專利名稱：一種含ghrelin的羊胚胎體外培養(yǎng)液及其培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種含ghrelin的羊胚胎體外培養(yǎng)液，以及利用該培養(yǎng)液進(jìn)行羊胚胎體外培養(yǎng)的方法，屬家畜胚胎工程技術(shù)領(lǐng)域。
(ニ)
背景技術(shù)：
隨著現(xiàn)代繁殖生物技術(shù)的發(fā)展及胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)的逐步完善，羊胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)(體外受精或克隆)已成為加快品種選育和優(yōu)良種群擴(kuò)繁速度的重要途徑。雖然通過(guò)胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)已經(jīng)獲得了活的后代，但體外受精或克隆獲得的體外胚胎在培養(yǎng)過(guò)程中普 遍存在發(fā)育阻斷現(xiàn)象，即胚胎發(fā)育到一定階段后停止發(fā)育并發(fā)生退化，導(dǎo)致體外胚胎的囊胚發(fā)育率遠(yuǎn)低于體內(nèi)胚胎。此外，與體內(nèi)胚胎相比，體外胚胎囊胚的細(xì)胞總數(shù)和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)明顯減少，體外胚胎移植入受體后，產(chǎn)仔率顯著低于體內(nèi)胚胎。目前的羊胚胎體外培養(yǎng)體系不能提供與體內(nèi)早期胚胎相同或相近的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境是導(dǎo)致上述問(wèn)題的關(guān)鍵原因之一，因此完善胚胎的早期培養(yǎng)體系、建立能提高囊胚發(fā)育率的體外培養(yǎng)液成為胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)推廣應(yīng)用的ー個(gè)突破口。Ghrelin是1999年從小鼠的胃中提純并鑒定的生長(zhǎng)激素促分泌素受體的特定內(nèi)源性配體。早期的研究表明，ghrelin的主要功能是通過(guò)激活磷酸脂酶C和蛋白激酶C信號(hào)通路，刺激垂體前葉釋放生長(zhǎng)激素，増加食欲、調(diào)節(jié)能量代謝平衡及促進(jìn)胃酸的分泌。但隨著研究的深入，越來(lái)越多的證據(jù)表明ghrelin在生殖調(diào)控方面發(fā)揮著重要作用。已在豬、羊和人的下丘腦和垂體中檢測(cè)到ghrelin的表達(dá)。Ghrelin在大鼠卵巢整個(gè)發(fā)情周期內(nèi)均表達(dá)，但在動(dòng)情間期第I天的表達(dá)量最高，動(dòng)情前期的表達(dá)量最低，這種周期性表達(dá)模式與黃體的功能相適應(yīng)。而在整個(gè)妊娠期，妊娠早期卵巣ghrelin的表達(dá)量較高，懷孕后期表達(dá)量較低。研究還發(fā)現(xiàn)，ghrelin基因在非懷孕和蛻膜化的子宮內(nèi)膜及胎盤中表達(dá)，在胚胎植入期間ghrelin作為子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的蛻膜化的旁分泌調(diào)控子，暫時(shí)調(diào)控子宮內(nèi)膜和胚胎之間的對(duì)話。Ghrelin基因在卵巣、子宮以及胎盤等生殖系統(tǒng)中的高效表達(dá)證實(shí)，其對(duì)體內(nèi)胚胎的分化、發(fā)育和著床具有重要的調(diào)控作用。