施方案包括移除一個(gè)或更多個(gè)收集入口的一個(gè)或更多個(gè)保護(hù)層以促進(jìn)收集PCR產(chǎn)物。
[0344]轉(zhuǎn)到圖22B，根據(jù)各種實(shí)施方案，使用配置以從多細(xì)胞捕獲和處理單個(gè)細(xì)胞的微流體設(shè)備的mRNA測(cè)序方法2200-b被示出。方法2200_b可使用多種不同的系統(tǒng)和/或設(shè)備執(zhí)行，其中系統(tǒng)/或設(shè)備包括但不限于例如圖1和/或圖2的微流體設(shè)備110，和/或圖16的微流體設(shè)備1600，和/或圖1和/或圖17的系統(tǒng)100的微流體控制器120。在一些情況下，方法2200-b可被與方法2200和/或方法2200-a相結(jié)合。
[0345]方法2200-b可包括準(zhǔn)備利用與每個(gè)單個(gè)捕獲細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的PCR產(chǎn)物的一個(gè)或更多個(gè)文庫(kù)。例如，在方框2265，可確定來自與每個(gè)單個(gè)細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的每個(gè)各自收集產(chǎn)物的cDNA濃度。
[0346]在方框2270，每個(gè)各自cDNA濃度可被稀釋到預(yù)先確定的濃度范圍內(nèi)。在方框2275，稀釋的cDNA濃度可被制備用于標(biāo)簽化以產(chǎn)生標(biāo)簽化產(chǎn)物。在方框2280，PCR擴(kuò)增可被在標(biāo)簽化產(chǎn)物上執(zhí)行以產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。在方框2285，一個(gè)或更多個(gè)文庫(kù)池可從PCR產(chǎn)物中被產(chǎn)生。
[0347]以上結(jié)合附圖的詳細(xì)描述闡述描述了示例性實(shí)施方案，且不代表可被執(zhí)行或在權(quán)利要求范圍內(nèi)的僅有實(shí)施方案。貫穿這些描述使用的術(shù)語“示例性”指“作為實(shí)例、例子或說明”，而不是“首選的”或“相對(duì)其它實(shí)施方案有利的”。詳細(xì)描述包括用于提供描述技術(shù)的理解的目的的特殊細(xì)節(jié)。然而，沒有這些詳細(xì)細(xì)節(jié)這些技術(shù)也可被實(shí)踐。在一些例子中，眾所周知的結(jié)構(gòu)和設(shè)備以框圖形式顯示，以便避免模糊描述的實(shí)施方案的概念。
[0348]信息和信號(hào)可以使用任何各種不同的技術(shù)學(xué)和技術(shù)代表。例如，貫穿以上描述可被參考的數(shù)據(jù)、說明、命令、信息、信號(hào)、位、符號(hào)和芯片，可通過電壓、電流、電磁波、磁場(chǎng)或顆粒、光場(chǎng)或顆?；蚱淙魏谓M合表示。
[0349]與本文公開有關(guān)的描述的各種說明性方框和模塊的一些可用設(shè)計(jì)以執(zhí)行本文描述功能的通用處理器、數(shù)字信號(hào)處理器(DSP)、專用集成電路(ASIC)、現(xiàn)場(chǎng)可編程門陣列(FPGA)或其它可編程邏輯設(shè)備、離散門或晶體管邏輯、離散硬件組件或其任何組合被實(shí)施或執(zhí)行。通用處理器可以是微處理器，但可替換地，處理器可以是任何傳統(tǒng)的處理器、控制器、微控制器或狀態(tài)機(jī)。處理器也可以作為計(jì)算設(shè)備的組合來實(shí)施，例如，DSP和微處理器、多個(gè)微處理器、與DSP核心連接的一個(gè)或更多個(gè)微處理器，或任何其它此類配置的組合。
[0350]本文描述的一些功能可在硬件、被處理器執(zhí)行的軟件、固件或其任何組合中實(shí)施。如果在被處理器執(zhí)行的軟件中實(shí)施，可存儲(chǔ)或傳輸功能為計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)的一種或更多種指令或代碼。其它實(shí)例和實(shí)施方案在公開和附帶的權(quán)利要求的范圍和精神內(nèi)。例如，由于軟件的性質(zhì)，以上描述的功能可以使用被處理器執(zhí)行的軟件、硬件、固件、硬接線或這些的任何組合實(shí)施。實(shí)現(xiàn)功能的特征也可能是物理地位于不同的位置，包括被分布使得部分功能在不同物理位置實(shí)施。同時(shí)，如本文所用的，包括在權(quán)利要求中，如在以“至少一個(gè)”開始的項(xiàng)目列表中使用的“或”表明分隔列表，使得，例如，“至少A、B或C中的至少一個(gè)”的列表指A或B或C或AB或AC或BC或ABC(即，A和B和C)。
[0351]計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)同時(shí)包括計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)介質(zhì)和通信介質(zhì)，其中通信介質(zhì)包括任何促進(jìn)計(jì)算機(jī)程序從一個(gè)位置到另一個(gè)位置的傳輸?shù)慕橘|(zhì)。存儲(chǔ)介質(zhì)可以是任何可被通用或特殊計(jì)算機(jī)訪問的可用介質(zhì)。通過示例且不限制的方式，計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)可包括以指令或數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)形式的手段，和可被通用或特殊計(jì)算機(jī)，或通用或特殊處理器訪問的RAM、ROM、EEPROM、CD-ROM或其它光盤存儲(chǔ)、磁盤存儲(chǔ)設(shè)備或其它磁性存儲(chǔ)介質(zhì)，或任何可被用于執(zhí)行或存儲(chǔ)所需的程序代碼的其它介質(zhì)。同時(shí)，任何連接被恰當(dāng)?shù)胤Q為計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)。例如，如果軟件從網(wǎng)站、服務(wù)器或其它遠(yuǎn)程源使用同軸電纜、光纖電纜、雙絞線、數(shù)字用戶線(DSL)、或無線技術(shù)(諸如紅外、無線電、微波)傳輸，然后同軸電纜、光纖電纜、雙絞線、DSL或無線技術(shù)諸如紅外、無線電、微波被包含在介質(zhì)的定義中。如本文使用的磁盤和光盤包括光盤(CD)、激光光盤、光學(xué)光盤、數(shù)字通用光盤(DVD)、軟盤和藍(lán)光光盤,其中磁盤通常磁力地再生數(shù)據(jù)，而光盤用激光光學(xué)地再生數(shù)據(jù)。以上的組合也包括在計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)范圍。
