專利名稱：一種快速檢測核酸病毒的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速檢測核酸病毒的試劑盒。
背景技術(shù)：
中國有I億3千萬乙肝病毒(HBV)攜帶者，4千萬丙肝病毒(HCV)攜帶者，專家預(yù)測2010年我國將有100(Γ1500萬人艾滋病毒(HIV)攜帶者，這三種疾病為全球性疾患。血液是艾滋病，乙肝及丙肝的主要傳播途徑，保證輸血安全是控制這些疾病血液傳播的最有效的環(huán)節(jié)之一?？v觀現(xiàn)代采血、輸血發(fā)展歷程，各種血液安全政策的實施或是重大革新技術(shù)的應(yīng)用，都能明顯降低因輸血造成傳染性疾病的傳播風險。雖然第3代的酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)(ELISA)的應(yīng)用已經(jīng)能夠降低這一風險，但是感染HBV、HCV、HIV后，產(chǎn)生抗HBV、抗HCV、抗HIV的“窗口期”較長，在窗口期內(nèi)用ELISA技術(shù)很有可能產(chǎn)生漏檢，所以國外從上世紀末開始就采用了核酸檢測(nucleic acid test, NAT)的方式來篩查血液,確保檢測的準確性。目前NAT技術(shù)主要是提高核酸探針的敏感性，從而提高檢測水平。主要分為兩種主要方法1)模板擴增技術(shù)主要有聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)、核酸序列依賴性擴增(NASBA)、自主序列復(fù)制系統(tǒng)、連接酶鏈式反應(yīng)等；2)信號放大系統(tǒng)，主要有分支DNA探針、3D DNA探針等。第一種模板擴增技術(shù)，需要用到相應(yīng)的PCR儀或是熒光定量PCR儀，擴增所用的試劑基本依賴于國外幾個大公司的試劑盒產(chǎn)品，價格昂貴，先期投資較大，同時檢測時間長。與第二種方法比較，第一種模板擴增的方法還存在技術(shù)上的局限1)不論是Tag酶或是逆轉(zhuǎn)錄AMV酶都沒有3’ -5’核酸外切酶的活性，容易發(fā)生堿基的錯配；2)引物3’端部分配對可導(dǎo)致非特異性的擴增，造成假陽性；3)外源性污染也容易導(dǎo)致假陽性。而第二種方法核酸檢測信號放大方式則是通過增加標記探針的數(shù)量或增強標記物的信號強度來提高靈敏性，不存在擴增靶序列的問題，所以其反應(yīng)迅速，重復(fù)性好，依托相應(yīng)的檢測儀器，升級其檢測功能，其臨床應(yīng)用潛力巨大。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種快速檢測核酸病毒的試劑盒，其原理是利用核酸檢測信號放大技術(shù)，依托相應(yīng)的檢測儀器，利用同時標記有羅丹明染料和報告探針的脂質(zhì)體，與經(jīng)分離的血液樣本混勻，這樣脂質(zhì)體和病毒核酸靶序列通過報告探針結(jié)合。然后混合血液樣本點滴于帶正電荷的尼龍膜上，根據(jù)毛細作用原理，血液樣本在膜上遷移，當移動至事先固定于尼龍膜上的捕獲探針時，脂質(zhì)體-病毒核酸復(fù)合物通過與捕獲探針之間的堿基互補作用，富集于捕獲探針區(qū)域，形成可分辨的紅色熒光斑點，通過測定吸光值大小，根據(jù)標準曲線獲得病毒核酸靶序列的含量。一種快速檢測核酸病毒的試劑盒，該試劑盒包括帶正電荷的尼龍膜、報告探針、捕獲探針、預(yù)雜交液和雜交液；所述的報告探針是標記在包裹有磺酰羅丹明B的脂質(zhì)體上。所述的包裹有磺酰羅丹明B脂質(zhì)體的制備方法是精密稱取20. Omg蛋黃卵磷脂、、5.Omg磷脂酰乙醇胺、25. Omg膽固醇溶于20mL氯仿,加入4mL 125Pg/mL磺酰羅丹明B溶液，混合后水浴超聲5min，制成均勻的白色乳劑，40° C水浴中減壓蒸發(fā)至凝膠態(tài)，然后加入6mL水溶液，放置30min使其充分水合即得磺酰羅丹明B脂質(zhì)體混懸液，儲存于4° C冰箱中。報告探針標記包裹有磺酰羅丹明B的脂質(zhì)體的方法是取合成的羧基修飾的DNA探針，加入EDC水溶液和S-NHS水溶液，室溫靜置。加入I mL制備的脂質(zhì)體溶液，混合，4°C下孵育。透析除去過量EDC，S-NHS和副產(chǎn)物脲。反應(yīng)結(jié)束后4°C下離心，重復(fù)洗滌離心2次分離出游離探針，收集沉淀脂質(zhì)體重懸于HEPES緩沖液中備用。所述預(yù)雜交液配方為50%的去離子甲酰胺，5XSSC，0. 1% SDS, O. 1%BSA，0. 1%PVP，用PH7的PB調(diào)終體積；并加入鮭魚精DNA50 μ g/mL。使用時預(yù)雜交液放入沸水中IOmin后放入-20°C冰箱中迅速冷卻IOmin,備用。所述的雜交液配方為50%的去離子甲酰胺，5XSSC，0. 1%SDS, 5 X Denhardt, s, 1%葡聚糖，用蒸餾水調(diào)終體積，現(xiàn)用現(xiàn)配。應(yīng)用本發(fā)明試劑盒快速檢測核酸病毒的時間可以在10分鐘內(nèi)完成。