但到目前為止，尚未見(jiàn)有關(guān)ghrelin用于家畜繁殖技術(shù)領(lǐng)域，特別是用于胚胎體外培養(yǎng)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明即是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中羊胚胎體外培養(yǎng)液不能滿足體外胚胎早期發(fā)育的需求，導(dǎo)致胚胎早期發(fā)育率較低的不足，提供了ー種具有提高體外胚胎早期發(fā)育率功能的含ghrelin的羊胚胎體外培養(yǎng)液及其培養(yǎng)方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是ー種含ghrelin的羊胚胎體外培養(yǎng)液，所述羊胚胎體外培養(yǎng)液以TCM199培養(yǎng)液為基質(zhì)，所述基質(zhì)中還含有400 800ng/mL的ghrelin、0. 15mg/mL的谷氨酰胺、100IU/mL的青霉素、100 μ g/mL的鏈霉素和5 10mg/mL的牛血清白蛋白。
ghrelin是ー種多肽類生物活性因子，屬于常用生化試劑，并已有商品出售。本發(fā)明中所用ghrelin由課題組從Sigma公司采購(gòu)。TCM199培養(yǎng)液為本領(lǐng)域常規(guī)用于胚胎培養(yǎng)的培養(yǎng)液,可米用市購(gòu)商品,本發(fā)明中所用TCM199培養(yǎng)液購(gòu)自Sigma公司。優(yōu)選的,所述羊胚胎體外培養(yǎng)液姆IOOOmL組成如下ghrelin 400 800mg,谷氨酰胺150mg，青霉素100000IU，鏈霉素100000 μ g，血清白蛋白5 10g，TCM199培養(yǎng)液補(bǔ)足至 1000mL。所述羊胚胎來(lái)自為綿羊或者山羊。優(yōu)選的,所述羊胚胎體外培養(yǎng)液中，ghrelin含量為500 600ng/mL,牛血清白蛋白含量為8mg/mL。本發(fā)明還涉及應(yīng)用所述羊胚胎體外培養(yǎng)液對(duì)羊胚胎進(jìn)行體外培養(yǎng)的方法，所述方法是將受精后的早期羊胚胎用TCM199培養(yǎng)液反復(fù)沖洗后，放入所述含ghrelin的羊胚胎體外培養(yǎng)液中，于38 39°C、5% CO2的環(huán)境內(nèi)，進(jìn)行胚胎體外培養(yǎng)。所述早期羊胚胎由羊卵母細(xì)胞經(jīng)體外成熟培養(yǎng)、體外受精獲得。所述羊卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)方法如下從屠宰場(chǎng)獲取的卵巣中用注射器抽取的羊卵母細(xì)胞，用成熟培養(yǎng)液在38 39°C、5% CO2的環(huán)境內(nèi)培養(yǎng)20 24小吋，獲得成熟的羊卵母細(xì)胞；所述成熟培養(yǎng)液以常規(guī)培養(yǎng)液為基質(zhì)，所述基質(zhì)中還含有10 μ g/mL的FSH (卵泡刺激素)、10 μ g/mL的LH(黃體生成素)、100IU/mL的青霉素、100 μ g/mL的鏈霉素和體積百分含量為8% 20%血清，所述常規(guī)培養(yǎng)液為TCM199、DMEM、F12、MEM培養(yǎng)液中的ー種或兩種以上的混合物；所述的血清為小牛血清、胎牛血清或者新生牛血清中ー種。所述羊卵母細(xì)胞體外受精方法如下將成熟的羊卵母細(xì)胞與精子一同放入受精培養(yǎng)液中，在38 39°C、5% CO2的環(huán)境內(nèi)培養(yǎng)18 24小時(shí)，進(jìn)行受精，獲得早期羊胚胎；所述受精培養(yǎng)液為含2%羊血清的TCM199培養(yǎng)液。本發(fā)明胚胎體外培養(yǎng)液，是根據(jù)目前胚胎體外培養(yǎng)時(shí)囊胚率較低，不能滿足在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用的需要，結(jié)合ghrelin的生物學(xué)功能研制而成。ghrelin作為生長(zhǎng)激素促分泌素受體的內(nèi)源性配體，具有調(diào)控生殖激素分泌；促進(jìn)卵泡生長(zhǎng)、排卵；調(diào)節(jié)卵巢功能；參與胚胎早期發(fā)育調(diào)控等功能。