[0352]先前公開的描述被提供以實(shí)現(xiàn)本領(lǐng)域技術(shù)人員制作和使用本公開。本公開的各種修改對(duì)于本【技術(shù)領(lǐng)域】的那些技術(shù)人員將是很明顯的，且本文限定的一般原則被應(yīng)用到其它變化而不脫離本公開的精神和范圍。貫穿本公開的術(shù)語“實(shí)例”或“示例性的”表明實(shí)例或例子，且不意味著或需要對(duì)記錄的實(shí)例的任何偏好。因此本公開不是被限制到本文描述的實(shí)例和設(shè)計(jì)，而是符合與本文公開的原則和新特征一致的最寬泛的范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種用于多個(gè)單細(xì)胞捕獲和處理的微流體設(shè)備，所述微流體設(shè)備包括: 串聯(lián)耦合的多個(gè)捕獲配置，其中每個(gè)各自捕獲配置被配置以捕獲單細(xì)胞；和 多個(gè)多室反應(yīng)配置，其中每個(gè)各自多室反應(yīng)配置與來自所述多個(gè)捕獲配置的各自捕獲配置耦合，且被配置用于單細(xì)胞處理。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流體設(shè)備，其中每個(gè)各自捕獲配置包括一個(gè)或更多個(gè)限定大小以僅容納單細(xì)胞的物理障礙物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流體設(shè)備，其中每個(gè)各自捕獲配置包括: 一個(gè)或更多個(gè)旁路通道，其與輸入通道和輸出通道耦合； 引流溝，其與所述輸入通道和所述輸出通道耦合；和 捕獲巢，其位于靠近所述輸入通道和所述一個(gè)或更多個(gè)旁路通道的連接點(diǎn)且與所述引流溝耦合，其中所述捕獲巢被配置以從多個(gè)細(xì)胞中捕獲單細(xì)胞，使得當(dāng)所述單細(xì)胞在所述捕獲巢被捕獲時(shí)，剩余的多個(gè)細(xì)胞被轉(zhuǎn)移到所述一個(gè)或更多個(gè)旁路通道中的至少一個(gè)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的微流體設(shè)備，其中所述一個(gè)或更多個(gè)旁路通道包括第一旁路通道和第二旁路通道。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的微流體設(shè)備，其中所述第一旁路通道和所述第二旁路通道被對(duì)稱地配置。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的微流體設(shè)備，其中所述對(duì)稱地配置的第一旁路通道和第二旁路通道包括第一翼配置和第二翼配置。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的微流體設(shè)備，其中至少所述輸入通道或所述輸出通道被進(jìn)一步配置為集中通道。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的微流體設(shè)備，其中所述集中通道包括在至少水平方向或垂直方向的縮小通道。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的微流體設(shè)備，其中所述多個(gè)多室反應(yīng)配置還被配置用于當(dāng)各自多室反應(yīng)配置的一個(gè)或更多個(gè)閥門被驅(qū)動(dòng)時(shí)熱循環(huán)。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的微流體設(shè)備，還包括: 一個(gè)或更多個(gè)成像特征，其中每個(gè)各自成像特征允許在各自捕獲巢位點(diǎn)捕獲的單細(xì)胞的成像。
11.根據(jù)權(quán)利要求3所述的微流體設(shè)備，還包括: 多個(gè)收集孔，其中每個(gè)各自的收集孔與各自多室反應(yīng)配置耦合，且配置以遞送反應(yīng)產(chǎn)物用于進(jìn)一步分析。
12.根據(jù)權(quán)利要求3所述的微流體設(shè)備，還包括: 基因組分析配置，其與每個(gè)各自多室反應(yīng)配置耦合以進(jìn)一步分析來自每個(gè)各自多室反應(yīng)配置的反應(yīng)產(chǎn)物。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流體設(shè)備，其中每個(gè)各自捕獲配置包括配置以從有限稀釋中捕獲單細(xì)胞的捕獲室。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流體設(shè)備，其中每個(gè)捕獲室被配置以利用隨機(jī)捕獲過程捕獲單細(xì)胞。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流體設(shè)備，其中每個(gè)各自捕獲配置包括: 捕獲區(qū)室；和 結(jié)合伴侶，其覆蓋所述捕獲區(qū)室的離散區(qū)域，其中所述離散部分被限定大小使得僅單細(xì)胞結(jié)合到所述離散區(qū)域。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流體設(shè)備，還包括: 一個(gè)或更多個(gè)捕獲支持物，其中每個(gè)捕獲支持物包括分布在所述捕獲支持物的至少一部分的結(jié)合伴侶。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的微流體設(shè)備，其中所述一個(gè)或更多個(gè)捕獲支持物包括一個(gè)或更多個(gè)珠結(jié)構(gòu)。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的微流體設(shè)備，還包括: 捕獲特征，其被配置以捕獲所述一個(gè)或更多個(gè)捕獲支持物。