具體實施例方式本發(fā)明所提到的百分比都是質(zhì)量體積比，即w/v (mg//mL)
SSC :檸檬酸緩沖液
SDS :十二烷基磺酸鈉 BSA :牛血清白蛋白 PB 磷酸鹽緩沖液。實施例一試劑盒的使用方法
(I)處理帶正電荷的尼龍膜首先剪成5X2cm大小，然后置于2XSSC中5min后取出，室溫干燥。(2)用移液槍取200ng的捕獲探針，點樣于已經(jīng)干燥的尼龍膜上。(3)將尼龍膜放置于紫外交聯(lián)儀2min，將捕獲探針固定在尼龍膜上，然后在室溫條件下等待膜干燥，使探針結(jié)合得更牢固。(4) 在培養(yǎng)皿中加入預(yù)雜交液2mL，然后將尼龍膜放入，將培養(yǎng)皿放置于脫色搖床上，并將脫色搖床放置于恒溫培養(yǎng)箱中，在42°C的條件下反應(yīng)30min。(5)反應(yīng)結(jié)束后，將尼龍膜取出，4°C保存。(6)提取血液中的核酸，并與標記上報告探針的內(nèi)部包裹有磺酰羅丹明B脂質(zhì)體混合，目的是讓病毒靶序列通過堿基互補配對與報告探針結(jié)合。(7)在混合樣品中加入雜交液并點樣于固定好捕獲探針的尼龍膜上在毛細遷移作用下，探針和靶序列的復(fù)合體向前遷移。(8) IOmin后檢測固定捕獲探針處熒光信號的強度，從而定性定量分析所檢測病
毒核酸的含量。
實施例二 HBV病毒的快速檢測
I.探針的設(shè)計
利用BLAST軟件對其序列進行比對并獲得特異序列；利用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計特異性高、Tm值接近、長度均一的寡核苷酸探針。捕獲探針的序列為5-CTTTCACTTTCTCGCCAACTTACA-3(SEQ ID No. I)
報告探針的序列為5-CTCTGCCAAGTGTTTGCTGACG-3 (SEQ ID No. 2)
2.脂質(zhì)體的制備
精密稱取20. Omg蛋黃卵磷脂、5. Omg磷脂酰乙醇胺、25. Omg膽固醇溶于20mL氯仿,力口Λ 4mL 125Pg/mL磺酰羅丹明B溶液,混合后水浴超聲5min,制成均勻的白色乳劑,40° C水浴中減壓蒸發(fā)至凝膠態(tài)，然后加入6mL水溶液，放置30min使其充分水合即得磺酰羅丹明B 脂質(zhì)體混懸液，儲存于4° C冰箱中。3.脂質(zhì)體上報告探針的標記
在40 μ L 20 μ M 5'端羧基修飾的報告探針中加入40 μ L EDC水溶液和S-NHS溶液，4°C靜置I h活化，然后加入到ImL脂質(zhì)體溶液中，4°C孵育4 h后于4°C、20000 rpm下離心30 min,重復(fù)洗滌離心2次分離出游離探針，收集沉淀脂質(zhì)體重懸于HEPES緩沖液中備用。4.探針的固定
首先將帶正電荷的尼龍膜剪成5 X 2cm大小，然后置于2 X SSC中5min后取出，室溫干燥，用移液槍取2ul50uM的捕獲探針，點樣于已經(jīng)干燥的尼龍膜上，將尼龍膜放置紫外交聯(lián)儀2min，將捕獲探針固定在尼龍膜上。5探針雜交
在培養(yǎng)皿中加入預(yù)雜交液2mL，然后將尼龍膜放入，將培養(yǎng)皿放置于脫色搖床上，并將脫色搖床放置于恒溫培養(yǎng)箱中，在42°C的條件下反應(yīng)30min。提取病毒核酸加入雜交液以及報告探針標記的脂質(zhì)體，反應(yīng)lOmin，然后點樣于固定好捕獲探針的尼龍膜上在毛細遷移作用下，探針和靶序列的復(fù)合體向前遷移。6.信號檢測
IOmin后檢測固定捕獲探針點樣處熒光信號的強度，從而定性定量分析病毒含量。實施例三 HCV genotype I病毒的快速檢測 與實施例二基本相同，不同之處在于
捕獲探針的序列為5- CTGTCTACCACGGGGCCGGA -3 (SEQ ID No. 3)
報告探針的序列為5- GGAAATGGGCCGGGGCGAAA -3 (SEQ ID No. 4)。實施例四HCV genotype 2的病毒檢測 與實施例二基本相同，不同之處在于
捕獲探針的序列為5- AGCTACGCCCCCTGGGTCAG-3 (SEQ ID No. 5)
報告探針的序列為5- GCCGCGAGCTCGTCACACTT-3 (SEQ ID No. 6)。實施例五HCV genotype 3的病毒檢測 與實施例二基本相同，不同之處在于
捕獲探針的序列為5- CAAGTTCCCGGGTGGCGGAC -3 (SEQ ID No. 7)