因此ghrelin應(yīng)用于羊胚胎體外培養(yǎng)，可以有效促進(jìn)胚胎體外發(fā)育，解決了目前羊早期胚胎體外發(fā)育率低的問(wèn)題。其經(jīng)濟(jì)成本較低，便于在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例I :制備含ghrelin的羊胚胎體外培養(yǎng)液準(zhǔn)確稱取ghrelin (Sigma公司)60 mg,先用20 mL的TCM199培養(yǎng)液溶解,然后向培養(yǎng)液中加入15mg谷氨酰胺、800 mg牛血清白蛋白和10000 IU的青霉素，10000 μ g的鏈霉素，輕微攪拌均勻，再加入TCM199培養(yǎng)液至IOOmL,再次攪拌混勻。用0. 22 μΜ的微濾 膜抽濾消毒后，在4°C下貯存，備用。實(shí)施例2 :含ghrelin的培養(yǎng)液用于山羊胚胎體外培養(yǎng)
山羊卵母細(xì)胞在含有10 μ g/ml的FSH、10 μ g/ml的LH、100IU/mL的青霉素、100 μ g/mL的鏈霉素和體積百分含量為10%血清的TCM199培養(yǎng)液中成熟培養(yǎng)，然后進(jìn)行體外受精。受精后的早期胚胎分別在不含ghrelin的TCM199培養(yǎng)液(對(duì)照組)及實(shí)施例I制備的含ghrelin的羊胚胎體外培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)7天。培養(yǎng)的第2天，對(duì)照組中的早期胚胎分裂率為64. 9%，在實(shí)施例I制備的含ghrelin的羊胚胎體外培養(yǎng)液中的早期胚胎分裂率為78. 3%，比對(duì)照組提高13. 4%。培養(yǎng)的第7天，對(duì)照組中的早期胚胎囊胚期發(fā)育率為24. 0%，在實(shí)施例I制備的含ghrelin的羊胚胎體外培養(yǎng)液中的早期胚胎囊胚期發(fā)育率為33. 7%，比對(duì)照組提高9. 7%。結(jié)果證實(shí)，含ghrelin的羊胚胎體外培養(yǎng)液體外培養(yǎng)山羊胚胎可有效提高受精后的早期胚胎發(fā)育率。實(shí)施例3 :含ghrelin的培養(yǎng)液用于綿羊胚胎體外培養(yǎng)綿羊卵母細(xì)胞在含有10 μ g/mL的FSH、10 μ g/mL的LH、lOOIU/mL的青霉素、100 μ g/mL的鏈霉素和體積百分含量為10%血清的TCM199培養(yǎng)液中成熟培養(yǎng)，然后進(jìn)行體外受精。受精后的早期胚胎分別在不含ghrelin的TCM199培養(yǎng)液(對(duì)照組)及實(shí)施例I制備的含ghrelin的羊胚胎體外培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)7天。培養(yǎng)的第2天，對(duì)照組中的早期胚胎分裂率為62. 7%，在實(shí)施例I制備的含ghrelin的羊胚胎體外培養(yǎng)液中的早期胚胎分裂率為76. 4%，比對(duì)照組提高13. 7%。培養(yǎng)的第7天，對(duì)照組中的早期胚胎囊胚期發(fā)育率為25. 3%，在實(shí)施例I制備的含ghrelin的羊胚胎體外培養(yǎng)液中的早期胚胎囊胚期發(fā)育率為35. 4%，比對(duì)照組提高10. 1%。結(jié)果證實(shí)，含ghrelin的羊胚胎體外培養(yǎng)液體外培養(yǎng)綿羊胚胎可有效提高受精后的早期胚胎發(fā)育率。權(quán)利要求
1.一種含ghrelin的羊胚胎體外培養(yǎng)液，其特征在于所述羊胚胎體外培養(yǎng)液以TCM199培養(yǎng)液為基質(zhì)，所述基質(zhì)中還含有400 800ng/mL的ghrelin、0. 15mg/mL的谷氨酰胺、100IU/mL的青霉素、100 μ g/mL的鏈霉素和5 10mg/mL的牛血清白蛋白。