19.一種配置用于多個(gè)單細(xì)胞捕獲和處理的微流體設(shè)備，所述微流體設(shè)備包括: 串聯(lián)耦合的多個(gè)捕獲配置，每個(gè)各自捕獲配置包括: 多個(gè)旁路通道，其與輸入通道和輸出通道耦合； 引流溝，其與所述輸入通道和所述輸出通道耦合；和 捕獲巢，其位于靠近所述輸入通道和所述多個(gè)旁路通道的連接點(diǎn)且與所述引流溝耦合，其中所述捕獲巢被配置以從多個(gè)細(xì)胞中捕獲單個(gè)細(xì)胞，使得當(dāng)所述單個(gè)細(xì)胞在所述捕獲巢被捕獲時(shí)，剩余的多個(gè)細(xì)胞被轉(zhuǎn)移到所述多個(gè)旁路通道中的至少一個(gè)；和 多個(gè)多室反應(yīng)配置，其中每個(gè)各自多室反應(yīng)配置與來自所述多個(gè)捕獲配置中的各自捕獲配置耦合，且被配置用于單細(xì)胞處理。
20.一種使用微流體的用于多個(gè)單細(xì)胞捕獲和處理的方法，所述方法包括: 裝載多個(gè)細(xì)胞到微流體設(shè)備； 流動(dòng)所述多個(gè)細(xì)胞到所述微流體設(shè)備的第一捕獲配置； 在所述第一捕獲配置從所述多個(gè)細(xì)胞中捕獲第一單細(xì)胞；流動(dòng)來自所述多個(gè)細(xì)胞的第一剩余多個(gè)細(xì)胞到所述微流體設(shè)備的第二捕獲配置；在所述第二捕獲配置中從所述第一剩余多個(gè)細(xì)胞中捕獲第二單細(xì)胞；和 執(zhí)行至少第一捕獲的單細(xì)胞和第二捕獲的單細(xì)胞的多級(jí)處理，以產(chǎn)生關(guān)于微流體設(shè)備上的至少第一捕獲的單細(xì)胞和第二捕獲的單細(xì)胞的各自收集產(chǎn)物。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中捕獲至少所述第一單細(xì)胞或所述第二單細(xì)胞包括: 利用一個(gè)或更多個(gè)限定大小以僅容納單細(xì)胞的物理障礙物捕獲至少所述第一單細(xì)胞或所述第二單細(xì)胞。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，還包括: 流動(dòng)來自所述多個(gè)細(xì)胞的所述第一剩余多個(gè)細(xì)胞通過所述第一捕獲配置的一個(gè)或更多個(gè)旁路通道到與第二捕獲配置耦合的流動(dòng)通道，所述第二捕獲配置與所述第一捕獲配置的第一輸出通道耦合。
23.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，還包括: 流動(dòng)來自所述第一剩余多個(gè)細(xì)胞的第二剩余多個(gè)細(xì)胞通過一個(gè)或更多個(gè)第二旁路通道到所述第二捕獲配置的出口，通過所述第二輸出通道到第三捕獲配置。
24.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述第一捕獲配置包括: 一個(gè)或更多個(gè)旁路通道，其與第一輸入通道和第一輸出通道耦合； 第一引流溝，其與第一輸入通道和第一輸出通道耦合；和 第一捕獲巢，其與所述第一引流溝耦合，且被配置以從所述多個(gè)細(xì)胞捕獲單個(gè)細(xì)胞。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述第二捕獲配置包括: 多個(gè)旁路通道，其與第二輸入通道和第二輸出通道耦合，其中所述第二輸入通道與所述第一捕獲配置的所述第一輸出通道耦合； 第二引流溝，其與所述第二輸入通道和所述第二輸出通道耦合；和 第二捕獲巢，其與第二引流溝耦合，被配置以從所述第一剩余的多個(gè)細(xì)胞捕獲單個(gè)細(xì)胞。
26.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中執(zhí)行至少所述第一捕獲的單細(xì)胞和所述第二捕獲的單細(xì)胞的所述多級(jí)處理以產(chǎn)生關(guān)于所述微流體設(shè)備上的至少所述第一捕獲的單細(xì)胞和所述第二捕獲的單細(xì)胞的各自收集產(chǎn)物，包括: 在所述微流體設(shè)備上裂解每個(gè)各自單獨(dú)地捕獲的細(xì)胞以釋放每個(gè)各自細(xì)胞的一種或更多種成分。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中執(zhí)行至少所述第一捕獲的單細(xì)胞和所述第二捕獲的單細(xì)胞的所述多級(jí)處理以產(chǎn)生關(guān)于所述微流體設(shè)備上的至少所述第一捕獲的單細(xì)胞和所述第二捕獲的單細(xì)胞的各自收集產(chǎn)物，包括: 流動(dòng)每個(gè)各自捕獲的細(xì)胞的所述一種或更多種成分進(jìn)入所述微流體設(shè)備的各自多室反應(yīng)配置用于進(jìn)一步處理。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中執(zhí)行至少所述第一捕獲的單細(xì)胞和所述第二捕獲的單細(xì)胞的所述多級(jí)處理以產(chǎn)生關(guān)于所述微流體設(shè)備上的至少所述第一捕獲的單細(xì)胞和所述第二捕獲的單細(xì)胞的各自收集產(chǎn)物，包括: 當(dāng)流動(dòng)所述一種或更多種成分通過所述微流體設(shè)備的各自多室反應(yīng)配置的一個(gè)或更多個(gè)方面時(shí)，執(zhí)行熱循環(huán)程序。
