專利名稱：新的安絲菌素類化合物及其制備方法
新的安絲菌素類化合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種化合物，尤其涉及一種新的安絲菌素類化合物，本發(fā)明還涉及該安絲菌素類化合物的制備方法。
背景技術(shù)：
1972年Kupchan等從原產(chǎn)熱帶非洲的齒葉美登木(M. serrata)中首次分離出天然抗腫瘤活性成分——大環(huán)內(nèi)酯類化合物美登素(Maytansine)，其后研究人員相繼從高等植物矛衛(wèi)科、鼠李科、大戟科植物、苔蘚類植物中分離到美登木類化合物。最引人注意的是從 微生物中發(fā)現(xiàn)了這類化合物，1977年，Higashide及其同事在篩選抗癌活性成分的過程中，從分離自莎草科苔屬植物葉子的橙色束絲放線菌(Actinosynnema pretiosum)中得到六個美登素衍生物，命名為安絲菌素PO、PU P2、P3、P4、P4’。隨后又從另一個橙色束絲放線菌亞種(A pretiosum ssp. Auranticum)中分離得到除上述六個化合物外的十五個新安絲菌素，其母核為19-C的大環(huán)內(nèi)酰胺環(huán)，C-3連接不同長度的碳鏈，主要活性成分是P-3。上述所有這些安絲菌素均可以被還原分解成C-3美登木醇(P-O)，該醇是用于合成含硫醇美登木素生物堿的前體。安絲菌素已被化學(xué)轉(zhuǎn)變成含硫醇的美登木素生物堿(maytansinoids),該生物堿以細胞結(jié)合劑-美登木素生物堿偶聯(lián)物的形式體現(xiàn)出的醫(yī)療用途已被報道。隨著對美登素類抗體結(jié)合物研究的不斷深入，市場對美登木素類化合物的需求量逐步擴大。由于美登木類植物含美登素及其同系物的含量很低，大量砍伐美登木類植物會對生態(tài)造成嚴重破壞，且從野生植物中尋找原料難以滿足工業(yè)生產(chǎn)的需要；采用化學(xué)合成，又因美登木素結(jié)構(gòu)復(fù)雜存在全合成和半合成工藝復(fù)雜、過程繁瑣、產(chǎn)率很低、反應(yīng)專一性差等缺點。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之一在于提供一種新的安絲菌素類化合物，所述新的安絲菌素類化合物具有抗腫瘤活性。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題之一的式(I)代表的新的安絲菌
素類化合物，
權(quán)利要求
1.式(I)代表的新的安絲菌素類化合物，
2.一種如權(quán)利要求I所述的新的安絲菌素類化合物的制備方法，其特征在于其操作步驟如下 步驟一制備束絲放線菌菌株FIM06-0063 (Actinosynnema sp)發(fā)酵液； 步驟二 將步驟一所獲得的束絲放線菌菌株FM06-0063發(fā)酵液進行大孔樹脂吸附柱層析，得到粗提物； 步驟三將步驟二所獲得的粗提物進行正相硅膠柱層析，并采用氯仿-甲醇梯度洗脫粗提物，然后分段收集各洗脫液； 步驟四將步驟三所獲得的各洗脫液分別進行薄層層析，并采用高效液相色譜對各洗脫液分別進行檢測分析，然后將薄層層析結(jié)果顯橙紅色、且高效液相色譜檢測結(jié)果具有相同峰的洗脫液合并，并減壓濃縮該合并后的洗脫液得到第一濃縮物； 步驟五將步驟四所獲得的第一濃縮物進行中壓反相硅膠柱層析以獲得粗產(chǎn)物，進行中壓反相硅膠柱層析時，先采用體積分數(shù)為10%甲醇水溶液為流動相平衡10分鐘后，然后流動相采用體積比10°/Γ100% 1的甲醇-水溶劑系統(tǒng)梯度洗脫90min，流動相的流速為5ml/min ； 步驟六將步驟五所獲得的粗產(chǎn)物進行Sephadex LH-20凝膠柱層析,所述SephadexLH-20凝膠柱層析采用體積比I: I的氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng)洗脫，并根據(jù)流分與碘化鉍鉀顯色反應(yīng)分段收集各流分，然后將與碘化鉍鉀反應(yīng)顯色相同的流分合并，減壓濃縮以獲得第二濃縮物； 步驟七將步驟六所獲得的第二濃縮物采用制備型高效液相色譜進行分離，得到3個組分；最后，將3個組分分別經(jīng)過制備型硅膠板分離以獲得安絲菌素類化合物；所述制備型高效液相色譜的分離條件為流動相為70%的甲醇水溶液，流動相的流速為I. 5ml/min，檢測波長為254nm。
3.如權(quán)利要求2所述的新的安絲菌素類化合物的制備方法，其特征在于所述束絲放線菌菌株FM06-0063的分離方法如下 步驟100 :取云南美登木的老葉和葉柄，用自來水沖洗30min后，再用蒸餾水洗凈置于無菌培養(yǎng)皿中；接著將所述老葉和葉柄依次用75%酒精擦洗，無菌水沖洗后，轉(zhuǎn)入質(zhì)量分數(shù)為O. 1%的氯化汞溶液中浸泡3min，再用無菌水沖洗5次，除去消毒液；然后將所述老葉和葉柄剪成小片或小段，放入無菌的研缽中搗碎成糊狀物； 步驟200 :用無菌的玻璃涂布棒沾取少量步驟100中得到的糊狀物直接涂布于淀粉天冬素瓊脂平板，然后將平板置于28°C下培養(yǎng)7 20天，得到放線菌單菌落；所述淀粉天冬素瓊脂的組分可溶性淀粉2%，L-天冬素O. 05%, KNO3 O. 1%，K2HPO4 · 3H20 O. 05%, NaClO.05%，MgSO4 · 7H20 O. 05%, CaCO3O. 05%,瓊脂I. 5%，蒸餾水配制，pH為7. 