報告探針的序列為5- TCCGACGCGCCTTGGGGATA -3 (SEQ ID No. 8)。實施例六HCV genotype 4的病毒檢測 與實施例二基本相同，不同之處在于
捕獲探針的序列為5- TTGCGTGCCCTGCGTGAGAG -3 (SEQ ID No. 9)
報告探針的序列為5- GGCGCCGTGGTCGGAATGAA -3 (SEQ ID No. 10)。
實施例七HCV genotype 5的病毒檢測 與實施例二基本相同，不同之處在于
捕獲探針的序列為5- GCCGTCATACCCGCGACAGG -3 (SEQ ID No. 11) 報告探針的序列為:5- TCCCTGTACGGCCCCTACGC -3 (SEQ ID No. 12)。實施例八HCV genotype 6的病毒檢測 與實施例二基本相同，不同之處在于
捕獲探針的序列為5- CGAGAAGCCAACGGCGTGGT -3 (SEQ ID No. 13) 報告探針的序列為5- CCATGCGCACCCCGTGTCAT -3 (SEQ ID No. 14)。實施例九HIVl的病毒檢測 與實施例二基本相同，不同之處在于
捕獲探針的序列為5- CTAGCAGTGGCGCCCGAACA -3 (SEQ ID No. 15) 報告探針的序列為5- AGCCGAGTCCTGCGTCGAGA -3 (SEQ ID No. 16)。實施例十HIV2的病毒檢測 與實施例二基本相同，不同之處在于
捕獲探針的序列為5- CAGACGGCTCCACGCTTGCT -3 (SEQ ID No. 17) 報告探針的序列為5- ACACCGAATGACCAGGCGGC -3 (SEQ ID No. 18)。權(quán)利要求
1.一種快速檢測核酸病毒的試劑盒，該試劑盒包括帶正電荷的尼龍膜、報告探針、捕獲探針、預(yù)雜交液和雜交液；其特征在于報告探針是標記在包裹有磺酰羅丹明B的脂質(zhì)體上。
2.根據(jù)權(quán)利I所說的快速檢測核酸病毒的試劑盒，其特征在于，包裹有磺酰羅丹明B脂質(zhì)體的制備方法是精密稱取20. Omg蛋黃卵磷脂、5. Omg磷脂酰乙醇胺、25. Omg膽固醇溶于20mL氯仿,加入4mL 125Pg/mL磺酰羅丹明B溶液，混合后水浴超聲5min,制成均勻的白色乳劑，40° C水浴中減壓蒸發(fā)至凝膠態(tài)，然后加入6mL水溶液，放置30min使其充分水合即得磺酰羅丹明B脂質(zhì)體混懸液，儲存于4° C冰箱中。
3.根據(jù)權(quán)利2所說的快速檢測核酸病毒的試劑盒，其特征在于，報告探針標記包裹有磺酰羅丹明B的脂質(zhì)體的方法是取合成的羧基修飾的DNA探針，加入EDC水溶液和S-NHS水溶液，室溫靜置；加入I mL制備的脂質(zhì)體溶液，混合，4°C下孵育；透析除去過量EDC，S-NHS和副產(chǎn)物脲；反應(yīng)結(jié)束后4°C下離心，重復(fù)洗滌離心2次分離出游離探針，收集沉淀脂質(zhì)體重懸于HEPES緩沖液中備用。
4.根據(jù)權(quán)利I所說的快速檢測核酸病毒的試劑盒，其特征在于，預(yù)雜交液配方為50%的去離子甲酰胺，5 X SSC，O. 1% SDS, O. 1%BSA，0. 1% PVP，用pH7的PB調(diào)終體積，并加入鮭魚精DNA50y g。
5.根據(jù)權(quán)利I所說的快速檢測核酸病毒的試劑盒，其特征在于，雜交液配方為50%的去離子甲酰胺,5 X SSC, O. 1%SDS, 5 X Denhardts, 1%葡聚糖,用蒸懼水調(diào)終體積。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種快速檢測核酸病毒的試劑盒，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。該試劑盒用夾心雜交法檢測核酸病毒，包括探針(報告探針和捕獲探針)的設(shè)計、脂質(zhì)體上報告探針的標記、捕獲探針的固定、報告探針與靶序列的雜交、靶序列與捕獲探針的雜交、熒光信號的檢測等過程。本發(fā)明的試劑盒能夠?qū)崿F(xiàn)定性定量快速檢測人體血液中的病毒，具有檢測快速、操作簡便、靈敏度高、低成本、準確度高等優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/68GK102634611SQ20121014859
公開日2012年8月15日 申請日期2012年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月15日
發(fā)明者呂煒鋒, 李利潔, 鄒洪平, 高向東 申請人:中國藥科大學