29.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中執(zhí)行至少所述第一捕獲的單細(xì)胞和所述第二捕獲的單細(xì)胞的所述多級(jí)處理以產(chǎn)生關(guān)于所述微流體設(shè)備上的至少所述第一捕獲的單細(xì)胞和所述第二捕獲的單細(xì)胞的各自收集產(chǎn)物，包括: 在所述微流體設(shè)備中用一種或更多種試劑洗滌每個(gè)各自捕獲的細(xì)胞。
30.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中執(zhí)行至少所述第一捕獲的單細(xì)胞和所述第二捕獲的單細(xì)胞的所述多級(jí)處理以產(chǎn)生關(guān)于所述微流體設(shè)備上的至少所述第一捕獲的單細(xì)胞和所述第二捕獲的單細(xì)胞的各自收集產(chǎn)物，包括: 在所述微流體設(shè)備中用一種或更多種試劑給藥每個(gè)各自捕獲的細(xì)胞。
31.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，還包括: 在所述微流體設(shè)備內(nèi)成像所述各自捕獲的細(xì)胞。
32.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中執(zhí)行至少所述第一捕獲的單細(xì)胞和所述第二捕獲的單細(xì)胞的所述多級(jí)處理以產(chǎn)生關(guān)于所述微流體設(shè)備上的至少所述第一捕獲的單細(xì)胞和所述第二捕獲的單細(xì)胞的各自收集產(chǎn)物，包括: 在所述微流體設(shè)備中執(zhí)行預(yù)擴(kuò)增處理。
33.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中執(zhí)行至少所述第一捕獲的單細(xì)胞和所述第二捕獲的單細(xì)胞的所述多級(jí)處理以產(chǎn)生關(guān)于所述微流體設(shè)備上的至少所述第一捕獲的單細(xì)胞和所述第二捕獲的單細(xì)胞的各自收集產(chǎn)物，包括: 在所述微流體設(shè)備中執(zhí)行mRNA測(cè)序過程。
34.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中執(zhí)行至少所述第一捕獲的單細(xì)胞和所述第二捕獲的單細(xì)胞的所述多級(jí)處理以產(chǎn)生關(guān)于所述微流體設(shè)備上的至少所述第一捕獲的單細(xì)胞和所述第二捕獲的單細(xì)胞的各自收集產(chǎn)物，包括: 在所述微流體設(shè)備內(nèi)執(zhí)行至少特異性靶擴(kuò)增、全基因組擴(kuò)增、全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增、實(shí)時(shí)PCR制備、拷貝數(shù)變化或單體型分析。
35.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中執(zhí)行至少所述第一捕獲的單細(xì)胞和所述第二捕獲的單細(xì)胞的所述多級(jí)處理以產(chǎn)生關(guān)于所述微流體設(shè)備上的至少所述第一捕獲的單細(xì)胞和所述第二捕獲的單細(xì)胞的各自收集產(chǎn)物，包括: 標(biāo)記來自與各自捕獲細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的所述進(jìn)一步處理中的反應(yīng)產(chǎn)物用于識(shí)別目的。
36.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，還包括: 從所述微流體設(shè)備的多個(gè)收集孔收集所述收集產(chǎn)物。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，還包括: 處理所述收集產(chǎn)物。
38.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中捕獲至少所述第一單細(xì)胞或所述第二單細(xì)胞包括: 利用配置以從有限稀釋中捕獲單細(xì)胞的捕獲室捕獲至少所述第一單細(xì)胞或所述第二單細(xì)胞。
39.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中捕獲至少所述第一單細(xì)胞或所述第二單細(xì)胞包括: 利用隨機(jī)捕獲過程捕獲至少所述第一單細(xì)胞或所述第二單細(xì)胞。
40.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中捕獲至少所述第一單細(xì)胞或所述第二單細(xì)胞包括: 利用以下捕獲至少所述第一單細(xì)胞或所述第二單細(xì)胞: 捕獲區(qū)室；和 結(jié)合伴侶，其覆蓋所述捕獲區(qū)室的離散區(qū)域，其中所述離散部分被限定大小使得僅單細(xì)胞結(jié)合到所述離散區(qū)域。
41.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中捕獲至少所述第一單細(xì)胞或所述第二單細(xì)胞包括: 利用一個(gè)或更多個(gè)捕獲支持物捕獲至少所述第一單細(xì)胞或所述第二單細(xì)胞，其中每個(gè)捕獲支持物包括分布在所述捕獲支持物的至少一部分上的結(jié)合伴侶。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述一個(gè)或更多個(gè)捕獲支持物包括一個(gè)或更多個(gè)珠結(jié)構(gòu)。
43.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，還包括: 捕獲特征，其被配置以捕獲所述捕獲支持物。