2.如權(quán)利要求I所述的羊胚胎體外培養(yǎng)液，其特征在于所述羊胚胎體外培養(yǎng)液每IOOOmL組成如下ghrelin 400 800mg,谷氨酰胺150mg,青霉素100000IU,鏈霉素100000 μ g，血清白蛋白5 10g, TCM199培養(yǎng)液補(bǔ)足至IOOOmL0
3.如權(quán)利要求I或2所述的羊胚胎體外培養(yǎng)液，其特征在于所述羊胚胎體外培養(yǎng)液中，ghrelin含量為500 600ng/mL,牛血清白蛋白含量為8mg/mL。
4.應(yīng)用如權(quán)利要求I或2所述羊胚胎體外培養(yǎng)液對(duì)羊胚胎進(jìn)行體外培養(yǎng)的方法，所述方法是將受精后的早期羊胚胎用TCM199培養(yǎng)液反復(fù)沖洗后，放入所述含ghrelin的羊胚胎體外培養(yǎng)液中，于38 39°C、5% CO2的環(huán)境內(nèi)，進(jìn)行胚胎體外培養(yǎng)。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述早期羊胚胎由羊卵母細(xì)胞經(jīng)體外成熟培養(yǎng)、體外受精獲得。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述羊卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)方法如下從屠宰場(chǎng)獲取的卵巢中用注射器抽取的羊卵母細(xì)胞，用成熟培養(yǎng)液在38 39°C、5% CO2的環(huán)境內(nèi)培養(yǎng)20 24小時(shí),獲得成熟的羊卵母細(xì)胞；所述成熟培養(yǎng)液以常規(guī)培養(yǎng)液為基質(zhì)，所述基質(zhì)中還含有10 μ g/mL的FSH、10 μ g/mL的LH、100IU/mL的青霉素、100 μ g/mL的鏈霉素和體積百分含量為8% 20%血清，所述常規(guī)培養(yǎng)液為TCM199、DMEM、F12、MEM培養(yǎng)液中的一種或兩種以上的混合物；所述的血清為小牛血清、胎牛血清或者新生牛血清中一種。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述羊卵母細(xì)胞體外受精方法如下將成熟的羊卵母細(xì)胞與精子一同放入受精培養(yǎng)液中，在38 39°C、5% CO2的環(huán)境內(nèi)培養(yǎng)18 24小時(shí)，進(jìn)行受精，獲得早期羊胚胎；所述受精培養(yǎng)液為含2%羊血清的TCM199培養(yǎng)液。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種含ghrelin的羊胚胎體外培養(yǎng)液，所述羊胚胎體外培養(yǎng)液以TCM199培養(yǎng)液為基質(zhì)，所述基質(zhì)中還含有400～800ng/mL的ghrelin、0.15mg/mL的谷氨酰胺、100IU/mL的青霉素、100μg/mL的鏈霉素和5～10mg/mL的牛血清白蛋白。本發(fā)明胚胎體外培養(yǎng)液中g(shù)hrelin 作為生長(zhǎng)激素促分泌素受體的內(nèi)源性配體，具有調(diào)控生殖激素分泌；促進(jìn)卵泡生長(zhǎng)、排卵；調(diào)節(jié)卵巢功能；參與胚胎早期發(fā)育調(diào)控等功能。因此ghrelin應(yīng)用于羊胚胎體外培養(yǎng)，可以有效促進(jìn)胚胎體外發(fā)育，解決了目前羊早期胚胎體外發(fā)育率低的問(wèn)題。其經(jīng)濟(jì)成本較低，便于在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N5/073GK102676449SQ20121014857
公開(kāi)日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月14日
發(fā)明者俞頌東, 王爭(zhēng)光, 白惠琴, 白驪驊 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)