5，且該淀粉天冬素瓊脂組分中的百分數(shù)均為質(zhì)量分數(shù)； 步驟300 :將經(jīng)過步驟200處理獲得的放線菌單菌落轉(zhuǎn)接于無機鹽淀粉瓊脂斜面，獲得束絲放線菌菌株FM06-0063的斜面培養(yǎng)物；所述無機鹽淀粉瓊脂斜面的組分為可溶性淀粉 IOg ；K2HPO4 · 3H20 Ig ；MgS04 · 7H20 Ig ；NaCl Ig ； (NH4)2SO4 2g ；CaCO3 2g ；FeS04 · 7H200.OOlg ；MnCl2 · 4H20 0. OOlg ；ZnSO4 · 7H20 0. OOlg ;瓊脂 20g ;蒸餾水 IOOOmL, pH 為 7. 0 7. 4。
4.如權(quán)利要求2所述的新的安絲菌素類化合物的制備方法，其特征在于所述步驟一具體為、 (O制備種子液將束絲放線菌菌株FM06-0063斜面培養(yǎng)成熟后接種于種子培養(yǎng)基中，并將其置于恒溫搖床中振蕩培養(yǎng)40 48h，溫度28°C，轉(zhuǎn)速220r/in ； (2)制備發(fā)酵液按10%的移種量將步驟(I)所獲得的種子液轉(zhuǎn)接入已消毒滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)96 120h，溫度28°C，轉(zhuǎn)速220r/min。
5.如權(quán)利要求4所述的新的安絲菌素類化合物的制備方法，其特征在于 所述種子培養(yǎng)基的組分可溶性淀粉I. 5%，葡萄糖O. 5%，黃豆粉1%，氯化鈉O. I %，蛋白胨O. 5%，酵母提取物O. 5%，碳酸鈣O. 5%，pH為7. 0，且該種子培養(yǎng)基組分中的百分數(shù)均為質(zhì)量分數(shù)。
6.如權(quán)利要求4所述的新的安絲菌素類化合物的制備方法，其特征在于 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組分糊精1%，甘油3 %，黃豆粉2%，玉米漿干粉I %，磷酸二氫鉀O.05%,氯化氨0.05%，碳酸鈣O. 5%，pH為7. O，且該發(fā)酵培養(yǎng)基組分中的百分數(shù)均為質(zhì)量分數(shù)。
7.如權(quán)利要求2所述的新的安絲菌素類化合物的制備方法，其特征在于所述步驟二具體為將束絲放線菌菌株FM06-0063發(fā)酵液在轉(zhuǎn)速為3000r/min下離心15min，并取上清液；接著將上清液上樣于大孔吸附樹脂，再用甲醇洗脫獲得混合液；混合液經(jīng)減壓濃縮除去甲醇以獲得濃縮液；將濃縮液用與該濃縮液相等體積的乙酸乙酯萃取三次，然后合并乙酸乙酯萃取液；乙酸乙酯萃取液經(jīng)減壓濃縮后到得粗提物。
8.如權(quán)利要求2所述的新的安絲菌素類化合物的制備方法，其特征在于所述步驟三中的氯仿-甲醇梯度洗脫粗提物是指用體積比100 0,98 2,95 5,90 10,85 15，80 20,70 30，60 40,50 50的氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng)對粗提物進行梯度洗脫。
9.如權(quán)利要求2所述的新的安絲菌素類化合物的制備方法，其特征在于所述步驟四中的薄層層析的展層劑為體積比15 I的三氯甲烷-甲醇溶劑，顯色劑為碘化鉍鉀顯色劑。
10.如權(quán)利要求2所述的新的安絲菌素類化合物的制備方法，其特征在于所述步驟四中的高效液相色譜檢測條件為流動相為體積比35 65的含0.1%三氟乙酸的水-甲醇，洗脫20min,流速lmL/min,檢測波長254nm,柱溫40°C。
11.如權(quán)利要求2、3、4或6所述的新的安絲菌素類化合物的制備方法，其特征在于所述束絲放線菌菌株FIM06-0063 (Actinosynnema sp),于2011年12月30日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO. 5677。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的安絲菌素類化合物及其制備方法，該新的安絲菌素類化合物的結(jié)構(gòu)式如下所示其中R為CH2CH3或CH2CH(CH3)2；所述安絲菌素類化合物的制備方法是通過大孔樹脂吸附柱層析、硅膠柱層析等方法從束絲放線菌菌株FIM06-0063的發(fā)酵產(chǎn)物中，分離純化獲得兩個新的安絲菌素類化合物，并對其結(jié)構(gòu)通過質(zhì)譜、核磁共振波譜、紫外光譜等技術(shù)進行表征。本發(fā)明制得的安絲菌素類化合物具有較強的抗腫瘤活性；本發(fā)明通過微生物發(fā)酵方法制備安絲菌素類化合物，具有工藝簡單、生產(chǎn)成本低的優(yōu)點。
文檔編號C12R1/01GK102731526SQ201210148068
公開日2012年10月17日 申請日期2012年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月14日
發(fā)明者張祝蘭, 楊煌建, 王傳喜, 謝穎, 賈緯, 鄭衛(wèi), 陳麗, 陳宏 , 陳曉明, 黃維 申請人:福建省微生物研究所