44.一種使用微流體的用于多個(gè)單細(xì)胞捕獲和處理的方法，所述方法包括: 裝載多個(gè)顆?；蚣?xì)胞到微流體設(shè)備； 流動(dòng)所述多個(gè)細(xì)胞到所述微流體設(shè)備的至少第一捕獲配置，其中所述第一捕獲配置包 括: 第一多個(gè)旁路通道，其與第一輸入通道和第一輸出通道耦合； 第一引流溝，其與所述第一輸入通道和所述第一輸出通道耦合；和 第一捕獲巢，其與所述第一引流溝耦合，且被配置以從所述多個(gè)細(xì)胞捕獲單個(gè)細(xì)胞； 在所述第一捕獲巢，從所述多個(gè)細(xì)胞中捕獲第一單個(gè)顆?；蚣?xì)胞； 流動(dòng)來自所述多個(gè)細(xì)胞的第一剩余多個(gè)細(xì)胞通過所述第一多個(gè)旁路通道的至少一個(gè)到與所述第一捕獲配置的所述第一輸出通道耦合的至少第二捕獲配置； 流動(dòng)所述第一剩余多個(gè)細(xì)胞到所述微流體設(shè)備的至少所述第二捕獲配置，其中所述第二捕獲配置包括: 第二多個(gè)旁路通道，其與第二輸入通道和第二輸出通道耦合，其中所述第二輸入通道與所述第一捕獲配置的所述第一輸出通道耦合； 第二引流溝，其與所述第二輸入通道和所述第二輸出通道耦合；和第二捕獲巢，其與第二引流溝耦合，被配置以從所述第一剩余的多個(gè)細(xì)胞捕獲單個(gè)細(xì)胞；和 在所述第二捕獲巢從所述第一剩余多個(gè)細(xì)胞捕獲第二顆粒或細(xì)胞；和流動(dòng)來自所述第一剩余多個(gè)細(xì)胞的第二剩余多個(gè)細(xì)胞通過所述多個(gè)第二旁路通道的至少一個(gè)，通過所述第二輸出通道到第三捕獲配置。
45.一種預(yù)擴(kuò)增方法，其利用配置以從多個(gè)細(xì)胞中捕獲和處理單個(gè)細(xì)胞的微流體設(shè)備，所述方法包括: 利用一種或更多種溶液?jiǎn)?dòng)所述微流體設(shè)備； 流動(dòng)所述多個(gè)細(xì)胞通過所述微流體設(shè)備使得在所述微流體設(shè)備的單個(gè)捕獲位點(diǎn)從所述多個(gè)細(xì)胞中捕獲單個(gè)細(xì)胞； 裂解在所述微流體設(shè)備的單個(gè)捕獲位點(diǎn)的所述多個(gè)捕獲的單個(gè)細(xì)胞； 在所述微流體設(shè)備內(nèi)，在所述多個(gè)單個(gè)裂解的細(xì)胞上執(zhí)行逆轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生與每個(gè)各自單個(gè)細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；和 在所述微流體設(shè)備內(nèi)，在與每個(gè)各自裂解的單個(gè)細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的所述各自逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上執(zhí)行預(yù)擴(kuò)增以產(chǎn)生與每個(gè)單個(gè)捕獲細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，還包括: 從所述微流體設(shè)備的多個(gè)收集入口遞送與每個(gè)單個(gè)捕獲細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的所述預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物到各自收集入口。
47.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，還包括: 裝載所述一種或更多種溶液到所述微流體設(shè)備。
48.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述一種或更多種溶液包括至少一種或更多種試劑或一種或更多種緩沖液。
49.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，還包括: 裝載所述多個(gè)細(xì)胞到所述微流體設(shè)備。
50.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，還包括: 成像在所述微流體設(shè)備上的所述捕獲的單個(gè)細(xì)胞的一個(gè)或更多個(gè)。
51.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，還包括: 裝載至少一種或更多種裂解試劑、一種或更多種逆轉(zhuǎn)錄試劑、或一種或更多種預(yù)擴(kuò)增試劑到所述微流體設(shè)備。
52.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，還包括: 移除一個(gè)或更多個(gè)收集入口的一個(gè)或更多個(gè)保護(hù)層；和 從所述微流體設(shè)備的所述多個(gè)收集入口的每個(gè)各自收集入口收集所述預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物。
53.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，還包括: 染色在所述微流體設(shè)備上的所述單個(gè)捕獲細(xì)胞的一個(gè)或更多個(gè)。
54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，還包括: 基于所述染色確定所述單個(gè)捕獲細(xì)胞的一個(gè)或更多個(gè)為存活或死亡。
55.根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，還包括: 基于所述成像確定所述單個(gè)捕獲細(xì)胞的一個(gè)或更多個(gè)為存活或死亡。
56.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述微流體設(shè)備包括: 串聯(lián)耦合的多個(gè)捕獲配置，每個(gè)各自捕獲配置包括: 多個(gè)旁路通道，其與輸入通道和輸出通道耦合； 引流溝，其與所述輸入通道和所述輸出通道耦合；和 捕獲巢，其位于靠近所述輸入通道和所述多個(gè)旁路通道的連接點(diǎn)且與所述引流溝耦合，其中所述捕獲巢被配置以從所述多個(gè)細(xì)胞中捕獲單個(gè)細(xì)胞，使得當(dāng)所述單個(gè)細(xì)胞在所述捕獲巢被捕獲時(shí)，剩余的多個(gè)細(xì)胞被轉(zhuǎn)移到所述多個(gè)旁路通道中的至少一個(gè)，其中所述捕獲巢包括單個(gè)細(xì)胞位點(diǎn)中的一個(gè)；和 多個(gè)多室反應(yīng)配置，其中每個(gè)各自多室反應(yīng)配置與來自所述多個(gè)捕獲配置中的各自捕獲配置耦合，且被配置用于單細(xì)胞處理。
57.一種預(yù)擴(kuò)增方法，其利用配置以從多個(gè)細(xì)胞中捕獲和處理單個(gè)細(xì)胞的微流體設(shè)備，所述方法包括: 裝載一種或更多種溶液到所述微流體設(shè)備； 利用所述一種或更多種溶液?jiǎn)?dòng)微流體設(shè)備； 裝載所述多個(gè)細(xì)胞到所述微流體設(shè)備； 流動(dòng)所述多個(gè)細(xì)胞通過所述微流體設(shè)備使得在所述微流體設(shè)備的單個(gè)捕獲位點(diǎn)從所述多個(gè)細(xì)胞中捕獲單個(gè)細(xì)胞； 成像在所述微流體設(shè)備上的所述捕獲的單個(gè)細(xì)胞的一個(gè)或更多個(gè)； 裝載至少一種或更多種裂解試劑、一種或更多種逆轉(zhuǎn)錄試劑、或一種或更多種預(yù)擴(kuò)增試劑到所述微流體設(shè)備； 裂解在所述微流體設(shè)備的單個(gè)捕獲位點(diǎn)的所述多個(gè)捕獲的單個(gè)細(xì)胞； 在所述微流體設(shè)備內(nèi)，在所述多個(gè)單個(gè)裂解的細(xì)胞上執(zhí)行逆轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生與每個(gè)各自單個(gè)細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物； 在所述微流體設(shè)備內(nèi)，在與每個(gè)各自裂解的單個(gè)細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的各自逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上執(zhí)行預(yù)擴(kuò)增，以產(chǎn)生與每個(gè)單個(gè)捕獲細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物； 從所述微流體設(shè)備的多個(gè)收集入口遞送與每個(gè)單個(gè)捕獲細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的所述預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物到各自收集入口； 移除一個(gè)或更多個(gè)收集入口的一個(gè)或更多個(gè)保護(hù)層；和 從所述微流體設(shè)備的所述多個(gè)收集入口的每個(gè)各自收集入口收集所述預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物。
58.一種mRNA測(cè)序方法，其利用配置以從多個(gè)細(xì)胞中捕獲和處理單個(gè)細(xì)胞的微流體設(shè)備，所述方法包括: 利用一種或更多種溶液?jiǎn)?dòng)所述微流體設(shè)備； 流動(dòng)所述多個(gè)細(xì)胞通過所述微流體設(shè)備使得在所述微流體設(shè)備的單個(gè)捕獲位點(diǎn)從所述多個(gè)細(xì)胞中捕獲單個(gè)細(xì)胞； 裂解在所述微流體設(shè)備的單個(gè)捕獲位點(diǎn)的所述多個(gè)捕獲的單個(gè)細(xì)胞； 在所述微流體設(shè)備內(nèi)，在所述多個(gè)單個(gè)裂解的細(xì)胞上執(zhí)行逆轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生與每個(gè)各自單個(gè)細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；和 在所述微流體設(shè)備內(nèi)，在與每個(gè)各自裂解的單個(gè)細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的所述各自逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上執(zhí)行PCR以產(chǎn)生與每個(gè)單個(gè)捕獲細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的PCR產(chǎn)物。
59.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，還包括: 從所述微流體設(shè)備的多個(gè)收集入口遞送與每個(gè)單個(gè)捕獲細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的所述PCR產(chǎn)物到各自收集入口。
60.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，還包括: 裝載所述一種或更多種溶液到所述微流體設(shè)備。
61.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其中所述一種或更多種溶液包括至少一種或更多種試劑或一種或更多種緩沖液。
62.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，還包括: 裝載所述多個(gè)細(xì)胞到所述微流體設(shè)備。
63.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，還包括: 成像在所述微流體設(shè)備上的所述捕獲的單個(gè)細(xì)胞的一個(gè)或更多個(gè)。
64.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，還包括: 裝載至少一種或更多種裂解試劑、一種或更多種逆轉(zhuǎn)錄試劑、或一種或更多種PCR試劑到所述微流體設(shè)備。
65.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，還包括: 移除一個(gè)或更多個(gè)收集入口的一個(gè)或更多個(gè)保護(hù)層；和 從所述微流體設(shè)備的所述多個(gè)收集入口的每個(gè)各自收集入口收集所述PCR產(chǎn)物。
66.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，還包括: 染色在所述微流體設(shè)備上的所述單個(gè)捕獲細(xì)胞的一個(gè)或更多個(gè)。
67.根據(jù)權(quán)利要求66所述的方法，還包括: 基于所述染色確定所述單個(gè)捕獲細(xì)胞的一個(gè)或更多個(gè)為存活或死亡。
68.根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，還包括: 基于所述成像確定所述單個(gè)捕獲細(xì)胞的一個(gè)或更多個(gè)為存活或死亡。
69.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其中所述PCR產(chǎn)物包括擴(kuò)增的cDNA。
70.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，還包括: 利用與每個(gè)單個(gè)捕獲細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的所述PCR產(chǎn)物制備一個(gè)或更多個(gè)文庫(kù)。
71.根據(jù)權(quán)利要求70所述的方法，其中制備所述一個(gè)或更多個(gè)文庫(kù)包括: 確定來自與每個(gè)單個(gè)細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的每個(gè)各自收集產(chǎn)物的cDNA濃度；和 稀釋每個(gè)各自cDNA濃度到預(yù)先確定的濃度范圍內(nèi)。
72.根據(jù)權(quán)利要求71所述的方法，還包括: 制備用于標(biāo)簽化的稀釋的cDNA濃度以產(chǎn)生標(biāo)簽化產(chǎn)物。
73.根據(jù)權(quán)利要求72所述的方法，還包括: 在標(biāo)簽化產(chǎn)物上執(zhí)行PCR擴(kuò)增以產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。
74.根據(jù)權(quán)利要求73所述的方法，還包括: 從所述PCR產(chǎn)物產(chǎn)生一個(gè)或更多個(gè)文庫(kù)池。
75.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其中所述微流體設(shè)備包括: 串聯(lián)耦合的多個(gè)捕獲配置，每個(gè)各自捕獲配置包括: 多個(gè)旁路通道，其與輸入通道和輸出通道耦合； 引流溝，其與所述輸入通道和所述輸出通道耦合；和 捕獲巢，其位于靠近所述輸入通道和所述多個(gè)旁路通道的連接點(diǎn)且與所述引流溝耦合，其中所述捕獲巢被配置以從所述多個(gè)細(xì)胞中捕獲單個(gè)細(xì)胞，使得當(dāng)所述單個(gè)細(xì)胞在所述捕獲巢被捕獲時(shí)，剩余的多個(gè)細(xì)胞被轉(zhuǎn)移到所述多個(gè)旁路通道中的至少一個(gè)，其中所述捕獲巢包括單個(gè)細(xì)胞位點(diǎn)的一個(gè)；和 多個(gè)多室反應(yīng)配置，其中每個(gè)各自多室反應(yīng)配置與來自所述多個(gè)捕獲配置中的各自捕獲配置耦合，且被配置用于單細(xì)胞處理。
76.—種mRNA測(cè)序方法，其利用配置以從多個(gè)細(xì)胞中捕獲和處理單個(gè)細(xì)胞的微流體設(shè)備，所述方法包括: 裝載一種或更多種溶液到所述微流體設(shè)備； 利用所述一種或更多種溶液?jiǎn)?dòng)所述微流體設(shè)備； 裝載所述多個(gè)細(xì)胞到所述微流體設(shè)備； 流動(dòng)所述多個(gè)細(xì)胞通過所述微流體設(shè)備使得在所述微流體設(shè)備的單個(gè)捕獲位點(diǎn)從所述多個(gè)細(xì)胞中捕獲單個(gè)細(xì)胞； 成像在所述微流體設(shè)備上的一個(gè)或更多個(gè)所述捕獲的單個(gè)細(xì)胞； 裝載至少一種或更多種裂解試劑、一種或更多種逆轉(zhuǎn)錄試劑、或一種或更多種PCR試劑到微流體設(shè)備； 裂解在所述微流體設(shè)備的所述單個(gè)捕獲位點(diǎn)的所述多個(gè)捕獲的單個(gè)細(xì)胞； 在所述微流體設(shè)備內(nèi)，在所述多個(gè)單個(gè)裂解的細(xì)胞上執(zhí)行逆轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生與每個(gè)各自單個(gè)細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物； 在所述微流體設(shè)備內(nèi)，在與每個(gè)各自溶解的單個(gè)細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的各自逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上執(zhí)行PCR以產(chǎn)生與每個(gè)單個(gè)捕獲細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的PCR產(chǎn)物； 遞送與每個(gè)單個(gè)捕獲細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的PCR產(chǎn)物到來自所述微流體設(shè)備的多個(gè)收集入口的各自收集入口； 移除一個(gè)或更多個(gè)收集入口的一個(gè)或更多個(gè)保護(hù)層；和 從所述微流體設(shè)備的所述多個(gè)收集入口的每個(gè)各自收集入口收集所述PCR產(chǎn)物。
77.—種配置用于使用微流體設(shè)備的多個(gè)單細(xì)胞處理的微流體控制器，所述微流體控制器包括: 殼體； 微流體設(shè)備輸入和輸出模塊，其被配置以加載和卸載所述微流體設(shè)備到所述殼體內(nèi)； 壓力模塊，其被配置以與所述微流體設(shè)備耦合以提供控制器壓力到所述微流體設(shè)備； 密封模塊，其被配置以提供一個(gè)或更多個(gè)壓力密封圈到所述微流體設(shè)備；和 熱循環(huán)模塊，其被配置以熱循環(huán)所述微流體設(shè)備。
78.根據(jù)權(quán)利要求77所述的微流體控制器，還包括: 成像模塊，其被配置以成像微流體設(shè)備的一個(gè)或更多個(gè)方面。
79.根據(jù)權(quán)利要求78所述的微流體控制器，其中所述成像模塊包括至少顯微鏡或照相機(jī)，其被配置以成像在所述微流體設(shè)備中的一個(gè)或更多個(gè)捕獲的細(xì)胞。
80.根據(jù)權(quán)利要求78所述的微流體控制器，其中所述成像模塊包括至少顯微鏡或照相機(jī)，其被配置以成像在所述微流體設(shè)備中的一個(gè)或更多個(gè)反應(yīng)產(chǎn)物。
81.根據(jù)權(quán)利要求77所述的微流體控制器，其中所述熱循環(huán)模塊被配置以當(dāng)所述壓力模塊激活所述微流體設(shè)備內(nèi)的一個(gè)或更多個(gè)閥門時(shí)熱循環(huán)所述微流體設(shè)備。
82.根據(jù)權(quán)利要求77所述的微流體控制器，還包括: 輸入模塊，其被配置以從所述微流體控制器的用戶接收輸入。
83.根據(jù)權(quán)利要求77所述的微流體控制器，還包括: 顯示模塊，其被配置以至少提供信息到所述微流體控制器的用戶或從所述微流體控制器的所述用戶接收輸入。
84.根據(jù)權(quán)利要求77所述的微流體控制器，其中配置以與所述微流體設(shè)備耦合以提供控制器壓力到所述微流體設(shè)備的所述壓力模塊被配置以控制在所述微流體設(shè)備中的壓力，以流動(dòng)多個(gè)細(xì)胞通過所述微流體設(shè)備，并在所述微流體設(shè)備內(nèi)在單個(gè)捕獲配置捕獲單個(gè)細(xì)胞。
85.根據(jù)權(quán)利要求77所述的微流體控制器，其中配置以與所述微流體設(shè)備耦合以提供控制器壓力到所述微流體設(shè)備的所述壓力模塊被配置以在所述微流體設(shè)備中控制壓力以執(zhí)行在所述微流體設(shè)備內(nèi)捕獲的多個(gè)單細(xì)胞的多級(jí)處理。
86.根據(jù)權(quán)利要求77所述的微流體控制器，其中配置以熱循環(huán)所述微流體設(shè)備的所述熱循環(huán)模塊被配置以執(zhí)行在所述微流體設(shè)備內(nèi)捕獲的多個(gè)單細(xì)胞的多級(jí)處理。
87.根據(jù)權(quán)利要求86所述的微流體控制器，其中所述多級(jí)處理包括預(yù)擴(kuò)增處理。
88.根據(jù)權(quán)利要求86所述的微流體控制器，其中所述多級(jí)處理包括mRNA測(cè)序處理。
89.根據(jù)權(quán)利要求77所述的微流體控制器，其中配置以與所述微流體設(shè)備耦合以提供控制器壓力到所述微流體設(shè)備的所述壓力模塊被配置以控制在所述微流體設(shè)備中的壓力以啟動(dòng)微流體設(shè)備。
90.根據(jù)權(quán)利要求89所述的微流體控制器，其中配置以與所述微流體設(shè)備耦合以提供控制器壓力到所述微流體設(shè)備的所述壓力模塊被配置以控制在所述微流體設(shè)備中的壓力，以裝載多個(gè)細(xì)胞進(jìn)入所述微流體設(shè)備，并在所述微流體設(shè)備內(nèi)從所述多個(gè)細(xì)胞中捕獲多個(gè)單個(gè)細(xì)胞。
91.根據(jù)權(quán)利要求90所述的微流體控制器，其中至少所述壓力模塊或所述熱循環(huán)模塊被配置以促進(jìn)在所述微流體設(shè)備上執(zhí)行至少裂解、逆轉(zhuǎn)錄、PCR或收集。
92.根據(jù)權(quán)利要求90所述的微流體控制器，其中至少所述壓力模塊或所述熱循環(huán)模塊被配置以促進(jìn)在所述微流體設(shè)備上執(zhí)行至少裂解、逆轉(zhuǎn)錄、預(yù)擴(kuò)增或收集。
93.一種配置用于多個(gè)單細(xì)胞處理的微流體系統(tǒng)，所述微流體系統(tǒng)包括: 微流體設(shè)備，其包括: 串聯(lián)耦合的多個(gè)捕獲配置，每個(gè)各自捕獲配置包括: 多個(gè)旁路通道，其與輸入通道和輸出通道耦合； 引流溝，其與所述輸入通道和所述輸出通道耦合；和 捕獲巢，其位于靠近所述輸入通道和所述多個(gè)旁路通道的連接點(diǎn)且與所述引流溝耦合，其中所述捕獲巢被配置以從多個(gè)細(xì)胞中捕獲單個(gè)細(xì)胞，使得當(dāng)所述單個(gè)細(xì)胞在所述捕獲巢被捕獲時(shí)，剩余的多個(gè)細(xì)胞被轉(zhuǎn)移到所述多個(gè)旁路通道中的至少一個(gè)；和 多個(gè)多室反應(yīng)配置，其中每個(gè)各自多室反應(yīng)配置與來自所述多個(gè)捕獲配置中的各自捕獲配置耦合，且被配置用于單細(xì)胞處理；和 微流體控制器，其與所述微流體設(shè)備耦合，所述微流體控制器包括: 殼體； 微流體設(shè)備輸入和輸出模塊，其被配置以加載和卸載所述微流體設(shè)備到所述殼體內(nèi)； 壓力模塊，其被配置以與所述微流體設(shè)備耦合以提供控制器壓力到所述微流體設(shè)備； 密封模塊，其被配置以提供一個(gè)或更多個(gè)壓力密封圈到所述微流體設(shè)備；和 熱循環(huán)模塊，其被配置以熱循環(huán)所述微流體設(shè)備。
【文檔編號(hào)】G01N15/10GK104350374SQ201380022521
【公開日】2015年2月11日 申請(qǐng)日期:2013年2月28日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月29日
【發(fā)明者】布賴恩·福勒, 吉克·金保爾, 貌妙杜, 安德魯·梅, 邁克爾·C·諾里斯, 多米尼克·G·托普帕尼, 馬克·A·恩格, 王晶, 詹森·A·A·韋斯特 申請(qǐng)人:富魯達(dá)公司